CN103163293A - 辅助诊断非小细胞肺癌患者的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辅助诊断非小细胞肺癌患者的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括用于检测蛋白标志物IDH1的产品、用于检测蛋白标志物CA125的产品、用于检测蛋白标志物CYFRA21-1的产品和记载有如下函数式的载体：

Description

辅助诊断非小细胞肺癌患者的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种辅助诊断非小细胞肺癌患者的试剂盒。

背景技术

肺癌是严重威胁人类生命和健康的重大疾病。2011年世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构IARC公布的2008全球统计资料结果显示：肺癌是发病率和死亡率都高居榜首的恶性肿瘤。每年全球新发病例数160.8万，死亡病例数137.7万，占全部恶性肿瘤的12.7%和18.2%。美国癌症协会公布的统计结果显示：预计在2012年，美国新发肺癌病例数将达到22.6万，因肺癌死亡病例数将达到16万。在我国，由卫生部主持的全国第三次死因回顾抽样调查结果显示：肺癌为样本地区恶性肿瘤死亡原因之首，粗死亡率为30.83/10万，其中男性41.34/10万，女性19.84/10万；在男性、女性中均为首位癌症死亡原因。随着全球老龄化的加速和环境污染加剧等因素，肺癌发病必将继续呈上升趋势，因此，对肺癌的诊断治疗研究的进展需求，必定越来越强烈。

从病理上，肺癌可分为非小细胞肺癌（NSCLC，约占85%）和小细胞肺癌（SCLC，约占15%）。

肺癌的发病较为隐匿，超过70%的患者在就诊时已发展至中晚期，失去了手术机会。这也是肺癌疗效差，死亡率高的主要原因之一。因此，早期筛查、诊断成为防治肺癌的重中之重。目前，临床所使用肺癌筛查诊断方法主要是胸部X射线检查、CT扫描等影像学技术。虽然这些影像资料对诊断起着重要作用，但也存在很多局限性，例如假阳性率高，无法检出隐性病灶、亚临床病灶和微小转移病灶。除此之外，对肺癌的诊断方法还包括支气管镜检查、穿刺活检等有创操作，这类方法耗时长，增加患者痛苦。因此，寻找无创、无辐射、费用低廉、诊断快速且敏感性、特异性均高的筛查、诊断方法，是目前癌症早期诊断的迫切需求。

肿瘤标记物是指肿瘤细胞或者组织由于癌基因或其他肿瘤相关基因及其产物异常表达所产生的生物活性物质或其本身由癌组织脱落，而在正常组织或良性疾病时有一定程度表达或产量甚微。它反映了癌的发生发展过程，可在肿瘤患者组织、体液及排泄物中检出，广泛应用于肿瘤的诊断，监测复发、转移，预后，预测疗效等。临床上现有的广泛受到认可的几种主要标志物为：应用于卵巢癌的肿瘤抗原125（CA125），应用于胰腺癌的类抗原19-9(CA19-9)，应用于结直肠癌的癌胚抗原（CEA）和应用于前列腺癌的前列腺特异性抗原（PSA）。而其他癌症例如乳腺癌和肺癌，目前仍然缺少用于筛查的可信的肿瘤标记物。

目前已经应用于肺癌临床辅助诊断的标记物只有蛋白标记物，为下列几种：

（1）CEA：Gold和Freeman在1965年首先在大肠癌中发现CEA，它是一种糖蛋白，分子量为180KD，半衰期为3-4天，是胚胎发展过程产生的抗原，出生后显著下降；其特异性不强，但可用于肿瘤发展的监测、疗效判断和预后估计，对于早期诊断并不敏感；肺癌病人虽有升高，但存在较高的假阴性和假阳性，不适于在肺癌筛查诊断中单独使用；

（2）CA125：Bast在1981首先发现CA125这种大分子糖蛋白，其半衰期约4.8天，主要应用于卵巢癌，同时在肺癌中也有上升；

（3）CYFRA21-1（CYFRA211）：CYFRA211是细胞角蛋白19的水溶性片段，半衰期约4天；

虽然目前以上蛋白标记物已经用于肺癌的辅助诊断，但其诊断效率低下，达不到临床需求。因此，开发新的诊断标记物和诊断方法已迫不及待。

IDH1是一种位于细胞质和过氧化物酶体中的NADP⁺依赖的异柠檬酸脱氢酶，可催化异柠檬酸进行氧化脱羧反应为α-酮戊二酸。本发明的发明人在以往的研究中发现，肺鳞癌和肺腺癌患者的IDH1水平明显高于正常人群及肺良性肿瘤患者，能够作为肺癌的新的诊断标记物。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助诊断非小细胞肺癌患者的试剂盒。

