CN114933646A

CN114933646A - Smagp蛋白多肽构建及其抗脂肪性肝病活性的应用

Info

Publication number: CN114933646A
Application number: CN202210711746.8A
Authority: CN
Inventors: 陈玲
Original assignee: Nantong Sixth Peoples Hospital
Current assignee: Nantong Sixth Peoples Hospital
Priority date: 2022-06-22
Filing date: 2022-06-22
Publication date: 2022-08-23

Abstract

本发明公开了SMAGP蛋白多肽的表达载体构建及其抗脂肪性肝病的活性；其中，一种SMAGP蛋白多肽的构建序列，其包括，氨基酸序列和核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1，核苷酸序列如SEQ ID NO:2；一种SMAGP蛋白多肽表达载体的构建方法，包括全基因合成SMAGP蛋白多肽编码cDNA序列，并将其分子克隆进入pcDNA3.1(+)真核表达载体中，形成重组表达质粒；将所述重组质粒转染肝细胞。本发明利用多种功能手段明确SMAGP蛋白多肽对肝细胞脂肪蓄积的拮抗作用，并阐明其机制与AMPK通路活化和脂肪合成关键酶表达下降存在联系。在细胞生物学层面证明了此SMAGP蛋白多肽具有拮抗肝细胞中脂肪合成代谢通路抑制肝脏脂肪蓄积的重要应用价值。

Description

SMAGP蛋白多肽构建及其抗脂肪性肝病活性的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，涉及SMAGP蛋白的表达载体构建及其抗脂肪性肝病活性，具体是明确一种SMAGP蛋白多肽的表达及其应用于脂肪性肝病的靶向治疗。

背景技术

代谢相关脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease,MAFLD)是能量营养素代谢异常诱导的脂肪性肝脏病变疾病的总称，其发病率居慢性肝病的首位。MAFLD依据病情进展可分为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎和肝纤维化等，晚期的MAFLD可引发肝硬化和肝癌，威胁患者生命。我国是MAFLD高发的国家，据估测约30％的成年人中均存在不同程度的MAFLD，总患者超过2亿。MAFLD发病机制复杂，主要诱导因素包括肥胖、糖尿病、饮食能量过剩和缺乏体力锻炼等。肝脏能量代谢异常是诱发MAFLD发生的关键原因，涉及肝细胞中一系列脂代谢蛋白表达的变化，包括脂质合成酶：乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合酶(FASN)，脂质β氧化相关酶：脂酰CoA合成酶和脂酰CoA脱氢酶等。肝脏中上述脂代谢相关酶的表达变化对MAFLD的病理进程具有非常重要的意义。

肝脏中脂代谢相关酶的表达异常可诱导体内脂肪的过度蓄积，进而影响肝脏中脂肪代谢，促进肝脏中脂质的蓄积。肝脏中的脂质代谢受复杂的信号通路调控，脂质代谢酶的调控上游信号通路包括过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等。我们近期通过研究发现SMAGP蛋白在MAFLD患者肝脏组织中存在表达下调，并且在肝细胞中过表达SMAGP蛋白多肽可明显促进AMPK通路的活化并引起脂代谢相关酶的表达变化，促进肝细胞中脂肪酸的降解，缓解肝细胞中脂质的蓄积。本发明可潜在应用于脂肪性肝病的靶向治疗，为脂肪性肝病临床治疗提供新的靶向多肽药物。

发明内容

本发明提供了如下技术方案：一种SMAGP蛋白多肽的构建序列，其cDNA序列和表达的多肽氨基酸序列：

编码cDNA序列：

作为本发明的另一方面，本发明提供一种SMAGP蛋白多肽的表达方法，其包括，利用全基因合成仪合成SMAGP蛋白多肽的编码序列，进而以限制性内切酶酶切后与重组入pcDNA3.1(+)真核表达载体中，进而鉴定获得SMAGP蛋白多肽表达质粒；将上述重组SMAGP蛋白多肽质粒转染肝细胞。

作为本发明所述的SMAGP蛋白多肽的表达方法的优选方案，其中：所述限制性内切酶包括HindIII、XbaI中的一种或几种。

作为本发明所述的SMAGP蛋白多肽的表达方法的优选方案，其中：所述肝细胞为永生化的人正常肝细胞系L02。

作为本发明所述的SMAGP蛋白多肽的表达方法的优选方案，其中：所述转染方法，在100μl opti-mem培养基中加入4μg的重组SMAGP蛋白多肽质粒，随后加入12μl的Fugene脂质体试剂并以移液器吹打混匀，室温孵育15分钟，进而将上述转染复合物加入以无血清培养基培养的L02细胞中，转染6h后，将培养基更换为新鲜的DMEM完全培养基，转染36h后，收集细胞检测SMAGP蛋白多肽表达。

