CN108004310B - 肾素(原)受体(p)rr基因及其抑制剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开肾素(原)受体[(pro)renin receptor,(P)RR]抑制剂在非酒精性脂肪肝和肥胖疾病中的功能和应用。以C57小鼠背景下的，(P)RR受体肝脏特异性敲除/敲降小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型，结果表明肝脏(P)RR受体敲除小鼠体型明显较瘦，且体内脂肪组织显著减少，而且在给予高脂饮食后，该种小鼠的体重增加幅度不大，不发生肥胖，血糖不高，油红染色及肝脏脂质测定等结果均说明肝脏肾素(原)受体敲除小鼠肝功能显著优于对照肥胖小鼠，小鼠脂肪肝病变明显改善，脂质蓄积显著减少，血糖降低。因此，(P)RR可作为筛选治疗II型糖尿病、非酒精性脂肪肝和肥胖的药物靶标，其抑制剂可用于制备治疗II型糖尿病、非酒精性脂肪肝和肥胖的药物。

Description

肾素(原)受体(P)RR基因及其抑制剂的应用
技术领域
本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种肾素(原)受体(P)RR基因及其抑制剂作为靶基因在制备预防、缓解和/或治疗II型糖尿病、非酒精性脂肪肝和肥胖病的药物中应用。
背景技术
随着我国居民饮食结构的西化以及多坐少动生活方式的流行，使得包括肥胖和糖尿病在内的代谢综合症的患者大幅增加。据最新的流行病学调查统计，我国2型糖尿病的发病率高达11.6％，超重和肥胖患病率高达23％,各种脂代谢紊乱疾病发病率高达12％。这类代谢综合征的多发，也直接导致我国非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发病率大幅增加。这表明非酒精性脂肪肝和肥胖症不仅是世界范围内的健康杀手，也已经成为影响我国居民健康的重要疾病。
肥胖症，是一种多因素引起的慢性代谢性疾病，以体内脂肪细胞的体积和细胞数增加致体脂占体重的百分比异常增高并在某些局部过多沉积脂肪为特点。已有研究表明超重和肥胖是心血管疾病、糖尿病、某些癌症及炎症代谢类疾病的重要危险因素。非酒精性脂肪肝是一种以肝细胞弥漫性脂肪变性为主的疾病，它与多种因素有关如肥胖、胰岛素抵抗等，主要包括单纯非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)及其进展的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)。NASH表现为肝脏炎症及细胞气球样变；随着NASH的进展，肝脏纤维化可能继续加重，并最终进展为肝硬化并出现相关并发症，如门静脉高压和肝癌等。肥胖、高血压、高脂血症和2型糖尿病在内的一系列代谢异常疾病，都是引起NAFLD和NASH的主要原因，其中，肥胖是非酒精性脂肪肝最常见的危险因素。
减肥是肥胖症和非酒精性脂肪肝的主治疗方式，患者通过改变生活方式，平衡膳食和适当的体育锻炼还有药物和手术治疗。对于改变生活方式和饮食锻炼治疗而言，患者从医性差，使治疗大都以失败告终。同时，不得不面对的事实是：至今为止，仍然没有治疗肥胖和脂肪肝的特异性药物。只有少数药物处于临床试验阶段。另有些将药物研究的靶点放在不同的通路以治疗肥胖和脂肪肝，比如代谢因子，炎症，氧化应激和肝脏纤维化。目前药物治疗的主要缺点是，易产生较多副作用，且治疗效果不显著。例如治疗肥胖的Beloranlb等药物出现血栓栓塞死亡事件，维他命E药物治疗脂肪肝因缺少标准化可能造成患者死亡。手术治疗缺点是患者恢复慢，易反弹，且手术风险较大。
