JP6987393B2 - 血液中の無細胞dnaを用いた血液学的障害の検出 - Google Patents
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Description
本出願は、その全体的な内容がすべての目的にために参照により本明細書に組み込まれる、2016年5月30日出願の「血液中の無細胞DNAを用いた血液学的障害の検出(Detecting Hematological Disorders Using Cell−Free DNA In Blood)」という表題の米国仮特許出願第62/343050号に由来する優先権を主張し、その非仮出願である。
「メチローム」は、ゲノムにおける複数の部位または遺伝子座のDNAメチル化の量の尺度を提供する。メチロームは、ゲノムの全部、ゲノムの実質的な部分、またはゲノムの比較的わずかな部分(複数可)に対応し得る。
血漿DNAは、分子診断にとってますます遂行される分析物である。特に非侵襲的出生前検査(1〜7)および腫瘍学(8〜12)において血漿DNAの臨床応用に関する継続的な調査研究がある。広範な種類の臨床応用にもかかわらず、循環DNAの組織起源は完全には理解されていない。
本発明者らは、RBCの成熟に関与する赤芽球除核プロセスまたは他のプロセスが循環無細胞DNAのプールに有意に寄与するであろうという仮説を立てている。赤芽球由来の循環DNAの寄与を決定するために、本発明者らは、赤芽球のDNAメチル化特性を他の組織および血球と比較することによって、赤芽球のDNA中の差次的にメチル化された領域(DMR)を特定した。本発明者らは、BLUEPRINT ProjectおよびRoadmap Epigenomics Projectならびに本発明者らのグループによって生成したメチロームから、赤芽球および他の血球(好中球、Bリンパ球およびTリンパ球)ならびに組織(肝臓、肺、結腸、小腸、膵臓、副腎、食道、心臓、脳および胎盤)のメチル化プロファイルを調べた(18〜20,23)。
差次的にメチル化された領域(DMR)を特定するために、本明細書に説明されるように、特定のタイプ/系譜の組織(例えば、赤芽球)を単離した後、例えば、メチル化認識配列決定を用いて分析することができる。組織タイプ(例えば、たった2タイプの赤芽球など)にわたる部位のメチル化密度を分析して、DMRで使用する部位を特定するのに十分な相違が存在するかどうかを判定することができる。
赤芽球特異的DMRにおけるメチル化DNA配列および非メチル化DNA配列を検出するために、2つのデジタル式PCRアッセイが開発され得る。1つは非メチル化配列を標的とし、もう1つはメチル化配列を標的とする。他の実施形態において、DMRのメチル化配列および非メチル化配列の検出および/または定量化のために、メチル化認識配列決定(例えば、二亜硫酸塩配列決定、またはDNAのメチル化状態に基づいてDNAを差別的に修飾するであろう生化学的プロセスまたは酵素によるプロセスに続く配列決定)、リアルタイムメチル化特異的PCR、メチル化感受性制限酵素分析、およびマイクロアレイ分析などの他の方法も使用することができる。したがって、PCRアッセイの他に、他のタイプのアッセイを使用することができる。
普遍的にメチル化されたDNAおよび普遍に非メチル化されたDNAの分析を行って、2つのアッセイの正確率を確認した。
赤血球系DNAについてFECH遺伝子関連DMRを標的とするデジタル式PCRアッセイの組織特異性を確認するために、本発明者らは、異なる量の赤芽球細胞を有する種々の試料におけるデジタル式PCRアッセイを、これらのデジタル式PCRアッセイ以外の技術を用いて測定したように試験した。デジタル式PCRアッセイによって検出された非メチル化DNA配列の量は、赤血球系DNAの量を反映するはずである。同様に、メチル化配列の量は、他の組織または細胞タイプに由来するDNAを反映するはずである。それゆえ、本発明者らは、生物学的試料中の赤血球系DNA(E%)の百分率を、赤芽球特異的DMRにおいて検出された(非メチル化およびメチル化)配列全部における非メチル化配列の百分率として定義した。したがって、DMR領域についてのメチル化配列および非メチル化配列に特異的なアッセイを用いて血液試料を分析して、非メチル化配列の百分率、非メチル化%(E%とも呼ぶ)、および赤芽球由来のDNAの存在の相関を決定した。非メチル化%(E%)は、メチル化レベルの例である。
