CN115300628A - Na/K-ATPaseα3在治疗肥胖及相关疾病中的应用 - Google Patents

Na/K-ATPaseα3在治疗肥胖及相关疾病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了Na/K‑ATPaseα3在治疗肥胖及相关疾病中的应用。具体地，本发明提供了一种Na/K‑ATPaseα3抑制剂的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病。本发明首次发现，Na/K‑ATPase的α3是一个新的减肥靶点，并且通过实验证明了干预这个靶点能很好的抵抗肥胖。

Description

Na/K-ATPaseα3在治疗肥胖及相关疾病中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域。更具体地，本发明涉及Na/K-ATPaseα3在治疗肥胖及相关疾病中的应用。
背景技术
肥胖，癌症，心血管疾病，神经退行性疾病等慢性疾病是现代人类社会的主要健康威胁，严重影响人体的健康和生活质量，同时也给社会带来巨大的经济压力。肥胖同时有心血管疾病，糖尿病，高血压等并发症。所以降低体重的药物治疗对于肥胖本身和肥胖相关的伴随症都是有利的，但是过去的几十年我们见证了太多的药物由于严重的毒副作用而被迫下市，比如导致肺动脉高压、心血管系统毒性、神经及精神问题。到现在为止，选择安全有效的治疗肥胖的药物依然面临严峻挑战。
Na/K-ATPase最早于1957年由丹麦科学家Jens Christian Skou发现，并获得了1997的诺贝尔奖。Na/K-ATPase是一个泛在表达的膜上Na+和K+转运蛋白，对建立维持细胞膜内外Na+和K+的浓度梯度和维持渗透压方面发挥着关键作用。Na/K-ATPase主要由α和β两个亚基组成，其中α亚基是大亚基和催化反应亚基，也是小分子化合物干预结合的靶点，β亚基是小亚基，主要发挥调节功能。α亚基包括4种亚型(Na/K-ATPase，α2，α3和α4)，其中α1是泛在表达在各种组织和细胞，α2在心脏，肌肉等中表达，α3只表达在神经元，α4主要表达在睾丸。强心苷(Cardiac glycosides,CGs)是一大类结合 Na/K-ATPase大亚基的天然化合物，其中部分如地高辛，洋地黄毒苷已经长期被使用作为心衰和心律失常的治药物，主要机制是抑制心脏中Na/K-ATPase的α2亚基。α3亚基已有的功能报道与一些神经系统疾病如快发病性肌张力障碍- 帕金森病，癫痫等相关。除了离子泵的功能，最近的一系列研究还发现发现 Na/K-ATPase的非离子泵的功能-即信号传导功能，主要是α1介导的这个信号功能。
因此，本领域迫切需要开发一种治疗肥胖及相关伴随疾病的新的强效的靶点。
发明内容
本发明的目的就是提供一种治疗肥胖及相关伴随疾病的新的强效的靶点。
本发明第一方面提供了一种Na/K-ATPaseα3抑制剂的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病。
在另一优选例中，所述肥胖指BMI大于30。
在另一优选例中，所述肥胖及其相关疾病选自下组：肥胖、糖尿病、脂肪肝、高血压、动脉粥样硬化、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途： (i)减少哺乳动物的体重和体脂，增强肥胖个体的代谢稳态；
(ii)缓解或治疗脂肪肝、葡萄糖耐受与胰岛素耐受等肥胖相关不良指标；
(iii)激活白色脂肪组织的p-HSL，促进脂肪分解；
(iv)降低哺乳动物进食量。
在另一优选例中，所述Na/K-ATPaseα3抑制剂包括用如下方式抑制或降低Na/K-ATPaseα3表达或活性的物质：
(1)在基因组水平上对ATP1A3基因的敲除，敲低或编辑；
(2)在mRNA水平上对基因ATP1A3的mRNA的量的敲低；
(3)在蛋白水平上对Na/K-ATPaseα3蛋白量的降解或降低；
(4)在蛋白水平上对Na/K-ATPaseα3的酶活性的抑制。
在另一优选例中，所述Na/K-ATPaseα3抑制剂结合或突变Na/K-ATPase 的α3亚基的T807和F793位点，抑制Na/K-ATPaseα3的酶活性。
在另一优选例中，所述突变包括将Na/K-ATPase的α3亚基的T807和F793 位点分别突变为T807C和F793C。
在另一优选例中，所述Na/K-ATPaseα3抑制剂不通过NUCB2预防和/ 或治疗肥胖及其相关疾病。
在另一优选例中，所述Na/K-ATPaseα3抑制剂选自下组：小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、核酸适配体、Crispr试剂、蛋白质降解靶向嵌合体技术(PROTAC)或其组合。
在另一优选例中，所述小分子化合物包括HLY72及其衍生物、强心甾类 Na/K-ATP酶抑制剂、非甾类Na/K-ATP酶抑制剂。
在另一优选例中，所述强心甾类化合物选自下组：洋地黄毒苷、夹竹桃苷、地高辛及其衍生物、或其组合。
在另一优选例中，所述HLY72及其衍生物如中国专利申请CN2019104076229中所述。
在另一优选例中，所述哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人。
另一优选例中，所述哺乳动物包括正常的哺乳动物和患有肥胖或其相关疾病的哺乳动物。
在另一优选例中，所述Na/K-ATPaseα3抑制剂靶向脑组织。
在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物、食品组合物、膳食组合物或保健品组合物。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂还包括选自下组的额外组分：其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病药物。
在另一优选例中，所述其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物选自下组：苯丁胺(phentermine)、奥利司他(orlistat)、氯卡色林 (Lorcaserin)、利拉鲁肽(Liraglutide)、托吡酯(Topiramate)、苄非他明(Benzphetamine)、苯二甲吗啉(Phendimetrazine)、二乙氨苯丙酮 (diethylpropion)、纳曲酮(naltrexone)、丁氨苯丙酮(bupropion)、贝洛拉尼(Beloranib)、西替利司他(Cetil istat)、特索芬辛(Tesofensine)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、美曲普汀(Metreleptin)、多肽YY(PYY)、达伐林肽(Daval intide)、大麻素受体阻断剂(SR141716,AM251,AM6545)、韦利贝特(Velneperit)、塞特黑肽(Setmelanotide)、或其组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物含有(i)Na/K-ATPaseα3抑制剂；以及(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述组分(i)占所述药物组合物总重量的0.001-99.9wt％, 较佳地0.1-99wt％，更佳地1％-90wt％。
