KR20230003666A - 혈액 내 무세포 dna를 사용하는 혈액 장애의 검출 - Google Patents

혈액 내 무세포 dna를 사용하는 혈액 장애의 검출 Download PDF

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Abstract

혈액 샘플, 예를 들어, 혈장 또는 혈청 내 무세포 DNA를 사용하여 혈액 장애를 검출하는 기술이 제공된다. 예를 들어, 검정은 특정 혈액 세포 계통(예를 들어, 적혈구모세포)에 특이적인 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역을 표적화할 수 있다. 메틸화 수준은 혈액 샘플의 무세포 혼합물 내 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA 단편의 양을 결정하기 위한 검정으로부터 정량화될 수 있다. 메틸화 수준은, 예를 들어, 혈액 장애의 수준을 결정하는 부분으로서 특정 혈액 세포 계통에 대한 정상 범위에 상응하는 하나 이상의 컷오프 값과 비교될 수 있다.

Description

혈액 내 무세포 DNA를 사용하는 혈액 장애의 검출{DETECTING HEMATOLOGICAL DISORDERS USING CELL-FREE DNA IN BLOOD}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은, 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 참고로 본 명세서에 편입된, "혈액에서 무세포 DNA를 사용한 혈액 장애 검출"의 명칭으로 2016년 5월 30일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/343,050으로부터의 우선권을 주장하고 그리고 본원은 비가출원이다.
혈액 장애 (예를 들어, 빈혈)가 사람에게 존재하는지 여부를 결정하기 위해, 종래 기술은 골수 생검의 조직학적 시험을 수행한다. 그러나, 골수 생검은 그와 같은 절차를 겪는 환자에게 통증과 불안으로 이어지는 침습적 과정이다. 따라서, 사람에서의 혈액 장애를 검출하고 특징화하기 위한 신규한 기술을 확인하는 것이 바람직하다.
빈혈은 각각이 그 자체의 치료를 갖는, 다중 임상 증상에 의해 유발될 수 있다. 그러므로, 빈혈 경우의 원인을 확인하고 그 다음 그에 따라 추가로 조사하거나 치료하는 것이 임상적으로 유용할 것이다. 빈혈의 원인 중 하나는 적혈구생성 (적혈구를 생산하기 위한 과정)에 필요한 영양소, 예컨대, 비제한적으로, 철, B12, 폴레이트, 등의 결핍이다. 빈혈의 또 다른 원인은 혈액 손실로, 이는 급성 또는 만성일 수 있다. 혈액 손실은, 예를 들어, 월경 과다 또는 위장관으로부터의 출혈에 의해 야기될 수 있다. 빈혈은 암 및 염증성 장 질환에서 발견될 수 있는, 만성 질환의 빈혈이라고도 불리는, 많은 만성 장애에서 또한 빈번하게 발견된다.
따라서, 혈액 장애에 대한 대상체를 스크리닝하거나, 혈액 장애의 원인을 결정하거나, 혈액 장애가 있는 대상체를 모니터링하거나 및/또는 혈액 장애가 있는 대상체의 적절한 치료를 결정하기 위한 신규한 기술을 제공하는 것이 바람직하다.
일부 구현예는, 예를 들어, 혈장 또는 혈청을 사용하여, 혈액 샘플에서 무세포 DNA를 사용하여 혈액 장애를 검출하기 위한 시스템, 방법, 및 장치를 제공한다. 예를 들어, 검정은 특정 혈액 세포 계통(예를 들어, 적혈구모세포)에 특이적인 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역을 표적화할 수 있다. 메틸화 수준은 혈액 샘플의 무세포 혼합물 내 메틸화 또는 비메틸화된 DNA 단편의 양을 결정하기 위한 검정으로부터 정량화될 수 있다. 메틸화 수준은 하나 이상의 컷오프 값, 예를 들어 혈액 장애의 수준을 결정하는 부분으로서 특정한 혈액 세포 계통에 대한 정상 범위에 상응하는 것에 비교될 수 있다. 일부 구현예는 하나 이상의 메틸화 수준을 사용하여 유사한 방식으로 혈액 샘플에서 특정한 혈액 세포 계통(예를 들어, 적혈구모세포 DNA)으로부터 DNA의 양을 측정할 수 있다.
