CN110368502B - Utx基因在制备预防或治疗血脂类疾病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了UTX基因在制备预防或治疗血脂类疾病药物中的应用。本发明还公开了一种在小鼠肝脏中敲除UTX基因的方法。本发明还公开了一种UTX过表达腺病毒及其制备方法和应用。本发明还公开了UTX蛋白在制备预防或治疗脂质疾病药物中的应用。本发明为制备降血脂药物提供了可用的实验室依据，从而可利用UTX制备影响血脂的药物，为研究血脂异常的发生发在展提供了新的研究手段。

Description

UTX基因在制备预防或治疗血脂类疾病药物中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，涉及UTX基因在制备预防或治疗血脂类疾病药物中的应用。
背景技术
组蛋白甲基化修饰在调控高脂血症、肥胖和非酒精性脂肪肝(NAFLD)等代谢性疾病中发挥重要作用。组蛋白去甲基化酶UTX(ubiquitously transcribedtetratricopeptide repeat on chromosome X)基因位于X染色体，在肝脏、脾脏、脑等组织中高表达。作为组蛋白去甲基化酶，从组蛋白H3K27中去除二甲基和三甲基来激活基因表达，参与众多的生物学和病理学过程。研究发现，UTX基因在糖尿病人及小鼠肾脏中的表达量显著上升；且在HepG2中敲降UTX后，肝脏糖异生关键基因PEPCK的表达也显著下调，说明UTX参与机体糖代谢。此外，脂肪细胞特异性UTX敲除鼠的甘油三酯合成酶活性显著下降，进一步揭示了UTX基因与脂质代谢密切相关。但目前没有关于UTX在高脂血症的功能报道。
高脂血症是指血脂水平过高，即血液中胆固醇及甘油三酯代谢或转运异常而导致。研究表明，高血脂作为冠心病、脑中风、脂肪肝、高尿酸血症等疾病发生的高危因素，正呈现急剧上升、低龄化的趋势。《中国心血管病报告2010》显示，我国18岁以上血脂异常的人群占总人数的18.6％，患病人数已经达到了2亿人；据统计，全世界每年有3000万人死于高血脂引起的相关疾病。已知高脂血症是机体在遗传、环境、生活行为等多种因素相互作用下脂质代谢紊乱的结果，发病机制复杂，因此，开展高脂血症病因学研究十分重要，将为阐明高脂血症的发病机制提供重要的理论基础。
在前期研究工作中，发明人采用基因工程技术，在小鼠肝脏组织中特异性敲除UTX基因后，发现肝脏特异性UTX敲除小鼠出现明显的高胆固醇及高甘油三酯血脂，提示其可能与高脂血症的发生发展相关。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了UTX基因或其UTX蛋白在制备预防或治疗血脂类疾病药物中的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了UTX基因在制备降血脂药物中的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种在小鼠肝脏中敲除UTX基因的方法。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种腺病毒载体、一种UTX腺病毒、其制备方法和应用。
本发明还要进一步解决的技术问题是提供UTX基因过表达在制备治疗高脂血症和NAFLD药物中的应用。
本发明构建了UTX过表达腺病毒载体，并通过尾静脉注射将其转导到小鼠肝脏中，特异性过表达UTX基因。H&E染色和肝脏甘油三酯检测结果证实了UTX基因对高脂血症和NAFLD的治疗作用。因此，我们应该更加努力推进UTX基因或其蛋白在制备预防或治疗血脂类疾病药物中的应用
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明的的技术方案如下：本发明内容包括UTX基因在制备预防或治疗血脂类疾病药物中的应用。
本发明内容还包括UTX基因在制备降血脂药物中的应用。
本发明内容还包括一种在小鼠肝脏中敲除UTX基因的方法，通过构建基因工程小鼠在肝脏组织中特异性敲除UTX基因，包括以下步骤：
1)将雌性小鼠UTXf/f小鼠与雄性albcre小鼠交配，通过基因鉴定，得到UTXf/y；albcre雄性小鼠；
2)将UTXf/y；albcre雄性小鼠与UTXf/f雌性小鼠交配，获得UTXf/f；albcre雌性小鼠或UTXf/y；albcre雄性小鼠；
3)对UTXf/f；albcre雌性小鼠进行基因鉴定获得UTX敲除小鼠。