本发明的有益效果：

本发明利用分子克隆技术，将一段SMAGP蛋白多肽对应的编码核酸序列克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中。通过Sanger测序验证重组克隆构建成功，进而利用脂质体将此重组真核表达载体转染至肝细胞中，进行免疫印迹检测SMAGP蛋白多肽的表达，阐明其在肝细胞中存在表达。继而，利用多种生物功能学研究技术明确SMAGP蛋白多肽对肝细胞脂质代谢相关酶及脂质蓄积的调控作用，结果发现SMAGP蛋白多肽具有促进AMPK通路活化及下游脂质代谢相关酶表达，进而抑制肝细胞中脂质蓄积的重要功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为SMAGP在正常及MAFLD组织中的表达(*，P<0.05，相比于空载组)；

图2为重组SMAGP蛋白多肽在L02肝细胞中的表达；

图3为重组SMAGP蛋白多肽活化L02肝细胞中AMPK信号通路(*，P<0.05，相比于空载组)；

图4为重组SMAGP蛋白多肽调控肝细胞中脂质代谢酶的表达(*，P<0.05，相比于空载组)；

图5为重组SMAGP蛋白多肽抑制L02细胞中脂质蓄积(*，P<0.05，相比于空载组)。

具体实施方式

如图1所示脂肪性肝病组织中SMAGP存在表达下调。

获得临床活检的正常和MAFLD新鲜肝组织各100mg，加入2ml的Trizol裂解液后迅速在电动匀浆器中粉碎组织，随后匀浆结束后的组织样品转移至EP管中，并在13 000g、4℃中离心15min，利用Trizol法按照产品说明书各组肝组织中的总RNA提取，并利用Nanodrop微量核酸浓度测定仪测定RNA浓度。取1μg总RNA利用RevertAid逆转录试剂盒进行逆转录成cDNA，反应体系为20μl，包括1μl的Oligo dT，4μl 5×Buffer，2μl dNTP，1μl逆转录酶，1μlRiboLock RNase抑制剂，42℃反应1h后，65℃热激灭活反应酶。利用RT-PCR检测SMAGP的表达：取0.5μl cDNA，1μl引物混合物(5μM)，3.5μl dH2O，5μl 2×Premix Ex Taq II(Takara)，在96孔板中以β-actin作为内参检测SMAGP在正常和脂肪性肝病组织中的表达差异，结果表明脂肪性肝病组织中SMAGP的表达显著降低(图1)。

如图2-5所示，SMAGP蛋白多肽在抗脂肪性肝病活性中的应用包括如下步骤：

第一步：重组SMAGP蛋白多肽在L02肝细胞中的表达；

以DMEM+10％FBS+双抗培养基培养和传代L02肝细胞，每2-3天传代一次，将2×10⁶细胞接种于T25培养瓶中，过夜培养。在干净无菌的EP管中加入100μl opti-mem培养基，并加入4μg的重组SMAGP蛋白多肽质粒或空载pcDNA3.1(+)载体，再加入12μl的Fugene脂质体试剂，室温孵育15分钟。孵育结束后，先将L02细胞培养基弃去，加入4ml DMEM基础无血清培养基，进而加入上述转染复合物，37℃培养箱中培养6h后，更换培养基为DMEM完全培养基。转染36h，弃去培养基，以冰浴的PBS洗涤细胞一次，加入200μl RIPA裂解液并将细胞刮下，冰上放置裂解30min。以BCA法进行蛋白定量，并将等量的蛋白样品加入5×SDS上样缓冲液后煮沸5min，取10μl蛋白样品在12％SDS-PAGE中分离，分裂结束后，将蛋白样品转膜至PVDF膜中，以1％BSA的TBST封闭1h，进而加入1:1000的抗myc标签抗体孵育过夜。TBST洗涤3次，每次5min，并加入1:2000HRP标记的山羊抗小鼠二抗孵育2h，以ECL法显影SMAGP蛋白的条带，结果表明重组SMAGP可表达于肝细胞中(图2)。

第二步：重组SMAGP蛋白多肽活化L02肝细胞中AMPK信号通路；

在转染pcDNA3.1(+)空载和SMAGP蛋白多肽的L02肝细胞中，依据第一步中相同的方法进行免疫印迹，以Thr172位点磷酸化AMPK(p-AMPK)的抗体进行孵育，一抗孵育过夜后，以1:2000HRP标记的山羊抗小鼠二抗孵育2h，并利用ECL法显影p-AMPK条带，结束后以同样的方法孵育抗AMPK抗体检测总AMPK的表达，分析空载和SMAGP蛋白多肽表达的L02肝细胞中p-AMPK相比于总AMPK的表达变化。结果表明，SMAGP蛋白多肽过表达后可显著促进p-AMPK的表达升高，提示AMPK通路发生活化(图3)。

