CN110361531B - 一种检测微粒促凝活性的实验方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测微粒促凝活性的实验方法，包括血浆标本的制备：取新鲜枸橼酸盐抗凝全血2ml，通过梯度离心的方法，得到无细胞血浆标本，吸取离心后的血浆上清备用；微粒促凝活性检测实验：取一定量的无细胞血浆标本和Ca²⁺混匀，放入凝血功能仪上检测，通过凝血功能仪中探针的振动感受血液粘稠度的改变，记录粘稠度改变时间。这一过程所用时间，可以反映人血浆促凝活性状态，凝固时间(纤维蛋白形成时间)的长短与组织细胞急性损伤等病理状态下细胞产生微粒的水平及其促凝功能相关，进而反映人体病理状态下的高凝状态和严重程度，此方法重复性好、灵敏度高、操作简便。

Description

一种检测微粒促凝活性的实验方法

技术领域

本发明属于医疗技术实验技术领域，尤其涉及一种检测微粒促凝活性的实验方法。

背景技术

微粒是人体细胞在生理或病理过程中代谢、释放到外周血中的一种囊泡(MVs)，直径在100～1000nm之间，主要由磷脂双分子层和膜包裹的内容物构成，在不同病生理状态下可发挥不同生物学效应。此外，前期研究还证实：(1)某些疾病发生时，血浆中Annexin-V(+)微粒的数量会呈现规律性升高；(2)由于Annexin-V(+)微粒表面富含带负电荷的磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine PS)，因此具有较强的促凝活性；(3)血小板在病理状态下产生的微粒也有极强的促凝作用；(4)可能还有一些未知的促凝微粒也发挥促凝作用。人体的血液凝固需经历三个过程，即凝血因子活化、纤维蛋白形成和纤溶系统活化。现阶段，临床上主要的凝血功能试验多是以诱发血液中凝血因子自身活性为基础原理，实验过程都需要有凝血介质和促凝剂参与，如硅藻土、白陶土、玻璃微粒及磷脂悬液等促凝剂，主要用于凝血因子缺陷性疾病的诊断、促凝/抗凝蛋白活性测定以及临床抗凝药物监测，但此类方法的不足在于无法反映凝血启动的全貌，而且实验过程中诱导剂(激活剂)往往对特定病理过程不敏感。目前，由于宏观反映血液凝固启动阶段活化过程(即凝血因子初始激活)的检测方法尚缺乏，而传统凝血试验不能敏感的反映病人血浆促凝趋势以及高凝状态的类型，常造成医生在评估复杂临床情况下的凝血异常活化或缺陷疾病时缺乏足够的依据。

因此，基于这些问题，提供一种可反映人体在病理状态下的高凝状态和严重程度，并且重复性好、灵敏度高、操作简便的检测微粒促凝活性实验方法，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的检测人体高凝状态的方法，该方法可反映人体在某些病理情况下的高凝状态和严重程度，该实验重复性好、灵敏度高、操作简便。

本发明采取以下技术方案实现：

一种检测微粒促凝活性的实验方法，包括如下步骤：

步骤一：血浆标本的制备

取新鲜枸橼酸盐抗凝全血2ml，通过梯度离心的方法，得到无细胞血浆标本，吸取离心后的血浆上清备用；

步骤二：微粒促凝活性的检测方法

取一定量的无细胞血浆标本和Ca²⁺混匀，放入LTHCARE CENTURY(世纪亿康)凝血功能仪中检测，通过探针的振动感受血液粘稠度的改变，记录粘稠度改变时间。

优选的，所述步骤一中通过两次梯度离心，第一次梯度离心的离心条件为室温下1500g/20min，第二次梯度离心的离心条件为室温下13000g/2min。

优选的，所述步骤一中无细胞血浆标本的用量是200ul，Ca²⁺的浓度为0.02mmol/L，Ca²⁺的用量是170ul。

优选的，还包括微粒促凝活性实验的重复性实验，所述重复性实验包括如下步骤：

取该实验测定结果中时间长、短的两份血浆标本，分别各重复测定10次，其结果进行统计学分析，得到该实验的重复性结果。

优选的，还包括微粒浓度与纤维蛋白形成时间相关性的测定实验，包括如下步骤：

分别选取微粒浓度不同的两组标本，每组8份血浆标本，分别检测纤维蛋白形成时间和微粒浓度，结果采用非参数检验，去除异常值，得到相关系数，得到微粒浓度与纤维蛋白形成时间的相关性结果。

本发明的优点和积极效果是：

1.本发明通过梯度离心枸橼酸钠抗凝全血获得无细胞血浆，并在Ca²⁺存在的环境下诱导血浆粘弹性阻力改变，即纤维蛋白形成的过程(血浆凝固)。这一过程所用时间，可以反映人血浆中微粒的促凝活性状态，凝固时间的长短与组织细胞急性损伤等病理状态下细胞产生微粒的水平及其促凝功能相关，进而反映人体在病理状态下的高凝状态和严重程度，此方法重复性好、灵敏度高、操作简便。