肾素(原)[(pro)renin receptor,(P)RR]受体是由ATP6AP2基因编码，一种由350个氨基酸组成的跨膜蛋白。由于最初被发现N端结构的(P)RR受体可结合肾素和前肾素而得名。目前已有研究发现(P)RR具有多重身份：ATP酶、质子泵载体、溶酶体辅助蛋白2、内质网I型跨膜接头前体，在心血管疾病，肾脏疾病，细胞增殖分化、炎症及代谢性疾病中扮演着重要作用。同时，(P)RR在糖尿病和动脉粥样硬化等多种糖脂代谢异常疾病中有重要作用,前期研究中我们发现(P)RR可调节脂代谢相关蛋白，但关于(P)RR对脂肪生成及其在肥胖和脂肪肝中的作用仍不清楚,
因此，研究(P)RR，解决(P)RR基因表达与肥胖、非酒精性脂肪肝之间的具体作用关系，提供一种治疗肥胖、脂肪肝的治疗方案成为可能。
发明内容
为解决上述问题，本发明在对(P)RR基因的表达与肥胖、脂肪肝之间的相互作用关系进行研究的基础上，提供一类可用于治疗肥胖、非酒精性脂肪肝和/或II型糖尿病的靶基因抑制剂和用于治疗肥胖、脂肪肝的治疗方案。
本发明以C57小鼠实验对象，采取敲除和敲降两种实验方法。其中，敲除方法中对照组为C57小鼠，实验组为由Alb-cre+/+小鼠和(P)RRFlox/WT小鼠杂交并经基因型鉴定得到的肝脏特异性敲除(P)RR C57小鼠。敲降方法中对照组为尾静脉注射PBS和乱序序列的普通C57小鼠，实验组为尾静脉注射肝脏特异性的(P)RR反义寡核苷酸药物的普通C57小鼠。通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型，研究肝脏(P)RR基因的功能。结果发现与对照组相比，实验组肝脏特异性敲除或敲降(P)RR小鼠耗氧量增加，体重明显减轻，体内脂肪含量减少。进一步观察肝脏变化，发现肝脏质量减轻，脂质含量减少。并且实验组肝脏特异性敲除或敲降(P)RR小鼠空腹血糖降低，通过糖耐量实验检测，实验组肝脏特异性敲除或敲降(P)RR小鼠对葡萄糖耐受能力明显改善。这表明肝脏特异性敲除或敲降(P)RR基因会减缓小鼠肥胖，非酒精性脂肪肝及II型糖尿病的发生。
根据本发明的一个方面，提供(P)RR基因作为药物靶标在筛选用于治疗肥胖、非酒精性脂肪肝和/或II型糖尿病的药物中的应用。
根据本发明的另一个方面，提供(P)RR基因在制备用于治疗肥胖、非酒精性脂肪肝和/或II型糖尿病的药物中的应用。
根据本发明的另一个方面，提供能够降低(P)RR基因表达的试剂在制备用于治疗肥胖、非酒精性脂肪肝和/或II型糖尿病的药物中的应用。
在一些实施方案中，降低(P)RR基因表达的试剂是特异性结合(P)RR基因的蛋白；特异性干扰(P)RR基因表达或加工的干扰分子；能够表达所述干扰分子的表达载体；或者用于特异性敲除(P)RR基因的试剂。
在一些实施方案中，所述特异性干扰(P)RR基因表达或加工的干扰分子是dsRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子或反义寡核苷酸。
根据本发明的另一个方面，提供筛选用于治疗肥胖、非酒精性脂肪肝和/或II型糖尿病的药物的方法，包括如下步骤：
(1)用候选药物处理表达(P)RR基因的细胞；
(2)检测细胞中(P)RR基因的表达水平；
(3)如果候选药物使细胞中(P)RR基因表达降低，则该候选药物是用于治疗肥胖、非酒精性脂肪肝和/或II型糖尿病的潜在药物。
根据本发明的另一个方面，提供用于治疗肥胖、非酒精性脂肪肝和/或II型糖尿病的药物组合物，其包含降低(P)RR基因表达的试剂。
在一些实施方案中，降低(P)RR基因表达的试剂是特异性结合(P)RR基因的蛋白；特异性干扰(P)RR基因表达或加工的干扰分子；能够表达所述干扰分子的表达载体；或者用于特异性敲除(P)RR基因的试剂。