그와 같은 분석은 골수 생검의 침습 과정을 수행하지 않고 혈액 장애의 검출을 제공할 수 있다. 예를 들어, 우리의 결과는 골수 세포가 순환하는 무세포 DNA에 상당한 비율로 기여한다는 것을 입증한다. 순환하는 무세포 DNA에서 조혈 세포의 메틸화 서명의 분석은 골수 세포의 상태를 반영할 수 있다. 그와 같은 구현예는 치료에 대한 골수의 반응, 예를 들어, 철 결핍성 빈혈이 있는 환자에서 경구용 철 요법에 대한 반응의 모니터링에 특히 유용할 수 있다. 구현예는 또한 상이한 절차, 예를 들어, 골수 생검 또는 덜 침습성인 조사를 위해 환자를 할당하는데 사용될 수 있다.
다른 구현예는 본 명세서에서 기재된 방법과 관련된 시스템 및 컴퓨터 판독가능 매체에 대한 것이다.
본 발명의 구현예의 특성 및 이점의 더 나은 이해는 하기 상세한 설명 및 수반되는 도면들과 관련하여 얻어질 수 있다.
도 1은 본 발명의 구현예에 따른 페로킬라타제 (FECH) 유전자의 프로모터 내의 CpG 부위의 메틸화 밀도를 도시한다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 구현예에 따른 메틸화 및 비메틸화된 DNA를 검출하기 위해 설계된 디지털 PCR 검정을 사용하여 보편적으로 메틸화 및 비메틸화된 DNA의 분석을 도시한다.
도 3a는 본 발명의 구현예에 따른 혈구 내의 E%와 유핵의 RBC (적혈구모세포)의 수 사이의 상관관계를 나타내는 플롯이다. 도 3b는 본 발명의 구현예에 따라 무세포 DNA를 분석함에 의해 생물학적 샘플에서 특정 세포 계통의 세포 양을 결정하는 방법 (300)을 나타내는 순서도이다.
도 4는 본 발명의 구현예에 따라 상이한 3개월 안에 건강한 비-임신한 대상체 및 임신한 여성의 버피 코트 및 혈장 중의 비메틸%를 도시한다.
도 5는 혈장과 버피 코트에서 비메틸% 사이의 상관관계의 결여를 도시하는 플롯이다.
도 6a 및 6b는 본 발명의 구현예에 따른 건강한 대상체에서 적혈구 DNA (E%(FECH))의 백분율을 도시한다. E%는 비메틸%와 동일한 것으로 정의될 수 있다.
도 7은 혈장 DNA에서의 E%(FECH) 결과와 건강한 대상체의 연령 사이의 상관관계의 결여를 도시한다.
도 8은 본 발명의 구현예에 따른 재생불량성빈혈 환자, 베타-종증성 지중해 빈혈 환자, 및 건강한 대조군 대상체에서 헤모글로빈 농도에 대한 비메틸%의 플롯이다.
도 9는 본 발명의 구현예에 따른 철 (Fe) 결핍 빈혈 및 급성 혈액 손실 환자에서의 혈장 비메틸%의 플롯이다.
도 10은 본 발명의 구현예에 따른 재생불량성빈혈 환자, 만성 신부전 (CRF) 환자, β-종증성 지중해 빈혈 환자, 철 결핍성 빈혈 환자 및 건강한 대상체 중에서 헤모글로빈 수준과 혈장 내 적혈구 DNA의 백분율 (E%(FECH)) 사이의 관계를 도시한다.
도 11a 및 11b는 본 발명의 구현예에 따른 재생불량성빈혈 환자, 만성 신부전 (CRF) 환자, β-종증성 지중해 빈혈 환자, 철 결핍성 빈혈 환자 중에서 헤모글로빈 수준과 망상적혈구 수/지수 사이의 관계를 도시한다.
도 12는 본 발명의 구현예에 따른 골수이형성 증후군 및 적혈구증가증 루브라 베라 환자에서 혈장 비메틸%의 플롯이다.
도 13a는 본 발명의 구현예에 따른 재생불량성빈혈 (AA) 환자와 골수이형성 증후군 (MDS) 환자 사이의 혈장에서의 적혈구 DNA의 백분율 (E%(FECH))을 도시한다. 도 13b는 본 발명의 구현예에 따른 재생불량성빈혈에서 치료-반응성 및 치료 비-반응성 군 사이에서 혈장에서의 적혈구 DNA의 백분율 (E%(FECH))을 도시한다.
