CN112007157B - Mrg15蛋白或基因作为靶点在代谢疾病治疗和预防中的应用 - Google Patents

Mrg15蛋白或基因作为靶点在代谢疾病治疗和预防中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及MRG15蛋白或基因作为靶点在代谢疾病治疗和预防中的应用。具体而言，本发明涉及以MRG15蛋白或基因为靶点的抑制MRG15基因表达或降低MRG15蛋白活性的试剂在制备治疗或预防受益于甘油三酯和/或总胆固醇含量降低的疾病或症状的药物中的应用。

Description

MRG15蛋白或基因作为靶点在代谢疾病治疗和预防中的应用
技术领域
本发明涉及代谢疾病的预防和治疗，特别涉及MRG15蛋白或基因作为靶点在代谢疾病治疗和预防中的应用。
背景技术
高血脂、脂肪肝等是由多种因素引起的慢性代谢性疾病，表现为血液中甘油三酯、总胆固醇含量升高，肝脏脂肪过多积累，胰岛素抵抗的发生。可造成多种疾病患病率增加，如2型糖尿病、肝纤维化、冠心病、某些癌症等。
MRG15(MORF4-related gene on chromosomes 15)是一种具有诱导细胞衰老功能的转录因子。人MRG15基因定位于染色体15q24，cDNA序列全长为969bp，编码含323个氨基酸残基的约37kD的核内蛋白。MRG15蛋白具有两个主要的结构域：N末端结构域和C末端结构域，它们中间通过一段灵活区域相连。MRG15蛋白具有高度保守性，C端疏水区形成很多α螺旋，这些α螺旋构成稳定的疏水中心。MRG15蛋白会影响鼠中枢神经和神经祖细胞的增殖与分化(姜天鹏，《MRG15蛋白与Sedlin蛋白的相互作用研究》，硕士学位论文，2013年5月)。
发明内容
本发明涉及以MRG15蛋白或基因为靶点治疗或预防代谢疾病。
因此，本发明提供MRG15蛋白或基因作为靶点在代谢疾病治疗和预防中的应用，在降血脂和/或降胆固醇中的应用，在改善葡萄糖耐受性和/或胰岛素敏感性中的应用，在治疗或预防脂肪肝和/或脂肪组织炎症中的应用。
更具体而言，本发明涉及以MRG15蛋白或基因为靶点、抑制MRG15基因表达或降低MRG15蛋白活性的试剂在制备治疗或预防受益于甘油三酯和/或总胆固醇含量降低的疾病或症状的药物中的应用。
本发明也涉及以MRG15蛋白或基因为靶点、抑制MRG15基因表达或降低MRG15蛋白活性的试剂在制备降血脂药和降胆固醇药中的应用。
本发明还涉及以MRG15蛋白或基因为靶点、抑制MRG15基因表达或降低MRG15蛋白活性的试剂在制备改善葡萄糖耐受性和/或胰岛素敏感性的药物中的应用。
本发明还还涉及以MRG15蛋白或基因为靶点、抑制MRG15基因表达或降低MRG15蛋白活性的试剂在制备治疗或预防脂肪肝和/或脂肪组织炎症的药物中的应用。
在一个或多个实施方案中，该试剂为MRG15的抗体。
在一个或多个实施方案中，该试剂选自能抑制MRG15基因表达的siRNA、反义RNA、核酶或基因编辑载体。
在一个或多个实施方案中，所述疾病为代谢性疾病。
在一个或多个实施方案中，所述代谢疾病为肥胖或肥胖相关疾病。
在一个或多个实施方案中，所述肥胖相关的疾病选自：2型糖尿病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低高密度脂蛋白胆固醇血症、高尿酸血症(痛风)、冠心病、高血压、胆石症、脂肪肝、脂肪组织炎症、肥胖性低通气综合征、肺心综合征、骨关节炎、骨质疏松和内分泌失调。
在一个或多个实施方案中，所述受益于甘油三酯含量降低的疾病或症状选自：冠心病、心梗、脑卒中、中风、视力下降、失明、动脉狭窄或闭塞、高血压、胆结石、胰腺炎、老年痴呆以及动脉粥样硬化。
在一个或多个实施方案中，所述受益于总胆固醇含量降低的疾病或症状选自：高胆固醇血症、冠心病、糖尿病、脑血栓、中风和肝硬化。
在一个或多个实施方案中，所述试剂选自：
(1)MRG15蛋白的抗体或小分子抑制剂；和
