CN104694534B - 非小细胞肺癌标记物，其检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种非小细胞肺癌标记物及其应用。本发明所提供的非小细胞肺癌标记物包括在人体血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的两种或多种，如2、3、4种：miR‑7、miR‑25、miR‑193a‑3p，miR‑483‑5p。本发明还提供了用于检测非小细胞肺癌标记物的探针组合、试剂盒和生物芯片。此外，本发明还提供了一种检测肺癌病人血清中的微小核糖核酸的方法，通过肺癌病人血清中的微小核糖核酸的变化，在体外诊断非小细胞肺癌、预测非小细胞肺癌发病过程，判断并发症的发生，非小细胞肺癌复发的几率，及非小细胞肺癌的预后，并分析药效和疗效。

Description

非小细胞肺癌标记物，其检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种非小细胞肺癌标记物及其应用，尤其涉及使用包括至少两种选自四种在人血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体作为非小细胞肺癌标记物，进一步地，本发明还提供了用于检测所述非小细胞肺癌标记物的探针组合、试剂盒和生物芯片以及所述非小细胞肺癌标记物的应用，具体地，通过检测受试者血清中所述标记物的表达水平和变化，达到在体外辅助诊断非小细胞肺癌，预测并发症发生及癌症复发几率，以及非小细胞肺癌的预后等效果。

背景技术

在全球范围内，肺癌是发病率和死亡率都最高的癌症。中国的肺癌发病率高于全球平均水平。

根据统计数据，2009年，在中国肿瘤登记地区，肺癌的粗发病率为54.75/10万（男性为73.12/10万并且女性为36.08/10万；城镇人口中为57.96/10万并且农村人口中为42.80/10万）。中国人口（CASR）和世界人口（WASR）的发病年龄标准化率分别为24.98/10万和34.07/10万。在中国和城镇地区，这是最常见的癌症，在农村地区为第二常见的癌症。肺癌粗死亡率为46.07/10万（男性为62.47/10万并且女性为29.39/10万；城镇人口中为48.76/10万并且农村人口中为36.03/10万）。CASR和WASR的死亡率分别为20.09/10万和27.68/10万。在男性和女性中，城镇地区和农村地区，肺癌均为癌症死亡的首要原因。对于肺癌的发病率和死亡率，男性高于女性，城市地区高于农村地区。年龄特异性发病率和死亡率表明，在50岁之前，发病率和死亡率相对较低，随后显著增加，并在80-84年龄组达到峰值（Chen,W.,Zheng,R.,Zhang,S.,Zou,X.,Zhao,P.and He,J.(2013),Lung cancerincidence and mortality in China,2009.Thoracic Cancer,4:102–108.）。

其中，非小细胞肺癌为最常见的肺癌病理类型，约占肺癌总数的85%。而针对肺癌来说，准确的早期诊断是取得良好治疗效果的关键。

但是，现有的肺癌诊断技术仍不理想。非小细胞肺癌的传统诊断方法，包括影像学、支气管镜、肺组织活检等，由于这些技术各自的局限性，在实际应用中通常还需多项技术合并使用，反复检测。

肺癌的影像分析诊断方法，包括超声、胸部X线、胸部CT、PET显像等。超声为常规无创伤性检查，但仅对周围型肺部肿块的诊断效果最好。一些发病率低、早期胸部X线、CT表现和临床表现均缺乏特征性的病例，如细支气管肺泡癌（BAC,NSCLC的一种），其被误诊或漏诊的概率相当高。为提高诊断准确率，还需将纤维支气管镜检查与CT引导下活体组织检查相结合使用。CT检查的敏感度、特异度、准确度都较低，其应用的基于结节体积的判读体系存在局限，常导致误诊。PET技术存在固有缺陷，包括无法检测肿瘤体积及其对胸壁、纵膈及其他临近组织的浸润程度，故常与成熟的CT技术联用。PET/CT联用，方可提高敏感度、特异度、准确度。纤维支气管镜肺活检被认为是一种安全简便的检测肺疾病的方法，但是其对不同病因确诊率不一，对部分肺疾病也难以提供有价值的诊断信息。为弥补影像分析技术的不足，还常联用穿刺活检技术。但穿刺活检的诊断准确率也有限，且受病变类型和部位影响很大。

现在，越来越多的疾病标记物已经被发现并应用于临床疾病的普查、诊断和疗效的监控，但是它们的临床应用效果还存在着明显不足。例如，肿瘤标记物甲胎蛋白，乳酸脱氢酶，癌胚抗原等已被广泛应用于临床，但是这些疾病标记物还远远不能满足对癌症早期诊断的需要，其主要原因有两个方面：（1）上述疾病标记物的灵敏度和特异性相对较低，它们的检测结果还不能作为疾病确诊的指标；（2）疾病的早期诊断率应与治疗的效果呈现正相关，而上述任何一种疾病标记物还难以满足疾病的早期诊断的这种要求。以癌症为例，由于存在着肿瘤分化类别特异性过强、肿瘤整体敏感性较低、送检标本难以反复采取、标本保存要求条件高等缺陷，同时价格昂贵，因此在现有条件下难以广泛推广应用现有的肿瘤标记物。

目前，临床常用的检测肺癌的5种血清肿瘤标志物包括NSE、pm-GRP、CYFRA21-1、p53抗体和CEA，但即使优化联合使用数种标志物，检测的敏感性、特异性和有效性都有限。

