CN104818322A - miRNA和Cyfra21-1联合在检测非小细胞肺癌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种miRNA和Cyfra21-1联合在检测非小细胞肺癌中的应用。本发明公开检测miR-652、miR-660和Cyfra21-1表达水平的物质在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用。本发明发现miR-652+miR-660+Cyfra21-1这种组合对非小细胞肺癌具有最优的检测效率，该组合对于非小细胞肺癌的检测效率要优于其中两个miRNA的组合和单独的Cyfra21-1(p<0.01)。本发明公开的组合物在非小细胞肺癌的检测中具有重要应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种miRNA和Cyfra21-1联合在检测非小细胞肺癌中的应用，属于生物医疗领域。
背景技术
肺癌是全世界发病率、死亡率最高的恶性肿瘤，大约80％的肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)，主要分为两种亚型：肺腺癌(ADC)和肺鳞癌(SCC)。到目前为止，治疗非小细胞肺癌最有效的方法是手术治疗，然而，患者通常在早期时没有明显的症状，这就使得部分患者丧失了最佳的治疗时机。目前常用的肺癌诊断方法有胸部X片、CT和其它影像学方法。但是，低剂量螺旋CT和胸部X片都有较高的假阳性率。此外，低剂量螺旋CT还存在过度诊断和射线诱导癌变这两个潜在的危险。因此，我们希望能够找到一个具有较高的诊断敏感度和特异度的方法来辅助肺癌的诊断。
近年来，循环miRNA能够作为疾病标志物这一发现引起了众多科学工作者的兴趣，尤其是作为肿瘤诊断标志物方面更是备受关注。miRNA是一类内源性、高度保守的非编码小分子RNA，长度约为18-23个碱基。已有报道证明miRNA在癌症的发病机理和发生发展过程中起到了一定的作用，并且它能够起到类似癌基因或抑癌基因一样的功能。自从Mitchell等和Chen等对循环miRNA进行了一个较为系统的报道之后，循环miRNA立即受到了众多科研人员的关注。早先的研究发现miRNA可以在血清或者血浆中稳定存在，不受反复冻融或者pH变化的影响，并且能够被分离出来进行进一步的研究。更重要的是，通过抽血检测其中物质的变化就能指示患者的健康状况是一种微创的方法，能够减轻病人的痛苦，因此可以作为一种较好的筛查或者辅助诊断的方式。近几年来，有研究显示血清中的miRNA可以作为非小细胞肺癌的标志物，而且一些循环miRNA已被证实有助于那些需要进一步进行CT筛查患者的早期诊断。
尽管miRNA对于癌症诊断来说是一个很有前景的标志物，某些miRNA的诊断价值在不同的研究中变化比较大。McDonald等人发现一些数据分析前和数据分析方法上的差异对循环miRNA的诊断效率影响颇大。他们发现不同的RNA的提取方法是导致实验内部不精确性的主要原因。因为miRNA较短并且在血液中的含量较低，通过柱子吸附来提取miRNA方法的稳定性还有待商榷。此外，尽管传统的Trizol提取方法的精确度要优于柱子吸附的方法，但其操作流程相对比较繁复。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是检测非小细胞肺癌。
为了解决以上技术问题，本发明提供检测miR-652、miR-660和Cyfra21-1表达水 平的物质在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用；
所述Cyfra21-1的表达水平为Cyfra21-1蛋白的表达水平。
为了解决以上技术问题，本发明还提供miR-652、miR-660和Cyfra21-1作为标志物在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用。
为了解决以上技术问题，本发明还提供检测miR-652和miR-660表达水平的物质在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用；
或，
为了解决以上技术问题，本发明还提供miR-652和miR-660作为标志物在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用。
为了解决以上技术问题，本发明还提供检测miR-652表达水平的物质在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用；
或，
为了解决以上技术问题，本发明还提供miR-652作为标志物在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用。
上述任一所述的应用中，所述非小细胞肺癌为肺腺癌和/或肺鳞癌。
上述任一所述的应用中，所述miR-652的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述miR-660的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述Cyfra21-1的氨基酸序列如更新日为2015年3月15日Genbank登录号为NP_002267.2的序列所示。
上述应用中，所述检测miR-652、miR-660和Cyfra21-1表达水平的物质包含实时荧光定量PCR检测miR-652和miR-660表达水平所用的引物和/或探针以及检测Cyfra21-1表达水平所用的抗体。
上述任一所述的应用中，所述检测miR-652、miR-660和Cyfra21-1表达水平的物质还包含提取miRNA所需的试剂和/或仪器，和/或，实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平所需的试剂和/或仪器；