在另一优选例中，所述的Na/K-ATPaseα3抑制剂的浓度为 0.001ug-10000000ug/kg，较佳地为0.1ug-100000ug/kg，更佳地， 1ug-1000ug/kg。
在另一优选例中，所述的组合物或药物包括：口服制剂和非口服制剂。
在另一优选例中，所述的制剂包括：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂或含片。
在另一优选例中，所述组合物为口服制剂。
在另一优选例中，所述的组合物(如药物组合物)通过以下方式施用于哺乳动物：口服、静脉注射、或局部注射。
在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如小鼠、大鼠。
本发明第二方面提供了一种药物组合物，包括：
(a1)用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的第一活性成分，所述第一活性成分为Na/K-ATPaseα3抑制剂；和
(a2)任选的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的第二活性成分，所述第二活性成分为其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物；和
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物选自下组：苯丁胺(phentermine)、奥利司他(orlistat)、氯卡色林 (Lorcaserin)、利拉鲁肽(Liraglutide)、托吡酯(Topiramate)、苄非他明(Benzphetamine)、苯二甲吗啉(Phendimetrazine)、二乙氨苯丙酮 (diethylpropion)、纳曲酮(naltrexone)、丁氨苯丙酮(bupropion)、贝洛拉尼(Beloranib)、西替利司他(Cetil istat)、特索芬辛(Tesofensine)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、美曲普汀(Metreleptin)、多肽YY(PYY)、达伐林肽(Daval intide)、大麻素受体阻断剂(SR141716,AM251,AM6545)、韦利贝特(Velneperit)、塞特黑肽(Setmelanotide)、或其组合。
在另一优选例中，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为1:100至 100：1，较佳地为1:10至10：1。
在另一优选例中，所述药物组合物中，含有0.0001-99wt％(较佳地0.01-90wt％，更佳地，0.1-80wt％)的组分(a1)，以药物组合物的总重量计。
在另一优选例中，所述药物组合物中，含有0.0001-99wt％(较佳地0.01-90wt％，更佳地，0.1-80wt％)的组分(a2)，以药物组合物的总重量计。
在另一优选例中，所述药物组合物中可以是单一化合物，也可以是多个化合物的混合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物或制剂。
在另一优选例中，所述的药物剂型为口服给药或非口服给药剂型。
在另一优选例中，所述的口服给药剂型是片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，或乳剂或糖浆剂。
在另一优选例中，所述的非口服给药剂型是注射剂或针剂。
在另一优选例中，所述的活性成分(a1)和活性成分(a2)的总含量为组合物总重的1～99wt％，更佳地为5～90wt％。
本发明第三方面提供了一种药盒，所述药盒含有：
(i)第一容器，以及装于该第一容器中的活性成分(a1)Na/K-ATPaseα3 抑制剂，或含有活性成分(a1)的药物；
(ii)第二容器，以及装于该第二容器中的活性成分(a2)其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物，或含有活性成分(a2)的药物。
在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器是相同或不同的容器。
在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含Na/K-ATPaseα3抑制剂的单方制剂。
在另一优选例中，所述的第二容器的药物是其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的单方制剂。
在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书，所述说明书中记载了联合给予活性成分(a1)和活性成分(a2)从而预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的说明。
在另一优选例中，所述含有Na/K-ATPaseα3抑制剂的制剂或含有其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物的制剂的剂型分别包括胶囊、片剂、栓剂、或静脉注射剂。
在另一优选例中，所述含有如Na/K-ATPaseα3抑制剂的制剂中，所述 Na/K-ATPaseα3抑制剂的浓度为0.001ug-10000000ug/kg，较佳地为 0.1ug-100000ug/kg，更佳地，1ug-1000ug/kg。
本发明第四方面提供了一种本发明第二方面所述的药物组合物或本发明第三方面所述的药盒的用途，用于制备预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物。
本发明第五方面提供了一种预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的方法，包括：
(i)给需要的对象施用Na/K-ATPaseα3抑制剂、本发明第二方面所述的药物组合物、或本发明第三方面所述的药盒。
在另一优选例中，所述的施用包括口服。
在另一优选例中，所述的施用剂量为5μg-5mg/kg体重/天。
在另一优选例中，施用频率为1-3次/天，较佳地2次/天。
在另一优选例中，施用包括一个或多个周期，各周期为1-7天，较佳地3-5 天。
在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长类动物(如猴)。
本发明第六方面提供了一种筛选用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的候选药物的方法，包括步骤：
(a)在测试组中，在测试化合物及在表达Na/K-ATPaseα3酶的细胞的存在下，检测测试组中的Na/K-ATPaseα3酶的活性A1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组中 Na/K-ATPaseα3酶的活性A2；
(b)对A1和A2进行比较，如果A1显著低于A2，则表示所述测试化合物是预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的候选药物。
在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。