微小核糖核酸(microRNA，简写作miRNA)，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，广泛存在于动植物细胞中。近五年来在人类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种微小核糖核酸分子。

微小核糖核酸通过识别靶mRNA的3’端非翻译序列，与之不完全互补，从而抑制靶mRNA的翻译，是mRNA强有力的调节因子，并在基因表达调控领域中起重要作用。

微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动密切相关，与许多疾病的发生及发展存在密切联系。疾病发生时，总有一些微小核糖核酸表达量是上调的，一些是下调的。最近研究发现，慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中几种微小核糖核酸的表达水平均有不同程度的下调（Lawrie CH,Gal S,Dunlop HM et al.Detection of elevated levelsof tumor-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-celllymphoma.Br J Haematol2008;141:672–675）；分析比较人肺癌、乳腺癌组织中微小核糖核酸表达时，发现有若干组织特定的微小核糖核酸的表达水平相对于正常组织发生了变化（Garofalo M,Quintavalle C,Di Leva G et al.MicroRNA signatures of TRAILresistance in human non-small cell lung cancer.Oncogene2008）。也有研究证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展并且与II型糖尿病等代谢性疾病有密切关联（Tryndyak VP,Ross SA,Beland FA,Pogribny IP.Down-regulation of the microRNAs miR-34a,miR-127,and miR-200b in rat liver duringhepatocarcinogenesis induced by a methyl-deficient diet.MolCarcinog.2008Oct21）。

这些结果提示微小核糖核酸表达与疾病发生和发展之间存在必然联系。微小核糖核酸完全可以作为一类新的疾病标志物，相比于传统的病理切片或单一使用的生化指标等手段，能更加准确地辅助诊断疾病，判断疾病的发展阶段，预测并发症发生和恶性疾病复发的几率，以及疾病的预后，并评价药效和疗效。

微小核糖核酸在作为疾病标志物方面的优势，使其成为近年研究的热点，相关技术及产品也相继涌现。

2011年，Rosetta Genomics推出了

lung诊断服务，该诊断技术通过检测受试者肺部组织样本，对受试者所患肺癌进行分型，以辅助制定治疗方案。

在专利号为200980148847.1的在先申请中，公开了微小核糖核酸在血清/血浆中稳定存在，且可作为生物标记物，协助诊断包括非小细胞肺癌在内的疾病，并公开了以26种微小核糖核酸中任意一种或多种的组合作为非小细胞肺癌辅助诊断方法的申请。但是该申请需要使用的标记物的种类多，相应的探针库比较大，并且准确率还不够理想。因此，在该申请的基础上，发明人继续研究并形成了本申请的技术方案。与在先申请相比，本申请中的标记物种类大大减少，相应的探针库得到极大简化，同时还能实现高诊断准确率。

发明内容

为克服上述缺陷，本申请人将研究目光投向较易获得，甚至常规体检中就可以收集到的血液。由于血液会循环至全身所有组织，并向细胞输送营养并清除废物，因此血液能够反映出整个机体的生理、病理状况，其检测结果对人体健康具有指导意义。

通过上述对血清/血浆微小核糖核酸与非小细胞肺癌的相关性的研究，发明人提出了以血清/血浆中稳定存在的特定微小核糖核酸作为非小细胞肺癌检测标记物，建立一种体外检测血清/血浆中稳定存在的特定微小核糖核酸的方法，通过检测特定微小核糖核酸的特异性变化来进行非小细胞肺癌的早期诊断，疾病鉴定和病程监控，复发及预后、并发症发生的预测，同时可以进一步进行药效判定，用药指南，个体化治疗，中药有效成份筛选，种群分类等研究。

因此，本发明的目的是提供一种在人体血清/血浆中稳定存在的，可用于检测非小细胞肺癌的标记物。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测非小细胞肺癌标记物的探针组合。

本发明的又一个目的是提供一种检测上述非小细胞肺癌标记物的方法。

本发明的另一个目的是提供上述非小细胞肺癌标记物的用途，包括制备相应的试剂盒和生物芯片。

本发明的再一个目的是提供使用上述标记物预测、诊断和/或评价非小细胞肺癌的方法。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。

一方面，本发明提供一种非小细胞肺癌标记物，所述标记物包括以下在人体血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体（Mature microRNA）中的两种或多种，如2、3、4种：miR-7、miR-25、miR-193a-3p，miR-483-5p，优选地所述标记物为miR-193a-3p和mir-483-5p的组合、miR-7与miR-25中的至少一种和miR-193a-3p和mir-483-5p中的至少一种的组合。

另一方面，本发明提供了一种上述标记物的检测方法，所述检测方法选自反转录聚合酶链式反应方法（RT-PCR）、实时荧光定量聚合酶链式反应方法（Real-time PCR）、微滴式数字PCR方法(Droplet Digital PCR)、Northern印迹杂交方法（Northern blotting）、核糖核酸酶保护分析方法（RNase protection assay）、Solexa测序技术（Solexa sequencingtechnology）、生物芯片方法和新一代测序方法(Next Generation Sequencing)中的一种或几种。