所述实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平所需的试剂包括外参ath miR-159a和/或内参miR-484；
所述ath miR-159a的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述miR-484的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
上述应用中，所述检测miR-652和miR-660表达水平的物质包含实时荧光定量PCR检测miR-652和miR-660表达水平所用的引物和/或探针。
上述任一所述的应用中，所述检测miR-652和miR-660表达水平的物质还包含提取miRNA所需的试剂和/或仪器，和/或，实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平所需 的试剂和/或仪器；
所述实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平所需的试剂包括外参ath miR-159a和/或内参miR-484；
所述ath miR-159a的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述miR-484的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
上述应用中，所述检测miR-652表达水平的物质包含实时荧光定量PCR检测miR-652表达水平所用的引物和/或探针。
上述任一所述的应用中，所述检测miR-652表达水平的物质还包含提取miRNA所需的试剂和/或仪器，和/或，实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平所需的试剂和/或仪器；
所述实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平所需的试剂包括外参ath miR-159a和/或内参miR-484；
所述ath miR-159a的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述miR-484的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
为了解决以上技术问题，本发明还提供一种系统，该系统包含如下(1)-(3)所示的系统中的至少一种：
(1)检测miR-652表达水平的系统；
(2)检测miR-660表达水平的系统；
(3)检测Cyfra21-1表达水平的系统；
所述Cyfra21-1的表达水平为Cyfra21-1蛋白的表达水平。
上述系统中，所述检测miR-652表达水平的系统包含实时荧光定量PCR检测miR-652表达水平所用的引物和/或探针；
所述检测miR-660表达水平的系统包含实时荧光定量PCR检测miR-660表达水平所用的引物和/或探针；
所述检测Cyfra21-1表达水平的系统包含检测Cyfra21-1表达水平所用的抗体。
所述系统还包含提取miRNA所需的试剂和/或仪器，和/或，实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平所需的试剂和/或仪器。
上述任一所述的实时荧光定量PCR检测miR-652表达水平所用的引物和/或探针的商品名称为MicroRNA Assays试剂盒，该试剂盒为Thermo Fisher产品，产品目录号为002352；
上述任一所述的实时荧光定量PCR检测miR-660表达水平所用的引物和/或探针的商品名称为MicroRNA Assays试剂盒，该试剂盒为Thermo Fisher产品，产品目录号为001515；
上述任一所述的检测Cyfra21-1表达水平所用的抗体来自CYFRA21-1定量测定试剂盒，该试剂盒为罗氏诊断产品(上海)有限公司产品，产品目录号为11820966122。
本发明通过荧光定量PCR的方法发现并验证了一些在非小细胞肺癌患者血清中高表达的miRNA，进一步对这些异常表达的miRNA进行模型建立并对其是否能有助于非小细胞肺癌的诊断进行评价，发现miR-652+miR-660+Cyfra21-1这种组合对非小细胞肺癌具有最优的检测效率(训练组曲线下面积：0.953，95％CI:0.907-0.981；验证组曲线下面积：0.943，95％CI:0.893-0.974)，并且该组合对于非小细胞肺癌的检测效率要优于miR-652+miR-660的组合和单独的Cyfra21-1(p<0.01)，其在训练组中诊断敏感性为86.81％，特异性为93.44％，在验证组中的诊断敏感性为85.06％，特异性为93.44％。本发明在非小细胞肺癌的检测中具有重要应用。
附图说明
图1为实验设计图。
图2为实时荧光定量PCR的可行性及可重复性的评估。
图3为miR-194、miR-652和miR-660在发现组、训练组和验证组的正常血清标本、肺腺癌血清标本和肺鳞癌血清标本中的相对表达水平。
图4为miR-194、miR-652和miR-660在训练组和验证组整体中的正常血清标本、非小细胞肺癌血清标本中的相对表达水平。
图5为miR-194、miR-652和miR-660在非小细胞肺癌患者术前及术后1个月的血清样本中相对表达水平的变化。
图6为miR-652+miR-660和单独miRNA在训练组和验证组中的ROC曲线。
图7为miR-652+miR-660和临床蛋白标志物在训练组和验证组中的ROC曲线。