在另一优选例中，所述细胞选自下组的细胞表达系统：哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母细胞表达系统、无细胞蛋白表达系统。
在另一优选例中，所述细胞选自下组：HEK293细胞、HEK293T细胞、CHO细胞、 sf9细胞、sf21细胞、PichiaPink细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述“显著低于”指A1/A2≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的候选药物施用于非人哺乳动物，进一步测定其对非人哺乳动物的肥胖及其相关疾病的影响。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了HLY78和HLY72降低小鼠进食量。(a)HLY78的分子结构式(b,c)HLY179结合293T细胞表达和细菌表达纯化的NUCB2蛋白(d) HLY78降低小鼠的进食量(e)HLY78有激活Wnt的活性而HLY72和HLY103 没有(f)HLY72降低小鼠的进食量而HLY103不能(g)HLY72剂量依赖性的降低小鼠的进食量。
图2显示了HLY72对高脂诱导和OB/OB两种肥胖模型小鼠的减肥作用。 (a,b,c,d)HLY72处理显著减轻高脂诱导的肥胖小鼠体重，体脂，相对肌肉比重增加；(e,f,g)HLY72处理显著减轻高脂诱导的肥胖小鼠的血糖，血脂(三酰甘油和胆固醇)；(h)DMSO组和HLY72组高脂肥胖小鼠，肝切片苏木精和伊红染色(标尺，200μm)；(i,j,k)HLY72降低OB/OB肥胖小鼠的体重和进食量。
图3显示了HLY72对代谢的作用。正常饲料喂养的小鼠(a,b,c)，高脂饲料喂养的小鼠(d,e,f)被放入代谢笼3天，每天注射一次HLY72或DMSO。小鼠的能量耗散(a,d)，呼吸交换率(b,e)，物理活动(c,f)高脂饲料喂养的小鼠(g-k)peer-feed中3组小鼠平均每天进食量(g)，能量耗散(h)，呼吸交换率(i)，物理活动(j)及3天代谢笼实验结束后小鼠体重(k)。
图4显示了HLY72的降低进食量的作用不是通过NUCB2。(a)NUCB2 基因信息和sgRNA序列(b)基因组PCR鉴定NUCB2基因的敲除(c)野生型和NUCB2敲除小鼠的脑和附睾白色脂肪组织NUCB2的mRNA表达水平 (d)野生型和NUCB2敲除小鼠的附睾白色脂肪组织NUCB2的蛋白表达检测 (e,f)野生型和NUCB2敲除小鼠的体重和进食量(f图每个点代表一笼小鼠进食的平均值，每笼5只小鼠)(g)野生型和NUCB2敲除小鼠的注射HLY72 后的进食量。
图5显示了Bio72结合Na/K-ATPase。(a)免疫沉淀-质谱的策略鉴定 HLY72结合蛋白的流程(b)Biotin修饰的HLY72与HLY72有着同等的降低小鼠进食量的作用(c)13个HLY72潜在结合蛋白的列表(d)Na/K-ATPase 的4个α亚基的组织表达情况。
图6显示了HLY72抑制Na/K-ATPaseα3的活性，α3的T807是强心苷的关键结合位点。(a)在293T细胞中表达并纯化了Na/K-ATPase的α3和β1亚基，直接染色和WB检测纯化的蛋白(b)HLY72剂量依赖性抑制Na/K-ATPase (α3β1)的活性(c)没有降低进食量作用的HLY103没有抑制Na/K-ATPase (α3β1)的作用(d)Digitoxin显著降低小鼠的进食量(e)Na/K-ATPase的α1和α3亚基上的5个潜在的HLY72结合位点的序列比对(f,g)α3的T807C 和F793C突变显著影响HLY72对Na/K-ATPase(α3β1)的酶活抑制(h)α3 的T807C突变和α1的T804C突变一方面降低Digitoxin的对酶活的抑制，同时也降低了本身的酶活性。
图7显示了Na/K-ATPase的α3酶活降低的小鼠体重体脂减少。(a,b) Na/K-ATPase的α3和α1的点突变小鼠的测序鉴定(c)Na/K-ATPase的α1 点突变小鼠体重不变，体脂微弱但显著降低，最终的小鼠肌肉比重没变化(d) Na/K-ATPase的α3点突变小鼠体重显著降低，非常显著降低了小鼠体脂，最终的小鼠肌肉比重增加(e)Na/K-ATPase的α3点突变降低小鼠附睾的脂肪图像与重量情况。
图8显示了Na/K-ATPase的α3的酶活降低显著促进脂解。(a-d)α1点突变的小鼠的能量耗散(EE)增加,代谢增强(VO2)，RER与运动无差别(e-h) α3点突变的小鼠的能量耗散(EE)增加,代谢增强(VO2)，RER与运动无差别 (i,j)α1点突变的小鼠的p-HSL无差异，但α3的突变小鼠的p-HSL显著增加 (k)α1与α3小鼠代谢与脂解的比较。
图9显示了HLY72和Digitoxin通过Na/K-ATPase的α3亚型发挥降低进食量和脂解功效。(a)HLY72对α1突变小鼠显著的减少小鼠的进食量，但是对α3突变的小鼠不能减少(b)Digitoxin对α1突变小鼠显著的减少小鼠的进食量，但是对α3突变的小鼠不能减少(c)Digitoxin能增强α1突变小鼠的脂解(p-HSL)，同WT增加的一样(d)Digitoxin不能增强α3突变小鼠的脂解 (p-HSL)。
图10显示了HLY72和Digitoxin通过血脑屏障。(a,b)Na/K-ATPase的抑制剂Digitoxin，Istaroxime和Oleandrin对小鼠进食的作用(c,d)Istaroxime 和Oleandrin对Na/K-ATPase的酶活抑制作用(e)HLY72，Digitoxin， Istaroxime的小鼠脑组织分布能力(f-h)HLY72，Digitoxin，Istaroxime和 Rostafuroxin的心脏和血液浓度变化(i)口服或血液注射HLY72后的血液浓度变化(j)HLY72的药代数据统计。
图11显示了HLY72和Digitoxin通过神经控制脂肪分解。(a)实验模式图(b,c)HLY72促进HSL的磷酸化，磷酸化可以被交感神经阻断剂Hexam 阻断(d,e)Digitoxin，Istaroxime和Rostafuroxin对HSL的磷酸化调控作用(f,g) Digitoxin对HSL的磷酸化可以被交感神经阻断剂Hexam阻断。
图12显示了Na/K-ATPase的α3的酶活抑制能很好地抵抗肥胖。(a-b) 高脂饲养中α3的WT和点突变的小鼠的体重(c-f)高脂饲养中α3的WT和点突变的小鼠的体脂(g-j)高脂饲养中α3的点突变的小鼠的能量耗散(EE)，代谢(VO2)，RER与运动都增强(k)α3点突变的小鼠的能很好缓解高脂带来的脂肪肝(l,m)高脂饲养中α3的WT和点突变的小鼠的糖耐受(GTT)和胰岛素耐受(ITT)(n)Na/K-ATPase的α3的酶活抑制抵抗肥胖的机制模式图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，Na/K-ATPaseα3抑制剂可有效预防和/或治疗肥胖及其相关疾病，并且，本发明人还意外的发现， Na/K-ATPase的α3是一个新的减肥靶点，并且通过实验证明了干预这个靶点能很好的抵抗肥胖(尤其是高脂诱导的肥胖)。本发明首次研究检测Na/K-ATPase 的α3小鼠的体脂情况，发现抑制Na/K-ATPaseα3的酶活会减少体脂，并且发现抑制Na/K-ATPase的α3后能通过激活白色脂肪组织的p-HSL显著的促进脂解。在此基础上，本发明人完成了本发明。