本发明内容还包括一种腺病毒载体，所述腺病毒载体包含UTX基因，该载体可以有效地在肝脏细胞中过表达UTX基因。
其中，所述腺病毒载体为pAdEasy-1载体。
本发明内容还包括一种UTX过表达腺病毒，其包含所述的腺病毒载体。
本发明内容还包括一种UTX过表达腺病毒的制备方法，包括以下步骤：
1)cDNA的获得：抽提小鼠肝脏组织RNA及逆转录cDNA；
2)UTX基因的获得：以肝脏组织cDNA为模板PCR扩增UTX基因；
3)UTX腺病毒过表达载体的构建：将UTX基因克隆至pShuttle载体，经PmeI限制酶线性化后，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染至BJ5183菌中，筛选重组后的阳性质粒即得UTX腺病毒过表达载体；
4)将UTX腺病毒过表达载体转染至培养好的AD-293细胞中继续培养7-10天后弃去细胞培养液上清，收集细胞悬液于EP管中，反复于甲醇冰浴与水浴中冷冻/解冻，解冻后短暂震荡细胞以获取pAdFasy-UTX腺病毒。
其中，所述步骤2)中PCR扩增上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物如SEQ ID NO：2所示。
其中，所述步骤4)中所述培养好的AD-293细胞为在37℃、5％CO2孵箱中按7-8*105/ml密度均匀接种于培养皿中，待细胞融合度达70-80％的AD-293细胞。
本发明内容还包括所述的腺病毒载体、所述的UTX腺病毒制备预防或治疗血脂类疾病药物中的应用。
本发明内容还包括UTX蛋白在制备预防或治疗脂质疾病药物中的应用。
本发明内容还包括影响UTX表达或活性的药物在制备预防或治疗血脂类疾病药物中的应用。
本发明内容还包括一种在小鼠肝脏中特异性过表达UTX基因的方法，包括以下步骤：
1)给6周龄小鼠饲喂高脂饲料(higt-fat diet，HFD，fat content 60％；ResearchDiets，New Brunswick，NJ)，以获得高脂血症和非酒精性脂肪肝病模型，简称HFD小鼠；
2)2个月后，将纯化的pAdEasy-UTX腺病毒以每只小鼠1.5*108个单位通过尾静脉注射到小鼠体内，使肝脏中特异性过表达UTX基因。
3)注射后3天处死所有小鼠，取肝脏进一步分析脂质含量。
最后通过分析脂质含量，检测UTX基因的降脂功能。
有益效果：相对于现有技术，本发明的优越性在于：
1)本发明利用UTX flox小鼠及Albcre小鼠杂交，获得肝脏UTX特异性敲除的UTXf /f；albcre小鼠，首次发现UTX敲除后能够显著升高小鼠血液中胆固醇及甘油三酯的含量，故提出UTX在制备降血脂药物中的应用。
2)本发明首次得到了一种UTX过表达腺病毒，利用腺病毒实现在肝脏细胞中过表达UTX蛋白，腺病毒载体中包含UTX核苷酸序列，该UTX过表达后可抑制肝脏细胞脂质分泌，从而起到降低血脂方面的用途。
3)本发明通过尾静脉注射将纯化的UTX过表达腺病毒转导到小鼠体内，获得肝脏中特异性过表达UTX基因的小鼠。三天后处死所有小鼠，收集肝脏进行进一步分析，检测UTX基因的降脂功能。
4)本发明为制备降血脂药物提供了可用的实验室依据，从而可利用UTX制备影响血脂的药物，为研究血脂异常的发生发展提供了新的研究手段。
附图说明
图1A UTX不同基因型PCR鉴定结果图，图1B qRT-PCR检测mRNA水平的敲除效率；图1C Western blot检测蛋白水平的敲除效率；图1D Western blot结果的定量分析；
图2 UTX在HepG2肝脏细胞中过表达效率检测结果；
图3在HepG2肝脏细胞中过表达UTX后的甘油三酯检测结果；
图4A在HFD小鼠中过表达UTX基因后的肝组织切片，H&E染色显示脂质含量；图4B显示在HFD小鼠中过表达UTX基因后的肝脏甘油三酯检测结果。
具体实施方式
(一)主要试剂
本研究中所使用的UTX抗体购买自美国Genetex公司；GAPDH抗体购自南京Bioworld公司；Trizol试剂、mRNA逆转录试剂盒及定量PCR试剂盒，购自美国Invitrogen公司；蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、蛋白酶K，购自美国Pierce公司；ECL化学发光检测试剂盒，购自南京天根生物有限公司；PVDF膜，购自美国Millipore公司；普通Taq酶，购自南京Vazyme公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、PBS、青链霉素购自美国Gibico公司；葡萄糖购自美国Sigma公司；