图8为miR-652+miR-660+Cyfra21-1、miR-652+miR-660和Cyfra21-1在训练组和验证组中的ROC曲线分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
252例非小细胞肺癌血清标本以及144例正常血清标本均来自于中国医学科学院肿瘤医院。
下述实施例中miR-652的核苷酸序列为5’-AAUGGCGCCACUAGGGUUGUG-3’(SEQ ID No.1)。
下述实施例中miR-660的核苷酸序列为5’-UACCCAUUGCAUAUCGGAGUUG-3’(SEQ ID No.2)。
下述实施例中miR-194的核苷酸序列为5’-UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA-3’(SEQ ID No.3)。
下述实施例中Cyfra21-1蛋白(细胞角蛋白19的可溶性片段)的氨基酸序列如更新日为2015年3月15日Genbank登录号为NP_002267.2的序列所示。
下述实施例中miR-484的核苷酸序列为5’-UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU-3’(SEQ ID No.4)。
下述实施例中ath miR-159a的核苷酸序列为5’-UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA-3’(SEQ ID No.5)。
CEA(癌胚抗原)蛋白的氨基酸序列如Genbank登录号为CAE75559.1的序列所示。
CA125(糖类抗原125)蛋白的氨基酸序列如Genbank登录号为AAL65133.2的序列所示。
下述实施例中的cell miR-2，cell lin-4，cell miR-39，cell miR-54，cell miR-238和ath miR-159a均为Thermo Fisher产品，产品目录号分别为MC10451、MC10768、MC10956、MC10279、MC11005和MC10332。
下述实施例中检测cell miR-2表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒，检测cell lin-4表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒，检测cell miR-39表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒，检测cell miR-54表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒，检测cell miR-238表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒，检测ath miR-159a表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒，检测miR-15b表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒，检测miR-16表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒，检测miR-24表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒，检测miR-652表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒，检测miR-660表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒，检测miR-194表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒，检测miR-484表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒和检测ath miR-159a表达水平所用到的MicroRNA Assays试剂盒均为Thermo Fisher产品，产品目录号分别为000195、000258、000200、001361、000248、000338、000390、000391、000402、002352、001515、000493、001821和000338。下述实施例中的实时荧光定量PCR检测miRNA的表达水平均按照上述试剂盒的说明书进行操作。
CEA定量测定试剂盒、CA125定量测定试剂盒和CYFRA21-1定量测定试剂盒均为罗氏诊断产品(上海)有限公司产品，产品目录号分别为11731629322、11776223822和11820966122。
伦理声明
本实验一共入组了396例血清标本，其中包括252例非小细胞肺癌血清标本以及 144例正常血清标本，所有癌标本来自于中国医学科学院肿瘤医院胸外科，所有正常血清标本来自于中国医学科学院肿瘤医院防癌科。本研究取得了中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会的许可。
实施例1、miRNA和Cyfra21-1联合检测非小细胞肺癌
本发明的实验设计图如图1所示。
一、标本的采集及临床信息
于2009年11月到2010年7月收集44例非小细胞肺癌(22例肺腺癌和22例肺鳞癌)血清标本和22例年龄及性别与之匹配的正常血清标本(作为对照样本)用于筛选工作，该组为发现组，用于从380个候选miRNA中筛选异常表达的miRNA。