成人血液中の赤芽球の数は非常に低い。臍帯血は赤芽球の数が非常に多い。したがって、4つのCpG部位についてのE%は、健常な患者についてのものよりも臍帯血において非常に高いはずである。したがって、赤血球系DNAのFECH遺伝子関連DMRを標的とするデジタル式PCRアッセイの組織特異性を確認するために、本発明者らは、12の異なる正常組織タイプから抽出されたDNAを含む試料において、および赤芽球を濃縮した試料において、デジタル式PCRアッセイを試験した。本発明者らは、各組織タイプについて異なる個体から4つの試料を含めた。赤芽球濃縮試料を、分析のために臍帯血から調製した。
重症型ベータサラセミアに罹患している患者において、骨髄は、多くの赤血球(RBC)を作ろうとしている。しかしながら、ヘモグロビンの産生に欠陥がある。結果として、多くのRBCは十分なヘモグロビンを含有しておらず、多くの過剰なアルファグロビン鎖を含有している。これらの欠陥のあるRBCは骨髄から除去されるであろうことから、成熟RBCとなることは決してないことになっている。グロビン鎖には、アルファとベータの2種類がある。1つのヘモグロビン分子は2つのアルファ鎖と2つのベータ鎖を必要とする。ベータ鎖が産生されない場合、過剰なアルファ鎖は互いに凝集することになっており、機能的ヘモグロビンは形成されることができない。
いくつかの実施形態において、無細胞混合物(例えば、血漿試料または血清試料)中の非メチル化DNA断片またはメチル化DNA断片の量が特定の細胞系譜に特異的な1つ以上のDMRで計数される場合、この量を用いて、特定の細胞系譜の細胞数(または他の量のDNA)を測定することができる。図3Aに示すように、FECH DMRでメチル化されていないDNA断片の百分率は、血液試料中の赤芽球の数と相関する。絶対濃度も使用され得る。高メチル化DMRについては、メチル化DNA断片の量(例えば、百分率または絶対濃度)を使用することができる。本明細書で説明されているように、種々の細胞系譜を使用することができる。
非メチル化%と赤芽球由来のDNAとの確立された関係を用いて、血漿の非メチル化%を用いて血漿中の赤芽球由来のDNAを定量化することができる。上述のアッセイを用いて、血漿中の非メチル化%を決定した。バフィーコートおよび血漿における非メチル化%の相違が見られる。この分析は、血漿中の無細胞赤芽球DNAが骨髄における赤血球産生に由来し、血流中の赤芽球由来ではないことを示している。
先の観察に基づき、本発明者らは、赤芽球DMRの非メチル化%が、骨髄における赤血球産生活性を反映するであろうと判断した。高い非メチル化%は、増加した赤血球産生活性を示すであろう。換言すれば、血漿/血清中の赤芽球DNAの分析は、骨髄の液体生検として役立つであろう。この分析は、貧血の調査に、例えば、貧血が赤血球産生の低下(例えば、再生不良性貧血)、赤血球産生欠損(例えば、サラセミアにおける成熟したRBCの産生の不全)、またはRBC消費の上昇(例えば、失血および溶血性貧血)によるものかどうかを判断するために、特に有用であろう。この目的のために、本発明者らは、35名の健常対象および異なる病因を有する75名の貧血患者を募集した。末梢血試料の収集および加工、血漿およびバフィーコートのDNAの抽出、ならびにDNAの二亜硫酸塩変換を行った。方法のさらなる詳細は、第XII節において説明する。
本発明者らのアッセイの特異性を確認した後、本発明者らは、これらのアッセイを用いて健常対象の血漿を分析した。本発明者らは、健常対象35名の血漿中のE%(FECH)を分析し、これには、同じくバフィーコート試料も提供した同じ群の20名の対象も含まれた。血漿DNAの中央値E%(FECH)は30.1%(四分位範囲:23.8〜34.8%)であった。このことは、赤血球系DNAが健常個体の血漿中の循環DNAプールの有意な比率を構成することを示唆した。血漿赤血球系DNAの起源を判断するために、本発明者らは、20名の健常対象の血漿およびバフィーコートにおける対応するE%(FECH)結果を比較した。
血漿中の赤血球系DNAが循環中の未処置の赤芽球から主に放出されなかったと判断した後、本発明者らは、これらのDNA分子が赤血球産生の間に骨髄から放出された可能性がより高いことを提唱した。本発明者らは、血漿中の赤血球系DNAの定量分析が、骨髄における赤血球産生活性に関する情報を提供することができるであろうと推論した。
貧血は、栄養素(例えば、鉄、B12、葉酸など)の欠乏、失血(例えば、過多月経または消化管からの出血による)または慢性障害(例えば、癌、炎症性腸疾患)に起因し得る。