도 14는 본 발명의 구현예에 따른 정상 대상체와 백혈병이 있는 두 환자에서의 헤모글로빈 농도에 대한 혈장에서의 비메틸%의 플롯이다.
도 15a 및 15b는 본 발명의 구현예에 따른 염색체 12 상의 적모세포-특이적 DMR 내의 CpG 부위의 메틸화 밀도를 도시한다.
도 16은 ENCODE 데이터베이스로부터 2개의 다른 적모세포-특이적 DMR (Ery-1 및 Ery-2) 상의 히스톤 변형 (H3K4me1 및 H3K27Ac)을 도시한다.
도 17a 및 17b는 Ery-1 마커 (도 17a) 및 Ery-2 마커 (도 17b)를 표적화하는 디지털 PCR 검정에 의해 측정된 β-종증성 지중해 빈혈 환자의 버피 코트 DNA에서 적혈구 DNA 서열의 백분율 (E%)과 자동화 혈액학 분석기를 사용하여 측정된 모든 주변 백혈구 중에 적혈구모세포의 백분율 사이의 상관관계를 도시한다.
도 18a 및 18b는 β-종증성 지중해 빈혈 환자의 버피 코트에서 E%(Ery-1) 및 E%(Ery-2)와 E%(FECH) 결과의 상관관계를 도시한다.
도 19는 본 발명의 구현예에 따른 3개의 적모세포-특이적 DMR을 표적화하는 디지털 PCR 분석을 사용하여 건강한 대상체와 재생불량성빈혈 환자 및 β-종증성 지중해 빈혈 환자에서 적혈구 DNA의 백분율을 도시한다.
도 20a 및 20b는 본 발명의 구현예에 따른 치료 전 상태와 치료 2일 후에서 정맥내 철 요법을 받은 철 결핍성 빈혈의 망상적혈구 수의 백분율과 혈장 DNA에서 적혈구 DNA의 백분율 (E%(FECH))의 일련의 측정을 도시한다.
도 21a는 본 발명의 구현예에 따른 경구 철 치료를 받은 월경과다에 기인한 철 결핍성 빈혈 환자에서 적모세포 DMR에서의 혈장 E%의 일련의 변화를 도시한다. 도 21b는 치료 후 헤모글로빈에서의 변화를 도시한다.
도 22는 재조합 에리트로포이에틴 (EPO) 또는 적혈구생성-자극제 (ESA) 치료를 받은 만성 신장 질환 (CKD) 환자에서 적모세포 DMR에서의 혈장 비메틸%의 일련의 변화를 도시한다.
도 23a는 본 발명의 구현예에 따른 면역억제성 요법으로 항-흉선세포 글로불린 (ATG) 치료 또는 사이클로스포린을 받은 재생불량성빈혈 환자에서 적모세포 DMR에서의 혈장 비메틸%의 일련의 변화를 도시한다. 도 23b는 치료를 받은 재생불량성빈혈 환자에서 헤모글로빈의 일련의 변화를 도시한다.
도 24a 및 24b는 4명의 재생불량성빈혈 환자에서 헤모글로빈 농도에 대한 혈장에서의 비메틸%의 플롯을 도시한다.
도 25는 본 발명의 구현예에 따른 건강한 대상체 및 빈혈 환자에서 FECH 유전자-관련된 DMR에서 적혈구 DNA의 절대적인 농도 (복사체/혈장 ml)를 도시하는 박스-및-위스커 플롯을 예시한다.
도 26은 본 발명의 구현예에 따른 포유동물의 혈액 샘플을 분석하는 방법을 예시하는 순서도이다.
도 27은 본 발명의 일 구현예에 따른 시스템 (2700)을 예시한다.
도 28은 본 발명의 구현예에 따른 시스템 및 방법과 함께 사용가능한 예시적인 컴퓨터 시스템의 블록 선도를 도시한다.
용어들
"메틸롬"은 게놈 내의 복수의 부위 또는 유전자좌에서의 DNA 메틸화의 양의 측정을 제공한다. 메틸롬은 모든 게놈, 게놈의 실질적인 부분, 또는 게놈의 비교적 작은 부분(들)에 상응할 수 있다.