于2013年2月到7月收集178例非小细胞肺癌(105例肺鳞癌和73例肺腺癌)血清标本以及122例正常血清标本(作为对照样本)随机分成训练组(91例癌，61例正常)和验证组(87例癌，61例正常)用于验证工作。
于2013年2月到7月收集另外30对术前和术后1个月匹配的非小细胞肺癌血清标本用于验证工作，用于验证候选miRNA的表达水平是否受肿瘤切除的影响。
以上非小细胞肺癌血清标本来源的病人均通过穿刺活检或者手术得到了细胞学或者组织学的病理诊断，临床分期参考AJCC分期系统，除此之外还需符合以下标准：病人在采血之前未经过任何放疗或化疗的治疗；没有癌症史，没有多种类型癌症的症状。以上正常血清标本来源的人需符合以下要求：通过常规的检查(胸片、B超、肝功、血常规)没有发现恶性或者良性肿瘤的征兆。
以上标本的临床信息如表1所示。
表1 发现组、训练组和验证组标本的临床资料信息
二、miRNA的提取
对发现组的各血清标本各取200ul，对验证组的各血清标本各取100ul，按照 miRNA ABC Purification Kit-Human Panel A(Applied)试剂盒(Thermo Fisher产品)说明书进行各血清标本的miRNA的提取，得到发现组的各血清标本的miRNA以及验证组的各血清标本的miRNA。
三、实时荧光定量PCR检测miRNA的表达水平
(一)实时荧光定量PCR检测miRNA的表达水平的可行性和重复性评估
1、miRNA的提取
将6种外源性的miRNA，包括一定浓度的cell miR-2，一定浓度的cell lin-4，
一定浓度的cell miR-39，一定浓度的cell miR-54，一定浓度的cell miR-238和一定浓度的ath miR-159a分别加入含有裂解液(Thermo Fisher产品)的血清中，用miRNA ABC Purification Kit-Human Panel A(Applied)试剂盒进行miRNA的提取。
2、反转录
将步骤1提取得到的各miRNA分别通过反转录得到各cDNA。
反转录条件：16℃孵育30分钟，42℃孵育30分钟，85℃孵育5分钟之后储存 于4℃。
3、实时荧光定量PCR
将步骤2得到的各个miRNA的cDNA分别进行10倍浓度梯度稀释，然后按照相对应的MicroRNA Assays试剂盒的说明书检测6个miRNA(cell miR-2，cell lin-4，cell miR-39，cell miR-54，cell miR-238和ath miR-159a)的表达水平。
各实时荧光定量PCR体系(10ul)：包含1ul稀释好的cDNA，其它条件按照试剂盒Universal Master Mix II,no UNG(Appl ied)(Thermo Fisher产品)说明书进行操作，并于ABI 7900HT快速荧光定量PCR仪器进行检测。
以miRNA的表达量(单位为pg)的log值为横坐标，Ct值为纵坐标作图，制作曲线，并得到曲线公式。
结果如图2中A-F所示。
图2中A-F表明，miRNA的表达量的对数值和Ct值有较好的一致性，说明实时荧光定量PCR检测miRNA的表达水平的方法是可行的。
4、选取发现组的5例非小细胞肺癌样本，按照相对应的TaqMan miRNA assays试剂盒的说明书分别检测3个miRNA(miR-15b，miR-16和miR-24)在这5例样本中的相对表达水平，从提取到检测miRNA整个过程重复3次。
结果如图2中G-I所示。
图2中G-I表明，每一个样本的每一种miRNA所检测出来的3次Ct值有较好的重复性，说明实时荧光定量PCR检测miRNA的表达水平的方法是可重复的。
这5例非小细胞肺癌样本中的3个miRNA(miR-15b，miR-16和miR-24)的变异系数如表2所示。
表2 miR-15b、miR-16和miR-24的变异系数
表2表明，不同样本对于同一miRNA在3次相对独立的实验中所得到的结果计算出的变异系数数值均很小，这说明所采用的实时定量荧光PCR的方法的重复性较好。
(二)筛选阶段
按照步骤(一)的实时荧光定量PCR检测miRNA的表达水平的方法检测了381个miRNA(380个人源miRNA和一个外参ath miR-159a)在发现组各样本中的表达水平。使用NormFinder来确定最优内参或者使用外参来挑选差异表达的miRNA，miRNA的相对表达量使用公式2-△Ct来计算，其中△Ct＝Ct(miRNA)-Ct(外参或者内参)。miRNA在癌血清标本和正常血清标本之间的倍数用2-△△Ct公式进行计算，其中△△Ct＝中位数△Ct癌–中位数△Ct正常。结果发现只有25个miRNA在发现组的所有66个样本中都有检测值，其中2个miRNA(miR-672和miR-871)由于miRBase数据库的更新而被排除，剩余23个miRNA如表3所示。
表3肿瘤相关的miRNA及序列
| 名称 | 序列(5’-3’) |
| hsa-let-7b | UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU |
| hsa-miR-124a | UAAGGCACGCGGUGAAUGCC |
| hsa-miR-128a | UCACAGUGAACCGGUCUCUUU |
| hsa-miR-194 | UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA |
| hsa-miR-221 | AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC |
| hsa-miR-223 | UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA |
| hsa-miR-302a | UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA |
