CN109136358B - 鉴别诊断NOA患者睾丸内残存精子的试剂及miRNA在其中的应用 - Google Patents
鉴别诊断NOA患者睾丸内残存精子的试剂及miRNA在其中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及miRNA在制备诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂中的应用；还涉及一种用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂和试剂盒。将所述miRNA作为分子标志物，通过检测其表达水平来诊断NOA患者睾丸内是否存在精子，从而预先判断NOA患者通过micro‑TESE等方法手术取精成功率，可避免大约60％左右的NOA患者进行不必要的外科手术和睾丸创伤，具有较大的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及人类生殖健康领域，更特别地，涉及miRNA在制备诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂中的应用，还涉及用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂和试剂盒。
背景技术
不孕不育是一类常见的生殖疾病，在育龄夫妇中的发病率约为15％。男性不育症中，最严重的一类是无精子症，约占育龄男性人口的1％。在所有导致男性的不育病因中，精子发生障碍是最为常见的因素，也是成年男性生殖健康面临的最主要威胁之一。精子发生障碍是一个多因素、多阶段的过程，主要临床表现为射出精液中精子密度的降低，按WHO标准可分为少精子症、无精子症等(WHO定义的无精子症为：三次精液常规分析，显微镜检查精液标本未见精子，经3000g离心15min，仍无精子)。其中非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia，NOA)约占无精子症的60％，梗阻性无精子症(obstructiveazoospermia,OA)约占40％。
微小核糖核酸(miRNA)是一类小分子非编码单链RNA，长约19-25个核苷酸，通过与靶mRNA的3'非翻译区(3'UTR)互补配对，使靶mRNA降解或使其翻译受到抑制，从而在转录后水平对生物体内基因时序性表达起到精细调节作用。据估计，人体内约1/3的基因受miRNA调控。它与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。最近的研究表明，miRNA能够游离于细胞之外，稳定存在于血浆、精浆以及其他体液中，具备疾病分子生物学标志物的某些优点，已在多种肿瘤和非肿瘤疾病的诊断和预后中显示了其独特的价值，如：恶性肿瘤,产前诊断,法医鉴定,糖尿病,药物诱导的肝损伤,组织损伤,心血管疾病等。此外，miRNA与男性生殖也密切相关，在精子发生过程中发挥重要的表观遗传学调控作用。
有研究发现，大约30～40％NOA患者睾丸组织中还残存有少量的“局灶性”精子发生，可以找到少量睾丸内残存精子，并借助于辅助生殖技术生育自己的遗传学后代。因此，目前对于NOA的处理方法主要是通过外科睾丸显微取精术(micro-dissection testicularsperm extraction,micro-TESE)配合辅助生殖技术(assisted reproductivetechnology，ART)来达到生育自己遗传学后代的目的。
然而，迄今报道的micro-TESE获取精子成功率大约只有40％左右，其原因在于，大部分NOA患者的睾丸组织中没有睾丸内残存精子。micro-TESE手术需要切开睾丸并分离睾丸组织查找极为少量的具有一定精子发生能力的生精小管，对睾丸组织的创伤相对较大，可能破坏睾丸的血供，甚至形成瘢痕粘连，严重时甚至可能导致术后睾丸萎缩。对于没有睾丸内残存精子的NOA患者而言，进行micro-TESE手术不利于患者的身体健康。
然而，迄今尚无手术前预判睾丸内残存精子的非损伤性检测指标，也没有使用miRNA作为NOA患者睾丸内残存精子的预判指标的任何报道。
由于大部分NOA的病因尚不清楚，还缺乏有效的治疗手段。大多数NOA病人只能盲目选择micro-TESE和辅助生殖技术，这会给大部分病人造成不必要的身体上的伤害、心理上和经济上的负担。能否术前预判NOA患者睾丸睾丸内残存精子是本领域亟待解决的问题，也是精准医疗的发展方向。
因此，需要找到非损伤性、高灵敏性以及高特异性的生物学标志物，这些新的标志物及其指标变化可以作为NOA患者micro-TESE能否找到精子的预判指标。
发明内容
发明人在研究过程中发现，在具有睾丸内残存精子的NOA患者的睾丸组织和精浆中一些miRNA的表达水平与没有睾丸内残存精子的NOA患者之间具有显著差异，这一发现使得进行无创伤性地预判NOA患者睾丸内是否存在精子成为可能，从而预先判断NOA患者通过micro-TESE等方法手术取精成功率。
基于以上发现，本发明提供了miRNA在制备诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂中的应用。
由于这样的miRNA的表达水平在存在睾丸内残存精子的NOA患者与不存在睾丸内残存精子发生和精子的NOA患者之间具有显著差异，所以，可将这些miRNA作为分子标志物，通过检测其精浆中表达水平来诊断NOA患者睾丸内是否存在精子，从而预先判断NOA患者通过micro-TESE等方法手术取精成功率，可避免大约60％左右的NOA患者进行不必要的外科手术和睾丸创伤，具有较大的社会效益和经济效益。
在一个优选实施方案中，所述miRNA为以下miRNA中的任一种或多种组合：hsa-miR-10-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-3529-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-378c、hsa-miR-449a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-507、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520d-3p。