在一些实施方案中，所述特异性干扰(P)RR基因表达或加工的干扰分子是dsRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子或反义寡核苷酸。
附图说明：
图1是对照组和实验组肝脏特异性敲除(P)RR小鼠的体重和脂肪肌肉含量结果：其中，对照组小鼠为(P)RRWT/YAlb-cre+/0，肝脏特异性敲除的实验组小鼠为(P)RRFlox/YAlb-cre+/0。A为小鼠体重统计结果；B为小鼠对比图；C为小鼠4种脂肪组织采样结果：腹股沟脂肪、性腺脂肪、棕色脂肪和腹膜后脂肪图片，其中1为对照组小鼠组织，2为实验组小鼠组织；D为4种脂肪组织的重量统计结果；E,F分别为体脂仪检测的肥肉和瘦肉组织的重量；H为小鼠耗氧量比较图((*:p<0.05,**:p<0.01)。
图2是对照组和实验组肝脏特异性敲除(P)RR小鼠血糖和肝脏相关指标：其中，对照组小鼠为(P)RRWT/YAlb-cre+/0，肝脏特异性敲除的实验组小鼠为(P)RRFlox/YAlb-cre+/0。A为小鼠空腹血糖结果；B为小鼠腹腔葡萄糖耐量试验结果(IPGTT)；C为小鼠肝脏采样及油红O染色结果；B为小鼠肝脏重量统计结果。
图3是对照组小鼠为(P)RRWT/YAlb-cre+/0，肝脏特异性敲除的实验组小鼠为
(P)RRFlox/YAlb-cre+/0的基因鉴定结果。其中，A表明实验组小鼠同时有Flox和Cre基因片段；B为特异性敲除鉴定结果，表明肝脏特异性敲除了(P)RR片段。
图4是空白对照组PBS、乱序对照组G-Control小鼠和实验组肝脏特异性敲降(P)RRG-(P)RR小鼠的肝脏(P)RR蛋白表达鉴定结果。其中空白对照组为尾静脉注射PBS，乱序对照组为尾静脉注射肝脏特异性乱序序列，实验组为尾静脉注射肝脏特异性(P)RR敲降反义寡核苷酸序列。
图5是空白对照组PBS、乱序对照组G-Control小鼠和实验组肝脏特异性敲降(P)RRG-(P)RR小鼠的体重，脂肪和肌肉含量结果。其中空白对照组为尾静脉注射PBS，乱序对照组为尾静脉注射肝脏特异性乱序序列，实验组为尾静脉注射肝脏特异性(P)RR敲降反义寡核苷酸序列。A为小鼠体重结果；B为小鼠图片；C为小鼠4种脂肪组织的重量统计结果；D为小鼠四种脂肪组织采样图，其中1为棕色脂肪，2为腹股沟脂肪，3为性腺脂肪，4为腹膜后脂肪；E,F分别为体脂仪检测的肥肉和瘦肉组织的重量；G为肥肉与瘦肉的比例；H为小鼠耗氧量比较图(*:p<0.05,**:p<0.01)。
图6是空白对照组PBS、乱序对照组G-Control小鼠和实验组肝脏特异性敲降(P)RRG-(P)RR小鼠血糖调节和肝脏相关指标结果。其中空白对照组为尾静脉注射PBS，乱序对照组为尾静脉注射肝脏特异性乱序序列，实验组为尾静脉注射肝脏特异性(P)RR敲降反义寡核苷酸序列。A为小鼠空腹血糖对比结果；B为小鼠腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)；C为小鼠肝脏采样及油红O染色结果；D为小鼠肝脏重量统计结果。
具体实施方案
本发明人发现实验小鼠在肝脏特异性敲除或敲降(P)RR基因后，小鼠耗氧量增加，体重明显减轻，体内脂肪含量减少。进一步观察肝脏变化，发现肝脏质量减轻，脂质含量减少。并且肝脏特异性敲除或敲降(P)RR小鼠空腹血糖降低。这表明肝脏特异性敲除或敲降(P)RR基因会减缓小鼠肥胖，脂肪肝及II型糖尿病的发生。