| hsa-miR-373 | GAAGUGCUUCGAUUUUGGGGUGU |
| hsa-miR-383 | AGAUCAGAAGGUGAUUGUGGCU |
| hsa-miR-483-5p | AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG |
| hsa-miR-485-5p | AGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUC |
| hsa-miR-486-3p | CGGGGCAGCUCAGUACAGGAU |
| hsa-miR-493 | UUGUACAUGGUAGGCUUUCAUU |
| hsa-miR-502 | AUCCUUGCUAUCUGGGUGCUA |
| hsa-miR-513-5p | UUCACAGGGAGGUGUCAU |
| hsa-miR-519d | CAAAGUGCCUCCCUUUAGAGUG |
| hsa-miR-598 | UACGUCAUCGUUGUCAUCGUCA |
| hsa-miR-652 | AAUGGCGCCACUAGGGUUGUG |
| hsa-miR-660 | UACCCAUUGCAUAUCGGAGUUG |
| hsa-miR-758 | UUUGUGACCUGGUCCACUAACC |
| hsa-miR-873 | GCAGGAACUUGUGAGUCUCCU |
| hsa-miR-885-3p | AGGCAGCGGGGUGUAGUGGAUA |
| hsa-miR-93 | CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG |
1、当用外参ath miR-159a作为参照的时候，表3中23个miRNA在发现组的44例非小细胞肺癌血清标本中的表达水平要显著高于其在发现组的22例年龄及性别与之匹配的正常血清标本的表达水平(p<0.05)。在表3的23个miRNA中通过以下筛选标准选出5个候选靶miRNA(如表4所示)，筛选标准为：90％以上的标本(60个标本)中Ct值小于40，miRNA在非小细胞肺癌血清标本中的相对表达水平为在年龄及性别与之匹配的正常血清标本的表达水平的5倍以上。
2、当使用内参做参照的时候，选取了157个能在发现组全部44例非小细胞肺癌 血清标本或者在全部22例年龄及性别与之匹配的正常血清标本中检测到Ct值的miRNA，将这157个miRNA用NormFinder进行分析并选出合适的miRNA作为内参，结果显示miR-484可以作为内参进行校正。之后用和步骤1用外参ath miR-159a作为参照的时候同样的筛选标准对剩余的156个miRNA进行处理，结果发现3个miRNA(如表4所示)在发现组的44例非小细胞肺癌血清标本中的表达水平与其在发现组的22例年龄及性别与之匹配的正常血清标本的表达水平有显著差异。
表4 以ath miR-159a为外参和以miR-484为内参在发现组中发现的异常表达的miRNA及其倍数值
由表4可知，miR-194，miR-652和miR-660在上述两种参照方法中都有异常表达,即这3个miRNA在非小细胞肺癌血清标本中的相对表达水平与其在年龄及性别与之匹配的正常血清标本的表达水平有显著差异，因此对miR-194，miR-652和miR-660进行进一步研究。
(三)验证阶段
采用大样本对miR-194，miR-652和miR-660的表达水平进行进一步的验证。
首先选取于2013年2月到7月收集的178例非小细胞肺癌血清标本以及122例正常血清标本(作为对照样本)，按照步骤(一)的实时荧光定量PCR检测miRNA的表达水平的方法检测miR-194，miR-652和miR-660在这些样本中的表达水平，发现miR-194、miR-652和miR-660在178例非小细胞肺癌血清标本(105例肺鳞癌和73例肺腺癌)中的表达水平要显著高于其在122例正常血清标本中的表达水平(p<0.001)。另外将这178例非小细胞肺癌血清标本和122例正常血清标本随机分成 训练组(91例癌(既包含肺腺癌又包含肺鳞癌)，61例正常)和验证组(87例癌(既包含肺腺癌又包含肺鳞癌)和61例正常)用于后续进一步的分析。
将训练组进一步分为肺腺癌和肺鳞癌血清标本，按照步骤(一)的实时荧光定量PCR检测miRNA的表达水平的方法检测miR-194，miR-652和miR-660在该组的肺腺癌血清标本、该组的肺鳞癌血清标本以及该组的正常血清标本中的表达水平。
将验证组进一步分为肺腺癌和肺鳞癌血清标本，按照步骤(一)的实时荧光定量PCR检测miRNA的表达水平的方法检测miR-194，miR-652和miR-660在该组的肺腺癌血清标本、该组的肺鳞癌血清标本以及该组的正常血清标本中的表达水平。
同样，将发现组的44例非小细胞肺癌(22例肺腺癌和22例肺鳞癌)血清标本进一步分为肺腺癌血清标本和肺鳞癌血清标本，共有22例肺腺癌血清标本和22例肺鳞癌血清标本，按照步骤(一)的实时荧光定量PCR检测miRNA的表达水平的方法检测miR-194，miR-652和miR-660在该组的22例肺腺癌血清标本、该组的22例肺鳞癌血清标本以及该组的22例正常血清标本中的表达水平。
miR-194在发现组的正常血清标本、肺腺癌(ADC)血清标本和肺鳞癌(SCC)血清标本中的-△Ct(可以用于粗略比较miRNA在各个标本中的表达量，-△Ct为-(Ct 样本-Ctath miR-159a))值如图3中A所示。
miR-194在训练组的正常血清标本、肺腺癌(ADC)血清标本和肺鳞癌(SCC)血清标本中的-△Ct值如图3中B所示。
miR-194在验证组的正常血清标本、肺腺癌(ADC)血清标本和肺鳞癌(SCC)血清标本中的-△Ct值如图3中C所示。