优选地，所述检测方法为RT-PCR方法，例如包括以下步骤的RT-PCR方法：

1）提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；

2）用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；

3）进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；

4）EB染色后在紫外灯下观察结果；

或者优选地，所述检测方法为Real-time PCR方法，例如包括以下步骤的Real-time PCR方法：

1）提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；

2）用微小核糖核酸设计引物；

3）加入荧光探针进行PCR反应；

4）检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化。

或者优选地，所述检测方法为Droplet Digital PCR方法，例如包括如下步骤的Droplet Digital PCR方法：

1）提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；

2）对样品进行微滴化处理；

3）用微小核糖核酸设计引物；

4）加入荧光探针进行PCR反应；

5）检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化。

或者优选地，所述检测方法为RT-qPCR方法，例如包括如下步骤的RT-qPCR方法：

1）提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；

2）对样品进行预扩增；

优选地，所述预扩增包括以下步骤：

a）配制含除cDNA和引物以外试剂的预扩增PCR体系母液，份数依逆转录得到的cDNA的份数来定；

b）取母液混合物放入PCR反应管中，加入对应的引物（包含正向引物、反向引物）及逆转的cDNA，组成20μl的反应体系，混合均匀。

c）将20μl的混合物进行PCR预扩增；

优选地，所述扩增条件为95℃10min，一个循环；95℃15s，60℃1min，12个循环；

3）qRT-PCR反应，并对待测的miRNA进行定量；

优选地，所述RT-qPCR方法中，使用ΔCT法处理数据，其中每个miRNA相对于标准内参的表达量用方程2^-ΔCT表示，ΔCT=CT样品-CT内参。

具体来说，本发明提供的检测受试者血清/血浆中的上述标记物的方法，可以进一步评价人体非小细胞肺癌的状态。所述检测人体血清/血浆中稳定存在且可检测的上述标记物的方法包括：反转录聚合酶链式反应方法（RT-PCR）、实时荧光定量聚合酶链式反应方法（Real-time PCR）、微滴式数字PCR方法(Droplet Digital PCR)、Northern印迹杂交方法（Northern blotting）、核糖核酸酶保护分析方法（RNase protection assay）、Solexa测序技术（Solexa sequencing technology）、生物芯片方法和新一代测序方法(NextGeneration Sequencing)中的一种或几种。

所述RT-PCR方法包括以下步骤：（1）收集血清/血浆样本，具体地，使用Trizol试剂提取血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；（2）用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；（3）进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；（4）EB染色后在紫外灯下观察结果。

所述Real-time PCR方法包括以下步骤：（1）收集血清/血浆样本，具体地，使用例如Trizol试剂提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；（2）用微小核糖核酸设计引物；（3）加入荧光探针例如EVA GREEN进行PCR反应；（4）分析处理数据并比较结果，具体地，检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化。

所述Droplet Digital PCR方法包括如下步骤：（1）收集血清/血浆样本，具体地，使用例如Trizol试剂提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；（2）对样品进行微滴化处理；（3）用微小核糖核酸设计引物；（4）加入荧光探针例如EVA GREEN进行PCR反应；（5）分析处理数据并比较结果，具体地，检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化。

所述Northern印记杂交方法包括以下步骤：（1）收集血清/血浆样本；（2）通过Trizol试剂提取血清/血浆总RNA；（3）进行变性PAGE电泳和膜转移实验；（4）制备同位素标记微小核糖核酸探针；（5）进行膜杂交反应；（6）同位素信号检测，如磷屏扫描检测结果。

所述核糖核酸酶保护分析方法包括如下步骤：（1）进行反义RNA探针的合成，同位素标记与纯化；（2）收集血清/血浆样本并提取RNA；（3）将提取后的RNA溶解在杂交缓冲液中并加入反义RNA探针进行杂交反应；（4）加入RNase消化液进行反应；（5）进行电泳与放射自显影；（6）分析结果。

所述Solexa测序技术方法方法包括如下步骤：（1）收集血清/血浆样本；（2）通过Trizol试剂提取血清/血浆总RNA；（3）进行PAGE电泳回收17-27nt RNA分子；（4）将adaptorprime酶联在小RNA分子的3'与5'端；（5）进行RT-PCR反应后并进行测序；（6）数据分析与处理。

所述生物芯片方法包括如下步骤：（1）将全部五百多种人微小核糖核酸成熟体库点阵并制备生物芯片；（2）收集血清/血浆样本；（3）提取血清/血浆总RNA；（4）通过柱分离来分离微小核糖核酸；（5）利用T4RNA连接酶进行微小核糖核酸荧光标记；（6）与生物芯片进行杂交反应；（7）数据检测与分析。

本发明通过上述的反转录PCR，实时定量PCR，Northern印记杂交方法，核糖核酸酶保护分析方法，Solexa测序技术和生物芯片等方法分析在非小细胞肺癌发生中血清/血浆微小核糖核酸的变化趋势及变化量，以及它们与非小细胞肺癌的相关性。

本发明也提供一种预测、诊断和/或评价非小细胞肺癌的方法，该方法包括检测上述标记物，优选地，该方法包括采用上述检测方法检测上述标记物。

本发明提供了上述非小细胞肺癌标记物在制备预测、诊断和/或评价非小细胞肺癌的试剂或工具中的用途。

本发明还提供了一种用于检测非小细胞肺癌标记物的微小核糖核酸探针组合，也即预测、诊断和/或评价非小细胞肺癌的小核糖核酸探针组合，所述探针组合包括以下核苷酸序列所示的探针中的两种或多种，如2、3、4种；优选地所述探针组合为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4的组合、SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2中的至少一种和SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的至少一种的组合。