本发明所述的(P)RR基因是指肾素(原)受体[(pro)renin receptor,(P)RR]的编码基因。在NCBI GENBANK中它被称为ATP6AP2。人、小鼠、大鼠、斑马鱼、狗、牛等动物中都具有(P)RR基因，其中人的(P)RR基因的NCBI GENBANK ID为10159，小鼠的NCBI GENBANK ID为70495。
(P)RR基因可以作为药物的作用靶标应用于制备治疗肥胖，脂肪肝及II型糖尿病的药物。具体而言，在制备治疗肥胖，脂肪肝及II型糖尿病的药物的过程中，可以以(P)RR基因作为药物的作用靶标，来研制针对这些疾病的药物，所述药物能够降低或抑制细胞内(特别是但不限于肝细胞内)(P)RR基因的表达，并由此抑制肾素(原)受体蛋白，从而获得治疗肥胖，脂肪肝及II型糖尿病的效果。
(P)RR基因还可以作为药物的作用靶标应用于筛选治疗肥胖，脂肪肝及II型糖尿病的药物。具体而言，将(P)RR基因作为药物的作用靶标，对众多候选药物进行筛选，找到能够降低或抑制细胞内(特别是但不限于肝细胞内)(P)RR基因的表达，并由此抑制肾素(原)受体蛋白的药物，作为治疗肥胖，脂肪肝及II型糖尿病的药物。
因此，本发明还提供用于治疗肥胖，脂肪肝及II型糖尿病的药物组合物，所述药物组合物包含能够降低或抑制(P)RR基因表达的试剂作为活性成分。
本发明所述的能够降低或抑制(P)RR基因表达的试剂或药物，应当能够降低或抑制细胞内(特别是但不限于肝细胞内)(P)RR基因的表达，并由此对肾素(原)受体蛋白产生抑制作用，例如降低或抑制肾素(原)受体蛋白的表达，例如使肾素(原)受体蛋白的表达量减少甚至使肾素(原)受体蛋白不表达。
本发明所说的降低或抑制(P)RR基因表达或肾素(原)受体蛋白的表达可以被理解为所述基因或蛋白的表达水平与未被降低或未受到抑制时相比有所降低，例如表达水平降低至未被降低或未受到抑制时的约90％-0％，例如约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30、约20％、约10％、约5％。其中降低至未被降低或未受到抑制时的0％是指(P)RR基因表达或肾素(原)受体蛋白的表达不能被检测到。
对于本领域技术人员来说，可以容易地利用本领域已知的各种方法检测(P)RR基因的表达。检测(P)RR基因表达水平的方法包括逆转录聚合酶链式反应(ReverseTranscription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)、印迹杂交(Northern blot)、c脱氧核糖核酸微阵列混合反应及原位(in situ)混合反应等方法，但不限于此。
检测肾素(原)受体蛋白的表达的方法也是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于Western Blot等。
所述降低或抑制细胞内(P)RR基因的表达包括干扰或抑制细胞内(P)RR基因的表达，例如使细胞内(P)RR基因的表达水平降低或使细胞内(P)RR基因不表达。例如，可以通过(P)RR基因敲除实现干扰或抑制(P)RR基因的表达，(P)RR基因敲除包括敲除部分或全部(P)RR基因，例如但不限于敲除(P)RR基因的外显子2，其最终结果是导致(P)RR基因表达水平降低或不表达。基因敲除可以通过本领域已知的基因敲除方法实现，例如CRISPR/Cas9系统。还可以通过双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、miRNA或反义寡核苷酸实现干扰或抑制(P)RR基因的表达，还可以使用能够表达dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA的表达载体实现干扰或抑制(P)RR基因的表达。所使用的表达载体例如可以是质粒或病毒载体，例如但不限于慢病毒载体或腺病毒载体。