肥胖及其相关疾病
在本发明中，“肥胖及其相关疾病”、“肥胖及其伴随症”可互换使用，包括如糖尿病、脂肪肝、高血压、动脉粥样硬化等疾病。
在本发明中，肥胖为BMI大于30的人。
Na/K-ATPaseα3
Na/K-ATPase的一个亚基，在人中由ATP1A3基因编码。
Na/K-ATPaseα3抑制剂
可用于本发明的Na/K-ATPaseα3抑制剂(或拮抗剂)包括任何可以降低或抑制Na/K-ATPaseα3表达或活性的物质。
在本发明中，所述Na/K-ATPaseα3抑制剂包括用如下方式降低或抑制 Na/K-ATPaseα3表达或活性的物质：
(1)在基因组水平上对ATP1A3基因的敲除，敲低或编辑；
(2)在mRNA水平上对基因ATP1A3的mRNA的量的敲低；
(3)在蛋白水平上对Na/K-ATPaseα3蛋白量的降解或降低；
(4)在蛋白水平上对Na/K-ATPaseα3的酶活性的抑制。
例如，所述Na/K-ATPaseα3抑制剂包括小分子化合物、microRNA、siRNA、 shRNA、反义寡核苷酸、核酸适配体、Crispr试剂、蛋白质降解靶向嵌合体技术(PROTAC)等。
通过各种常规筛选方法，可筛选出降低或抑制Na/K-ATPaseα3酶活性的物质，尤其是抑制剂等。
在本发明中，Na/K-ATPaseα3抑制剂还包括结合或突变Na/K-ATPase的α3亚基的T807和F793位点的抑制剂。
在一种优选的实施方式中，抑制Na/K-ATPaseα3的方法和步骤包括利用 CRISPR等基因编辑方法在基因组上进行ATP1A3基因的编辑达到沉默或突变的作用。
在一种优选的实施方式中，抑制Na/K-ATPaseα3的方法和步骤包括利用病毒(如腺相关病毒)或纳米技术等携带的shRNA或siRNA等试剂在mRNA水平上进行ATP1A3基因的沉默或敲低。
在一种优选的实施方式中，抑制Na/K-ATPaseα3的方法和步骤包括利用蛋白质降解靶向嵌合体技术(PROTAC)等方法在蛋白质水平上进行 Na/K-ATPaseα3蛋白含量的降解或降低。
对Na/K-ATPaseα3的抑制率一般为达到至少5％以上的抑制，优选为10％、 20％、30％、40％、50％的抑制，可以基于常规技术，例如流式细胞术、荧光定量 PCR或Westernblot等方法对Na/K-ATPaseα3的抑制率进行控制和检测。
本发明Na/K-ATPaseα3的抑制剂(包括小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、核酸适配体、Crispr试剂、蛋白质降解靶向嵌合体技术(PROTAC)以及其他抑制剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制 Na/K-ATPaseα3的数量或者活性，从而预防和/或治疗肥胖及其相关疾病。
组合物和施用方法
如本文所用，术语“组合物”包括(i)用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的Na/K-ATPaseα3的抑制剂，和(ii)任选的其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物(如苯丁胺(phentermine)、奥利司他(orlistat)、氯卡色林(Lorcaserin)、利拉鲁肽(Liraglutide)、托吡酯(Topiramate)、苄非他明(Benzphetamine)、苯二甲吗啉(Phendimetrazine)、二乙氨苯丙酮(diethylpropion)、纳曲酮(naltrexone)、丁氨苯丙酮(bupropion)、贝洛拉尼(Beloranib)、西替利司他(Cetilistat)、特索芬辛(Tesofensine)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、美曲普汀(Metreleptin)、多肽YY(PYY)、达伐林肽(Davalintide)、大麻素受体阻断剂(SR141716,AM251,AM6545)、韦利贝特(Velneperit)、塞特黑肽(Setmelanotide))；此外，所述的组合物包括药物组合物、食品组合物、膳食组合物或保健品组合物。
在一优选实施方式中，本发明的组合物还用于(i)减少哺乳动物的体重体脂、增加肌肉比例；和/或(ii)缓解或治疗脂肪肝、葡萄糖耐受与胰岛素耐受等肥胖不良指标；和/或(iii)激活白色脂肪组织的p-HSL，促进脂肪分解；和 /或(iv)降低哺乳动物进食量；和/或(v)减少能量耗散、呼吸交换率和物理活动。
通常，可将本发明的活性成分配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重，优选地，Na/K-ATPaseα3抑制剂的用量可以为：成年人每日0.01～10mg，优选0.1～1mg/天。
作为预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物，可以制成口服和非口服制剂。口服给药可制成片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等常用剂型，所用的赋型剂可以为淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羟甲基纤维素等中的一种或几种。崩解剂可以为马铃薯淀粉、羟甲基纤维素等中的一种或几种。粘合剂可以为阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、糊精等中的一种或几种。口服制剂除上述剂型外，还可以制成乳剂、糖浆剂等。
非口服制剂可以制成注射剂，可以与注射用水、生理盐水、葡萄糖水制成注射剂，也可以在其中加入一定比例的乙醇、丙醇、乙二醇等。
本发明的进一步目的是提供一种用预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物的制备方法，采用所述的Na/K-ATPaseα3抑制剂以及其他的用于预防和/ 或治疗肥胖及其相关疾病的药物为药物原料，用相应的赋型剂，按照常规的方法制成口服和非口服制剂，其中Na/K-ATPaseα3抑制剂的用量可以为：成年人每日0.01～200mg，优选0.1～20mg/天，每日服用1次；儿童的用量和次数需在成人的基础上酌情递减。
药盒
本发明还提供了一种药盒，所述的药盒含有：
(i)第一容器，以及装于该第一容器中的活性成分(a1)Na/K-ATPaseα3 抑制剂，或含有活性成分(a1)的药物；
(ii)第二容器，以及装于该第二容器中的活性成分(a2)其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物，或含有活性成分(a2)的药物；和
(iii)说明书。
所述含有Na/K-ATPaseα3抑制剂的药物可以是含有Na/K-ATPaseα3抑制剂的单元剂型，所述含有其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物的药物可以是含有其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物的单元剂型。
药盒中装有至少两个含有Na/K-ATPaseα3抑制剂的单元剂型和含有其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物的单元剂型；较佳地，各为4-10 个。