(2)抑制MRG15基因表达的siRNA、反义RNA、核酶或基因编辑载体。
在一个或多个实施方案中，所述基因编辑载体为CRISPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体。
本发明还提供一种药物组合物，其含有：
(1)以MRG15蛋白或MRG15基因为靶点的抑制MRG15基因表达或降低MRG15蛋白活性的试剂；和
(2)任选的选自以下的活性成分：降脂药、降胆固醇药、减肥药以及治疗肥胖相关的疾病的药物。
附图说明
图1：活体成像检测和Western检测证明可以在肝脏中高效地敲除Mrg15。
图2：常规喂养小鼠(NCD组)和高脂喂养小鼠(HFD组)血液中甘油三酯和总胆固醇的含量在Mrg15敲除后显著下降。
图3：肝脏敲除Mrg15后，可以改善小鼠的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。
图4：肝脏敲除Mrg15后，可以改善高脂诱导的小鼠脂肪肝表型。
图5：肝脏敲除Mrg15后，可以改善高脂诱导条件下小鼠肝脏中甘油三酯和总胆固醇的含量，降低炎症。
图6：常规喂养组小鼠肝脏敲除Mrg15后，主要影响脂肪酸代谢通路，抑制甘油三酯和总胆固醇的从头合成。
图7：高脂喂养组小鼠肝脏敲除Mrg15后，主要影响脂肪酸代谢通路，抑制甘油三酯和总胆固醇的从头合成，并且有更低的肝脏炎症表型。
图8：Mrg15与基因组的结合呈现节律改变，在ZT22与基因组的结合更强。
图9：在ZT22时结合并在敲除小鼠肝脏中下调的基因显著富集在脂质代谢相关通路中。
图10：营养状态影响MRG15与脂质合成相关基因启动子的结合。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明首次揭示MRG15基因的敲除能抑制甘油三酯和胆固醇的从头合成从而降低血液中甘油三酯和总胆固醇含量，改善葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性，并能改善脂肪肝表型和附睾脂肪组织炎症。因此，本发明涉及以MRG15蛋白或MRG15基因为靶点，治疗或预防受益于甘油三酯和/或总胆固醇含量降低的疾病或症状，尤其是指与甘油三酯和胆固醇含量过多相关的代谢疾病。
本文中，MRG15基因指MORF4相关基因，其是一种转录因子。本发明所涉及的MRG15蛋白或MRG15基因包括来自不同物质的MRG15蛋白或MRG15基因，尤其是哺乳动物的MRG15蛋白或MRG15基因，如人和鼠的MRG15蛋白或MRG15基因。人MRG15基因定位于染色体15q24，cDNA序列全长为969bp，编码含323个氨基酸残基的约37kD的核内蛋白。人MRG15蛋白的氨基酸序列可见GenBank登陆号AAD29872.1，mRNA序列的GenBank登陆号为AF100615.1，完整的编码序列为AF100615.1所示序列的第132-1103位碱基序列。本文中，除非另有说明，“Mrg15”指鼠源MRG15基因，“MRG15”指人源MRG15基因。应理解的是，本发明所述的MRG15蛋白或MRG15基因包括本领域周知的突变体。这些突变体通常是动物体自身天然产生并携带的。即在本领域中可被称为“MRG15蛋白”或“MRG15基因”的这类蛋白或基因都包括在本发明范围之内。
本发明涉及MRG15蛋白活性的抑制和/或MRG15基因表达的抑制，用以抑制甘油三酯和胆固醇的从头合成从而降低血液中甘油三酯和总胆固醇含量，和/或改善葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。