"세포 계통"은 수정된 배아로부터 조직 또는 장기의 발달성 이력을 나타낸다. 상이한 유형의 조직 (예를 들어, 상이한 유형의 혈구)는 상이한 세포 계통을 가질 것이다. 적혈구 (RBC)는 일련의 중간 세포를 통해 프로적혈구모세포로부터 유래된다. 프로적혈구모세포, 거핵구모세포, 및 미엘로모세포는 일반적인 골수 전구세포로부터 유래된다. 림프구는 일반적인 림프양 전구세포로부터 유래된다. 유핵의 RBC는 적혈구모세포이고, 미성숙한 제핵된 RBC는 망상적혈구이고, 그리고 성숙한 제핵된 RBC는 적혈구로, 헤모글로빈을 운반하는 혈류 내 적혈구이다.
"무세포 혼합물"은 다양한 세포로부터의 무세포 DNA 단편을 포함하는 샘플에 상응한다. 예를 들어, 무세포 혼합물은 다양한 세포 계통으로부터의 무세포 DNA 단편을 포함할 수 있다. 혈장 및 혈청은, 예를 들어, 원심분리를 통해 혈액 샘플로부터 수득된 무세포 혼합물의 예이다. 다른 무세포 혼합물은 다른 생물학적 샘플로부터의 것일 수 있다. "생물학적 샘플"은 대상체 (예를 들어, 인간, 예컨대 임신한 여성, 암이 있는 사람 또는 암이 있는 것으로 의심되는 사람, 장기 이식 수령체, 또는 장기에 연루되는 질환 과정, 예컨대 심근경색증이 있는 심장, 뇌졸중이 있는 뇌, 또는 빈혈이 있는 조혈 시스템을 갖는 것으로 의심되는 대상체)로부터 취해지고 관심 있는 하나 이상의 핵산 분자(들)를 함유하는 임의의 샘플을 지칭한다. 생물학적 샘플은 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 질액, 음낭수종 (예를 들어 고환)으로부터의 유체, 또는 질 세척 유체, 늑막 유체, 복수액, 뇌척수액, 타액, 땀, 눈물, 가래, 기관지폐포 세척 유체, 등일 수 있다. 대변 샘플이 또한 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 무세포 DNA가 풍부한 생물학적 샘플 (예를 들어, 원심분리 프로토콜을 통해 수득된 혈장 샘플)에서 다수의 DNA는, 예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 초과의 무세포 (세포와는 대조적임)일 수 있다. 원심분리 프로토콜은 3,000 g x 10분을 포함할 수 있어 유체 부분을 얻고 30,000 g에서 다시 10분 동안 재원심분리하여 잔존 세포를 제거할 수 있다.
"혈장 메틸롬"은 동물 (예를 들어, 인간)의 혈장 또는 혈청으로부터 결정된 메틸롬이다. 혈장 메틸롬은 혈장과 혈청이 무세포 DNA를 포함하고 있기 때문에 무세포 메틸롬의 일 예이다. 혈장 메틸롬은 이것이 신체 내의 다른 기관이나 조직 또는 세포로부터의 DNA의 혼합물이기 때문에 또한 혼합된 메틸놈의 예이다. 일 구현예에서, 이러한 세포는, 비제한적으로, 적혈구 (즉, 적혈구) 계통의 세포, 골수 계통 (예를 들어, 중성구 및 그것의 전구체), 및 거대핵세포성 계통을 포함하는 조혈 세포이다. 임신에 있어, 혈장 메틸롬은 태아와 엄마로부터의 메틸롬의 정보를 함유할 수 있다. 암이 있는 환자의 경우, 혈장 메틸롬은 환자의 신체 내의 종양 세포 및 다른 세포로부터의 메틸롬의 정보를 함유할 수 있다. "세포 메틸롬"은 환자의 세포 (예를 들어, 혈구)로부터 결정된 메틸롬에 상응한다. 혈구의 메틸롬은 혈구 메틸롬 (또는 혈액 메틸롬)으로 지칭된다. 메틸롬을 결정하는 기술은 "혈장의 종양이나 태아의 메틸롬의 비-침습성 결정"의 명칭으로 PCT 특허 출원 번호 WO2014/043763에 더 기재되어 있고, 그것의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 편입된다.
"부위"는 하나의 단일 염기 위치 또는 상관된 염기 위치의 그룹일 수 있는 단일 부위, 예를 들어, CpG 부위에 상응한다. "유전자좌"는 다중 부위를 포함하는 영역에 상응할 수 있다. 유전자좌는 단 하나의 부위를 포함할 수 있는데, 이것은 유전자좌를 그 맥락에서 부위와 동등하게 할 수 있다.