本发明还提供了一种用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂，所述试剂为miRNA的表达水平的检测剂。
在一个优选实施方案中，所述miRNA为以下miRNA中的任一种或多种组合：hsa-miR-10-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-3529-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-378c、hsa-miR-449a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-507、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520d-3p。在一个实施方案中，所述试剂为所述miRNA的检测引物或探针。
miRNA的表达水平可以通过PCR的方法来检测，也可通过探针来检测。虽然本发明的实施例中仅列举了PCR的方法，但这仅仅是用于示范性的目的，并非用于限制本发明的范围。本领域技术人员可使用任何本领域已知或未来开发的方式来检测miRNA的表达水平，这些方法中使用的检测试剂都应落在本发明的保护范围内。
在一个优选实施方案中，所述试剂为所述miRNA中的检测引物对，所述检测引物对由所述miRNA中的一种的特异性正向引物和通用反向引物组成，所述试剂为所述miRNA中的检测引物对，所述检测引物对由所述miRNA中的一种的特异性正向引物和通用反向引物组成，：hsa-miR-10-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-3529-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-378c、hsa-miR-449a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-507、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520d-3p。特异性正向引物序列依次如SEQ IDNO:16-30所示，内参的引物序列为SEQ ID NO:31，所述通用反向引物根据加尾PCR法涉及引物时所加的序列来涉及，例如本文的实施例中根据加尾法所加的序列设计的通用反向引物序列如SEQ ID NO:32所示。
本发明还提供了一种用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂盒，所述试剂盒包含上述用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂。
在一个优选实施方案中，所述试剂盒包含分别检测：hsa-miR-10-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-3529-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-378c、hsa-miR-449a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-507、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520d-3p中的一个或多个的表达水平的检测剂。
在一个优选实施方案中，所述试剂盒包含分别检测hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-449a和hsa-miR-486-5p的表达水平的检测剂。
在一个优选实施方案中，还包含内参的检测剂，所述内参为在具有睾丸内残存精子的NOA患者精浆中的表达水平与没有睾丸内残存精子的NOA患者精浆中的表达水平之间均没有差异的标志物。例如，hsa-miR-16。
附图说明
图1为分别使用下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)RNA-seq和RT-qPCR检测到的15种miRNA在存在睾丸内残存精子的NOA患者睾丸组织中的表达量相对于无睾丸内残存精子的NOA患者睾丸组织中表达量的倍数统计图；
图2为hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-449a和hsa-miR-486-5p在不同睾丸组织样本中的表达量统计图；A组代表睾丸内未找到精子组,B组代表睾丸内找到精子组；
图3为hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-449a和hsa-miR-486-5p在不同精浆样本中的表达量的统计图；A组代表睾丸内未找到精子组,B组代表睾丸内找到精子组，C组代表正常人组；
图4为存在睾丸内残存精子的NOA患者和无睾丸内残存精子NOA患者精浆中hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-449a和hsa-miR-486-5p的表达量四分位数评分的受试者工作特征曲线图(receiver operating characteristic curve,简称ROC曲线)。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.样本采集与分组
所有睾丸组织标本来自华中科技大学同济医学院生殖医学中心，研究通过伦理委员会审议批准并征得患者知情同意。micro-TESE手术找到精子组标本来源为NOA患者已经在本生殖医学中心通过辅助生殖技术治疗生育正常后代之后的多余废弃睾丸组织，未找到精子组标本来源为在本生殖医学中心micro-TESE手术后未找到精子的废弃睾丸组织。根据micro-TESE是否获得精子，将NOA患者分为两组：A组为睾丸内未找到精子组，B组为睾丸内找到精子组，收集两组的废弃的睾丸组织和精液样品，快速冷冻并储存在液氮中。此外，还采集了40例正常人的精液样品为C组，作为对照。
A组：NOA患者micro-TESE术中睾丸内未找到精子组(5例睾丸组织进行非编码小RNA高通量测序并且RT-qPCR验证，20例此类NOA患者精浆RT-qPCR验证)，A组患者满足以下条件：年龄在22至34岁间；男性不育一年以上；除无精子症之外,无其它全身性疾病；三次射出精液经离心前后检查均无精子，精浆生化指标以及生殖系统彩色超声检查排除梗阻性病因；micro-TESE术中未找到睾丸内残存精子。