如本文所用，术语“单元剂型”是指为了服用方便，将组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。
此外，可用于本发明药盒的其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物可以为一种或多种，优选地，所述其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物可以为多种，更优选地，可以为本领域技术人员所熟知的其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物组合。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，Na/K-ATPaseα3的抑制可有效预防和/或治疗肥胖及其相关疾病。
(2)本发明首次发现，Na/K-ATPase的α3是一个新的减肥靶点，并且通过实验证明了干预这个靶点能很好的抵抗肥胖(尤其是高脂诱导的肥胖)。本发明首次研究检测Na/K-ATPase的α3小鼠的体脂情况，发现抑制Na/K-ATPase α3的酶活会减少体脂，并且发现抑制Na/K-ATPase的α3后能通过激活白色脂肪组织的p-HSL显著的促进脂解。
(3)本发明首次发现，Na/K-ATPaseα3是新的强效的减肥靶点。 Na/K-ATPaseα3的酶活减弱突变(T807C)小鼠，体重体脂减少，抵抗高脂诱导的肥胖，缓解或治疗脂肪肝，葡萄糖耐受与胰岛素耐受等肥胖不良指标。
(4)本发明首次发现，从脑中的Na/K-ATPaseα3开始到外周白色脂肪组织中的p-HSL是一条全新的促进脂解的一条通路。特异性的Na/K-ATPaseα3 的抑制(比如Na/K-ATPaseα3的酶活减弱突变小鼠)能激活白色脂肪组织的 p-HSL，促进脂解；而特异性的Na/K-ATPaseα1的抑制(Na/K-ATPaseα1的酶活减弱突变小鼠)不能激活这条通路。强心苷类如洋地黄毒苷能到达脑的 Na/K-ATPase抑制剂也能激活这条脂解通路。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
在本发明中，本发明的HLY72及其衍生物中的具体化合物的制备以及结构见申请号为PCT/CN2018/107067的PCT申请或中国专利申请CN2019104076229。
通用方法
1实验试剂
小鼠ATP1A1，ATP1A3，ATP1B1基因全长通过PCR得到并克隆到哺乳动物表达载体PCMV-Flag，ATP1A1和ATP1A3的突变由相应点突变产生。NUCB2(N6789) 抗体购自SigmaAldrich公司。HA(16B12)抗体购自Covance公司。Flag抗体，化学修饰的环糊精Captisol(HY-17031)购买自MCE公司。HSL(#4107)和 p-HSL(#4139)购自CST。ATPase/GTPase酶活分析试剂盒购自Sigma Aldrich公司。Digitoxin(HY-B1357)，Istaroxime(HY-15718A)，Hexamethonium Bromide(55-97-0)购自MedChem Express。DDM(D100662)，DOPS(D130321)购自 Aladdin。Cholesteron(T0760)购自TargetMol。C12E8购自Sigma。HLY72，HLY78，HLY103，Bio72化学小分子来自中科院昆明植物所郝小江研究员实验室。
2细胞培养和转染
HEK293T细胞在含10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen)培养液中培养， 37℃,CO2浓度为5％。细胞在转染前18-24小时分盘，10cm盘总的质粒量为10μg (ATP1A1,ATP1A3转6ug，ATP1B1转4ug)。转染试剂为Lipo3000(Invitrogen)。转染后24小时时做相应的实验。
3免疫沉淀-质谱
首先准备小鼠大脑蛋白提取液到两个1.5ml管，分别加入100uM的HLY72或 DMSO。4度旋转30分钟后，13000rpm/min离心10分钟。上清和Streptavidin Agarose beads(提前与20uM的Bio72孵育1小时，并洗2次)孵育2小时，用裂解洗2次后用PBS洗一次。冻-80度知道质谱分析。
4 Western Blot
配制适当浓度的SDS-PAGE胶，加入蛋白样品电泳分离。电转胶中蛋白到NC (硝酸纤维素)膜，用0.5％的脱脂牛奶封闭1小时。TBST洗涤3次，每次5分钟，再加入相应的一抗4℃孵育过夜。回收抗体后，TBST洗涤3次，每次5分钟，加入相应HRP偶联的二抗，室温孵育1小时。洗涤三次后，加入显影液扫描。
5 Na/k-ATPase蛋白的制备
转染Na/k-ATPase的α和β亚基到293T细胞，24-30小时后，刮细胞1000转低速离心收集细胞。加入裂解液(1.4M sorbitol,10mM Tris-HCl,pH 7.2, 1mM EDTA,proteaseinhibitors)在均将器中均匀抽-拉约40次。10000g/min 离心10分钟，收集上清做进一步高速离心(100000g/min)1小时。高速离心的沉淀溶于缓冲液(DDM，2倍质量于沉淀重量，NaCl250mM，20mM Tris-HCl, pH 7.4,0.1M PMSF,10％glycerol)，不溶的部分用12000g/min离心去除。可溶部分与anti-Flag M2 Magnetic Beads在4度孵育4小时。用含(NaCl,100 mM,Tris-HCl,20mM,pH 7.4,C12E8 0.1mg/ml,DOPS 0.05mg/ml,Cholesterol 0.01mg/ml,glycerol 10％)的清洗液洗2次后，用含有Flag peptide(DYKDDDDK， 500ug/ml)的清洗液洗脱，-80度保存。
6 Na/k-ATPase酶活测定
Na/k-ATPase酶活测定使用ATP/GTPase活性测定试剂盒。特异性 Na/k-ATPase活性定义为Digitoxin敏感的ATPase活性。具体的：buffer体系为 10mM HEPES,pH 7.4,NaCl130mM,KCl 20mM,MgCl2 4mM。一个酶活反应总体系45ul,3部分混合组成。一部分15ul包含小分子化合物或DMSO，第2部分15ul含3mM ATP，第3部分含Na/k-ATPase蛋白。37度反应20分钟后立即放冰上，后用试剂盒测量。
7小鼠
所有动物实验被生化细胞所动物管理委员会批准。C57BL/6小鼠购买自灵畅公司(正常小鼠和高脂饲料诱导肥胖小鼠)，C57/BLJ6(NUCB2基因敲出小鼠的繁殖和背景纯化用)购买自灵畅公司，OB/OB小鼠购买自斯莱克公司。用于诱导肥胖小鼠的高脂饲料(45％kcal，D12451)购买自Research Diets。从第六周开始，喂高脂饲料14-25周。其余小鼠用正常饲料(13.5％kcal)。小鼠饲养于生化细胞所SPF级别动物房，12小时关灯(19:00-07:00)，12小时开灯(07:00-19:00)。
8进食量，体重和体脂含量测定
小鼠在关灯前2小时内腹腔注射DMSO，HLY72等化合物(溶于DMSO)25μL，灌胃实验时，溶于DMSO的高浓度HLY72等溶于10％的环糊精，灌胃100μL的总体积，使DMSO的最终浓度小于10％。在息灯后的第3小时，第6小时，第12小时，第24小时时分别称量饲料的重量。相应的小鼠体重也在每天给药前相同的时间称量。小鼠脂肪含量用所里动物平台的磁共振脂肪含量测量仪测定。