(二)主要仪器
UTL超低温冰箱：Thermo公司，美国
梯度PCR仪：Eppendorf公司，法国
凝胶成像系统：Bio-rad，美国
电泳仪、电泳槽：Bio-rad，美国
Life ViiA7荧光定量PCR仪：Life公司，美国
Nanodrop2.0：Thermo Fisher Scientific，美国
水浴箱：PolyScience公司，美国
电子天平：上海精密仪器有限公司
细胞培养箱：三洋公司，日本
实施例1敲除UTX基因的方法
1、小鼠饲养
C57BL/6J小鼠、UTX flox小鼠、Albcre工具小鼠均购自南京大学模式动物研究所。实验用小鼠饲养在SPF级动物房中，严格按照实验动物管理条例要求。环境符合12小时昼夜循环的生物节律，且自由摄食摄水。按1只雄鼠对2只雌鼠的方式配置繁殖笼，小鼠出生后7-14天脚趾编号，剪尾巴鉴定基因型；出生后21天分笼，雌雄分开饲养。以同年龄、同性别的野生型UTXf/f小鼠为对照组小鼠。
2、小鼠基因型鉴定
1)尾巴DNA抽提
A、剪取小鼠尾尖组织1-2cm，或小鼠脚趾；
B、加入300μl裂解液和5μl蛋白酶K(浓度20mg/ml)，55℃过夜至组织被完全消化；
C、加入600μl无水乙醇并混匀；
D、12,000rpm离心2min，移去液体；
E、加入600μl 70％乙醇洗涤，12,000rpm离心2min，移去液体；
F、在空气中凉干；
G、加入300μl灭菌蒸馏水溶解DNA，保存在4℃冰箱。
2)PCR法鉴定小鼠基因型
以提取的尾巴DNA为模板，采用Vazyme公司的Taq酶试剂，照下表，将试剂加入8联管，混匀并离心；
Figure BDA0002169082160000051
置于PE2400PCR仪中进行PCR扩增，PCR循环参数为：
Figure BDA0002169082160000061
引物序列如下：
Figure BDA0002169082160000062
取10μl PCR产物，1.0-2.0％琼脂糖/溴化乙锭凝胶电泳，以UVP凝胶密度扫描仪及其分析软件(UVP，Inc.)进行分析；
阳性可见相应大小目的条带。
3、将雌性小鼠UTXf/f小鼠(购自美国jackson实验室)与雄性albcre小鼠(购自美国jackson实验室)交配，采用步骤2的方法通过基因鉴定，得到UTXf/y；albcre雄性小鼠；进一步将这种雄性小鼠与UTXf/f雌性小鼠交配，获得UTXf/f；albcre雌性或UTXf/y；albcre雄性小鼠，再进行后续实验。鉴于UTX为X性染色体连锁基因，在雌性小鼠中含两个等位基因，雄性小鼠则仅有一个，因此本文研究中主要采用雌性UTXf/f；albcre敲除小鼠进行研究。小鼠的基因型通过PCR来鉴定(见图1A)；
敲除效率则分别通过qRT-PCR和Western blot方法来鉴定。
1)小鼠敲除效率qRT-PCR法鉴定：分别选取UTXf/f；albcre敲除小鼠及UTXf/f小鼠肝脏组织适量，采用Invitrogen公司的
Figure BDA0002169082160000063
试剂提取小鼠肝脏组织RNA；经过甲醛变性电泳检测RNA完整性，采用NanoDrop 2.0检测总RNA浓度后，用Promega公司的逆转录试剂盒进行逆转录，获取cDNA；进一步使用Invitrogen公司的定量试剂盒进行检测，结果示UTXf/f；albcre敲除小鼠的UTX mRNA表达水平低于对照组小鼠，敲除效率可达到60-70％(图1B)。
2)小鼠敲除效率Western blot法鉴定：分别选取UTXf/f；albcre敲除小鼠及UTXf/f小鼠肝脏组织适量，采用RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail收集肝脏组织样品，分别抽提总蛋白，采用Pierce公司BCA试剂盒测定蛋白浓度，进行Western blot检测。结果显示，UTX mRNA表达水平和蛋白水平结果相一致，UTX的敲除效率达到70％(图1C-D)，提示肝脏特异性UTX敲除小鼠已构建成功。
4、小鼠的血清收集与血液生化测定
1)小鼠准备：于实验前一天下午5点将小鼠换入干净的笼子禁食，禁食16小时，至次日上午9点操作。禁食期间，小鼠保持正常的饮水。
2)让小鼠适应30min之后，用毛细管通过小鼠的眼眶采血约500μl，将血液置于没有抗凝剂的1.5ml EP管，将血样放置于4℃冰箱，让其凝结2h。
3)将凝结后的血样在4℃冷冻离心机用4000g的速度离心15min。
将上清液(血清)转移到新的EP管中，进行后续实验。如需保存，则根据需要