在一些实施方案中，MRG15蛋白活性的抑制和/或MRG15基因表达的抑制可用于治疗或预防受益于甘油三酯含量降低的疾病或症状。通常，血清甘油三酯(TG)的正常水平为＜2.3毫摩尔/升，当＞4.5毫摩尔时为高TG血症。甘油三酯高(如＞2.3毫摩尔/升)容易造成“血稠”，在血管壁上沉积，渐渐形成小斑块，而血管壁上的这些块状沉积会逐渐扩大面积和厚度，使血管内径变小，血流变慢，从而加速堵塞血管的进程，严重时血流中断。阻塞物脱落还能造成血栓，发生在心脏可引起冠心病、心梗；在大脑可引起脑卒中、中风；在眼底会引起视力下降，失明；发生在下肢会引起下肢动脉狭窄或闭塞而致肢体坏死。此外，甘油三酯高还会引发高血压、胆结石、胰腺炎、老年痴呆等。因此，受益于甘油三酯含量降低的疾病或症状包括但不限于冠心病、心梗、脑卒中、中风、视力下降、失明、动脉狭窄或闭塞、高血压、胆结石、胰腺炎、老年痴呆以及动脉粥样硬化等。
在一些实施方案中，MRG15蛋白活性的抑制和/或MRG15基因表达的抑制可用于治疗或预防受益于总胆固醇含量降低的疾病或症状。通常，血清总胆固醇(TC)的正常水平为＜5.17毫摩尔/升，当≥6.47毫摩尔时为高TC血症。总胆固醇偏高会导致高胆固醇血症、冠心病、糖尿病、脑血栓、中风和肝硬化等疾病或症状。因此，受益于总胆固醇含量降低的疾病或症状包括但不限于高胆固醇血症、冠心病、糖尿病、脑血栓、中风和肝硬化等疾病或症状。
在一些实施方案中，MRG15蛋白活性的抑制和/或MRG15基因表达的抑制可用于治疗或预防代谢疾病，包括肥胖和肥胖相关的疾病。本文中，肥胖是一种慢性代谢性疾病，以体内脂肪细胞的体积和细胞数增加致体脂占体重的百分比异常增高并在某些局部过多沉积脂肪为特点。通常，可以体质指数(BMI)来评价对象是否属于肥胖：BMI＝体重(千克)/身高(米)的平方。如果BMI大于30，则认为对象肥胖。或者，也可采用腰围(WC)或腰臀比(WHR)来判断对象是否肥胖。肥胖除脂肪在体内贮存量多外，还有一种肥胖是体脂分布在内脏和腹壁，表现为大腹便便，被称之为向心性肥胖或腹部肥胖。腰围男性超过94cm，女性超过80cm，可作为肥胖的标准；腰臀比男性超过0.9，女性超过0.8可视为中心性肥胖。
本文中，肥胖相关的疾病包括但不限于2型糖尿病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低高密度脂蛋白胆固醇血症、高尿酸血症(痛风)、冠心病、高血压、胆石症、脂肪肝、肥胖性低通气综合征、肺心综合征、骨关节炎、骨质疏松和内分泌失调等。在某些实施方案中，肥胖相关的疾病为肥胖导致的代谢性疾病，如2型糖尿病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低高密度脂蛋白胆固醇血症、高尿酸血症、脂肪肝和脂肪组织炎症等。
本发明中，MRG15蛋白活性的抑制可采用本领域周知的技术实现。例如，可通过给予MRG15蛋白的抗体，拮抗其活性。MRG15抗体为本领域所周知，可使用市售抗体。抗体优选为人源化抗体。另外，抗体优选为单克隆抗体。或者，MRG15蛋白活性的抑制可通过表达突变的MRG15蛋白来实现，通常，该突变的MRG15蛋白作为转录因子的生物学活性下调或丧失。例如，可在对象细胞内表达同源重组载体，将编码其转录活性下调或丧失的MRG15蛋白的核酸序列重组如细胞的基因组内，替换正常的MRG15基因，使得对象细胞表达突变的MRG15蛋白。突变通常发生在MRG15蛋白的功能结构域内。例如，MRG15蛋白的C端形成保守的MRG区域，这个区域能在转录调控过程中和细胞因子相互作用；而其N端则具有染色质域，这是一种依赖ATP的、能移动核小体和修饰组蛋白的染色质重塑因子。因此，突变可发生在MRG15蛋白的C端结构域和/或N端结构域。突变可以是数量不限的插入、缺失或取代突变，只要使得突变的MRG15蛋白的转录活性下调或丧失即可。在一些实施方案中，也可使用小分子化合物来拮抗MRG15蛋白的生物学活性。