miR-652在发现组的正常血清标本、肺腺癌(ADC)血清标本和肺鳞癌(SCC)血清标本中的-△Ct值如图3中D所示。
miR-652在训练组的正常血清标本、肺腺癌(ADC)血清标本和肺鳞癌(SCC)血清标本中的-△Ct值如图3中E所示。
miR-652在验证组的正常血清标本、肺腺癌(ADC)血清标本和肺鳞癌(SCC)血清标本中的-△Ct值如图3中F所示。
miR-660在发现组的正常血清标本、肺腺癌(ADC)血清标本和肺鳞癌(SCC)血清标本中的-△Ct值如图3中G所示。
miR-660在训练组的正常血清标本、肺腺癌(ADC)血清标本和肺鳞癌(SCC)血清标本中的-△Ct值如图3中H所示。
miR-660在验证组的正常血清标本、肺腺癌(ADC)血清标本和肺鳞癌(SCC)血清标本中的-△Ct值如图3中I所示。
图3中，腺癌代表肺腺癌，鳞癌代表肺鳞癌。
miR-194在训练组和验证组整体中的正常血清标本、非小细胞肺癌血清标本中的-△Ct值如图4中A所示。
miR-652在训练组和验证组整体中的正常血清标本、非小细胞肺癌血清标本中的-△Ct值如图4中B所示。
miR-660在训练组和验证组整体中的正常血清标本、非小细胞肺癌血清标本中的-△Ct值如图4中C所示。
图3和图4表明，在发现组、训练组以及验证组中，分别与正常血清标本相比，miR-652和miR-660这两个miRNA在肺腺癌和肺鳞癌血清标本中的表达水平均有显著性的升高(p<0.01)。在发现组和验证组中，miR-194在肺腺癌和肺鳞癌血清标本中的表达水平要显著高于正常血清标本(p<0.05)，但是在训练组中没有显著差异。
另外，按照步骤(一)的实时荧光定量PCR检测miRNA的表达水平的方法检测miR-194，miR-652和miR-660在于2013年6月收集的另外30对术前和术后1个月匹配的非小细胞肺癌血清标本(标本信息如表5)中的表达水平。对于术前术后miRNA的表达差异用Wilcoxon进行检测。
miR-194在30对术前和术后1个月匹配的非小细胞肺癌血清标本中的相对表达水平如图5中A所示。
miR-652在30对术前和术后1个月匹配的非小细胞肺癌血清标本中的相对表达水平如图5中B所示。
miR-660在30对术前和术后1个月匹配的非小细胞肺癌血清标本中的相对表达水平如图5中C所示。
表5 30对术前和术后1个月匹配的非小细胞肺癌血清标本临床资料信息
图5表明，与术前相比，miR-194和miR-652在术后血清标本中有明显的下调(p<0.05)。而miR-660的下调水平不明显，由此提示miR-194和miR-652的表达水平 和肿瘤的存在有一定的相关性。
四、统计分析
(一)使用SPSS(13.0)和MedCalc(9.6.2.0)用于如下实验的数据分析，RNA提取和miRNA检测的重复性通过变异系数进行分析。
将2013年2月到7月收集的178例非小细胞肺癌血清标本(105例肺鳞癌和73例肺腺癌)以及122例正常血清标本(作为对照样本)随机分成训练组(91例癌(既包含肺腺癌又包含肺鳞癌)，61例正常)和验证组(87例癌(既包含肺腺癌又包含肺鳞癌)和61例正常)。分组方法为：分别给癌标本和正常血清标本赋予0-1之间的随机数字，其次对随机数字小于0.5的样本标记为1，大于0.5的样本标记为2，标记为1的标本作为训练组，标记为2的标本作为验证组。
miRNA的表达水平在癌标本和正常血清标本之间的差异性使用Mann-Whitney U进行检测，将训练组数据使用二元logistic回归方程对miRNA进行建模并选择最好的诊断模型(选择最好的诊断模型的标准是首先通过p<0.05确定每个miRNA在回归方程中的有效性，其次将有效的miRNA进行组合，并比较组合后的模型对非小细胞肺癌的诊断效率)，用实施例1步骤三的实时荧光定量PCR实验得到各个样本中miRNA的表达量的数据，同时使用受试者工作特征曲线(ROC曲线)和曲线下面积(AUC)来判定miRNA和模型的诊断效率，p值小于0.05为有意义。
接下来采用ROC曲线来分析每个miRNA对非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌的检测效率，这三个miRNA在区分非小细胞肺癌和正常对照这两组中，miR-652的曲线下面积(AUC)(训练组曲线下面积：0.819，95％CI：0.749-0.877；验证组曲线下面积：0.819，95％CI：0.747-0.877)要优于miR-660和miR-194，miR-660的曲线下面积(AUC)(训练组曲线下面积：0.735，95％CI：0.657-0.803；验证组曲线下面积：0.714，95％CI：0.634-0.785)要略差于miR-652，miR-194的曲线下面积(训练组曲线下面积：0.576，95％CI：0.494-0.656；验证组曲线下面积：0.660，95％CI：0.577-0.735)最小。这三个miRNA对于肺腺癌和肺鳞癌的诊断效率和其对非小细胞肺癌的的诊断效率大致相同，结果如图6所示。