本领域技术人员显然知道如何确定细胞中(P)RR基因的表达是否降低，例如可以在用药物或试剂处理细胞之前检测细胞中(P)RR基因的表达，在用药物或试剂处理细胞一段时间后检测细胞中(P)RR基因的表达，如果药物或试剂处理后(P)RR基因的表达相对于药物或试剂处理前细胞中(P)RR基因的表达显著降低，则说明该药物或试剂能够降低细胞内(P)RR基因的表达。还可以使用对照细胞，通常可以将细胞分成对照组和实验组，实验组细胞用药物或试剂处理，对照组细胞未经任何试剂处理，或者经安慰剂处理，然后检测实验组细胞中(P)RR基因的表达和对照组细胞中(P)RR基因的表达，如果实验组细胞中(P)RR基因的表达相对于对照组细胞中(P)RR基因的表达显著降低，则说明该药物或试剂能够降低细胞内(P)RR基因的表达。可以使用本领域已知的任何方法判断“显著降低”，例如但不限于统计学方法。其中细胞优选为肝细胞。
能够降低(P)RR基因表达的药物或试剂包括但不限于：特异性结合(P)RR基因的蛋白；特异性干扰(P)RR基因表达或加工的干扰分子，例如dsRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子、反义寡核苷酸等；能够表达dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA或反义寡核苷酸的表达载体，例如但不限于质粒或病毒载体等；用于特异性敲除或敲低细胞内(P)RR基因的试剂，例如但不限于CRISPR/Cas9系统等。
本文所述的“反义寡核苷酸”是指短序列的核苷酸。反义寡核苷酸在一定的杂交条件下能够与目的基因的转录产物(例如mRNA)的序列杂交。反义寡核苷酸通过碱基互补(A-T，A-U和G-C)配对与双链DNA形成三链(反基因)，或与单链RNA形成杂交双链(反义)，从而阻断基因的复制、转录或转录后mRNA的加工和翻译。同时，双链RNA能被细胞内的核糖核酸酶H(RNase H)所降解，从而更有效地阻断靶基因的表达。反义寡核苷酸可以是单链或双链的，特别是单链的。反义寡核苷酸可以是DNA或RNA。反义寡核苷酸可以是人工合成的。
本发明的反义寡核苷酸可以是反义DNA、或反义RNA、或者反义DNA和反义RNA的混合物。
本发明的反义寡核苷酸还可以被进一步化学修饰。
能够降低(P)RR基因表达的药物或试剂可以通过本领域已知的多种技术被输送到细胞内，包括但不限于口服、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。其中细胞优选为肝细胞。
用于治疗肥胖，脂肪肝及II型糖尿病的药物可以是药物组合物。所述药物组合物可以包含降低或抑制(P)RR基因表达的试剂作为活性成分，还可以进一步包含药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、稀释剂、湿润剂、乳化剂、防腐剂和/或甜味剂等，例如糖、葡萄糖、庶糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、生理盐水、甘油、聚乙二醇、乙醇、植物油等。
药物组合物应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备，还可以被制备成片剂、胶囊等，它们可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
此外，本发明的药物可单独直接用于疾病治疗，还可与其他治疗剂联用。
本发明的上述方法可以是非诊断目的的和非治疗目的的。
本发明的上述方法可以是在体外进行的。
实施例一