表1

miRNA	对应的探针序列	序列编号
			miR-7	CAACAAAATCACTAGTCTTCCA	SEQ ID NO.1
miR-25	TCAGACCGAGACAAGTGCAATG	SEQ ID NO.2
			miR-193a-3p	ACTGGGACTTTGTAGGCCAGTT	SEQ ID NO.3
miR-483-5p	CTCCCTTCTTTCCTCCCGTCTT	SEQ ID NO.4

本发明提供了一种用于检测非小细胞肺癌标记物的试剂盒，也即预测、诊断和/或评价非小细胞肺癌的试剂盒，该试剂盒包括检测上述标记物的工具。优选地，其中所述工具包括上述的用于检测非小细胞肺癌标记物的微小核糖核酸探针组合；更优选地，所述工具还包括聚合酶、脱氧核糖核苷酸。将筛选出来的与非小细胞肺癌相关的特异性变化的微小核糖核酸引物或其相应的探针序列收集到PCR试剂盒（RT-PCR或Real-time PCR）中即可制备非小细胞肺癌诊断试剂盒。

本发明还提供了一种用于检测非小细胞肺癌标记物的生物芯片，也即预测、诊断和/或评价非小细胞肺癌的生物芯片，该生物芯片包括检测上述标记物的元件。优选地，其中所述元件包括如上述的用于检测非小细胞肺癌标记物的微小核糖核酸探针组合。将筛选出来的与非小细胞肺癌相关的特异性变化的微小核糖核酸的反向互补序列作为探针点在芯片上，就制成了专门针对非小细胞肺癌的血清/血浆微小核糖核酸检测生物芯片。

具体而言，在任何包括以上微小核糖核酸标记物的组合、方法、试剂盒或生物芯片中，所述评价受试者的非小细胞肺癌状态可以为测定受试者给予待测物（用于治疗非小细胞肺癌的药物）后的非小细胞肺癌状态，具体用于筛选待测物的预防和/或治疗非小细胞肺癌的活性；所述评价受试者的非小细胞肺癌状态可以为诊断和/或鉴别诊断受试者的疾病；所述评价受试者的非小细胞肺癌状态可以为评价对受试者的疾病进行治疗的有效性；所述评价受试者的非小细胞肺癌状态可以为对受试者发生非小细胞肺癌的几率进行预测，所述发生非小细胞肺癌具体为非小细胞肺癌并发症的发生和/或非小细胞肺癌的复发。

目前对疾病进行临床诊断的传统生物化学及分子生物学技术还比较繁琐和粗糙。近年来发展起来的可能用于疾病诊断的新型技术有基因芯片和蛋白质（抗体）芯片技术等。基因芯片所测量的mRNA水平变化并不能完全反映真正的蛋白质水平的改变。因为蛋白质的生物活性与转录后修饰，如糖基化、磷酸化等密切相关。并且，对于许多疾病检测而言，基因芯片技术无法检测体液和血液中标记物分子。蛋白质(抗体)芯片技术和蛋白质组学技术也有其局限性。人体内特别是血清/血浆中含有数以万计的蛋白和多肽片断，它们浓度分布广，明确报道的蛋白很少，定量化的就更少了。在这数量庞大的蛋白质组中找寻与特定疾病有密切关联的蛋白质，并理解其在组织病变中的作用仍然是一项极其艰巨的工作，而且，缺乏完善的抗体资源将会是制约抗体芯片技术发展的一个瓶颈问题。血清/血浆微小核糖核酸检测技术，基于血清/血浆微小核糖核酸的生物芯片和诊断试剂盒技术巧妙地将血清/血浆微小核糖核酸的独特性质和常规分子生物学检测技术结合为一体，它们可以快速地高通量地分析非小细胞肺癌血清/血浆中微小核糖核酸的组成，临床适用性极强。由于器官组织的生理状态变化会引起血清/血浆微小核糖核酸组成的改变，因此血清/血浆微小核糖核酸可以作为“疾病指纹”，协助实现非小细胞肺癌的早期诊断。

综上所述，本发明具有如下优点：

（1）本申请选取特定的血清/血浆微小核糖核酸作为新型的非小细胞肺癌标记物，具有灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、样本易存放（血清/血浆-20℃存放即可）等优点，该方法可广泛用于疾病普查等相关工作，成为早期诊断疾病的有效手段。

（2）血清/血浆微小核糖核酸作为新的疾病标记物将改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高疾病的临床检出率和实现疾病的早期诊疗。

（3）血清/血浆微小核糖核酸检测技术检测的是一系列疾病相关标记物，因而能够克服病人个体之间的差异（如年龄、性别、种族、饮食和环境等），而这正是单一疾病标记物所无法逾越的一个主要问题。

（4）本申请选择的标记物数量适中，并且克服了传统诊断方法存在的固有缺陷，不需要多种方法的联用，有利于减轻患者的痛苦，并且诊断效果较为理想。

总之，本发明可以进一步应用于协助早期诊断非小细胞肺癌，这种新的血清/血浆非小细胞肺癌标记物为人们在分子水平上了解非小细胞肺癌的机理提供了物质基础，有利于该疾病的治疗和良好预后。