本発明者らは、再生不良性貧血(AA)、慢性腎不全(CRF)、慢性失血による鉄欠乏性貧血、および重症型β−サラセミアに罹患している貧血患者を募集した。骨髄における赤血球産生活性の範囲の両端を表すために、異なる疾患実体を募集した。
図12は、骨髄異形成症候群および真性赤血球増加症の患者における血漿非メチル化%のプロットである。骨髄異形成症候群患者においては、高い血漿非メチル化%が、低いヘモグロビンレベルとともに観察された。高い血漿非メチル化%は、真正赤血球増加症患者においても観察された。これらの結果は、血漿中の赤芽球DNAメチル化署名の検出および定量化が、骨髄芽細胞を包含する骨髄の異常な増殖または異形成の検出およびモニタリングに有用であることを示す。
他の障害間の区別も可能である。
再生不良性貧血およびMDSは両方とも、骨髄不全容態である。汎血球減少に関するこれらの類似の臨床的特徴にもかかわらず、これら2つの疾患実体は、異なる病態生理学的機序を有する。AAにおいては、異形成の特徴を持たない骨髄細胞減少がある。MDSにおいては、通常、1つまたは複数の系譜を包含する骨髄細胞増加および異形成がある(33)が、細胞減少性MDSも認識されている。
図13Bは、本発明の実施形態による再生不良性貧血における治療応答群と治療非応答群の間の血漿中の赤血球系DNAの百分率(E%(FECH))を示す。本発明者らは、免疫抑制療法に応答し、それによりヘモグロビンレベルを上げた8名の追加の再生不良性貧血患者を分析した。治療応答群の血漿DNAの中央値E%は、22.5%(四分位範囲:17.2〜27.1%)であり、非応答群の中央値E%(中央値:12.3%、四分位範囲:7.5〜13.7%)よりも高かった(マン・ホイットニー順位和検定でP=0.0003、図13B)。治療反応群と健常対照のE%結果の間には小さいが有意な差があった(マン・ホイットニー順位和検定でP=0.01)。
白血病以外の他の血液障害もFECHなどにおける、赤芽球特異的DMRを用いて検出することができる。
本発明者らは、試料のサブセットの血漿におけるその他2つのDMRに基づいてE%を分析して、FECH遺伝子関連DMRから先のE%の結果を検証した。健常対象と再生不良性貧血患者および重症型β−サラセミア患者との血漿中の赤血球系DNAの百分率における類似した相違が他の2つの赤芽球特異的DMRをFECH遺伝子におけるDMRとして用いて観察した。
第12番染色体上に位置する他の2つのDMRも低メチル化されている。これら2つのDMRと関連したゲノム領域は、いかなる注釈された遺伝子としても従来特定されていなかった。
本発明者らは、先に説明した8つの臍帯血試料由来の赤芽球濃縮試料中の他の2つのDMRに基づいて赤血球系DNAの百分率を分析した。プールされた試料から抽出されたDNAのE%(Ery−1)およびE%(Ery−2)は、66.5%および68.5%であった。これらのE%値は、FECH遺伝子関連DMRに基づくE%と類似しており、すなわち、67%であった。3つのDMR全部に由来する類似の所見を考慮すると、予想よりも低いE%値(すなわち、濃縮が実施される場合に予想されるよりも低い)は、濃縮プロトコルの不完全な選択性に起因し得た。
2つのDMRに基づく赤血球系DNAの百分率を、重症型β−サラセミア患者の同じ群のバフィーコートDNAにおいて分析した。バフィーコートDNA中の2つのDMRについてのE%は、図3Aと類似の様式で赤芽球の百分率と十分に相関した。
本発明者らは、健常対象ならびに再生不良性貧血および重症型β−サラセミアに罹患している患者の血漿DNAにおけるE%(ERY−1)およびE%(ERY−2)を分析した。同じ群の健常対象における3つの赤芽球特異的DMR、7つの再生不良性貧血、および9つの重症型β−サラセミアに基づくE%結果を分析した。
先に説明したように、E%を使用して、貧血のための治療効力をモニターすることができる。
本発明者らは、経口鉄による消化管の副作用に対する不耐性に起因して静脈内鉄療法を受けている鉄欠乏性貧血患者4名におけるヘモグロビンレベル、網状赤血球計数、および血漿DNAのE%の連続的な変化をモニターした。経口鉄療法を受けている患者の代わりに、本発明者らは、この群の患者の変化を観察して、様々な消化管吸収による異なる治療応答の起こり得る交絡因子を回避することを選択した。本発明者らは、これらのパラメータを治療前および治療2日後に測定した。