(二)在分析了单独的miRNA的诊断效率之后，通过二元logistic回归的方法对这三个miRNA进行整合并分析miRNA的组合是否能提高非小细胞肺癌的诊断效率。首先将这三个miRNA用二元logistic回归的方法进行建模，并分析这三个miRNA在模型中的意义，结果发现在这3个miRNA中，miR-652和miR-660在区分非小细胞肺癌(肺腺癌和肺鳞癌)血清标本和正常血清标本的二元线性回归方程中是有意义的。因此，使用二元logistic回归方法将miR-652和miR-660联合在一起，ROC曲线显示miR-652+miR-660的模型和miR-194或miR-660比较来看，miR-652+miR-660的模型对 非小细胞肺癌有较高的诊断能力(p<0.001，训练组曲线下面积：0.896，95％CI:0.837-0.940；验证组曲线下面积：0.858，95％CI:0.791-0.910)。与此同时，发现miR-652+miR-660模型对于肺腺癌和肺鳞癌的诊断效率也要优于单独的miR-194和miR-660(p<0.05，肺腺癌组：训练组曲线下面积：0.892，95％CI:0.820-0.942；验证组曲线下面积：0.851，95％CI:0.771-0.911；肺鳞癌组：训练组曲线下面积：0.900，95％CI:0.824-0.951；验证组曲线下面积：0.865，95％CI:0.780-0.926)。但是，将miR-652+miR-660的组合和单独的miR-652相比，组合对非小细胞肺癌的诊断效率只有在训练组要优于miR-652(p<0.05)，但是在验证组中，组合的诊断效率和单独的miR-652没有显著性的区别，结果如图6所示。
图6中，A的左图为miR-194、miR-652、miR-660和miR-652+miR-660在训练组的非小细胞肺癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；A的右图为miR-194、miR-652、miR-660和miR-652+miR-660在验证组的非小细胞肺癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；B的左图为miR-194、miR-652、miR-660和miR-652+miR-660在训练组的肺腺癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；B的右图为miR-194、miR-652、miR-660和miR-652+miR-660在验证组的肺腺癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；C的左图为miR-194、miR-652、miR-660和miR-652+miR-660在训练组的肺鳞癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；C的右图为miR-194、miR-652、miR-660和miR-652+miR-660在验证组的肺鳞癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线。
表6 组合模型的回归方程
表6中左边一列的方程代表的是图6和图7中的组合miR-652+miR-660的公式，右边一列的方程代表图8中组合miR-652+miR-660+Cyfra21-1的公式。PNSCLC代表某一样本中通过方程拟合后得出的用于后续非小细胞肺癌诊断的数据，PADC代表某一样本中通过方程拟合后得出的用于后续肺腺癌诊断的数据，PSCC代表某一样本中通过方程拟合后得出的用于后续肺鳞癌诊断的数据，X代表对应物质通过检测得出的表达值(miRNA是相对表达量，Cyfra21-1的单位为ng/ml)。
(三)将miR-652+miR-660的组合和现有的临床应用的标志物——CEA(癌胚抗 原)、CA125(糖类抗原125)和Cyfra21-1(细胞角蛋白19的可溶性片段)进行比较，将该组合和这三个蛋白标志物通过MedCalc(版本9.6.2.0)用实施例1中步骤三的实时荧光定量PCR得到miRNA的相对表达水平数据，用CEA定量测定试剂盒、CA125定量测定试剂盒和CYFRA21-1定量测定试剂盒分别得到CEA、CA125和Cyfra21-1的表达水平数据，进行ROC曲线的绘制，结果如图7所示。
图7中，A的左图为CEA、CA125、Cyfra21-1和miR-652+miR-660在训练组的非小细胞肺癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；A的右图为CEA、CA125、Cyfra21-1和miR-652+miR-660在验证组的非小细胞肺癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；B的左图为CEA、CA125、Cyfra21-1和miR-652+miR-660在训练组的肺腺癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；B的右图为CEA、CA125、Cyfra21-1和miR-652+miR-660在验证组的肺腺癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；C的左图为CEA、CA125、Cyfra21-1和miR-652+miR-660在训练组的肺鳞癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；C的右图为CEA、CA125、Cyfra21-1和miR-652+miR-660在验证组的肺鳞癌血清标和正常血清标本中的ROC曲线。
图7表明，miR-652+miR-660组合在训练组和验证组中对非小细胞肺癌或肺腺癌的诊断效率都要优于CEA和CA125(p<0.05)。此外，miR-652+miR-660的组合对非小细胞肺癌和肺腺癌的诊断效率要稍高于Cyfra21-1。然而，对于肺鳞癌，Cyfra21-1显示了更好的诊断效率，其曲线下面积要高于miR-652+miR-660的组合。
(四)为了提高miR-652+miR-660组合的诊断效率，将其和现有的临床标志物(CEA、CA125和Cyfra21-1)通过二元logistic回归进行组合并进一步的分析，首先随机将这三个蛋白标志物与miR-652+miR-660进行组合,得到7种不同的组合后通过MedCalc(版本9.6.2.0)进行ROC曲线的绘制并得到每个诊断模型的诊断敏感度和特异度值。