附图说明

图1显示正常人血清中直接检测到的部分微小核糖核酸的RT-PCR结果。

图2显示提取正常人血清中RNA并检测其中微小核糖核酸的RT-PCR结果。

在图1和图2中，U6是分子量为100bp的snRNA，作为微小核糖核酸实验的内参照分子，其余的12个代号分别代表血细胞特异性的微小核糖核酸miR-181a（181a）、miR-181b（181b）、miR-223（223）、miR-142-3p（142-3p）、miR-142-5p（142-5p）、miR-150（150），来自心肌及骨骼肌的微小核糖核酸miR-1（1）、miR-133a（133a）、miR-206（206），来自脑组织的微小核糖核酸miR-9（9）、miR-124a（124a），以及来自肝脏的微小核糖核酸miR-122a（122a）。

图3分别显示小鼠、大鼠、胎牛、小牛和马血清中直接检测到的部分稳定表达的微小核糖核酸RT-PCR结果。

图4显示再生障碍性贫血、乳腺癌、骨肉瘤、中枢神经系统淋巴瘤和糖尿病患者血清中部分微小核糖核酸相对于正常人血清中微小核糖核酸的变化量。

图5为聚类分析中，miR-483-5p的折线图。

图6示出四种miRNA的聚类分析结果。

图7示出为四个标记物组合的ROC曲线。

图8示出为三个标记物组合的ROC曲线。

图9示出为两个标记物组合的ROC曲线。

图10示出为单个标记物的ROC曲线。

图11为不同的标记物及其组合的AUC值。

图12显示在肺癌与其他疾病血清样本中，四种miRNA相对于正常人血清中miRNA的表达变化。

具体实施方式

可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。

实施例1血清/血浆中微小核糖核酸的RT-PCR实验

使用RT-PCR技术发现并证明人和动物血清/血浆中稳定存在各种微小核糖核酸，而且其表达量相当丰富。具体步骤为：

（1）收集小鼠、大鼠、正常人及某些病人的血清/血浆；

（2）制备cDNA样品。该操作有两种方案，一种方案为将10μl血清/血浆直接进行逆转录反应，另一种为使用Trizol试剂（Invitrogen公司）先提取血清/血浆总RNA（10ml血清/血浆通常能富集约10μg左右的RNA），然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl5×AMV buffer、2μl10mM each dNTP mixture（Takara公司）、0.5μl RNaseInhibitor（Takara公司）、2μl AMV（Takara公司）以及1.5μl基因特异性反向引物混和物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；

（3）PCR及电泳观察。将cDNA按1/50稀释，取1μl稀释后的cDNA，加入0.3μl Taq酶（Takara公司），0.2μl10μM正向引物，0.2μl10μM通用反向引物，1.2μl25mM MgCl2，1.6μl2.5mM dNTP（Takara公司），2μl10×PCR buffer，13.5μlH2O，20μl体系进行PCR。PCR的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。PCR产物取10μl进行3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外灯下观察。

具体实验结果见图1。图1是以取自正常人的血清为研究对象，将血清直接进行RT-PCR的实验结果。选用人全部五百多个微小核糖核酸成熟体进行PCR反应，图1为其中的12种微小核糖核酸。它们分别是血细胞特异性的微小核糖核酸miR-181a、miR-181b、miR-223、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-150，来自心肌及骨骼肌的微小核糖核酸miR-1、miR-133a、miR-206，来自脑组织的微小核糖核酸miR-9、miR-124a，以及来自肝脏的微小核糖核酸miR-122a。从结果可以看出，上述四种组织来源的微小核糖核酸在血液中都能检测到，并非全部五百多个微小核糖核酸成熟体在血清/血浆中都有高丰度表达，有些微小核糖核酸是很微量的，甚至不能正常检测到。

为了进一步验证血清/血浆中稳定存在这些微小核糖核酸，先提取正常人血清中的RNA，然后选用人全部五百多个微小核糖核酸成熟体进行PCR实验，结果如图2所示。图2的结果与图1的结果很吻合，PCR产物单一，表明这两种实验方法都能检测到人血清/血浆微小核糖核酸的表达和丰度，证明在人血清/血浆中稳定地存在多种组织来源微小核糖核酸。此外，用同样的方法检测了小鼠、大鼠、胎牛、小牛和马血清中五百多个微小核糖核酸的表达和丰度，同样发现不同组织来源的微小核糖核酸在小鼠、大鼠、胎牛、小牛和马血清中有稳定表达，结果如图3所示。

实施例2血清/血浆中微小核糖核酸的real-time PCR实验

为了研究非小细胞肺癌疾病过程中血清/血浆微小核糖核酸的特异变化，进行了血清/血浆微小核糖核酸的定量PCR实验。定量PCR实验原理及实验步骤同RT-PCR一样，唯一不同是在PCR的时候加入了荧光染料EVA GREEN。仪器使用的是ABI Prism7300荧光定量PCR仪，反应条件为95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。数据处理方法为ΔΔCT法，CT设为反应达到域值时的循环数，则每个微小核糖核酸相对于标准内参的表达量可以用方程2-ΔCT表示，其中ΔCT=CT样品-CT内参。将病人血清/血浆样本与正常人血清/血浆样本直接进行逆转录反应，通过定量PCR反应比较其中所含微小核糖核酸的量。