本发明提供的辅助诊断非小细胞肺癌患者的试剂盒，包括用于检测蛋白标志物IDH1的产品、用于检测蛋白标志物CA125的产品、用于检测蛋白标志物CYFRA21-1的产品和记载有如下函数式的载体：

$p=\frac{1}{1+{(20.186*{0.406}^{x_1}*{0.923}^{x_2}*{0.656}^{x_3})}^{-1}};$

X1代表蛋白标志物IDH1的浓度，x2代表蛋白标志物CA125的浓度，x3代表蛋白标志物CYFRA21-1的浓度。

所述蛋白标志物IDH1具体可为GENBANK ACCESSION NO.CAG46496.1所示的蛋白质（序列表的序列1；GENBANK ACCESSION NO.CAG46496.1；GI:49456351；linear PRI16-OCT-2008）。所述蛋白标志物CA125具体可为GENBANK ACCESSION NO.AAL65133.2所示的蛋白质（GENBANK ACCESSION NO.AAL65133.2；GI:24419041；linear PRI29-OCT-2002）。所述蛋白标志物CYFRA21-1具体可为GENBANK ACCESSIONNO.NP_002267.2所示的蛋白质（序列表的序列2；GI:24234699；linear PRI06-MAY-2012）。

所述蛋白标志物IDH1的浓度的单位具体为U/L，所述蛋白标志物CA125的浓度的单位具体为U/mL，所述蛋白标志物CYFRA21-1的浓度的单位具体为ng/mL。

所述载体上还可记载有如下诊断标准：当p≥0.7386时待测患者为候选的非小细胞肺癌患者，当p＜0.7386时待测患者为候选的非非小细胞肺癌患者。

本发明还保护用于检测蛋白标志物IDH1的产品、用于检测蛋白标志物CA125的产品、用于检测蛋白标志物CYFRA21-1的产品和记载有函数式和诊断标准的载体在制备辅助诊断非小细胞肺癌患者的试剂盒中的应用：

所述函数式如下：

$p=\frac{1}{1+{(20.186*{0.406}^{x_1}*{0.923}^{x_2}*{0.656}^{x_3})}^{-1}};$

X1代表蛋白标志物IDH1的浓度、单位为U/L，x2代表蛋白标志物CA125的浓度、单位为U/mL，x3代表蛋白标志物CYFRA21-1的浓度、单位为ng/mL；

所述诊断标准如下：

当p≥0.7386时待测患者为候选的非小细胞肺癌患者，当p＜0.7386时待测患者为候选的非非小细胞肺癌患者。

所述蛋白标志物IDH1具体可为GENBANK ACCESSION NO.CAG46496.1所示的蛋白质（序列表的序列1；GENBANK ACCESSION NO.CAG46496.1；GI:49456351；linear PRI16-OCT-2008）。所述蛋白标志物CA125具体可为GENBANK ACCESSION NO.AAL65133.2所示的蛋白质（GENBANK ACCESSION NO.AAL65133.2；GI:24419041；linear PRI29-OCT-2002）。所述蛋白标志物CYFRA21-1具体可为GENBANK ACCESSIONNO.NP_002267.2所示的蛋白质（序列表的序列2；GI:24234699；linear PRI06-MAY-2012）。

以上任一所述用于检测蛋白标志物IDH1的产品具体可为购自武汉优尔生科技有限公司的IDH1酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA Kit；其中包括IDH1标准品)。

以上任一所述用于检测蛋白标志物CYFRA21-1的产品具体可为购自罗氏诊断产品（上海）有限公司的CYFRA21-1定量测定试剂盒。

以上任一所述用于检测蛋白标志物CA125的产品具体可为罗氏诊断产品（上海）有限公司的CA125定量测定试剂盒。

肺癌居于世界癌症死亡原因的首位，也是危害我国人民健康的头号癌症杀手。因此，寻找可用于肺癌早期诊断、个体治疗、预后和监测复发的肿瘤标记物，成为近年研究的热点。采用本发明提供的试剂盒并按照相应的诊断标准辅助诊断非小细胞肺癌患者，具有灵敏性高、特异性强的特点，诊断结果可信度远远高于采用各个单独的蛋白质标记物进行诊断，对于肺癌的诊断和治疗具有重大价值和应用前景。

附图说明

图1为NSCLC诊断模型的ROC曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。灵敏性：诊断为阳性的癌症患者数目占总癌症患者数目的百分比。特异性：诊断为阴性的健康人数目占总健康人群数目的百分比。

实施例1、本发明方法的建立

一、模型的建立

NSCLC患者血浆样品952例，健康人（正常对照）血浆样品共479例，取自中国医学科学院肿瘤医院胸外科就诊并经病理确诊的肺癌患者及参加癌症普查的正常人群。本实验经伦理委员会同意，且受试者均被知情告知病签署知情同意书。血浆样本均在手术前获得，患者此前并未接受化疗、放疗、介入等治疗。