结果如图8所示。
图8中，A的左图为miR-652+miR-660+Cyfra21-1、Cyfra21-1和miR-652+miR-660在训练组的非小细胞肺癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；A的右图为miR-652+miR-660+Cyfra21-1、Cyfra21-1和miR-652+miR-660在验证组的非小细胞肺癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；B的左图为miR-652+miR-660+Cyfra21-1、Cyfra21-1和miR-652+miR-660在训练组的肺腺癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；B的右图为miR-652+miR-660+Cyfra21-1、Cyfra21-1和miR-652+miR-660在验证组的肺腺癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；C的左图miR-652+miR-660+Cyfra21-1、Cyfra21-1和miR-652+miR-660在训练组的肺鳞癌血清标本和正常血清标本中的ROC曲线；C的右图为miR-652+miR-660+Cyfra21-1、 Cyfra21-1和miR-652+miR-660在验证组的肺鳞癌血清标和正常血清标本中的ROC曲线。
图8表明，miR-652+miR-660+Cyfra21-1这种组合对非小细胞肺癌具有最优的诊断效率(训练组曲线下面积：0.953，95％CI:0.907-0.981；验证组曲线下面积：0.943，95％CI:0.893-0.974)。并且该组合对于非小细胞肺癌的诊断效率要优于两个miRNA的组合和单独的Cyfra21-1(p<0.01)，其在训练组中诊断敏感性为86.81％，特异性为93.44％，在验证组中的诊断敏感性为85.06％，特异性为93.44％。对于肺腺癌组，miR-652+miR-660+Cyfra21-1的组合也显示出了最好的诊断效率(p<0.05，训练组曲线下面积：0.941，95％CI:0.881-0.977；验证组曲线下面积：0.942，95％CI:0.881-0.977)。然而，在肺鳞癌组，在Cyfra21-1中加入了miR-652和miR-660的组合并没有对单独的Cyfra21-1的诊断效率有明显的提高。
通过对发现组、训练组和验证组标本的统计分析，在各个组内没有发现癌血清标本和正常血清标本中年龄有任何显著性差异，但是在训练组和验证组中，相对于正常血清标本，癌血清标本中有较多来源于的吸烟者的血清标本。
Claims (10)
1.检测miR-652、miR-660和Cyfra21-1表达水平的物质在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用。
2.miR-652、miR-660和Cyfra21-1作为标志物在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用。
3.检测miR-652和miR-660表达水平的物质在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用；
或，
miR-652和miR-660作为标志物在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用。
4.检测miR-652表达水平的物质在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用；
或，
miR-652作为标志物在制备筛查和/或辅助诊断非小细胞肺癌患者产品中的应用。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：所述非小细胞肺癌为肺腺癌和/或肺鳞癌。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测miR-652、miR-660和Cyfra21-1表达水平的物质包含实时荧光定量PCR检测miR-652和miR-660表达水平所用的引物和/或探针以及检测Cyfra21-1表达水平所用的抗体。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述检测miR-652和miR-660表达水平的物质包含实时荧光定量PCR检测miR-652和miR-660表达水平所用的引物和/或探针。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述检测miR-652表达水平的物质包含实时荧光定量PCR检测miR-652表达水平所用的引物和/或探针。
9.一种系统，该系统包含如下(1)-(3)所示的系统中的至少一种：
(1)检测miR-652表达水平的系统；
(2)检测miR-660表达水平的系统；
(3)检测Cyfra21-1表达水平的系统。
10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于：所述检测miR-652表达水平的系统包含实时荧光定量PCR检测miR-652表达水平所用的引物和/或探针；
所述检测miR-660表达水平的系统包含实时荧光定量PCR检测miR-660表达水平所用的引物和/或探针；
所述检测Cyfra21-1表达水平的系统包含检测Cyfra21-1表达水平所用的抗体。
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