B组：NOA患者micro-TESE手术中找到精子组(5例睾丸组织进行非编码小RNA高通量测序并且采用RT-qPCR验证，20例此类NOA患者精浆RT-qPCR验证)，B组的患者满足以下条件：年龄在22至34岁间；男性不育一年以上；除无精子之外,无其它全身性疾病；三次射出精液经离心前后检查均无精子，精浆生化指标以及生殖系统彩色超声检查排除梗阻性病因；micro-TESE术中找到睾丸内残存精子(10条以上)。
C组：健康生育男性精浆样本对照组，满足以下条件：年龄在22至30岁间；无生殖和内分泌系统疾病；无全身其他疾病；性功能正常；三次精液分析质量正常；并且至少已经生育一胎。
2.miRNA文库构建
分别从A组和B组的睾丸组织中提取总RNA，用Nanodrop仪器(美国Thermo公司)对所提取的总RNA定量并质检，分别加3’和5’接头，通过RT-qPCR扩增，电泳回收145-160bp的目的条带，即得到miRNA文库。
3.RNA-Seq高通量测序筛选差异miRNA
Qubit(美国invitrogen公司)定量miRNA文库，用Start cBot仪器进行簇生成，然后用Hiseq2500(美国illumnia公司)进行测序。
结果如图1所示，以下miRNA在两组间的表达具有极其显著的差异，而且读序数(reads)大于500以上：hsa-miR-10-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-3529-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-378c、hsa-miR-449a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-507、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520d-3p。这些miRNA的序列如表1所示。
表1 15条miRNA的序列
4.RT-qPCR方法测量验证睾丸组织miRNA表达量
针对以上15个miRNA，运用加尾PCR法，设计引物对A组和B组的睾丸组织进行miRNA的定量RT-qPCR检测,以hsa-miR-16为内参(该miRNA在研究中被确定在A和B两组均未发生差异表达)。
1)提取总RNA，反转录成cDNA；
2)取cDNA进行RT-qPCR反应，检测引物如表2所示，以hsa-miR-16为内参。其中，检测引物包括针对各miRNA的特异性正向引物和通用反向引物。每条miRNA均采用由针对该miRNA的特异性正向引物和通用反向引物构成的引物对进行扩增。
结果如图1所示，这15条miRNA在两组间均有极显著差别。可见这15条miRNA的表达情况可用作诊断NOA患者的睾丸组织中是否具有睾丸内残存精子，从而评价这样的患者是否适合进行手术睾丸取精结合辅助生殖技术来生育自己的后代。
选取hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-449a和hsa-miR-486-5p，对RT-qPCR测定的这四种miRNA在A组和B组的睾丸组织中的表达量进行统计，并用A组的表达量对B组的表达进行归一化，结果如图2所示，这四种miRNA在B组中相对于在A组中的表达倍数均高于3倍，因此，
表2 15条miRNA和内参miRNA的上游引物和通用反向引物的序列
5.NOA患者射出精浆的miRNA表达量的稳定性分析
为了研究方便，发明人从以上15条miRNA中任意选取4条，分别为：hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-449a和hsa-miR-486-5p。对40例成年男性NOA患者精浆(20例找到精子和20例未找到精子)中的这4条miRNA水平的稳定性进行评价，以hsa-miR-16为内参。引物见表2。
1)提取精浆的总RNA，反转录成cDNA；
2)取cDNA进行RT-qPCR反应，检测引物如表2所示，以hsa-miR-16为内参。其中，检测引物包括针对各miRNA的特异性上游引物和通用反向引物。每条miRNA均采用由针对该miRNA的特异性上游引物和通用反向引物构成的引物对进行扩增。
结果如图3所示，这4个miRNA在精浆中的水平也具有极其显著的组间差异，且差异水平较稳定。
6.使用组合miRNA诊断NOA患者睾丸是否存在精子
ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(灵敏度)为纵坐标，假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。AUC＝0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。AUC<0.5不符合真实情况，在实际中极少出现。发明人通过对micro-TESE找到精子组和未找到精子组精浆样品中的多个miRNA表达水平的进行分析，以找到精子组miRNA表达量的四分位数为阈值，并将所述多个miRNA表达水平的得分相加，进一步求得总得分，以此绘制R0C曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这所述多个miRNA表达对micro-TESE能否找到精子评估能力。根据四个miRNA在两组精浆样品中的表达量，我们得到的ROC分析结果显示，该miRNA组合以AUC＝0.783将存在睾丸内残存精子与无睾丸内残存精子组分开，最佳诊断界线cutoff值为4.5。(图4)提示该标志物组合具备鉴别有无睾丸内残存精子的预判价值。下文中，将以4条miRNA的组合(hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-449a和hsa-miR-486-5p)实例验证。
根据hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-449a和hsa-miR-486-5p这4个标志物的表达水平分别进行评分。按表达量的四分位数分为0分、1分、2分、3分。对20例确认具有睾丸内残存精子的NOA患者和20例确认没有睾丸内残存精子的患者进行四分位数评分并求和，结果如表3所示。