1、获得对照组小鼠和实验组小鼠并进行基因型鉴定
实验小鼠使用C57小鼠。Alb-cre+/+雄性小鼠购自南京模式动物，该小鼠在肝脏特异性表达Cre重组酶。(P)RRFlox/WT雌性小鼠购自南京模式动物，该小鼠是在(P)RR基因的外显子2两端具有loxP位点的转基因小鼠，其中(P)RR基因的外显子2连同其两端的loxP位点在本发明中被称为Flox片段或(P)RR flox。(P)RRFlox/WT小鼠的制备过程包括构建含有(P)RR flox的表达载体，转染小鼠胚胎干细胞，进行同源重组，筛选出表达(P)RR flox的细胞，将该细胞显微注射到小鼠早期胚胎中，将这种胚胎移植进入假孕鼠体内，通过分娩得到表达(P)RR flox的转基因小鼠，即为(P)RRFlox/WT小鼠。
用Alb-cre+/+雄性小鼠和(P)RRFlox/WT雌性小鼠杂交并经基因型鉴定，获得(P)RRWT/ YAlb-cre+/0对照组小鼠和(P)RRFlox/YAlb-cre+/0实验组小鼠，在肝脏基因中没有Flox片段(即没有loxP位点)的普通小鼠为(P)RRWT/YAlb-cre+/0对照组小鼠，由肝脏特异性Cre酶识别(P)RR flox并剪切后实现肝脏特异性敲除(P)RR的小鼠为(P)RRFlox/YAlb-cre+/0实验组小鼠。
进行基因型鉴定时，剪小于0.5cm的鼠尾到对应的管中，用Bimake公司的鼠尾直接PCR试剂盒(快速基因型鉴定)进行实验操作，将样本置于95℃水浴/金属浴中孵育5min以灭活消化液中的蛋白酶活性，12000rpm离心5分钟，取上清对包含5'端loxP位点的序列和Cre片段进行PCR，以鉴定是否存在Flox片段和Cre基因。
其中扩增包含5'端loxP位点的序列的引物序列为：
上游引物：5’-AGCACTCTCTTCCAGGTATGTTGTG-3’；
下游引物：5’-CTGGATCCCGGAGCATGGGTAAAGG-‘3。
如果基因中含有loxP位点，扩增产物应为330bp，如果基因中不含有loxP位点，扩增产物应为280bp。
扩增Cre基因的引物序列为：
上游引物：5’-GCTGCCACGACCAAGTG-3’；
下游引物：5’-TCGCCATCTTCCAGCAG-3’。
如果基因中存在Cre基因，则扩增产物应为720bp。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3A所示，电泳图中包括对照组的三个重复样品和实验组的三个重复样品，结果表明，实验组小鼠同时有Flox片段和Cre基因片段，对照组小鼠仅有Cre基因片段，没有Flox片段。
进行肝脏特异性敲除鉴定时，断颈处死小鼠，完整取下小鼠的心、肝、脾、肺、肾、小肠和肌肉，用Takara公司的PCR试剂盒进行实验操作，12000rpm离心5分钟，取上清对进行(P)RR flox进行PCR，所使用引物分别位于5'loxP的上游和3'loxP位点的下游，其中
上游引物是5’-AGCACTCTCTTCCAGGTATGTTGTG-3’；
下游引物是5’-GCCCCTCTCTTACAGTTCTATCAGT-3’。
如果(P)RR的外显子2未被敲除，则扩增产物应为2000bp，如果(P)RR的外显子2被敲除，则扩增产物应为326bp。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
鉴定结果如图3B所示，表明肝脏特异性地敲除了(P)RR的外显子2。
2、通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型，研究肝脏(P)RR基因的功能