CKD患者においては、貧血の主な原因は、腎臓の損傷によるエリスロポエチン産生の低下である。エリスロポエチンは、低い組織酸素レベルに応答して腎臓によって産生されるホルモンである。エリスロポエチンは、赤血球を産生するために骨髄を刺激する。外来性エリスロポエチンは、CKDの貧血の治療に使用されるであろう。
再生不良性貧血患者の免疫抑制療法は、患者の60〜70%において血液回収につながる可能性があり得る(Young et al.Blood.2006;108(8):2509−2519)。免疫抑制療法を受けている再生不良性貧血患者4名の血漿中の非メチル化%値を、免疫抑制療法の開始前、ならびに2か月後および4か月後に分析した。患者は全員、治療に応答せず、ヘモグロビンレベルはその期間にわたって正常レベルに回復せず、4名の患者は全員、定期的な輸血が必要であった。
血漿/血清中の赤血球系DNAの量を測定するために、いくつかの実施形態は、低メチル化マーカーのパラメータE%(非メチル化%とも呼ぶ)を使用するが、細胞系譜に特異的な高メチル化マーカーも、存在する場合、使用され得る。E%は、試料中のDNAの大部分(ほとんどが高メチル化されている)に対して正規化された赤芽球DNAの量に対応する。
血液学的評価のためのこの血漿DNAベースのアプローチは、他の血液細胞系譜、例えば、骨髄、リンパ、および巨核球系列のマーカーに一般化することができる。血液系譜特異的DNAメチル化マーカーの使用に関する従来の研究は、全血または血球に焦点を絞ってきた(Houseman EA,et al.Current Environmental Health Reports 2015;2:145−154)。先に呈された本発明者らのデータは、血漿DNAが血球には存在しない情報を含有していることを明らかに示している。それゆえ、複数の血液細胞系譜由来の発生マーカーを用いた血漿DNAの分析は、個体の血液系に関する価値のある診断情報を提供することができる。したがって、骨髄生検の非侵襲的置き換えである。血漿または血清中の特定の細胞系譜のメチル化署名を特異的に検出し、それにより骨髄中の異なる細胞系譜の活性をモニターすることができるアッセイを設計することができる。
1.血液学的悪性腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫(リンパ球系譜)
2.骨髄障害、例えば再生不良性貧血、骨髄線維症(骨髄系細胞およびリンパ球系譜)
3.免疫系およびその機能のモニタリング、例えば、免疫不全ならびに疾患および治療の間の免疫応答の封入(リンパ球系譜)
4.骨髄に対する薬物効果、例えばアザチオプリン(骨髄系細胞系譜)
5.血小板数は少ないが正常な骨髄を特徴とする容態である、血液学的徴候を伴う自己免疫疾患、例えば、免疫性血小板減少症(ITP)。血液系譜マーカー、例えば巨核球性マーカーを用いた血漿DNA分析は、このような容態に関する価値のある診断情報を提供するであろう。(巨核症マーカー)
6.赤血球産生の低下またはさらにより重度の再生不良の危機と合併することのできる、血液学的合併症を伴う感染、例えば、パルボウイルスB19による感染。(赤血球系系譜)
図26は、本発明の実施形態による哺乳類の血液試料を分析する方法2600を示す流れ図である。方法2600の一部は手動で実行されてもよく、他の部分はコンピュータシステムによって実行されてもよい。一実施形態において、システムは工程全部を実行することができる。例えば、システムは、(例えば、試料を得てアッセイを行うための)ロボット要素、アッセイからのシグナルを検出するための検出システム、およびシグナルを分析するためのコンピュータシステムを含むことができる。このようなシステムを制御するための命令は、フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)の構成論理、フラッシュメモリ、および/またはハードドライブなど、1つ以上のコンピュータ可読媒体に保存され得る。図27は、このようなシステムを示す。
RBCは、末梢血中に最も豊富な細胞タイプであるが、核を有していない。本開示において、本発明者らは、赤血球系譜の細胞が血漿DNAプールの有意な比率に寄与することを決定した。この研究の前に、造血細胞が、循環DNAプールに有意に寄与することは既知であった(13,14)が、多くの研究者はこのような造血DNAが、白血球系譜のみに由来すると仮定した(15)。DNAメチル化マーカーを使用したより近年の結果は、血漿DNAが好中球およびリンパ球のDNAメチル化署名を保有していることを示した(15)。