4)将血清按合适体积分装，保存于-80℃冰箱。切忌反复冻融。
5)血液标本送至南京市妇幼保健院检验科，检测相关生化学指标。
UTXf/f；albcre小鼠血液生化指标结果参见表1，UTXf/f；albcre小鼠在空腹状态下血液胆固醇和甘油三酯水平显著升高，而血糖水平没有明显差异；其中胆固醇主要分为LDL-C与HDL-C，结果显示UTXf/f；albcre小鼠血液中LDL-C含量显著升高，HDL-C虽然也有一定程度升高，但用总胆固醇含量(Chol)或LDL-C校正后，比值均明显下降。
表1 UTXf/f；albcre肝脏敲除小鼠的血液生化指标(雌鼠)
Figure BDA0002169082160000071
Data are expressed as mean±SD，*p＜0.05，**p＜0.001
实施例2 UTX过表达腺病毒制备
1)抽提肝脏组织RNA及逆转录cDNA：选取C57BL/6J小鼠肝脏组织适量，采用Qiagen公司的
Figure BDA0002169082160000081
总RNA抽提试剂盒提取小鼠肝脏组织RNA；经过甲醛变性电泳检测RNA完整性，采用NanoDrop 2.0检测总RNA浓度后，用Vazyme公司的HiScript 1st Strand cDNASynthesis Kit逆转录试剂盒进行逆转录，获取模板cDNA。
2)PCR扩增UTX基因：根据NCBI GeneBank中UTX mRNA序列设计PCR引物，上游引物(含BamHI/NotI酶切位点及HA tag序列)：TAAGGATCCACCATGGCTTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCGAAATCCTGCGGAGTGTCGC；下游引物：TCGGCGGCCGCTTACTTTCTGAATAGCAGAAAAGGTC；以肝脏组织cDNA为模板，采用
Figure BDA0002169082160000082
Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme公司)进行PCR扩增，扩增产物经过PCR产物纯化，克隆转化至TOP10感受态细胞中，涂板于含LB的固体培养基，进一步挑选阳性菌，抽提质粒后送测序。测序成功后，将UTX基因克隆至pShuttle载体(购自上海泽叶生物)，限制性内切酶PmeI(购自NEB公司)线性化后，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1载体(购自上海泽叶生物)共转染至质粒重组宿主菌BJ5183菌中，筛选重组后的阳性质粒，命名为vAD-UTX，经测序鉴定后进一步扩增用于病毒包被。
3)UTX腺病毒包被：在37℃、5％CO2孵箱中，将AD-293细胞(本实验室保存)按7-8*105/ml密度均匀接种于6cm培养皿中，待细胞融合度达70％左右时，将线性化后的vAD-UTX质粒转染至AD-293细胞，继续培养7-10天后弃去细胞培养液上清，收集细胞悬液于EP管中，反复于甲醇冰浴与37℃水浴中冷冻/解冻，解冻后短暂震荡细胞以获取病毒。
实施例3 UTX过表达腺病毒感染HepG2细胞的过表达效率鉴定
1)将冻存的HepG2细胞(本实验室保存)复苏于含10％胎牛血清、50μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液中，置于37℃恒温的5％CO2培养箱中培养，待细胞状态良好，生长至细胞融合度约80％时，用含0.01％EDTA、0.25％胰蛋白酶的消化液消化，按照1∶3进行传代。
2)待细胞融合度约50％时，分别加入实施例2得到的腺病毒UTX及不含目的基因UTX的阴性对照病毒进行感染，培养48-72小时后，用RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail收集细胞样品，抽提总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，进行Western blot检测。
UTX在HepG2肝脏细胞中过表达效率进行检测。Western blot结果参见图2，与阴性病毒对照组相比，腺病毒感染组的外源性HA-UTX蛋白含量较高(含标签蛋白HA)，提示过表达腺病毒制备成功。
实施例4 UTX腺病毒感染HepG2细胞后甘油三脂检测
1)培养HepG2细胞，待融合度约50％时，分别加入实施例2得到的腺病毒UTX及对照病毒进行感染，培养24h后进行换液；