2.本发明完善和拓展了传统凝血功能检测，为进一步观察研究多种复杂疾病(如DIC、脑创伤、妊高征等)的发生、发展机制及其凝血紊乱的全貌，为临床疾病诊断与治疗干预提供及时、有效且可靠的手段，同时也填补了传统凝血试验在促凝功能监测方面的空白。

3.微粒促凝活性实验检测的建立，完善了对血浆凝固全过程的观察方法，实现了利用简单技术全面评价微粒促进血浆凝固的目的。

4.基于本实验方法，发明人发现多种疾病状态下微粒促凝活性增强，诱导的凝血时间缩短，提示体内存在应激的高凝状态，特别在妊娠期高血压综合征、骨折等患者中存在着危险的高凝状态，即上述疾病中细胞所释放的微粒构成了患者凝血紊乱的基础和微环境，检测结果可能作为临床实施早期干预病理性凝血活化、改善止凝血功能、降低不良临床结局风险的可靠依据。

附图说明

图1是凝血功能仪的检测原理。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例来对本发明的技术方案作进一步的详细描述。

一、实验原理

人血浆中的某些微粒(来源自脑、胎盘或血小板等)可以促进血液凝固。在不同病生理状态下可发挥不同生物学效应。本实验与目前临床上主要的凝血功能的实验原理不同，临床意义也进一步拓展，本实验的技术原理是以血浆中不同疾病时产生的特异性微粒作为促凝剂(不再需要其他介质或诱导剂，减少体外干扰)，基于病理状态下微粒的促凝机制，在Ca²⁺的参与下观察纤维蛋白形成过程。本实验通过观测无细胞血浆(Cellfree plasmaCFP，含有微粒的血浆)，在Ca²⁺的存在下血浆粘滞度(粘稠度)的改变，以时间“秒”报告结果。病理性的微粒可导致凝固时间缩短，提示血液有高凝状态。

二、材料与方法

1.仪器与试剂

凝血和血小板功能分析仪：LTHCARE CENTURY(世纪亿康)

0.25mmol/L CaCl₂ Instrumengtation Laboratory

2.试验方法

2.1血浆标本的制备

取新鲜枸橼酸盐抗凝全血2ml，通过两次梯度离心的方法(离心条件：第一次离心，室温1500g 10分钟)，获得上清再次进行离心(离心条件：第二次离心，室温13000g 2分钟)得到无细胞血浆标本(Cell free plasma CFP)，吸取离心后的血浆上清备用。

2.2微粒促凝活性检测实验

2.2.1从制备好的无细胞血浆标本(CFP血浆标本)，吸取200ul放入试杯中，接着在标本液面上方加入170ul Ca²⁺(浓度为0.02mmol/L)溶液，随即放入LTHCARE CENTURY(世纪亿康)凝血功能仪中检测，注意在加样过程中不要产生气泡；

2.2.2凝血功能仪检测原理

凝血功能仪包括电子信息转换器、传感器、探针，该凝血功能仪通过探针的振动来感受血液粘滞度(粘稠度)的变化，对标本中的任何可加强或减弱探针运动的物质都很敏感。

2.2.3实验的报告结果：加入Ca²⁺后凝血功能仪通过探针感应发生粘滞度改变的时间，结果以“秒”报告，即为纤维蛋白形成时间。

2.3重复性实验

重复性实验包括如下步骤：取纤维蛋白形成时间测定结果(秒值)长、短两份病人血标本，分别各重复测定10次，得到该实验的重复性结果，并对结果进行统计学分析。微粒促凝活性实验的重复性测定结果如表1所示。

表1.微粒促凝活性实验的重复性测定结果

表1为微粒促凝活性实验重复10次测定长、短两份标本的结果，低值的cv＝5.9％；高值cv＝10.7％,符合试验的允许误差。

2.4微粒浓度与纤维蛋白形成时间相关性的测定实验

微粒具有促凝作用，纤维蛋白形成的时间长短与微粒的浓度直接相关，微粒浓度与纤维蛋白形成时间相关性的检测包括如下步骤：随机选取8份健康人和8份病人血标本，分别检测纤维蛋白形成时间和微粒浓度，结果采用非参数检验，去除异常值，得到相关系数，得到微粒浓度与纤维蛋白形成时间的相关性结果。

微粒与纤维蛋白形成时间的相关性测定实验中相关系数为0.754，显示微粒浓度与纤维蛋白形成时间有显著相关性。微粒与纤维蛋白形成时间相关性的测定实验结果如表2所示。

表2.微粒与纤维蛋白形成时间相关性的测定结果

表2采用非参数检验，8份标本ACT和微粒浓度的相关性为0.721，去除异常值，相关系数为0.754，表示微粒浓度与纤维蛋白形成时间为显著相关。

2.5病人及健康人凝血四项的检测实验

排除因为疾病状态导致的凝血因子异常对纤维蛋白形成时间的影响：以下14份血浆标本凝血四项(PT、APTT、FIB和TT)测定结果如下(结果见表3)