数据处理使用curve expert 1.4处理标准曲线；GraphPad Prism 5.01处理Column统计图；SPSS 13.0进行数据拟合，建立数学模型；SAS 9.2进行数学模型检验；MedCalc9.6.2.0版本计算模型ROC曲线及cutoff值；Adobe illustrator CS3进行图片处理。

ROC曲线（receiver operating characteristic curve，受试者工作曲线）以灵敏性为纵坐标（Y轴），以特异性为横坐标（X轴），当给试验不同临界值（cutoff）时，即可产生相应的坐标点，连成线所产生的曲线即ROC曲线。ROC曲线能比较不同肿瘤标志物的诊断效率，曲线下面积（AUC）越大者诊断效率越高。

通过SPSS软件的Logistic二项回归回归分析数据，并且使用SAS进行模型检验，最终确定了一个模型，用于NSCLC的诊断。将该模型的计算结果绘制ROC曲线（见图1），曲线下面积为0.872（95%置信区间：0.853-0.889，p＜0.0001），与对NSCLC诊断效率最高的标记物——IDH1（AUC为0.792）相比，具有显著性差异（p＝0.0001）。

二、模型的具体描述

步骤一中，通过对大量临床样本进行各个蛋白标志物的检测，进行大量数据模拟和模型建立，得到用于辅助诊断非小细胞肺癌的函数式如下：

X1代表蛋白标志物IDH1的浓度(单位为U/L)，x2代表蛋白标志物CA125的浓度（单位为U/mL），x3代表蛋白标志物CYFRA21-1的浓度（单位为ng/mL）。

基于上述函数式辅助诊断非小细胞肺癌的方法如下：

（1）取待测患者空腹状态下的外周静脉血，室温静置1h，然后3000r/min离心15min，取上清，分装1.5mL EP管，-80℃冰箱保存。

（2）检测步骤（1）得到的样本中的蛋白标志物IDH1浓度、蛋白标志物CA125浓度和蛋白标志物CYFRA211浓度，然后通过上述函数式计算p值，当p≥0.7386时待测患者为候选的非小细胞肺癌患者，当p＜0.7386时待测患者为候选为非非小细胞肺癌患者。

实施例2、本发明方法的验证

用于本实施例的患者为150例临床确诊的非小细胞肺癌患者（外周静脉血均在手术前获得，患者此前并未接受化疗、放疗、介入等治疗）和50例健康人（非非小细胞肺癌患者），均为知情同意的志愿者。

1、取待测患者空腹状态下的5ml外周静脉血，室温静置1h，然后3000r/min离心15min，取上清，分装于两个1.5mL EP管，-80℃冰箱保存。

2、在室温中溶解步骤1的样本3h，然后3000r/min离心5min。

3、检测步骤2得到的样本（上清）中的蛋白标志物IDH1浓度（单位为U/L）、蛋白标志物CA125浓度（单位为U/mL）、蛋白标志物CYFRA211浓度（单位为ng/mL）和蛋白标志物CEA浓度（单位为ng/mL）。

所述蛋白标志物IDH1具体可为GENBANK ACCESSION NO.CAG46496.1所示的蛋白质（序列表的序列1；GENBANK ACCESSION NO.CAG46496.1；GI:49456351；linear PRI16-OCT-2008）。所述蛋白标志物CA125具体可为GENBANK ACCESSION NO.AAL65133.2所示的蛋白质（GENBANK ACCESSION NO.AAL65133.2；GI:24419041；linear PRI29-OCT-2002）。所述蛋白标志物CYFRA21-1具体可为GENBANK ACCESSIONNO.NP_002267.2所示的蛋白质（序列表的序列2；GI:24234699；linear PRI06-MAY-2012）。蛋白标志物CEA具体可为GENBANK ACCESSION NO.CAE75559.1所示的蛋白质（序列表的序列3；GENBANK ACCESSION NO.CAE75559.1；GI:38522495；linearPAT 25-NOV-2003）。

采用购自武汉优尔生科技有限公司的IDH1酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA Kit；其中包括IDH1标准品；产品目录号为E97839Hu 96T)并按试剂盒的说明检测蛋白标志物IDH1的浓度。

采用购自罗氏诊断产品（上海）有限公司的CYFRA21-1定量测定试剂盒（产品目录号为11820966122）并按试剂盒的说明检测蛋白标志物CYFRA21-1的浓度。

