CN112592971B

CN112592971B - 一种与系统性红斑狼疮相关的生物标志物及其应用

Info

Publication number: CN112592971B
Application number: CN202011348022.9A
Authority: CN
Inventors: 窦环; 倪佳俐; 梁军; 侯亚义; 陆丽
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN112592971A

Abstract

本发明公开了一种与系统性红斑狼疮相关的生物标志物及其应用。lncRNA FTX作为检测靶点在制备系统性红斑狼疮辅助诊断试剂中的应用。检测lncRNA FTX的物质在制备系统性红斑狼疮辅助诊断试剂中的应用。本发明发现的lncRNA FTX作为一种新颖、可靠且易获取和检测的SLE生物标志物在SLE的早期诊断和治疗中具有重要意义，并且有助于尽快建立狼疮的标准化检测方法。

Description

一种与系统性红斑狼疮相关的生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物诊断领域，涉及一种与系统性红斑狼疮相关的生物标志物及其应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是以产生多种自身抗体导致不同靶器官损害为特点的一种常见慢性自身免疫病。目前全球SLE患病率为0-241/10万，中国大陆地区SLE患病率约为30-70/10万，患病率高居世界第二。该病病因复杂，与遗传、性激素、环境(如病毒与细菌感染)等多种因素有关，并且异质性极强，临床表现多样化。SLE患者疾病发生早期即可造成广泛器官损害，严重影响患者生存质量；如不及时治疗，会造成受累脏器的不可逆损害，最终导致患者死亡。因此，SLE的及时诊断至关重要，其中SLE的生物标志物在早期诊断、病情活动监测及评估和研究致病机制中发挥关键作用。

长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度在200-100000个碱基对之间的RNA，它一般无蛋白编码能力，可通过长链本身的不同区域与特异的蛋白质、DNA、RNA相结合，在X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录及翻译、免疫细胞分化、凋亡和免疫应答等方面发挥着重要作用。近期研究表明，lncRNA可作为免疫系统中基因表达的关键调节因子参与SLE病程进展。Wu等发现血浆中linc0597和Lnc-DC可以成为SLE潜在的生物标志物，通过荧光定量PCR实验证实Lnc-DC在SLE组中表达显著降低，而linc0597在SLE患者中过表达。在另一项研究中，研究人员通过荧光定量PCR实验发现SLE组的linc0949表达水平明显低于对照组，并且linc0949表达水平随治疗后病情改善明显升高，表明linc0949可以作为一种生物标志物监测疾病的进展以及判断疗效。因此lncRNA在未来有望成为SLE新的治疗靶点和疾病标志物，为临床治疗提供潜在的理论支持。

最接近现有技术：SLE现有诊断主要依靠临床表现、实验室检查、组织病理学和影像学检查。1997年美国风湿病协会(ACR)修订的SLE分类标准中，明确将血液学异常、免疫学异常和自身抗体阳性等实验室检查列入了诊断标准，特异性为96.4％，敏感性为93.1％。具体的临床表现包括蝶形或盘型红斑、日光过敏、关节炎等，实验室检查标准包括蛋白尿、抗核抗体阳性、血沉增快、白细胞减少或血小板降低、Sm抗体阳性等。

系统性红斑狼疮病因复杂，病理表现多样化，目前的诊断仍主要基于美国风湿病学会制定的复杂标准。然而，诊断SLE的敏感实验室检查指标有限，如灵敏度相对较高(91.75％)而特异度较低(79.65％)的抗核抗体、特异度相对较高(98.23％)而灵敏度较低(67.01％)的抗双链DNA抗体，并且该病临床表现复杂多变，如果仅依靠某一症状或某一指标异常，易出现诊断错漏。多种实验室指标的检查也大大增加了患者的诊疗成本，因此需要寻找更敏感、更可靠的诊断SLE的生物标志物。

lncRNA可以调节基因表达、广泛参与正常生理和疾病状态，影响免疫细胞的发育分化及功能，且在SLE患者血液中可检测到，在SLE的病程进展中发挥着重要作用，有望成为SLE的诊断标志物，提高SLE的诊疗水平。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种与系统性红斑狼疮相关的生物标志物。

本发明的另一目的是提供该生物标志物的应用。

本发明的又一目的是提供检测该lncRNA的物质的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

lncRNA FTX作为检测靶点在制备系统性红斑狼疮辅助诊断试剂中的应用，所述的lncRNA FTX在NCBI的登录号为NR_028379。

检测lncRNA FTX的物质在制备系统性红斑狼疮辅助诊断试剂中的应用。

作为本发明的一种优选，所述的检测lncRNA FTX的物质为检测lncRNA FTX的特异性引物或特异性探针。

作为本发明的进一步优选，所述的检测lncRNA FTX的特异性引物序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。

一种用于系统性红斑狼疮辅助诊断试剂盒，包含检测lncRNA FTX的特异性引物。

作为本发明的一种优选，所述的检测lncRNA FTX的特异性引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

一种用于系统性红斑狼疮辅助诊断的基因芯片，包含检测lncRNA FTX的特异性探针。

有益效果：

本发明首次通过大量临床样本的检测发现lncRNA FTX在狼疮患者中的异常表达；根据检测结果进行统计学分析，证实lncRNA FTX可作为一种新发现的生物标记物在狼疮的诊断中发挥重要作用。ROC曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标己被普遍认可，以lncRNA FTX作为诊断标志物，ROC曲线下面积为0.843(P<0.05)，最佳cutoff值为1.115，即为诊断阈值。因此，认为lncRNA FTX对SLE具有优异的诊断价值，能够作为检测靶点用于制备红斑狼疮辅助诊断试剂。综上所述，本发明发现的lncRNA FTX作为一种新颖、可靠且易获取和检测的SLE生物标志物在SLE的早期诊断和治疗中具有重要意义，并且有助于尽快建立狼疮的标准化检测方法