각각의 게놈 부위 (예를 들어, CpG 부위)에 대한 "메틸화 지수"는 그 부위를 차지하는 총 판독 횟수에 걸쳐 상기 부위에서의 메틸화를 나타내는 (예를 들어, 서열 판독치 또는 프로브로부터 결정된 바와 같은) DNA 단편의 비율을 지칭할 수 있다. "판독"은 DNA 단편으로부터 수득된 정보 (예를 들어, 부위에서의 메틸화 상태)에 상응할 수 있다. 판독은 특정 메틸화 상태의 DNA 단편에 우선적으로 혼성화하는 시약 (예를 들어 프라이머 또는 프로브)을 사용하여 수득될 수 있다. 전형적으로, 이러한 시약은 메틸화 상태, 예를 들어 바이설파이트 전환, 또는 메틸화-민감성 제한 효소에 의존하여 DNA 분자를 차별적으로 변형시키는 공정으로 처리한 후에 적용된다. 판독치는 서열 판독치일 수 있다. "서열 판독치"는 핵산 분자의 임의의 일부 또는 모두로부터 서열분석된 뉴클레오타이드의 문자열을 지칭한다. 예를 들어, 서열 판독치는 생물학적 샘플에 존재하는 핵산 단편으로부터 서열분석된 뉴클레오타이드의 짧은 문자열 (예를 들어, 20-150), 핵산 단편의 하나 또는 둘 모두의 단부에서 뉴클레오타이드의 짧은 문자열, 또는 전체 핵산 단편의 서열분석일 수 있다. 서열 판독치는 예를 들어, 서열분석 기술 또는 프로브를 사용하여 여러 가지의 방법 (예를 들어, 하이브리드화 어레이 또는 캡쳐 프로브, 또는 증폭 기술, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 단일 프라이머를 사용한 선형 증폭 또는 등온 증폭)으로 수득될 수 있다.
영역의 "메틸화 밀도"는 메틸화를 나타내는 영역 내의 부위에서의 판독치의 수를 영역 내의 부위를 차지하는 총 판독치의 수로 나눈 것을 지칭할 수 있다. 부위는, 예를 들어 CpG 부위인, 특정 특징을 가질 수 있다. 따라서, 영역의 "CpG 메틸화 밀도"는 CpG 메틸화를 나타내는 판독치의 수를 영역 내의 CpG 부위 (예를 들어, 특정 CpG 부위, CpG 섬 내의 CpG 부위, 또는 더 큰 영역)를 차지하는 총 판독치의 수로 나눈 것을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 인간 게놈에서 각각의 100-kb 빈에 대한 메틸화 밀도는 100-kb 영역에 맵핑된 서열 판독치에 의해 커버되는 모든 CpG 부위의 비율로서 CpG 부위에서 (메틸화된 시토신에 상응하는) 바이설파이트 처리 후 전환되지 않은 총 시토신의 수로부터 결정될 수 있다. 이 분석은 또한 다른 빈 크기, 예를 들어 500 bp, 5 kb, 10 kb, 50-kb 또는 1-Mb 등에 대해 수행될 수 있다. 영역은 전체 게놈 또는 염색체 또는 염색체의 일부 (예를 들어 염색체 아암)일 수 있다. CpG 부위의 메틸화 지수는 영역이 단지 그 CpG 부위만을 포함하는 경우 영역의 메틸화 밀도와 동일하다. "메틸화된 시토신의 비율"은 영역 내에 분석된 시토신 잔기, 즉 CpG 문맥의 외부 시토신을 포함한 시토신 잔기의 총 수에 대해 메틸화된 (예를 들어 바이설파이트 전환 후 비전환된) 것으로 나타난 시토신 부위의 수, "C's"를 지칭할 수 있다. 메틸화 지수, 메틸화 밀도 및 메틸화된 시토신의 비율은 "메틸화 수준"의 예이다. 바이설파이트 전환과는 별도로, 비제한적으로 메틸화 상태에 대해 민감성인 효소 (예를 들어 메틸화-민감성 제한 효소), 메틸화 결합 단백질, 메틸화 상태에 대해 민감성인 플랫폼을 사용한 단일 분자 서열분석 (예를 들어 나노포어 서열분석 (문헌 [Schreiber 등 Proc Natl Acad Sci 2013; 110: 18910-18915]) 및 Pacific Biosciences에 의한 단일 분자 실시간 분석 (문헌 [Flusberg 등 Nat Methods 2010; 7: 461-465]))을 포함하여, DNA 분자의 메틸화 상태를 조사하기 위해 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다른 공정이 사용될 수 있다.