采用罗氏诊断产品（上海）有限公司的CEA定量测定试剂盒并按试剂盒（产品目录号为11731629322）的说明检测蛋白标志物CEA的浓度。

采用罗氏诊断产品（上海）有限公司的CA125定量测定试剂盒（产品目录号为11776223822）并按试剂盒的说明检测蛋白标志物CA125的浓度。

4、将步骤3得到的蛋白标志物IDH1浓度、蛋白标志物CA125浓度和蛋白标志物CYFRA21-1浓度代入实施例1的函数式，得到p值，根据实施例1的标准判断患者是否为非小细胞肺癌患者。

步骤3和步骤4的结果见表1和表2（性别中，1代表男性，2代表女性）。

表1和表2中，将根据各个单个蛋白标志物的诊断结果作为采用实施例1的函数式进行诊断的结果的对照。单独采用蛋白标志物IDH1时，按照常规阈值，当浓度≥2.0874时待测患者为候选的非小细胞肺癌患者，当浓度＜2.0874时待测患者为候选为非非小细胞肺癌患者。单独采用蛋白标志物CA125时，按照常规阈值，当浓度≥35时待测患者为候选的非小细胞肺癌患者，当浓度＜35时待测患者为候选为非非小细胞肺癌患者。单独采用蛋白标志物CYFRA21-1时，按照常规阈值，当浓度≥3.3时待测患者为候选的非小细胞肺癌患者，当浓度＜3.3时待测患者为候选为非非小细胞肺癌患者。单独采用蛋白标志物CEA时，按照常规阈值，当浓度≥5时待测患者为候选的非小细胞肺癌患者，当浓度＜5时待测患者为候选为非非小细胞肺癌患者。

表1确诊非小细胞肺癌患者患者(+代表诊断阳性，-代表诊断阴性)

表2确诊健康者(+代表诊断阳性，-代表诊断阴性)

按照实施例1的函数式及诊断方法进行结果判定，灵敏性为70.67%，特异性为90%。单独采用蛋白标志物IDH1及其阈值进行结果判定，灵敏性为46%，特异性为90%。单独采用蛋白标志物CA125及其阈值进行结果判定，灵敏性为13.33%，特异性为98%。单独采用蛋白标志物CYFRA21-1及其阈值进行结果判定，灵敏性为55.33%，特异性为82%。单独采用蛋白标志物CEA及其阈值进行结果判定，灵敏性为25.33%，特异性为72%。综合考虑灵敏性和特异性，采用实施例1的函数式和诊断方法显著优于采用几个单独的蛋白标志物进行诊断。

Claims (6)

1.辅助诊断非小细胞肺癌患者的试剂盒，包括用于检测蛋白标志物IDH1的产品、用于检测蛋白标志物CA125的产品、用于检测蛋白标志物CYFRA21-1的产品和记载有如下函数式的载体：

$p=\frac{1}{1+{(20.186*{0.406}^{x_1}*{0.923}^{x_2}*{0.656}^{x_3})}^{-1}};$

X1代表蛋白标志物IDH1的浓度，x2代表蛋白标志物CA125的浓度，x3代表蛋白标志物CYFRA21-1的浓度。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白标志物IDH1为GENBANKACCESSION NO.CAG46496.1所示的蛋白质；所述蛋白标志物CA125为GENBANK ACCESSIONNO.AAL65133.2所示的蛋白质；所述蛋白标志物CYFRA21-1为GENBANK ACCESSIONNO.NP_002267.2所示的蛋白质。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白标志物IDH1的浓度的单位为U/L，所述蛋白标志物CA125的浓度的单位为U/mL，所述蛋白标志物CYFRA21-1的浓度的单位为ng/mL。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述载体上还记载有如下诊断标准：当p≥0.7386时待测患者为候选的非小细胞肺癌患者，当p＜0.7386时待测患者为候选的非非小细胞肺癌患者。

5.用于检测蛋白标志物IDH1的产品、用于检测蛋白标志物CA125的产品、用于检测蛋白标志物CYFRA21-1的产品和记载有函数式和诊断标准的载体在制备辅助诊断非小细胞肺癌患者的试剂盒中的应用：

所述函数式如下：

$p=\frac{1}{1+{(20.186*{0.406}^{x_1}*{0.923}^{x_2}*{0.656}^{x_3})}^{-1}};$

X1代表蛋白标志物IDH1的浓度、单位为U/L，x2代表蛋白标志物CA125的浓度、单位为U/mL，x3代表蛋白标志物CYFRA21-1的浓度、单位为ng/mL；

所述诊断标准如下：当p≥0.7386时待测患者为候选的非小细胞肺癌患者，当p＜0.7386时待测患者为候选的非非小细胞肺癌患者。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述蛋白标志物IDH1为GENBANKACCESSION NO.CAG46496.1所示的蛋白质；所述蛋白标志物CA125为GENBANK ACCESSIONNO.AAL65133.2所示的蛋白质；所述蛋白标志物CYFRA21-1为GENBANK ACCESSIONNO.NP_002267.2所示的蛋白质。

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