选取再生障碍性贫血、乳腺癌、骨肉瘤、中枢神经系统淋巴瘤、糖尿病病人血清样品，同时用人全部五百多个微小核糖核酸成熟体进行PCR实验。图4是上述提及的血细胞特异性miR-181a、miR-181b、miR-223、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-150，心肌及骨骼肌的微小核糖核酸miR-1、miR-133a、miR-206，来自脑组织的微小核糖核酸miR-9、miR-124a，以及来自肝脏的微小核糖核酸miR-122a在正常人和病人血清中进行定量PCR的实验结果。再生障碍性贫血、乳腺癌、骨肉瘤、中枢神经系统淋巴瘤、糖尿病病人血清中微小核糖核酸的量相对于正常人的量的比值分别有上调和下调，而且同一组织来源微小核糖核酸在不同疾病中变化程度不同，表明血清/血浆微小核糖核酸在不同疾病中有特异性变化，它们可以作为一类新的疾病诊断的标记物。

实施例3用于诊断非小细胞肺癌的血清/血浆微小核糖核酸芯片

芯片操作流程为：

（1）提取血清/血浆中总RNA，甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量；

（2）微小核糖核酸的分离：取50-100μg总RNA用Ambion's miRNA Isolation Kit（Cat#.1560）分离微小核糖核酸；

（3）微小核糖核酸样品的荧光标记：利用T4RNA连接酶标记方法进行荧光标记，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交；

（4）杂交与清洗：将RNA溶于16μL杂交液中（15%甲酰胺；0.2%SDS；3×SSC；50×Denhardt's solution），于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2%SDS，2×SSC的液体中洗4分钟，而后在0.2×SSC液体中室温洗4分钟，玻片甩干后即可用于扫描；

（5）芯片扫描：芯片用LuxScan10K/A双通道激光扫描仪进行扫描；

（6）数据提取及分析：采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，最后用SAM分析挑选差异表达基因。

将定量PCR技术和生物芯片技术双重验证的在非小细胞肺癌及正常生理状态下差异表达程度大的一类血清/血浆微小核糖核酸探针，用于制备生物芯片，方法同上。此芯片与传统芯片相比，制作工艺和操作流程没有很大改进，但是此芯片简化了探针库，由此将大大减少芯片的制作成本和生产时间，易于制备。同时也增加了芯片的针对性和实用性。将此芯片投入实践，仅仅需要病人的血清/血浆而不需要任何其它组织就可以在早期发现疾病，帮助指导诊断和治疗。

实施例4用于非小细胞肺癌诊断与预测的微小核糖核酸试剂盒

用于非小细胞肺癌的诊断、疾病并发症的发生和复发的预测，疗效评价，以及药物活性成分的筛选、药效评价的微小核糖核酸试剂盒的制作工艺和操作流程是基于定量和半定量PCR技术和生物芯片技术。

此试剂盒包括血清/血浆微小核糖核酸引物、该微小核糖核酸为人体血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体（Mature microRNA）中的两种或多种，如2、3、4种：miR-7、miR-25、miR-193a-3p，miR-483-5p，所述标记物可以为miR-193a-3p和miR-483-5p的组合、miR-7与miR-25中的至少一种和miR-193a-3p和miR-483-5p中的至少一种的组合。将该微小核糖核酸引物或其相应的探针序列收集到PCR试剂盒（RT-PCR或Real-timePCR）中即可制备非小细胞肺癌诊断试剂盒，所述试剂盒还包括Taq酶、dNTP等试剂。

该试剂盒属于本领域技术人员的常规技术手段，因此不赘述。

实施例5使用四个及多个标记物组合，以及单个标记物的诊断效果检验

其中，检验的可信度设为95%。

5.1四个标记物组合的诊断效果检验

5.1.1使用RT-qPCR技术，检测血清样本中miR-483-5p、miR193a-3p、miR25和miR7的表达水平。

血清样本制备步骤如下：

1)将100μl血清放入已除酶的1.5ml离心管中，加入300μl DEPC水稀释，涡旋混匀。

2)混匀毕，加入200μl酸性水饱和酚并剧烈震荡，室温静置两分钟，然后加入200μl氯仿，剧烈震荡在室温静置5min后4℃，16000g，离心5min。

3)离心毕，取上清，加入上清1/10体积的醋酸钠溶液（浓度=3M/L，pH=5.3）并加入上清两倍体积的异丙醇，涡旋混匀后-20℃静置1h，4℃，16000g离心20min。

4)离心毕，去上清，留RNA沉淀，加入1ml75%DEPC乙醇，涡旋混匀，洗涤RNA沉淀，洗涤毕4℃，16000g，离心20min。

5)离心毕，去上清，留沉淀，在室温下晾干沉淀约10min后加入20μl DEPC水，溶解RNA沉淀。待RNA完全溶解之后放入-70℃低温冰箱留存待用。

试验详细操作步骤和反应条件如下：

1）逆转录反应（10μl反应体系）的组成如表1所示

表1逆转录反应（10μl反应体系）组成

试剂	体积
		DEPC水	3.5μl
5×AMV buffer	2μl
		10mM dNTP	1μl
RT-primer	1μl
		AMV酶	0.5μl
RNA	2μl