附图说明

图1 lncRNA FTX在18例正常人和69例系统性红斑狼疮病人血液样本中的差异表达

图2按SLEDAI对病人进行分组，lncRNA FTX的表达在各组中与非狼疮患者之间的差异

图3 lncRNA FTX的ROC曲线

具体实施方式

实施例1

一、样品收集：分别收集18例正常人和69例系统性红斑狼疮病人血液样本，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。

二、RNA样品的制备及分析：采用Trizol法提取总RNA。

①样品中加入1mL Trizol(Invitrogen)，室温裂解5min；

②进行相分离，按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，震荡混匀15s，室温放置3min，4℃，12000g离心15min；吸取上层无色水相至新RNase free EP管中；

③加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀10次，室温放置10min，沉淀RNA，4℃，12000g离心15min，弃上清；

④加入1mL预冷的DEPC水配制的75％乙醇，温和震荡，洗涤RNA沉淀，4℃，7500g离心5min，弃上清；

⑤在37℃烘箱中干燥RNA沉淀，约15min；取20μL DEPC水溶解RNA沉淀，在60℃金属浴中促溶10min；

⑥取2μL提取到的RNA，用核酸蛋白检测仪检测提取的RNA的浓度及纯度。纯度标准为OD260/280在1.7-2.0之间。

三、QPCR验证lncRNA FTX的差异表达

①总RNA的逆转录，反应体系为20μL，组分如下：

充分混匀后，放置于PCR仪T100TM Thermal Cycler中，程序设置为：50℃15min，85℃5sec，得到的产物为cDNA。

②实时定量PCR检测lncRNA FTX的表达量，引物设计如下：

lncRNA FTX-F	5’-GAATGTCCTTGTGAGGCAGTTG-3’(SEQ ID NO：1)
		lncRNA FTX-R	5’-TGGTCACTCACATGGATGATCTG-3’(SEQ ID NO：2)
GAPDH-F	5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’(SEQ ID NO：3)
		GAPDH-R	5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’(SEQ ID NO：4)

反应体系为10μL，组分如下：

组分	体积
		cDNA	稀释10倍后加4μL
2×SYBR Green Mix	5μL
		F	0.5μL
R	0.5μL

充分混匀后，放置于Q-PCR仪Line Gene 9640中，程序设置为：95℃5min；[95℃30sec；60℃1min；72℃30sec；95℃15sec]重复45个循环。

③结果计算：本实验采用相对定量分析方法。每个样品做三个复孔，结果取三个复孔的平均CT值。△Ct＝目的基因平均CT值-内参基因平均CT值；△△Ct＝△Ct(SLE)-△Ct(Healthy)；相对表达量＝2^-△△Ct。采用GAPDH为内参，计算lncRNA FTX的相对表达量。

四、二元logistic回归分析和ROC曲线分析

数据用SPSS20.0软件进行分析，以目标lncRNA相对表达量为自变量，组别为因变量，进行二元Logistic回归，回归拟合度采用似然比检验，回归参数估计值采用非参数检验法。根据受试者工作特征曲线ROC曲线及曲线下面积(AUC)评估目标lncRNA诊断的敏感性和特异性。

五、结果

①与非系统性红斑狼疮患者相比，狼疮患者血液中lncRNA FTX相对内参的表达量显著上升(P<0.001)。如图1所示(**表示P<0.01，***P<0.001)。

按SLEDAI对病人进行分组，0-4分为基本无活动组，5-9分为中度活动组，>10分为重度活动组，发现lncRNA FTX的表达在各组中与非狼疮患者相比均显著升高。如图2所示。

②根据Hosmer and Lemeshow Test结果，显著性P为0.866，证实模型拟合优度较高。lncRNA FTX诊断SLE的Logistic模型拟合参数如下表所示，其中P<0.05表明在狼疮患者和非狼疮患者中lncRNA FTX表达量的差异具有统计学差异；lncRNA FTX表达量升高，患狼疮的风险增加(OR＝18.023，95％CI：3.569-91.008)。

③ROC曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标己被普遍认可，完全无价值的诊断试验AUC为0.5，理想的诊断试验AUC为1。一般认为，AUC在0.7～0.9之间时具有一定的诊断价值。ROC曲线如图3所示，ROC曲线下面积为0.843(P<0.05)，最佳cutoff值为1.115，即为诊断阈值。因此，认为lncRNA FTX对SLE具有优异的诊断价值。

序列表

<110> 南京大学

<120> 一种与系统性红斑狼疮相关的生物标志物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaatgtcctt gtgaggcagt tg 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggtcactca catggatgat ctg 23

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctggggctca tttg 14

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggggccatc cacagtcttc 20

Claims

1.检测lncRNA FTX的物质在制备系统性红斑狼疮辅助诊断试剂中的应用, 所述的lncRNA FTX在NCBI的登录号为NR_028379。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的检测lncRNA FTX的物质为检测lncRNA FTX的特异性引物或特异性探针。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的检测lncRNA FTX的特异性引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

4.一种用于系统性红斑狼疮辅助诊断试剂盒，其特征在于包含检测lncRNA FTX的特异性引物,所述的lncRNA FTX在NCBI的登录号为NR_028379。

5.根据权利要求4所述的用于系统性红斑狼疮辅助诊断试剂盒，其特征在于所述的检测lncRNA FTX的特异性引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

6.一种用于系统性红斑狼疮辅助诊断的基因芯片，其特征在于包含检测lncRNA FTX的特异性探针, 所述的lncRNA FTX在NCBI的登录号为NR_028379。