本发明中，可通过表达合适的核酸分子来抑制MRG15基因表达。这类核酸分子包括但不限于siRNA、反义RNA、核酶和基因编辑载体。siRNA是长20到25个核苷酸的双链RNA，参与RNA干扰(RNAi)，以带有专一性的方式抑制MRG15基因的表达。siRNA也可经由多种不同转染技术导入对象细胞内，并对MRG15基因产生具专一性的敲弱效果。可采用本领域周知siRNA设计原则设计siRNA。例如，可在MRG15mRNA中寻找一段20-25nt长、通常为21nt的以AA二核苷酸起始的序列作为siRNA靶位点。可采用化学合成、体外转录、siRNA表达载体以及PCR表达组件等方法制备感兴趣的siRNA。反义RNA是指与mRNA互补后，能抑制基因表达的RNA。反义RNA通常包括3类：I类反义RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和/或部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶III降解；II类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；III类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。核酶是具有催化功能的小分子RNA，能降解特异的mRNA序列。核酶可通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断靶基因的表达。基因编辑载体可以是本领域周知的CRISPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体。在一些实施方案中，所述基因编辑载体以AAV病毒载体为骨架载体构建得到。
可采用本领域周知技术制备适用于本发明的siRNA、反义RNA、核酶和基因编辑载体，并给予需要的对象，用于抑制MRG15基因的表达。
给药的方式依据试剂的不同而不同。例如，当使用AAV病毒载体作为骨架载体构建得到的基因编辑载体时，可通过静脉注射的方式给药。给药剂量也可根据不同对象的年龄、性别、所患疾病的种类和严重程度等加以确定。
在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其含有本文所述的以MRG15蛋白或基因为靶点、抑制MRG15基因表达或降低MRG15蛋白活性的试剂，和生理学或药学上可接受的载体或赋形剂。本文中，“生理上或药学上可接受的载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害所服用药物组合物中所述试剂的生物活性及性能的那些载体和稀释剂。“生理上或药学上可接受的赋形剂”是指加到药物组合物中进一步有利于所述试剂的服用的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
药物组合物中所述试剂以治疗有效量或预防有效量存在。有效量是足以改善或以某些方式减轻与疾病有关的症状的给药量。给药量是有效地改善或消除一个或多个病症的药量，可根据对象的年龄、性别、身体状态等由本领域普通技术人员加以确定。给药量也许可治愈疾病，但是给药通常是为了改善疾病的症状。一般需要反复给药来实现所需的症状改善。
本发明的药物组合物可被配制成任何合适的剂型，用于以口服、静脉注射或局部等方式给药。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物中除以MRG15蛋白或MRG15基因为靶点的试剂外，还含有其它的治疗肥胖或肥胖相关疾病的药物，和/或降血脂或总胆固醇的药物，如现有已知的其它减肥药物或治疗2型糖尿病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低高密度脂蛋白胆固醇血症、高尿酸血症(痛风)、冠心病、高血压、胆石症、脂肪肝、脂肪组织炎症、肥胖性低通气综合征、肺心综合征、骨关节炎、骨质疏松和/或内分泌失调的药物(指活性成分)。