2）预扩增反应

运用含有特异正向引物、反向引物的检测试剂盒对待测miRNA进行预扩增PCR反应，具体操作如下：

a）配制含除cDNA和引物以外试剂的预扩增PCR体系母液，如表2所示，份数依逆转录得到的cDNA的份数来定。

表2预扩增PCR体系母液组成

试剂	体积
		DEPC水	13.77μl

10*PCR buffer	2μl
		25mM MgCl<sub>2</sub>	1.2μl
10mM dNTP	0.4μl
		Taq酶	0.3μl
Probe	0.33μl
		cDNA	2μl

预扩增cDNA由逆转录得到。

b）取17.67μl的母液混合物放入PCR反应管中，加入对应的引物（包含正向引物、反向引物）0.33μl及逆转的cDNA2μl，组成20μl的反应体系，混合均匀。

c）将20μl的混合物进行PCR预扩增，扩增条件为95℃10min，一个循环；95℃15s，60℃1min，12个循环。

3）qRT-PCR反应

qRT-PCR反应20μl反应体系的组成如表3所示

表3qRT-PCR反应20μl反应体系的组成

试剂	体积
		DEPC水	14.77μl
10*PCR buffer	2μl
		25mM MgCl<sub>2</sub>	1.2μl
10mM dNTP	0.4μl
		Taq酶	0.3μl
Probe	0.33μl
		cDNA	1μl

运用含有特异正向引物、反向引物和MGB探针的检测试剂盒对待测miRNA进行定量。

5.1.2检测结果处理

血清miRNA表达测定数据处理方法为ΔCT法。CT为反应达到域值时的循环数，则每个miRNA相对于标准内参的表达量可以用方程2^-ΔCT表示，其中ΔCT=CT样品-CT内参。

检测样本共47例，其中包括19个肺癌样本（A31-A49），19个正常人样本（N27-N45）和9个肺炎样本（B1-B9）。

分别检测各样本中miR-483-5p、miR-193a-3p、miR-25和miR-7这四种miRNA的表达水平；可挑选内源性miRNA作为内参，此试验中使用miR let-7dgi的组合作为内参。

检测分为两组，第一组包括10个正常人样本（N27-N36）和10个肺癌样本（A31-A40），检测结果如表4所示：

表4四种miR在正常样本和肺癌样本中的表达水平的相对变化

第二组包括9个正常人样本（N37-N45）、9个肺炎样本（B1-B9）和9个肺癌样本（A41-A49）。检测结果如表5所示：

表5四种miR在正常样本、肺炎样本和肺癌样本中的变化及四种miRNA与miRNAlet-7dgi的相对变化

对47例样本数据的4个标记物分别进行异常值检验，以便进行聚类分析，以验证标记物对样本的分类能力。异常值检验方法为：统计均值、标准差，剔除超过均值±3SD范围的异常值，详细统计结果见表6。

表6标记物实验数据的描述性统计

根据以上标准，样本A39的值属于异常值，在后续聚类分析中剔除。

另外，由miR-483-5p的折线图（图5）也可以直观反映。

将4个标记物的实验数据采用Z标准化的方法进行处理，然后运用cluster3.0，以Centroid linkage方法对剔除异常值且标准化处理后的实验数据进行聚类分析。

从所得的聚类树中可以发现样本可以被分成两类，详见图6，图中：

A代表非小细胞肺癌患者，集中在图上端；N和B分别代表正常人和肺炎患者，集中在图下端。其中，A43为异常值。

第一类：A31，A36，A35，A38，A40，N32，A33，A45，N27，A34，A42，A46，N29，N34，A49，N31，N35，A32，A37，A47，A44，A41，A48，N28，N42；

第二类：N33，N36，N37，N41，N44，N38，N43，A43，N39，N40，N45，N30，B2，B3，B4，B9，B5，B7，B6，B8，B1。

观察聚类树可知，实验样本被明确分为两类，其中肺癌患者除A43以外都被分在第一类中。由此可见，这4种标记物可以明确地将肺癌患者辨识出来。

对上述样本进行风险打分，以准确判定样本是否患病。具体的打分方法如下：

为了进行风险评分，以正常范围单侧90%上限为参考值划分得分（>=90%分位数记1，<90%分位数记0）。将每个miRNA的风险评分记为S，用计算公式表达为：

其中，i表示第i个样本，j表示第j个miRNA。

miR-483-5p、miR-193a-3p、miR-25、miR-7这四个miRNA的参考值如表7所示：

表7四种miRNA的参考值

marker	参考值
		miR-483-5p	22.4558
miR-193a-3p	0.3751
		miR-25	0.0168
miR-7	0.2358

对这四个miRNA分别进行一元logistic回归，以得到的回归系数作为该miRNA的权重。依据每个miRNA的权重和参考值划分的得分对每个样本进行打分，结果采用向上取整法处理，得到每个样本的风险评分。

考虑到每个miRNA评估非小细胞肺癌风险的权重不同，根据对miRNA的表达水平的线性组合给每个病人建立了一个风险评分的函数。依据K个miRNA的相关资料，i样本的风险评分函数是：

在上面的公式中，S_ij是上述对于样本i中

的风险评分。W_j是miRNA_j的风险评分的权重，即上述将4个单变量逻辑斯蒂回归模型拟合计算出的回归系数，而回归系数中的sign则决定了风险评估函数中的sign。然后，使用频率表和ROC曲线来评价样本群体中的诊断效果。