四分位数评分法的方法如下：针对每个miRNA，将其在A组的20个精浆样本和B组的20精浆样本中表达量2-ΔCT值从小到大排列，分别找出其四分位数Q1，Q2和Q3作为评分标准，然后评估其在每个样本表达量2-ΔCT值，小于Q1，记为0分，Q1-Q2.记为1分，Q2-Q3记为2分，大于等于Q3记为3分，其他三个miRNA同此，然后将这四个miRNA在同一样本中的评分求和，得到该标志物组合对该样本能否找到精子的评价。
表3具有睾丸内残存精子的NOA患者和没有睾丸内残存精子的患者的四分位数分层评分统计表
根据得分判断其分组，高分组基本可判定为NOA患者具有睾丸内残存精子组，低分组基本可判定为NOA患者不具有睾丸内残存精子组；比较而言，≥8分为高分，≤4分为低分。
需要说明的是这个评分值是初步评估参考值，需要未来进一步大样本的临床验证。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院
<120> 鉴别诊断NOA患者睾丸内残存精子的试剂及miRNA在其中的应用
<130> 1
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人
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uacccuguag auccgaauuu gug 23
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<212> RNA
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ugugacuggu ugaccagagg gg 22
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<212> RNA
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<212> RNA
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uagcaccauu ugaaaucagu guu 23
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<212> DNA
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<213> 人工序列
<400> 21
gaggcagtgt agttagctga ttgc 24
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cgcgcgaggt agactgggat ttgttgtt 28
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
caaagtgctg cgacatttga gcgt 24
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gcgactggac ttggagtcag aaggc 25
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gcgactggac ttggagtcag aagagtgg 28
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cgtggcagtg tattgttagc tggt 24
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tcctgtactg agctgccccg ag 22
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cgcgcgtttt gcaccttttg gagtgaa 27
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cgaaagtgct tccctttgga ctgt 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cgaaagtgct tctctttggt gggt 24
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tgacagcacg taaatattgg cg 22
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gctgtcaacg atacgctacg t 21
Claims (3)
1.miRNA在制备诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂中的应用，所述miRNA为以下miRNA的组合：hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-449a和hsa-miR-486-5p，其中hsa-miR-34c-5p 的序列如SEQ ID NO:6所示，hsa-miR-372-3p 的序列如SEQ ID NO: 8所示，hsa-miR-449a的序列如SEQ ID NO: 11所示，hsa-miR-486-5p的序列如SEQ ID NO:12所示。
2.一种用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含分别检测hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-449a和hsa-miR-486-5p的表达水平的检测剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含内参的检测剂，所述内参为在具有睾丸内残存精子的NOA患者精浆中的表达水平与没有睾丸内残存精子的NOA患者精浆中的表达水平之间均没有差异的标志物，所述标志物为hsa-miR-16。
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