本節では、実施形態を実施するに使用された、および使用され得る技術を説明する。
血球およびFFPE組織から抽出した血漿DNAおよびゲノムDNAを、製造元の説明書により、Epitect Plus Bisulfite Kit(Qiagen)を用いて、2回の二亜硫酸塩処理へ供した(3)。
種々のメチル化アッセイ用いて、特定の細胞系譜からDNAの量を定量化するために使用することができる。
1つは二亜硫酸塩変換非メチル化配列を標的とし、もう1つはメチル化配列を標的とする、3つの赤芽球特異的DMRのそれぞれについて、2つのデジタル式PCRアッセイを開発した。アッセイのためのプライマーおよびプローブ設計は、付録表7に列挙する。
メチル化認識配列決定の他の例としては、(N6−メチルアデニン、5−メチルシトシンおよび5−ヒドロキシメチルシトシンを含む)DNA分子のメチル化状態を可能にするであろう単一分子配列決定プラットフォームを用いて(AB Flusberg et al.2010 Nat Methods;7:461−465、J Shim et al.2013 Sci Rep;3:1389)またはメチル化シトシンの免疫沈降を通じて(例えば、メチルシトシンに対する抗体を使用することによって、またはメチル化DNA結合タンパク質もしくはペプチドを使用した(LG Acevedo et al.2011 Epigenomics;3:93−101)後に、配列決定、メチル化感受性制限酵素の使用の後の配列決定を通じて、二亜硫酸塩変換なしで直接解明されることが挙げられる。
ピアソンの相関を用いて、重症型β−サラセミア患者における血液分析装置によって測定された末梢白血球において、赤血球系DNAの百分率(E%(FECH))と赤芽球の百分率との相関を研究した。ピアソンの相関を使用して、健常対照の血漿DNAにおけるおよびバフィーコートDNAにおける対形成したE%(FECH)の結果間の相関も研究した。ウィルコクソン符号づけ順位検定を用いて、健常対象の血漿DNAのE%と、対形成したバフィーコートDNAとの相違を比較した。マン・ホイットニー順位和検定を用いて、健常対象および異なる疾患群の貧血患者の血漿DNA中のE%の相違を比較した。
図28に示されるサブシステムは、システムバス75を介して相互接続される。プリンタ74、キーボード78、記憶装置(複数可)79、ディスプレイアダプタ82へ連結されるモニター76、およびその他などの追加のサブシステムが示されている。I/Oコントローラ71へ連結する周辺機器および入出力(I/O)装置は、入出力(I/O)ポート77(例えば、USB、FireWire(登録商標))など、当該技術分野で既知の任意の数の手段によって、コンピュータシステムへ接続することができる。例えば、I/Oポート77または外部インターフェース81(例えば、Ethernet、Wi−Fiなど)を使用して、Internetなどの広域ネットワーク、マウス入力装置、またはスキャナへ、コンピュータシステム10を接続することができる。システムバス75を介した相互接続は、中央処理装置73が各サブシステムと通信し、システムメモリ72または記憶装置(複数可)79(例えば、ハードドライブまたは光ディスクなどの固定ディスク)からの複数の命令の実行、およびサブシステム間の情報交換を制御することを可能にする。システムメモリ72および/または記憶装置(複数可)79は、コンピュータ可読媒体を具現化してもよい。別のサブシステムは、カメラ、マイクロホン、および加速度計、ならびにこれらに類するものなどのデータ収集装置85である。本明細書に言及されるデータのうちのいずれも、ある構成要素から別の構成要素へ出力することができ、ユーザに対して出力することができる。
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Claims (33)
- 哺乳類の血液試料を分析する方法であって、
アッセイから得られたシグナルに基づいて、1つ以上の差次的にメチル化された領域の、血液試料のセルフリー混合物中のメチル化または非メチル化DNA断片の第1の数を検出することと、ここで、前記セルフリー混合物は、複数の細胞系譜由来のセルフリーDNAを含み、前記1つ以上の差次的にメチル化された領域の各々は、他の細胞系譜と比較して低メチル化または高メチル化されていることによって特定の血球系譜に特異的であり、前記特定の血球系譜は赤血球である、