对上述4个标记物分别做logistic回归，可信度设为90%，结果如表8显示。

表8四种miRNA的logistic回归结果

将上述结果代入风险打分公式，得到各样本的打分结果，如表9所示：

表9各个样本的打分结果

样本共分为六个风险评价水平。对样本中肺癌患者、肺炎患者和正常人不同级别的风险评分进行了统计，详见表10。在表10中，表格的第一行表示的是所评估样本的风险评分分数；第二至四行分别表示在某个风险评分分数下的肺癌患者、肺炎患者、正常人数目；采用统计分析软件（SAS）进行统计分析，设定风险评分数值为2，若样本风险评分≥2，则划分为非小细胞肺癌患者，若样本风险评分<2，划分为正常人。

表10风险评分统计表

从表中数据可知，肺癌患者的风险评分明显高于肺炎患者和正常人；肺炎患者次之，说明肺炎对肺癌的诊断有着一定的干扰效果；正常人的风险评分则普遍偏低。取cut-off值为2时（即评分>=2的认为患有肺癌，<2的认为没患有肺癌），灵敏度为89.47%，特异性为67.86%，约登指数为0.57，说明此非小细胞肺癌标记物组合对肺癌的诊断效果良好。

根据一系列不同的临界值（cut-off值），以真阳性率（灵敏度）为纵坐标，假阳性率（1-特异度）为横坐标，绘制四个标记物的ROC曲线，依据其曲线下面积来判断这四个标记物对肺癌的诊断效果。结果见表11、图7。

表11四个标记物组合的ROC曲线下面积

检验结果变量:

miR-483_miR-193a_miR-25_miR-7

a.在非参数假设下

b.零假设：实面积=0.5

由ROC曲线分析可知，四个标记物组合的ROC曲线下面积与0.5相比存在显著差异，对肺癌的诊断效果好。

5.2三个标记物组合的诊断效果检验

使用RT-qPCR技术，分别检测血清样本中miR-483-5p、miR-193a-3p、miR-25和miR-7四个标记物中任意三个组合的表达水平。样本制备及检测方法如5.1所述。

绘制上述三个组合的ROC曲线，依据其曲线下面积判断各种组合对肺癌的诊断效果。计算方法为以logistic回归的回归系数作为权重，计算三个标记物组合的风险评分。结果见图8和表12。

表12三个标记物组合的ROC曲线下面积

a.在非参数假设下

b.零假设：实面积=0.5

由ROC曲线分析结果可知，三个标记物组合的ROC曲线下面积与0.5相比都存在显著差异。

5.3两个标记物组合的诊断效果检验

使用RT-qPCR技术，分别检测血清样本中miR483-5p、miR193a-3p、miR25和miR7四个标记物任意两两之间组合的表达水平。样本制备及检测方法如5.1所述。

绘制四个标记物两两之间组合的ROC曲线，依据其曲线下面积判断各种组合对肺癌的诊断效果。计算方法为：任一标记物起跳即判断为患病。结果见图9和表13，其中，图9中miR483-5p_miR25和miR483-5p_miR7的折线重合（详见表13中的数据）。

表13两个标记物组合的ROC曲线下面积

a.在非参数假设下

b.零假设：实面积=0.5

由ROC曲线分析结果可知，miR483-5p分别与miR25、miR7的组合ROC曲线下面积与0.5相比存在差异，其他组合均存在显著性差异。

5.4单个标记物的诊断效果检验

使用RT-qPCR技术，分别检测血清样本中miR483-5p、miR193a-3p、miR25和miR7的表达水平。样本制备及检测方法如5.1所述。

绘制单个标记物的ROC曲线，依据其曲线下面积来判断这单个标记物对肺癌的诊断效果。结果见表14、图10。

表14单个标记物的ROC曲线下面积

a.在非参数假设下

b.零假设：实面积=0.5

由ROC曲线分析结果可知，验证出来的4个标记物的ROC曲线下面积与0.5相比存在显著性差异。

通过绘制ROC曲线并检验曲线下面积可知，本实施例验证的4个标记物（miR-483-5p、miR-193a-3p、miR-25、miR-7）不论是单个还是任意组合都有着较好的诊断效果，如图11所示。

实施例10作为非小细胞肺癌标记物的微小核糖核酸敏检测特异性判断

使用RT-qPCR技术，分别检测非小细胞肺癌、肺炎、肝癌和胃癌患者血清样本中miR-483-5p、miR193a-3p、miR25和miR7的表达水平，以验证所述四种微小核糖核酸对非小细胞肺癌的特异性。

血清样本制备步骤、试验详细操作步骤和反应条件皆如实施例5.1所述。

miRNA表达测定数据处理方法为ΔCT法。CT为反应达到域值时的循环数，则每个miRNA相对于标准内参的表达量可以用方程2-ΔCT表示，其中ΔCT=CT样品-CT内参。血清miRNA的内参在此仍采用let-7dgi组合。

检测结果如图12所示。由图12可见，与非小细胞肺癌样本相比，所述四种miRNA组成的标记物在肺炎、肝癌和胃癌样本中并不发生如本申请所述的变化。即所述标记物对非小细胞肺癌具有特异性。

Claims (2)

1.非小细胞肺癌标记物在制备预测、诊断和/或评价非小细胞肺癌的试剂或工具中的用途；所述的非小细胞肺癌标记物由miR-193a-3p、miR-483-5p、miR-7与miR-25组成。

2.一种用于检测非小细胞肺癌标记物的微小核糖核酸探针组合，其特征在于，所述探针组合为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4的组合。

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