对照组和实验组小鼠性别均为雄性，8周龄。实验动物高脂肪饲料为(42％脂肪,0.2％胆固醇,购自Harlan Teklad)。动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在SPF级动物房，间隔12小时交替照明，温度24±2度，湿度为40％-70％，小鼠自由饮水进食。同窝对照组小鼠和实验组小鼠给予高脂饲料喂养12周后进行各项指标的检测。
1)小鼠体重及组织重量检测：体重检测，小鼠从第0周开始每周检测小鼠体重；脂肪重量检测，高脂饲料喂养12周后，断颈处死小鼠，完整取下小鼠腹股沟脂肪，腹膜后脂肪，附睾脂肪，肩甲脂肪及肝脏组织，万分天平称取各组织重量。
2)小鼠体脂检测：高脂喂养12周后，用小鼠体脂仪Echo MRI(Echo MedicalSystems,Houston,TX,USA)，检测小鼠脂肪量和瘦肉量，并计算各自占体重的比例。
3)小鼠耗氧量检测：高脂喂养12周后，每组随机挑选4只小鼠放入单独的代谢笼(Oxylet,Panlab)中，小鼠适应性喂养24小时，48小时后记录每只小鼠氧消耗。
4)血糖水平检测：
空腹血糖检测：第0周和第12周，小鼠禁食(上午8：00至下午2点)不禁水，即禁食6小时，剪刀剪断小鼠尾巴尖端，无菌棉球擦掉第一滴血，将第二滴血滴到血糖试纸(Roche)进行血糖检测。
5)小鼠糖耐量试验：
第12周，小鼠禁食(下午6：00至第二天10：00)不禁水，即禁食16小时，尾尖取血检测0点血糖，注射葡萄糖2g/kg体重，并在注射后第15，30，60，120分钟尾尖取血检测血糖。
6)小鼠肝脏油红O染色
取小鼠肝脏，4％PFA固定过夜，OCT液氮速冻，冰冻切片机进行切片，将切片PBS洗3遍，60％异丙醇处理5分钟，0.3％油红O染色10分钟，0％异丙醇处理2分钟，用水清洗一次，苏木精染细胞核3分钟，PBS洗3次，glycerol gelatin封片剂封片，拍照。
3、结果
小鼠体重结果见图1所示，经高脂饲料喂养12周，实验组小鼠与对照组比较体重增加显著减缓(图1A,1B)。12周后Echo-MRI检测实验组小鼠脂肪含量大幅减少(图1F-G)，解剖脂肪组织称重3种白色脂肪组织明显少于对照组(图1C,1D)，耗氧量显著增高(图1H)。实验组小鼠空腹血糖低于对照组，并且糖耐量得到明显改善(图2A,2B)。解剖小鼠肝脏，实验组小鼠肝脏明显小于对照组，重量明显减轻，同时肝脏切片经油红染色检测肝脏中性脂肪含量比对照组显著减少(图2C,2D)。这些结果说明抑制(P)RR表达可抑制小鼠肥胖，改善糖代谢，阻止脂肪肝的形成。
上述结果显示(P)RR敲除鼠在高脂饲喂的诱导下肥胖发展得到抑制，糖耐量得到改善，抑制脂肪肝的形成。这些结果表明(P)RR基因敲除对改善肥胖和脂肪肝具有显著作用。
实施例二
1、通过尾静脉注射(P)RR肝脏特异性反义寡核苷酸抑制(P)RR表达(即敲降)
以普通C57小鼠为实验对象，空白对照组小鼠尾静脉注射PBS，乱序对照组小鼠尾静脉注射肝脏特异性乱序序列，实验组小鼠尾部静脉注射(P)RR肝脏特异性反义寡核苷酸药物，每周注射一次，对照组和实验组的注射量均为3mg/kg/week。
其中，肝脏特异性乱序序列为：5'-GGCCAATACGCCGTCA-3'；(P)RR肝脏特异性反义寡核苷酸的序列为：5'-AGATATTGGTCCATTT-3'。
2、通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型，研究肝脏(P)RR基因的功能。