在某些实施方案中，本发明还提供降血脂和/降总胆固醇的方法，肥胖或肥胖相关疾病的治疗或预防方法，所述方法包括给予需要的对象治疗或预防有效量的以MRG15蛋白或基因为靶点、抑制MRG15基因表达或降低MRG15蛋白活性的试剂或其药物组合物。
本文中，对象为哺乳动物，尤其指人。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例1：利用AAV病毒介导的CRISPR Cas9技术在小鼠肝脏中定向敲除Mrg15
通过细胞水平筛选，得到靶向小鼠Mrg15基因的高活性的sgRNA(GCCTCTTCTCTATGAAGCAAagg，SEQ ID NO:1)，将其克隆至AAV病毒载体AAV-Cre-T2A-Luci-sgRNA(载体改造自pAAV-GFP质粒(Cell Biolabs.Inc)，用TBG启动子(Vector Core,University of Pennsylvania)替换掉原有的CMV启动子，用Cre-T2A-Luciferase-sgRNA替换掉原有的GFP，其中，sgRNA的骨架部分来自于lenti CRISPR V2plasmid(Addgene，#52961))，分别包装成AAV-对照及AAV-Mrg15-sgRNA病毒，通过尾静脉注射的方式递送到8周龄CRISPR-Cas9KI雄性小鼠(Jackson laboratory)体内，两周后通过活体成像检测小鼠体内荧光素酶报告基因的表达情况。并且通过Western检测对照和Mrg15-sgRNA小鼠肝脏中MRG15蛋白的表达情况。
结果如图1所示。活体成像检测结果显示，携带TBG启动子的AAV病毒可以非常特异的在小鼠肝脏组织中表达(上图)。Western检测结果证明可以在肝脏中高效的敲除Mrg15(下图)。
实施例2：肝脏特异敲除Mrg15可降低小鼠血液中甘油三脂和总胆固醇的含量
对40只雄性Cas9小鼠进行随机分组，每组10只小鼠，饥饿四小时后，每只小鼠通过尾静脉取血的方式取约100ul血液，4℃、6000rpm离心20分钟，取血清分装，测量和冻存。其中两组小鼠进行常规喂养(NCD组)，并通过尾静脉注射病毒：AAV-对照(10只)组和AAV-Mrg15-sgRNA(10只)组，注射病毒1个月和2个月的时候进行取血，取血的方式和检测同前所述。另外两组小鼠进行高脂饮食喂养(HFD组)，并通过尾静脉注射病毒：AAV-对照(10只)组和AAV-Mrg15-sgRNA(10只)组，分别在注射病毒1个月和2个月的时候进行取血，取血的方式和检测同前所述。
结果如图2所示。在常规喂养的小鼠(NCD组)血液中，注射病毒进行基因敲除之前，甘油三脂和总胆固醇的水平无差异，注射病毒1个月和2个月以后，甘油三脂和总胆固醇的水平明显下调(上图)。在高脂喂养的小鼠(HFD组)血液中，注射病毒进行基因敲除之前，甘油三脂和总胆固醇的水平无差异，注射病毒1个月和2个月以后，甘油三脂和总胆固醇的水平明显下调(下图)。
实施例3：肝脏特异性敲除Mrg15可改善小鼠葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性
在实施例2的小鼠注射AAV病毒进行基因敲除后的第9周，对常规喂养小鼠(NCD组)和高脂喂养小鼠(HFD组)进行葡萄糖耐受实验(GTT)；第10周进行胰岛素敏感实验(ITT)。GTT的具体实验方法为：小鼠禁食14小时后通过腹腔注射的方式，按照1g/kg体重的剂量给予葡萄糖(国药，63005518)注射，用血糖仪(Abbott)在第0、15、30、60、90和120分钟监测血糖。ITT的具体实验方法为：小鼠禁食4小时后通过腹腔注射的方式，按照NCD组0.7U/kg体重，HFD组1.05U/kg体重的剂量给与重组人胰岛素(Nono Nordisk,H20133107)注射，用血糖仪(Abbott)在第0、15、30、60、90和120分钟监测血糖。