前記第1の数を用いてメチル化レベルを決定することと、
前記哺乳類における血液学的障害の分類を決定する一環として、前記メチル化レベルを1つ以上のカットオフ値と比較することと、
を含む、方法。 - 前記1つ以上の差次的にメチル化された領域における前記セルフリー混合物中のDNA断片の総数を決定することと、
前記第1の数および前記総数を用いて前記メチル化レベルを決定することと、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記セルフリー混合物の体積を決定することをさらに含み、前記メチル化レベルが、前記第1の数および前記セルフリー混合物の前記体積を用いて決定される、請求項1に記載の方法。
- 前記セルフリー混合物を得ることが、
血漿または血清を含む前記セルフリー混合物を前記血液試料から分離することを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記特定の血球系譜および前記他の細胞系譜を含む複数の細胞系譜の各々について、複数の部位のメチル化指数を得ることと、
前記複数の部位の各部位の、前記複数の細胞系譜の前記メチル化指数を比較することと、
第1のメチル化閾値を下回る/上回る前記特定の血球系譜におけるメチル化指数と、第2のメチル化閾値を上回る/下回る前記他の細胞系譜の各々におけるメチル化指数と、を有する前記複数の部位の1つ以上の部位を特定することと、
前記1つ以上の部位を含有する1つ以上の差次的にメチル化された領域のうちの1つを特定することと、
によって、前記1つ以上の差次的にメチル化された領域のうちの1つを特定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 複数の試料を得ることと、ここで、各試料が前記血液学的障害の特定の分類を有することが既知であり、前記複数の試料が、前記血液学的障害の少なくとも2つの分類を有する、
前記複数の試料の各々について、前記1つ以上の差次的にメチル化された領域の試料メチル化レベルを決定することと、
前記血液学的障害の第1の分類を有する第1の試料セットを特定することと、
前記血液学的障害の第2の分類を有する第2の試料セットを特定することと、ここで、前記第1の試料セットが、前記第2の試料セットよりも統計的に高いメチル化レベルを集約的に有する、
指定された特異性および感度内で前記第1の試料セットと前記第2の試料セットとを区別するカットオフ値を決定することと、
を含む、前記1つ以上のカットオフ値を決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記血液学的障害の前記分類を決定することが、前記血液学的障害の特定のタイプを特定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アッセイを反復して、前記哺乳類が前記血液学的障害を有することを前記血液学的障害の分類が示すと決定することに応答して、前記血液学的障害について治療されている前記哺乳類の最新のメチル化レベルを決定することと、
コンピュータによって、前記最新のメチル化レベルに基づいて、前記血液学的障害の治療を行い続けるかどうかを判断することを補助することと、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記アッセイが、PCRアッセイまたは配列決定アッセイである、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の差次的にメチル化された領域が、CpG部位を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の差次的にメチル化された領域の第1の領域が、互いの100bpの範囲内にある複数のCpG部位を含み、前記複数のCpG部位がすべて低メチル化または高メチル化されている、請求項10に記載の方法。
- 前記複数のCpG部位が、前記哺乳類に対応する参照ゲノムの100bp以下に及ぶ、請求項10に記載の方法。
- 前記赤血球が赤芽球を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記血液試料のヘモグロビンレベルを測定することと、
前記ヘモグロビンレベルをヘモグロビン閾値と比較することと、