2)培养24h后，换成无血清的DMEM培养基继续培养24h促进细胞同步化，使绝大多数细胞处于G0期；
3)继续培养24h后，换成含30mmol/L葡萄糖的无糖DMEM培养液处理细胞24h；
4)收集细胞上清液在南京市妇幼保健院检验科自动生化分析以上检测细胞外甘油三酯含量。
在HepG2肝脏细胞中过表达UTX后，利用葡萄糖刺激24小时，而后收集细胞上清液，进行甘油三酯检测，结果参见图3，UTX过表达后可明显降低肝脏细胞脂质分泌，与对照组相比，降低可达50％左右。
实施例5 UTX基因过表达小鼠的表型
1、制备UTX基因过表达小鼠
给6周龄小鼠饲喂高脂饲料，以获得高脂血症和非酒精性脂肪肝病模型。2个月后，将纯化的pAdEasy-UTX腺病毒以每只小鼠1.5*108个单位的量通过尾静脉注射转导到小鼠体内，获得肝脏特异性过表达UTX基因的小鼠。注射三天后，所有小鼠均被处死，并收集肝脏作进一步分析。
2、UTX基因过表达小鼠的血清收集与血液生化测定
1)小鼠血清收集方法同实施例1-4。
2)UTX过表达小鼠血液生化指标结果见表2。UTX过表达小鼠血清中总胆固醇和甘油三酯水平显著降低，但血糖水平无显著差异；其中胆固醇主要由LDL-C和HDL-C组成，且结果显示UTX过表达小鼠中LDL-C含量下降到35％，而HDL-C含量上调1.5倍。进一步经总胆固醇含量(Chol)或LDL-C校正后，发现HDL-C含量的比值显著上升。
表2肝脏特异性过表达UTX基因小鼠的血液生化指标(雌鼠)
Figure BDA0002169082160000101
Data are expressed as mean±SD，n＝4，*p＜0.05，**p＜0.001
实施例6 UTX过表达对肝脏脂质含量的作用
1、H&E染色
UTX基因过表达小鼠被处死后，收集肝脏组织。切一小块肝脏，浸泡在4％多聚甲醛中。样品送至湖北武汉赛维尔生物公司进行苏木精和伊红染色检测脂质含量。
2、肝脏甘油三酯含量
处死UTX基因过表达小鼠后取肝脏组织，立即冷冻于液氮中，随后于-80℃保存，待后续分析。按重量(g)∶体积(ml)＝1∶9的比例加入PBS匀浆肝脏，收集细胞上清。在南京妇幼保健院实验室进行甘油三酯含量的自动生化分析。
UTX基因过表达小鼠肝脏的H&E染色和生化分析结果如图4所示。UTX过表达后，H&E染色显示肝组织脂滴数量和大小均明显减少(图4A)。与对照组相比，肝脏甘油三酯含量显著降低约50％(图4B)。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 南京市妇幼保健院
<120> UTX基因在制备预防或治疗血脂类疾病药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taaggatcca ccatggctta cccatacgat gttccagatt acgcttcgaa atcctgcgga 60
gtgtcgc 67
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcggcggccg cttactttct gaatagcaga aaaggtc 37

Claims (3)

1.UTX过表达腺病毒在制备预防或治疗血脂类疾病药物中的应用，其特征在于，所述UTX过表达腺病毒的制备方法，包括以下步骤：
1）cDNA的获得：抽提小鼠肝脏组织RNA及逆转录cDNA；
2）UTX基因的获得：以肝脏组织cDNA为模板PCR扩增UTX基因；
3）UTX腺病毒过表达载体的构建：将UTX基因克隆至pShuttle载体，限制性内切酶PmeI线性化后，与pAdEasy-1载体共转染至BJ5183菌中，筛选重组后的阳性质粒即得UTX腺病毒过表达载体；
4）将UTX腺病毒过表达载体转染至培养好的AD-293细胞中继续培养7-10天后弃去细胞培养液上清，收集细胞悬液于EP管中，反复于甲醇冰浴与水浴中冷冻/解冻，解冻后短暂震荡细胞以获取病毒。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤2）中PCR扩增上游引物序列如SEQID NO：1所示， 所述下游引物如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤4）中所述培养好的AD-293细胞为在37°C、5%CO2孵箱中按7-8×105/ml密度均匀接种于培养皿中，待细胞融合度达70-80%的AD-293细胞。
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