结果如图3所示。结果显示，常规喂养的小鼠(NCD动物)中，AAV-Mrg15-sgRNA组比AAV-对照组表现出更好的葡萄糖耐受能力(左上图)，且对胰岛素更加敏感(右上图)。高脂喂养小鼠(HFD动物)中，AAV-Mrg15-sgRNA组比AAV-对照组表现出更好的葡萄糖耐受能力(左下图)，且对胰岛素更加敏感(右下图)。
实施例4：肝脏特异性敲除Mrg15可改善高脂诱导的小鼠脂肪肝表型和附睾脂肪组织炎症
在实施例2的小鼠注射AAV病毒进行基因敲除后的第13周，对常规喂养小鼠(NCD组)和高脂喂养小鼠(HFD组)进行处死，记录小鼠的重量，对肝脏(liver)、皮下脂肪(iWAT)、附睾脂肪(eWAT)和褐色脂肪(BAT)分别进行拍照和称重，并对常规喂养小鼠(NCD组)和高脂喂养小鼠(HFD组)的肝脏进行甘油三酯和总胆固醇的含量测定；对组织进行HE染色，观察形态，对并对附睾脂肪(eWAT)进行F4/80进行免疫组化，标记巨噬细胞，指示炎症水平。
结果如4和5所示。图4显示，高脂喂养组AAV-Mrg15-sgRNA小鼠的肝重比明显下降(左上图)；高脂喂养组小鼠的肝脏形态(右上图)和HE染色(下图)结果都显示，敲除Mrg15后可以显著改善脂肪肝表型。
图5显示，高脂喂养组AAV-Mrg15-sgRNA小鼠的肝脏中含有更少的甘油三酯和总胆固醇(上图)；高脂喂养组小鼠的附睾脂肪中巨噬细胞免疫组化显示，敲除Mrg15后可以降低附睾脂肪组织中的炎症细胞浸润。
实施例5：肝脏敲除Mrg15后会抑制甘油三酯和胆固醇的从头合成
在实施例2的小鼠注射AAV病毒进行基因敲除后的第13周，对常规喂养小鼠(NCD组)和高脂喂养小鼠(HFD组)处死，取肝脏组织进行RNAseq测序，常规喂养组(NCD)和高脂组(HFD)的测序结果分别进行分析，以注射AAV-对照病毒的小鼠为对照。
对常规喂养组的RNAseq结果进行GO富集分析，结果显示在下表1和图6中。GO富集分析表明敲除后主要影响脂肪酸的代谢通路和胆固醇的合成通路(表1)。在甘油三酯和胆固醇从头合成通路中，有许多发挥关键作用的基因被发现在敲除组明显下调(左图是甘油三酯合成通路，右图是胆固醇合成通路，敲除后明显下调的基因包括甘油三酯合成通路中的Fitm1、Lpin1、Lpin2、Gpam、Cd36、Scd1、Scd2、Scd3、Scd4、Elovl5、Fasn、Acaca、Acacb和Acss2，以及胆固醇合成通路中的Fdps、Fdft1、Fdps、Idi1、Mvd、Pmvk、Mvk、Hmgcr、Hmgcs1、Acat2、Sqle、Lss和Dhcr7，这些基因名称后的括号中的数值为log2(下调的倍数))。
表1：NCD组中Mrg15敲除小鼠肝脏中下调的基因
生物学过程 P值
脂质代谢过程 9.65E-32
脂质生物合成过程 9.48E-21
类固醇代谢过程 2.30E-19
小分子代谢过程 3.03E-55
氧化还原过程 3.60E-30
对高脂喂养组的RNAseq结果进行GO富集分析，结果显示在下表2和图7中。GO富集分析表明敲除后主要影响脂肪酸的代谢通路(表2)。在甘油三酯(图7，左上图)和胆固醇(图7，右上图)从头合成通路中，有许多发挥关键作用的基因被发现在敲除组明显下调，包括甘油三酯合成通路中的Plin 2、Plin 4、Fitm1、Cidec、Lpin3、Mogat1、Agpat2、Agpat3、Gpam、Cd36、Scd1、Scd2、Scd3、Scd4、Elovl5、Fasn、Acaca和Acacb，以及胆固醇合成通路中的Mvd、Pmvk、Hmgcs1、Acat2、Lss、Dhcr7、Pcsk9和Srebf1，这些基因名称后的括号中的数值为log2(下调的倍数)。与炎症相关的基因表达明显下调(图7，下图)。
表2：HFD组中Mrg15敲除小鼠肝脏中下调的基因
Figure BDA0002078275420000111
Figure BDA0002078275420000121
实施例6：小鼠肝脏中Mrg15与基因组的结合呈现节律性变化