第三步：重组SMAGP蛋白多肽调控肝细胞中脂质代谢酶的表达；

随后，我们检测SMAGP蛋白多肽对肝细胞中脂质代谢酶表达的影响。在转染pcDNA3.1(+)空载和SMAGP蛋白多肽的L02肝细胞中，加入1ml的Trizol裂解液后迅速裂解细胞，进而按照Trizol说明书提取L02细胞中的总RNA，利用Nanodrop微量核酸浓度测定仪测定提取的L02细胞样品RNA浓度。利用RevertAid逆转录试剂盒将1μg总RNA逆转录成cDNA，总反应体积为20μl：1μl Oligo dT，4μl 5×Buffer，2μl dNTP，1μl逆转录酶，1μl RiboLockRNase抑制剂；反应条件为：42℃逆转录1h，65℃热激灭活。利用RT-PCR检测脂肪合酶(FASN)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的表达，反应体系为：0.5μl cDNA，1μl引物混合物(5μM)，3.5μldH2O，5μl 2×Premix Ex Taq II(Takara)，在96孔板中以2步法RT-PCR检测各组中上述基因相对表达的差异。结果表明，重组SMAGP蛋白多肽可显著抑制脂肪合成相关酶FASN和ACC的表达(图4)。

第四步：重组SMAGP蛋白多肽抑制L02细胞中脂质蓄积。

在转染pcDNA3.1(+)空载和SMAGP蛋白多肽后，将L02肝细胞以50-60％的融合度接种于6孔板中，12h后，以0.4 mM棕榈酸(PA)刺激细胞48h。刺激结束后，弃去培养基，以4％多聚甲醛溶液固定细胞30min，弃去多聚甲醛并加入1ml的油红染色试剂孵育30min，结束后以苏木素染核，分析空载及SMAGP蛋白多肽转染后L02肝细胞中脂质蓄积的程度。结果表明，SMAGP多肽可显著抑制L02肝细胞中脂滴的蓄积(图5)。

本发明是基于SMAGP蛋白是我们鉴定发现的新的肝脏脂肪病变相关蛋白，发明SMAGP蛋白多肽可以促进肝脏对脂质的正常代谢并减少肝细胞中脂质合成相关酶的表达，从而防止肝细胞中脂质蓄积和肝脏脂肪病变的发生。通过对肝细胞中能量代谢和脂质合成通路的研究，我们发现SMAGP蛋白多肽具有活化AMPK通路并抑制脂质合成关键酶表达的功能，从而抑制肝细胞中脂质的合成，减少肝脏中脂肪沉积，可以有效预防和治疗脂肪性肝病。本发明提供临床前SMAGP蛋白多肽干预肝脏脂肪合成进行脂肪性肝病的靶向治疗，对脂肪性肝病的临床治疗及靶向多肽药物研究具有重要的价值。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种SMAGP蛋白多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1。

2.根据权利要求1所述的一种SMAGP蛋白多肽，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2。

3.一种如权利要求1所述SMAGP蛋白多肽表达载体的构建方法，其特征在于，利用全基因合成仪合成SMAGP蛋白多肽的编码序列，进而以限制性内切酶酶切后与重组入pcDNA3.1(+)真核表达载体中，进而鉴定获得SMAGP蛋白多肽表达质粒；将上述重组SMAGP蛋白多肽质粒转染肝细胞。

4.根据权利要求3所述的一种SMAGP蛋白多肽表达载体的构建方法，其特征在于，所述限制性内切酶包括HindIII、XbaI中的一种或几种。

5.根据权利要求3所述的一种SMAGP蛋白多肽表达载体的构建方法，其特征在于，所述肝细胞为永生化的人正常肝细胞系L02。

6.根据权利要求3所述的一种SMAGP蛋白多肽表达载体的构建方法，其特征在于，所述转染方法为：在opti-mem培养基中加入重组SMAGP蛋白多肽质粒，随后加入Fugene脂质体试剂，室温孵育，进而将上述转染复合物加入以无血清培养基培养的L02细胞中，转染后，将培养基更换为新鲜的DMEM完全培养基，转染后，收集细胞检测SMAGP蛋白多肽表达。

7.一种如权利要求1所述SMAGP蛋白多肽在抗脂肪性肝病活性中的应用。