表3病人和健康人凝血四项检测结果

表3采用独立样本t检验做统计分析，每组结果之间p>0.05，没有差异。即某些疾病状态下凝血四项不受影响，排出凝血因子对纤维蛋白形成时间的干扰，进一步说明微粒与纤维蛋白形成的相关性。

2.6正常参考值的确定，检测46例健康人群纤维蛋白形成时间值(表4)，根据统计学百分位数法计算P₅＝427，确定纤维蛋白形成时间值﹥427秒为正常参考值。

表4：46例健康人纤维蛋白形成时间测定结果

表4：计算46例健康人正常参考值的测定结果(根据百分位法计算得P₅＝427,因此健康人群ACT参考值为>427)。

2.7两组不同病人纤维蛋白形成时间测定结果，分别采集天津医科大学总医院住院和门诊病人共56例包括妊娠高血压综合征、髋关节骨折病人的抗凝血，检测纤维蛋白形成时间，结果见表5。经过统计学分析，两组病人均p﹤0.05提示有显著差异。

表5：四组不同病人纤维蛋白形成时间测定结果

	例数	纤维蛋白形成时间均值(秒)	与健康组比较(p值)
				妊娠高血压综合征	20	325	p﹤0.05
髋关节骨折	36	349	p﹤0.0005

表5：对两组病人检测纤维蛋白形成时间分析，每组病人p值均小于0.05，与健康人纤维蛋白形成时间测定结果比较有显著差异。

3.临床意义

微粒促凝活性的检测直接反应人体自体的促凝活性的强弱，当人体在某些疾病中的高凝状态下纤维蛋白形成时间缩短(﹤427s)，在临床上我们检测了妊高症的病人、睡眠呼吸综合征的病人、不良妊娠、肺栓塞等的病人纤维蛋白形成时间小于320s，提示体内存在的高凝状态。

微粒参与凝血机制的试验与经典的内、外源性凝血途径筛选试验有明显不同，纤维蛋白形成时间主要观察病理条件下微粒对凝血系统的启动过程，与血液的促凝功能密切相关；而内、外源性凝血途径筛选试验(APTT、PT)则总体反映凝血因子自身的水平和活性。因此微粒促凝活性实验方法的建立有助于完善对人体凝血系统功能改变的观察。基于以上的实验方法，我们已经完成了一些临床疾病血浆标本的检测，发现多种疾病状态下微粒促凝活性增强，诱导的凝血时间缩短，提示存在应激的高凝状态，特别在妊娠期高血压综合征、骨折等患者中存在着危险的高凝状态，即上述疾病中细胞所释放的微粒构成了患者凝血紊乱的基础和微环境，检测结果可能作为临床实施早期干预病理性凝血活化、改善止凝血功能、降低不良临床结局风险的可靠依据。

综上所述，本发明提供一种可反映人体在病理状态下的高凝状态和严重程度，并且重复性好、灵敏度高、操作简便的检测微粒促凝活性实验方法。

以上实施例对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (3)

1.一种体外检测微粒促凝活性的非诊断目的的实验方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一：血浆标本的制备

取新鲜枸橼酸盐抗凝全血2ml，通过梯度离心的方法，得到无细胞血浆，吸取离心后的血浆上清备用；

其中：所述步骤一中通过两次梯度离心，第一次梯度离心的离心条件为室温下1500g/20min，第二次梯度离心的离心条件为室温下13000g/2min；

步骤二：微粒促凝活性检测实验

取一定量的无细胞血浆标本和Ca²⁺混匀，放入LTHCARE CENTURY凝血功能仪中检测，通过探针的振动感受血液粘稠度的改变，记录粘稠度改变时间，即为纤维蛋白形成时间；

其中：无细胞血浆标本的用量是200ul，Ca²⁺的浓度为0.02mmol/L，Ca²⁺的用量是170ul。

2.根据权利要求1所述的一种体外检测微粒促凝活性的非诊断目的的实验方法，其特征在于：

还包括微粒促凝活性检测实验的重复性检测，重复性实验包括如下步骤：

取微粒促凝活性检测实验测定结果中时间长、短的两份血浆标本，分别各重复测定10次，其结果进行统计学分析，得到重复性实验的重复性结果。

3.根据权利要求1所述的一种体外检测微粒促凝活性的非诊断目的的实验方法，其特征在于：

还包括微粒浓度与纤维蛋白形成时间相关性的测定实验，包括如下步骤：

分别选取微粒浓度不同的两组标本，每组8份血浆标本，分别检测纤维蛋白形成时间和微粒浓度，结果采用非参数检验，去除异常值，得到相关系数，得到微粒浓度与纤维蛋白形成时间的相关性结果。

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