9代谢笼
在开始代谢笼实验前，小鼠先单笼饲养适应1周。一周单笼适应期后，小分子化合物注射开始的三天前，在每天下午关灯前2小时内给小鼠注射DMSO 25 μL，使其适应注射3天。3天注射适应后的小鼠被放入代谢笼，当天开始任然是在关灯前2小时内分别注射DMSO和HLY72(20mg/kg)25μL，连续3天。分析数据时，第一天晚上的数据不被收录用来分析，后面连续收集两个白天(第二天白天，第三天白天)，两个夜晚(第二天夜晚，第三天夜晚)，分别48小时的数据作为代谢笼最终展示的数据。Pair-feed和fasting实验代谢笼细节描述见文章和图注。
10组织，细胞RNA的抽提和RT-PCR
小鼠被安乐死后，马上剥离出相应的组织，并用液氮速冻，-80℃保存。对于6孔培养皿里的细胞样品，吸掉培养基后，加入1mL的Trizol，室温放置 10分钟后，转移到1.5mL的EP管中，-80℃保存。抽提组织RNA时，先在含有钢珠的组织匀浆管中加入1.5mL的Trizol，将组织从-80℃冰箱取出放入匀浆管中匀浆破碎。用酚-氯仿-异丙醇方法抽提RNA。利用superscriptTMIII first strand synthesis system(Invitrogen)试剂盒将1μg的mRNA反转录为cDNA，反转录时使用随机引物。使用Quantitative SYBR green PCR kit(Takara)试剂盒做定量PCR反应，PCR反应的仪器为ABI-QuantStudio 6Realtime PCR仪。
11小鼠肝组织石蜡切片
采取小鼠肝组织于4％的多聚甲醛4℃固定过夜。PBS缓冲液洗两次后于30％，50％乙醇中各30分钟，4℃保存于70％乙醇中。(1)乙醇梯度脱水：80％乙醇30 分钟，95％乙醇30分钟，100％乙醇15分钟，新的100％乙醇15分钟。(2)二甲苯透明：1/2无水乙醇加1/2二甲苯中15分钟，二甲苯中10分钟，新的二甲苯中10 分钟。(3)浸蜡，包埋，切片：1/2二甲苯加1/2石蜡30分钟，石蜡1中90分钟，石蜡2中120分钟，石蜡3中过夜后包埋，常规切片厚4μm，贴于处理过的干净载玻片上，37℃烤片过夜，收集于载片盒中4℃密封保存。(4)二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水：组织切片经3次二甲苯脱蜡，每次10分钟，放入1/2二甲苯加1/2 无水乙醇中15分钟。经100％，90％，80％，70％，50％，30％的乙醇各5分钟后，放入纯水中5分钟。(5)HE染色，拍片：苏木精室温染色20分钟，流水冲洗，0.1％的盐酸乙醇分色1秒钟，流水冲洗，经30％，50％，70％，80％，95％的乙醇各1分钟后，1％伊红染色1分钟。放入无水乙醇中1分钟，用新的无水乙醇脱水2次，每次5分钟。再放入1/2无水乙醇加1/2二甲苯中15分钟，后经二甲苯1,2,3，每次5分钟。中性树胶封片，室温干燥保存。使用细胞平台Olympus BX51显微镜拍片。
12脂解分析和神经阻断
HLY72,Digitoxin,Istaroxime,Rostafuroxin或DMSO注射小鼠连续2天，每天一次。收集白色脂肪组织后匀浆检测HSL的磷酸化。阻断实验时，在注射前述化合物10分钟后注射Hexamethonium bromideadministration。
13葡萄糖耐受和胰岛素耐受试验
对于葡萄糖耐受试验，小鼠禁食过夜，腹腔注射1g/kg体重的葡萄糖。在0、15、30、45、60、90和120分钟时测量血糖水平。对于胰岛素耐受试验，小鼠禁食5h，腹腔注射0.75U/kg胰岛素。在0、15、30、45、60、90和120分钟时测量血糖水平。
14数据统计分析
数据以平均值±标准误(means±s.e.m)的方式呈现。P值通过t检验 (student′stest)或one-way or two-way ANOVA得出，显著性表示为*：P＜0.05， **：P＜0.01，***：P＜0.001。
实施例1 HLY78和HLY72降低小鼠进食量
HLY78的结构如图1a所示，以前报道有激活wnt信号的作用。HLY78结合蛋白的质谱数据中排名第二的NUCB2蛋白。查阅文献发现NUCB2是近年来报道的一个新兴的潜在治疗肥胖及伴随症的分泌蛋白。因此假设HLY78有可能具有调节体重的功能，从而成为一个潜在的治疗肥胖的化合物。首先，结果表明 HLY179(含biotin修饰的HLY78)能够结合细胞表达或细菌表达的NUCB2蛋白 (图1b)。同时，HLY78有显著地减少小鼠的进食量的作用，而且主要是在夜间前六小时内有影响小鼠进食量的作用，其后时间段跟对照组没有明显的差异 (图1c)。图1d,1e显示HLY78的结构改造类似物HLY72，HLY103，都没有激活wnt活性。HLY72有显著抑制进食量的作用而HLY103没有作用(图1f)。进一步实验显示了小分子HLY72对小鼠进食量作用的剂量梯度作用(图1g)。
实施例2 HLY72对高脂诱导和OB/OB两种肥胖模型小鼠都有很好的减肥作用
在高脂诱导的肥胖小鼠模型中，HLY72注射显著的降低了小鼠的体重(图 2a,b)。磁共振脂肪含量测量仪的分析也显示脂肪的含量显著降低(图2c)，同时肌肉的比重增高大概9个百分点(图2d)。通过血液生化检测，HLY72处理组小鼠的血糖，三酰甘油和胆固醇含量明显的降低(图2e-g)，说明肥胖导致的糖脂代谢相关的异常有所改善。小鼠的肝脏切片也清晰地显示了高脂导致的脂肪肝得以很好的治疗(图2h)。同时，口腔灌胃HLY72对OB/OB肥胖小鼠也有显著的减肥效果(图2i,j)。OB/OB小鼠的每天进食量相比于DMSO组， HLY72组也有显著的降低(图2k)。这意味着对leptin耐受的广大群体，HLY72 也能发挥作用，有显著的效果。
实施例3 HLY72对代谢的作用
对于正常饲养的小鼠(Lean)和高脂饲料喂养的肥胖小鼠(DIO)，HLY72 处理都显著减少了能量耗散(图3a,d),呼吸交换率(图3b,e)，物理活动(图 3c,f)。接下来比较HLY72注射组和它们的配对饲养组，DMSO注射的小鼠分成了两组，第一组可以自由获得足量食物，而另一组每天定量提供HLY72组相同量的食物。结果显示，HLY72组跟其配对饲养组每天进食量几乎一致(图3g)。 HLY72组及其配对饲养组与DMSO组比，不管白天还是夜间，能量耗散都有所下降，HLY72组与其配对饲养组白天和夜间的能量耗散没差异(图3h)。和配对饲养组及DMSO处理组相比，HLY72组的夜间和白天呼吸交换率都显著降低，配对饲养组和DMSO处理组白天和夜间也表现出了显著的差异(图3i)。物理活动方面，HLY72组比DMSO组和配对饲养组都明显降低，而DMSO组和配对饲养组无显著差别(图3j)。HLY72组和配对饲养组的体重都显著下降，但两组之间没有明显的差异(图3k)。
实施例4 HLY72发挥作用不是通过靶向NUCB2蛋白