"메틸화 프로파일" (또한 소위 메틸화 상태)은 영역에 대한 DNA 메틸화에 관련된 정보를 포함한다. DNA 메틸화에 관련된 정보는, 비제한적으로, CpG 부위의 메틸화 지수, 영역 내 CpG 부위의 메틸화 밀도, 인접 영역에 걸친 CpG 부위의 분포, 1 초과 CpG 부위를 함유하는 영역 내의 각각의 개별 CpG 부위에 대한 메틸화의 패턴 또는 수준, 및 비-CpG 메틸화를 포함할 수 있다. 게놈의 실질적인 일부의 메틸화 프로파일은 메틸롬과 동등한 것으로 간주될 수 있다. 포유동물 게놈에서의 "DNA 메틸화"는 전형적으로 CpG 디뉴클레오타이드 중 시토신 잔기의 5' 탄소에 메틸의 첨가 (즉 5-메틸시토신)를 지칭한다. DNA 메틸화는 다른 문맥, 예를 들어 CHG 및 CHH에서의 시토신에서 발생할 수 있고, 여기서 H는 아데닌, 시토신 또는 티민이다. 시토신 메틸화는 또한 5-하이드록시메틸시토신의 형태로 될 수 있다. 비-시토신 메틸화, 예컨대 N6-메틸아데닌이 또한 보고되어 있다.
"조직"은 작용 단위로 함께 그룹화된 세포의 군에 상당한다. 단일 조직에서 1 초과 유형의 세포가 발견될 수 있다. 상이한 유형의 조직은 상이한 유형의 세포 (예를 들어, 간세포, 폐포 세포 또는 혈구)로 구성될 수 있을 뿐만 아니라 상이한 유기체 (모체 대 태아)로부터의 조직 또는 건강한 세포 대 종양 세포에도 상응할 수 있다. "기준 조직"은 조직-특이적 메틸화 수준을 결정하는 데 사용되는 조직에 상응한다. 상이한 개체로부터의 동일한 조직 유형의 다중 샘플이 그 조직 유형에 대한 조직-특이적 메틸화 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. 상이한 시기에 동일한 개체로부터의 동일한 조직은 생리학 (예를 들어 임신) 또는 병리학 (예를 들어 암 또는 빈혈 또는 감염 또는 돌연변이)에 기인하여 차이를 나타낼 수 있다. 상이한 개체로부터의 동일한 조직 유형은 생리학 (예를 들어 연령, 성별) 또는 병리학 (예를 들어 암 또는 빈혈 또는 감염 또는 돌연변이)에 기인하여 차이를 나타낼 수 있다.
용어 "장애의 수준" 또한 일명 "장애의 분류"는 장애가 존재하는지, 장애의 유형, 장애의 단계 및/또는 장애의 중증도의 기타 측정의 분류를 지칭할 수 있다. 수준은 숫자 또는 다른 문자일 수 있다. 수준은 0일 수 있다. 장애의 수준은 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 스크리닝은 장애가 이전에 있었는지 알려지지 않은 사람에서 존재하였는지를 확인할 수 있다. 평가는 장애가 있는 것으로 진단받은 사람을 조사하여 경시적으로 장애의 진행을 모니터하고, 치료법의 유효성을 연구하거나 예후를 결정할 수 있다. 일 구현예에서, 예후는 환자가 장애로 죽을 확률 또는 특정 지속기간 또는 시간 후에 장애가 진행될 확률로 표현될 수 있다. 검출은 '스크리닝'을 의미할 수 있거나 장애의 시사적인 특징 (예를 들어 증상 또는 다른 양성 검사)이 있는 사람이 장애가 있는지 확인하는 것을 의미할 수 있다.