三组小鼠性别均为雄性，8周龄。实验动物高脂肪饲料为(42％脂肪,0.2％胆固醇,购自Harlan Teklad)。动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在SPF级动物房，间隔12小时交替照明，温度24±2度，湿度为40％-70％，小鼠自由饮水进食。注射同时开始高脂饲料喂养，14周后进行蛋白表达测定(即实验动物敲降效率测定)和各项指标测定。
1)实验动物敲降效率鉴定:断颈处死小鼠，取小鼠肝脏样品加入蛋白裂解液中。蛋白裂解液中的样品加入钢珠研磨后，12000rpm离心10分钟，取上清BCA法蛋白浓度定量后，进行Western Blot检测该样品中(P)RR蛋白表达量。
2)小鼠体重及组织重量检测：体重检测，小鼠从第0周开始每周检测小鼠体重；脂肪重量检测，高脂饲料喂养14周后，断颈处死小鼠，完整取下小鼠腹股沟脂肪，腹膜后脂肪，附睾脂肪，肩甲脂肪及肝脏组织，万分天平称取各组织重量。
3)小鼠体脂检测：高脂喂养14周后，用小鼠体脂仪Echo MRI(Echo MedicalSystems,Houston,TX,USA)，检测小鼠脂肪量和瘦肉量，并计算各自占体重的比例。
4)小鼠耗氧量检测：高脂喂养14周后，每组随机挑选四只小鼠放入单独的代谢笼(Oxylet,Panlab)中，小鼠适应性喂养24小时，48小时后记录每只小鼠氧消耗。
5)血糖水平检测：
空腹血糖检测：第0周和第14周，小鼠禁食(上午8：00至下午2点)不禁水，即禁食6小时，剪刀剪断小鼠尾巴尖端，无菌棉球擦掉第一滴血，将第二滴血滴到血糖试纸(Roche)进行血糖检测。
6)小鼠糖耐量试验：
第14周，小鼠禁食(下午6：00至第二天10：00)不禁水，即禁食16小时，尾尖取血检测0点血糖，注射葡萄糖2g/kg体重，并在注射后第15，30，60，120分钟尾尖取血检测血糖。
7)小鼠肝脏油红O染色
取小鼠肝脏，4％PFA固定过夜，OCT液氮速冻，冰冻切片机进行切片，将切片PBS洗3遍，60％异丙醇处理5分钟，0.3％油红O染色10分钟，0％异丙醇处理2分钟，用水清洗一次，苏木精染细胞核3分钟，PBS洗3次，glycerol gelatin封片剂封片，拍照。
小鼠肝脏特异性敲降结果见图4，表明(P)RR肝脏特异性反义寡核苷酸药物能够抑制(P)RR的表达。体重结果见图5所示，经高脂饲料喂养12周，实验组组小鼠与空白对照组和乱序对照组相比体重增加显著减缓(图5A,5B)。14周后Echo-MRI检测实验组小鼠脂肪含量大幅减少(图5F-G)，解剖脂肪组织称重4种脂肪组织明显少于空白对照组和乱序对照组(图5C,5D)，同时实验组小鼠氧气消耗显著增加(图5H)。实验组小鼠空腹血糖低于空白对照组和乱序对照组，并且糖耐量得到明显改善(图6A,6B)。解剖小鼠肝脏，实验组小鼠肝脏明显小于空白对照组和乱序对照组，重量明显减轻，同时肝脏切片经油红染色检测肝脏中性脂肪含量比空白对照组和乱序对照组显著减少(图6C,6D)。这些结果说明抑制(P)RR表达可抑制小鼠肥胖，改善糖代谢，阻止脂肪肝的形成。
综上，通过对肝脏特异性敲除或敲降试验结果，表明抑制(P)RR表达可以抑制小鼠肥胖，同时改善肝脏脂质积累，阻止脂肪肝的形成，同时还能改善糖代谢。本发明结果说明抑制(P)RR基因在肥胖和脂肪肝疾病模型中有着重要的保护作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.肝脏特异性降低(P)RR基因表达的试剂在制备用于预防肥胖和/或非酒精性脂肪肝的药物中的应用。
2.权利要求1的应用，其中降低(P)RR基因表达的试剂是特异性干扰(P)RR基因表达或加工的干扰分子；能够表达所述干扰分子的表达载体；或者用于特异性敲除(P)RR基因的试剂。
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