从HLY78是潜在的NUCB2蛋白的结合小分子出发，因为NUCB2被报道作为潜在的治疗肥胖的分泌蛋白，因而建立假设：HLY78分子可能是潜在的治疗或预防肥胖及相关疾病的化合物。为了验证HLY72发挥功能是否通过NUCB2 蛋白，在合作者的帮助下我们得到NUCB2基因敲除小鼠。具体的做法是，在 NUCB2基因翻译成蛋白的第一个外显子E3(Exon3，前两个外显子E1，E2不含编码蛋白的序列)处设计2条sgRNA(图4a)。通过测序方式确认拿到了到了基因敲除小鼠，删除了83个碱基而达到译码突变的目的，我们设计引物通过基因组水平PCR的方式(图4b)和在mRNA水平Q-PCR的方式确认了碱基段的去除(图4c)。在蛋白水平上，分别用了NUCB2的两个抗体，即识别N端和识别 C端的两个抗体都确认了NUCB2在蛋白水平的敲除(图4d)。但是令人意外的是，NUCB2的敲除对小鼠的体重没任何影响，不管是雄鼠和雌鼠都一样。进一步统计进食量也没有发现WT和KO小鼠之间的差异(图4e-f)，NUCB2小鼠的这个表型就否定了以前的报道：NUCB2蛋白有调控体重和食欲的作用。而几乎在同一时期，国外实验室发表了这个结果，我们的发现与他们报道的结果和结论是一致的。接下来的实验，我们对野生型小鼠和NUCB2敲除小鼠注射HLY72，结果是：HLY72的处理使NUCB2敲除的小鼠同WT小鼠有着一样地减少进食量的作用(图4g)，而且雄鼠和雌鼠得到同样地结果。根据上述地这些实验证据，我们正式地否定了最早地假设，NUCB2不是HLY72发挥减肥作用的靶点，真正地靶点仍需要进一步地探寻。
实施例5 HLY72靶向Na/K-ATPaseα3，一个新的减肥减脂靶点
为了找到HLY72的作用靶点和分子机制，在合作者的帮助下，我们得到了 biotin修饰的HLY72分子。因为大脑作为调控身体稳态和进食的中枢，我们期望通过免疫沉淀-质谱的策略找出HLY72在小鼠大脑匀浆蛋白中的结合的蛋白 (图5a)。首先确认了修饰后的HLY72同没修饰的分子都有显著的降低小鼠进食量的作用(图5b)。质谱鉴定到了13个潜在的HLY72的结合蛋白，我们选中潜在的靶点Na/K-ATPase的α3亚基。文献报告Na/K-ATPase的α3亚基的组织表达只在神经元，我们实验结果也显示Na/K-ATPase的α3亚基主要表达在小鼠脑部 (图5c,d)。
接下来的实验首先在生化上探究HLY72和Na/K-ATPase的α3亚基的靶向关系。使用293T细胞表达和纯化了Na/K-ATPase的α3和β1亚基(图6a)。HLY72 对Na/K-ATPase的α3和β1亚基的酶活抑制活性IC50约18uM(图6b)，而没有降低进食量作用的HLY103没有抑制Na/K-ATPase的活性(图6c)。Digitoxin，经典的Na/K-ATPase特异性抑制剂，长期作为治疗心衰的药物，在注射小鼠后也显著降低小鼠的进食量(图6d)。根据Na/K-ATPase的α1的结构docking小分子 HLY72，得出了5个潜在的结合位点。序列对比α1和α3的蛋白，这5个位点都高度保守(图6e)。突变并纯化了α3的5个突变与β1复合物，酶活实验显示T807 和F793位点是HLY72结合的关键位点(图6f,g)，这两个位点也是经典的 Na/K-ATPase抑制剂的结合位点，α3的T807C突变和α1的T804C突变一方面降低 Digitoxin的结合对酶活的抑制，对Digitoxin变得不敏感，同时也降低了本身的酶活性，点突变使酶活降低约50％(图6h)。
紧接着的实验设计就是在小鼠上探究HLY72和Na/K-ATPase的α3亚基的靶向关系。Na/K-ATPase作为非常重要的细胞活动维持和调控的离子转运蛋白， Na/K-ATPase的α3的基因敲除小鼠是致死的，但杂合子能存活。在找到了HLY72 和Digitoxin结合的关键位点后，我们决定构建Na/K-ATPase的α3的点突变小鼠。在合作者的帮助下，我们构建并得到了Na/K-ATPase的α3的T807C和α1的T804C 点突变小鼠，测序验证了得到的小鼠是精确的定点突变(图7a,b)。得到小鼠后首先分析α1和α3突变小鼠的基本情况：α1点突变的小鼠体重有略微降低，但无显著性变化，体脂略微但显著的下降，最终小鼠的肌肉比例不变(图7c)。α3的点突变显著的减轻了小鼠的体重，体脂非常显著的下降，最终小鼠的肌肉比例显著增加(图7d)。除了用磁共振的方式测量突变小鼠的体脂情况，我们也取出小鼠附睾白色组织直接称量。重量也直接地显示了α3的点突变使整个附睾白色组织明显变少，重量变轻(图7e)。初步的表型观测结果暗示： Na/K-ATPase的α3亚基基因(即ATP1A3基因)是一个功能显著的调控体重和体脂的基因，是一个潜在的治疗和预防肥胖及相关伴随症的潜在靶点。
实施例6一条新的促进脂解的通路：从脑的Na/K-ATPaseα3到外周白色脂肪的p-HSL
接下来分析Na/K-ATPaseα3减重减脂的原因。首先做了代谢笼分析：α1点突变的小鼠的能量耗散(EE)增加,代谢增强(VO2)，RER与运动无差别，而α3 点突变的小鼠的趋势同α1点突变的小鼠一样(图8a-h)。由于α3小鼠的有非常显著的减脂表型，我们进一步检测了白色脂肪组织中HSL的活性，HSL是调控脂肪分解的最关键酶，磷酸化可以促进其脂解活性。与WT相比，α1点突变的小鼠的p-HSL无差异，但α3的突变小鼠的p-HSL显著增加(图8i,j)。这些数据的出现就意味着一条新的调控脂肪分解的通路出现了：即脑中的Na/K-ATPase α3到脂肪组织的p-HSL。这条通路是Na/K-ATPaseα3减重减脂的重要原因，是 Na/K-ATPaseα3所特有而Na/K-ATPaseα1所不具有的(图8k)。
实施例7 HLY72和Digitoxin通过Na/K-ATPase的α3降低进食量和增加脂解
给α1突变小鼠注射HLY72，同野生型小鼠一样都显著的减少小鼠的进食量，但是给α3突变的小鼠注射HLY72就不能减少小鼠进食量(图9a)，这个实验说明HLY72通过α3而非α1发挥降低进食量的作用。同理，使用另外的已知 Na/K-ATPase抑制剂Digitoxin，结果Digitoxin显著减少α1突变小鼠的进食量，但对α3突变小鼠没有作用(图9b)。这两个数据都表明了α3而非α1作为降低小鼠进食量的α亚型。再进一步，对于ATP1A1突变小鼠：Digitoxin处理后WT和突变小鼠的白色脂肪组织脂解(p-HSL)一样增加(图9c)。而ATP1A3突变小鼠白色脂肪组织脂解(p-HSL)，不能被Digitoxin处理进一步增加(图9d)。这些数据清晰地表明了Na/K-ATPase的α3亚基作为调控进食和脂解的亚型， Na/K-ATPase的α3亚基是HLY72和Digitoxin发挥减肥减脂的作用靶点。
实施例8 HLY72和Digitoxin能够到达脑部，通过交感神经促进脂解
当选用更多的Na/K-ATPase的抑制剂时发现Istaroxime不能降低小鼠进食量，但Oleandrin同digitoxin一样有显著的效果(图10a,b)，而Istaroxime对 Na/K-ATPase的抑制剂活性远强于Oleandrin(图10c,d)。这时产生了一个猜测：能进入脑的Na/K-ATPase的抑制剂小分子才能降低进食和增加脂解。药物组织分布实验结果支持了这一猜测：HLY72和Digitoxin能通过血脑屏障，而 Istaroxime不能到达脑部(图10e)。同时分析了HLY72，Digitoxin，Istaroxime 的心脏分布情况，相比于Digitoxin的长半衰期和较高的心脏分布，HLY72在心脏的分布较低(图10f-h)。HLY72的半衰期小于3小时，生物利用率约50％(图10i,j)。