构建3×Flag-MRG15过表达质粒(将Flag标签加在小鼠Mrg15cDNA(NM_001039147.2)的N端，得到3xFlag-MRG15，再替换掉AAV-TBG-Cre-T2A-Luci-sgRNA的Cre部分)，包装AAV病毒，通过尾静脉注射的方式递送到8周龄C57野生雄性小鼠，在小鼠肝脏组织中特异性过表达3×Flag-Mrg15，注射病毒2周后在ZT10(5pm)和ZT22(5am)分别取小鼠肝脏组织进行Flag的ChIP-seq。
结果如图8、9和表3所示。ChIP-seq结果显示,在ZT22的时候Mrg15在全基因组范围内对DNA的结合更强(图8，左下图和右图)，总共有2581个峰(左上图)，而ZT10的时候Mrg15在全基因组范围内对DNA的结合要弱很多(左下图和右图)，只有38个峰(左上图)。
通过对MRG15在ZT22时的结合，并在敲除小鼠肝脏中下调的基因进行GO富集分析后发现，这些基因显著富集在脂肪酸代谢相关通路中(表3)；CHIP-seq显示Flag-MRG15在Srebf1、Pcsk9、Fasn等脂质从头合成相关基因的启动子区域呈现明显的节律性结合，在ZT22的时候结合明显强于ZT10(图9)。
表3：HFD组中Mrg15敲除小鼠肝脏中下调的基因
生物学过程 P值
血浆脂蛋白颗粒装配 4.93E-05
脂质代谢过程 1.14E-09
类固醇代谢过程 2.94E-08
小分子代谢过程 7.55E-12
脂质生物合成过程 7.65E-07
实施例7：营养状态影响Mrg15与脂质合成相关基因启动子的结合
对实施例6的肝脏3×Flag-MRG15过表达小鼠的常规进食时间进行逆转，即在夜晚(ZT12-ZT24)时对小鼠禁食，白天(ZT0-ZT12)的时候喂食，持续两周后，在ZT10(5pm)和ZT22(5am)分别取小鼠肝脏组织做Flag-MRG15的ChIP-qPCR。
结果如图10所示。结果显示，当对小鼠的进食时间进行逆转后，MRG15在脂合成相关基因Srebf1、Fasn、Acly、Acat2、Pcsk9、Elovl5启动子区域的结合情况也发生了逆转，即在ZT10的时候要显著强于ZT22。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> MRG15蛋白或基因作为靶点在代谢疾病治疗和预防中的应用
<130> 193716
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctcttctc tatgaagcaa agg 23

Claims (5)

1.以MRG15蛋白或MRG15基因为靶点的抑制MRG15基因表达或降低MRG15蛋白活性的试剂在制备治疗或预防受益于甘油三酯和/或总胆固醇含量降低的疾病或症状的药物中的应用；其中，所述试剂选自MRG15的抗体、能抑制MRG15基因表达的siRNA或抑制MRG15基因表达的基因编辑载体；所述药物为降血脂药、降胆固醇药、改善葡萄糖耐受性和/或胰岛素敏感性的药物、治疗脂肪肝的药物或治疗脂肪组织炎症的药物。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为所述试剂在制备降血脂药或降胆固醇药中的应用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为所述试剂在制备改善葡萄糖耐受性和/或胰岛素敏感性的药物中的应用。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因编辑载体为CRISPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述siRNA以MRG15 mRNA中的一段长20-25nt、以AA二核苷酸起始的序列为靶位点。
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