前記ヘモグロビンレベルと前記ヘモグロビン閾値との比較にさらに基づいて、前記血液学的障害の分類を決定することと、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記血液学的障害が貧血であり、前記分類を決定することが、β−サラセミアに由来する増加した赤血球産生活性と、鉄欠乏性貧血に由来する中程度の赤血球産生活性と、再生不良性貧血または慢性腎不全に由来する減少した赤血球産生活性とを識別する、請求項14に記載の方法。
- 前記1つ以上の差次的にメチル化された領域のうちの1つが、FECH遺伝子にある、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の差次的にメチル化された領域のうちの1つが、ゲノム座標48227688〜48227701の第12番染色体にある、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の差次的にメチル化された領域のうちの1つが、ゲノム座標48228144〜48228154の第12番染色体にある、請求項1に記載の方法。
- 前記血液学的障害が貧血である、請求項1に記載の方法。
- 前記血液学的障害の分類が、増加した赤血球産生活性、中程度の赤血球産生活性、または低減した赤血球産生活性に対応する、請求項19に記載の方法。
- 前記血液学的障害の分類が、β−サラセミアに由来する増加した赤血球産生活性である、請求項20に記載の方法。
- 前記血液学的障害の分類が、鉄欠乏性貧血に由来する中程度の赤血球産生活性である、請求項20に記載の方法。
- 前記血液学的障害の分類が、再生不良性貧血または慢性腎不全に由来する低減した赤血球産生活性である、請求項20に記載の方法。
- 前記1つ以上の差次的にメチル化された領域が低メチル化されている、請求項1に記載の方法。
- 前記セルフリー混合物が血漿である、請求項1に記載の方法。
- 生物学的試料中の特定の細胞系譜の細胞量を測定する方法であって、
アッセイから得られたシグナルに基づいて、1つ以上の差次的にメチル化された領域の、生物試料のセルフリー混合物中のメチル化されたか、またはメチル化されていないDNA断片の第1の数を検出することと、ここで、前記セルフリー混合物は、複数の細胞系譜由来のセルフリーDNAを含み、前記1つ以上の差次的にメチル化された領域の各々は、他の細胞系譜と比較して低メチル化または高メチル化されていることによって特定の血球系譜に特異的である、
前記第1の数を使用して第1のメチル化レベルを決定することと、
1つ以上の較正データ点を得ることと、ここで、前記1つ以上の較正データ点の各々は(1)前記特定の細胞系譜の細胞較正量および(2)較正メチル化レベルを指定し、前記1つ以上の較正データ点が複数の較正試料から決定される、
前記第1のメチル化レベルを少なくとも1つの前記1つ以上の較正データ点の較正メチル化レベルと比較することと、
前記比較することに基づいて、前記生物学的試料中の前記特定の細胞系譜の前記細胞量を概算することと、を含む、方法。 - 前記特定の細胞系譜が、特定の血球系譜であり、前記生物学的試料が血漿又は血清である、請求項26に記載の方法。
- 前記特定の細胞系譜が赤芽球である、請求項27に記載の方法。
- 前記1つ以上の較正データ点が、複数の較正データ点であり、前記較正データ点が較正曲線を形成する、請求項26に記載の方法。
- 血液試料のセルフリー混合物を得ること、
前記セルフリー混合物中のDNA断片を、1つ以上の差次的にメチル化された領域に対応するアッセイと接触させることと、
を更に含み、
前記1つ以上の差次的にメチル化された領域の各々は、他の細胞系譜と比較して低メチル化または高メチル化されていることによって特定の血球系譜に特異的である、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。 - 請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法を実施するようにシステムを制御するための複数の命令を保存するコンピュータ可読媒体。
- 請求項31に記載のコンピュータ可読媒体と、
前記コンピュータ可読媒体上に保存された命令を実行するための1つ以上のプロセッサと、を備えた、システム。 - 請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法を実施するように構成された、システム。
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