除了上面的小分子组织分布数据，接下来再通过设计实验进一步的核实。 leptin作为经典的减肥减脂的蛋白到达脑部后可以通过交感神经调节白色脂肪 HSL的磷酸化促进脂肪分解，我们想看看Na/K-ATPase的酶对脂肪的分解是否通过交感神经。首先参考leptin文献的方法：注射小分子HLY72，Digitoxin或 Istaroxime后再注射神经阻断剂Hexam，取白色脂肪检测HSL的磷酸化(图11a)，可以看出这个信号中间是否需要交感神经的环节。结果显示注射HLY72也能促进HSL的磷酸化，并且磷酸化可以被交感神经阻断剂Hexam阻断(图11b,c)。进一步，有降低小鼠进食量能够达到脑部的Digitoxin也能促进HSL的磷酸化，不能降低进食量也不能到达脑部的Istaroxime和Rostafuroxin不能影响HSL的磷酸化(图11d,e)。同HLY72一样，Digitoxin对HSL的磷酸化也能被经阻断剂Hexam 阻断(图11f,g)。根据上述的实验结果可以合理推测：只在神经元表达的 Na/K-ATPase的α3亚型是调控体重体脂和进食的靶点，小分子HLY72或 Digitoxin通过血液循环到达脑部后，结合神经元上的Na/K-ATPase的α3亚基，抑制其酶活后续传出至少两种信号。一方面，小鼠的进食量降低；另一方面，通过传出交感神经促进白色脂肪的HSL的磷酸化，促进脂解。
实施例9 Na/K-ATPaseα3活性的抑制，能够抵抗高脂诱导的肥胖，逆转肥胖导致的多种不良指标
最后，再一次在小鼠层面检测Na/K-ATPaseα3活性的抑制的抗肥胖作用。用高脂饲料(60％)饲养Na/K-ATPaseα3的野生型和Na/K-ATPaseα3的突变小鼠 8周。其中Na/K-ATPaseα3的突变小鼠能很好的抵抗肥胖(图12a,b)。磁共振检测小鼠体脂减少约50％，8周后突变小鼠的肌肉比重显著增加，取出小鼠附睾白色组织直接称量,也直接地显示整个附睾白色组织明显变少，重量变轻(图 12c-f)。代谢分析显示α3的突变小鼠在高脂饲养条件下的能量耗散(EE)， RER，运动，VO2都显著增加(图12g-j)，说明点突变小鼠的代谢活动明显加强。小鼠的肝脏切片也清晰地显示了高脂导致的脂肪肝得以很好的治疗(图12k)。糖耐受(GTT)和胰岛素耐受(ITT)也有显著的改善(图12l,m)。如图12n所示，Na/K-ATPaseα3的突变小鼠通过增强代谢和促进脂解达到减脂减重和改善不良指标的作用。
讨论
通过各种生物学技术靶向干预Na/K-ATPase的α3亚基，基因改造或改变其表达量或特异性抑制其活性能达到很好地减肥减脂地效果。
本发明是在研究减肥小分子化合物的过程中首次提出Na/K-ATPase的α3是一个新的减肥靶点，并且通过实验证明了干预这个靶点能很好的抵抗高脂诱导的肥胖。本发明首次研究检测Na/K-ATPase的α3小鼠的体脂情况，发现抑制 Na/K-ATPaseα3的酶活会减少体脂，并且发现抑制Na/K-ATPase的α3后能通过激活白色脂肪组织的p-HSL显著的促进一条脂解。
本发明中对比α3和α1地小鼠，对后续的药物筛选提供了重要的理论基础和筛选标准。一方面：筛选更优的治疗肥胖及其相关疾病的化合物的标准(1) Na/K-ATPase的α1，α2，α3的相似性极高，相对特异性地靶向Na/K-ATPase的α3亚基为佳。已经报道的大量的特异性的Na/K-ATPase抑制剂和本文新发现的 HLY72及其大量衍生物是筛选的巨大宝库。(2)小分子的组织分布能够到达脑部，同时对心脏等组织的分布系数相对少些，这个对减少副作用有帮助。(3) 半衰期稍短(2-10小时或2-5小时更佳)。另一方面：抗心衰药物的使用一直非常的谨慎，常发生不同程度的毒副作用。而经典的Na/K-ATPase的酶活抑制剂如Digoxin等长期作为治疗心衰地药物，主要机制是抑制心脏中的Na/K-ATPase (α2亚型)活性。筛选更优和安全的治疗心衰的药物标准(1)相对特异性地靶向Na/K-ATPase的α2亚基为佳。(2)不能通过血脑屏障，心脏分布系数高。现在常用的地高辛和digitoxin，根据我们的研究都能到达脑，可能减少病人的进食和促进脂解。在治疗心衰的同时还在减肥减脂，这大大增加了患者的负担。

Claims (10)

1.一种Na/K-ATPaseα3抑制剂的用途，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肥胖及其相关疾病选自下组：肥胖、糖尿病、脂肪肝、高血压、动脉粥样硬化、或其组合。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Na/K-ATPaseα3抑制剂结合或突变Na/K-ATPase的α3亚基的T807和F793位点，抑制Na/K-ATPaseα3的酶活性。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Na/K-ATPaseα3抑制剂不通过NUCB2预防和/或治疗肥胖及其相关疾病。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Na/K-ATPaseα3抑制剂选自下组：小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、核酸适配体、Crispr试剂、蛋白质降解靶向嵌合体技术(PROTAC)或其组合。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物或制剂还包括选自下组的额外组分：其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病药物。
7.一种药物组合物，其特征在于，包括：
(a1)用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的第一活性成分，所述第一活性成分为Na/K-ATPaseα3抑制剂；和
(a2)任选的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的第二活性成分，所述第二活性成分为其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物；和
(b)药学上可接受的载体。
8.一种药盒，其特征在于，所述药盒含有：
(i)第一容器，以及装于该第一容器中的活性成分(a1)Na/K-ATPaseα3抑制剂，或含有活性成分(a1)的药物；
(ii)第二容器，以及装于该第二容器中的活性成分(a2)其他的用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物，或含有活性成分(a2)的药物。
9.一种权利要求7所述的药物组合物或权利要求8所述的药盒的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的药物。
10.一种筛选用于预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的候选药物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在测试组中，在测试化合物及在表达Na/K-ATPaseα3酶的细胞的存在下，检测测试组中的Na/K-ATPaseα3酶的活性A1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组中Na/K-ATPaseα3酶的活性A2；
(b)对A1和A2进行比较，如果A1显著低于A2，则表示所述测试化合物是预防和/或治疗肥胖及其相关疾病的候选药物。
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