빈혈은 적혈구의 수 또는 그것의 산소-운반 능력이 연령, 성별, 키, 흡연 및 임신 상태에 따라 변할 수 있는 생리적 요구를 충족시키기에 불충분한 상태를 지칭한다. 세계보건기구 (WHO)의 권고에 따르면, 빈혈은 헤모글로빈 농도가 남성의 경우 130g/L 미만이고 여성의 경우 110g/L 미만인 경우 진단될 수 있다. 용어 "빈혈의 정도"는 대상체에서 헤모글로빈 농도에 의해 반영될 수 있다. 보다 낮은 헤모글로빈 수준은 보다 증증도의 빈혈을 나타낸다. WHO의 권고에 따르면, 중증 빈혈은 남성의 경우 <80 g/L, 여성의 경우 <70g/L의 헤모글로빈 농도를 지칭하고, 중간 정도 빈혈은 남성의 경우 80 - 109g/L, 여성의 경우 70 - 99g/L의 헤모글로빈 농도를 지칭하고, 그리고 경증 빈혈은 남성의 경우 110 - 129g/L, 여성의 경우 100 - 109g/L의 헤모글로빈 농도를 지칭한다.
"분리 값"은 2개의 값, 예를 들어 2개의 단편적인 기여 또는 2개의 메틸화 수준을 포함하는 차이 또는 비에 상응한다. 분리 값은 단순한 차이 또는 비일 수 있다. 분리 값은 다른 인자, 예를 들어, 증가하는 인자를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 값의 함수의 차이 또는 비, 예를 들어 두 값의 자연 로그 (ln)의 차이 또는 비가 사용될 수 있다. 분리 값은 차이와 비를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "분류"는 샘플의 특정 특성과 관련된 임의의 수(들) 또는 다른 문자(들)를 지칭한다. 예를 들어, "+" 기호 (또는 단어 "양성")는 샘플이 결실 또는 증폭된 것으로 분류되었음을 나타낼 수 있다. 분류는 2원 (예를 들어, 양성 또는 음성)일 수 있거나 더 많은 분류 수준 (예를 들어, 1 내지 10 또는 0 내지 1의 척도)을 가질 수 있다. 용어 "컷오프" 및 "역치"는 작동에 사용된 예정된 수를 지칭한다. 역치 값은 특정 분류가 적용되는 위 또는 아래 값일 수 있다. 이들 용어들 중 하나는 이들 상황 중 어느 하나에서 사용될 수 있다.
상세한 설명
일부 구현예에서, 적혈구모세포로부터의 무세포 DNA (또한 소위 순환하는 DNA)의 기여는 다른 조직으로부터의 무세포 DNA에 대비하여 적혈구모세포에 특이적인 하나 이상의 메틸화 서명 (예를 들어, 마커당 하나의 서명)을 사용하여 정량화된다. 마커 (예를 들어, 차별적으로 메틸화된 영역, DMR)은 동일한 서명에 기여하는 하나의 부위 또는 부위의 군을 포함할 수 있다.
적혈구모세포로부터의 무세포 DNA 기여는 혈액 장애, 예컨대 빈혈의 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 태아, 신생아 또는 아동에서의 빈혈을 평가하기 위한 구현예가 사용될 수 있다. 빈혈의 맥락에서, 구현예는: (i) 빈혈의 원인을 밝혀내기 위해; (ii) 경시적으로 임상 상태의 진행을 모니터하기 위해, (iii) 치료법의 유효성을 연구하기 위해, 또는 (iv) 예후를 결정하기 위해, 빈혈이 있는 것으로 의심되거나 빈혈로 진단된 사람을 조사하는데 사용될 수 있다. 따라서, 구현예는 순환하는 DNA 풀의 지금까지 인식되지 않은 주요 구성요소로서, 그리고 빈혈, 뿐만 아니라 다른 혈액 장애의 차별적인 진단 및 모니터링을 위한 비침습성 바이오마커로서의 적혈구 DNA를 확인하였다.
I. 도입
혈장 DNA는 분자 진단을 위해 점점 더 탐구되는 피분석물이다. 특히 비침습성 태아기 검사 (1-7)와 종양학 (8-12)에서의 그것의 임상 적용에 대한 연구들이 조사 진행 중에 있다. 다양한 임상 적용에도 불구하고, 순환하는 DNA의 조직 기원은 완전히 이해되지 않았다.
순환하는 DNA는 모델 시스템으로서 성-불일치 골수 이식을 사용하여 조혈 세포로부터 우세하게 방출되는 것으로 나타났다 (13, 14). Kun 등은 최근에 혈장 DNA의 상당한 비율이 중성구와 림프구의 메틸화 서명을 가지고 있음이 실증하였다 (15). 그러나 현재 적혈구 기원 (적혈구모세포)의 DNA가 혈장에서도 또한 검출가능할 수 있는지 여부에 관한 정보는 없다.
적혈구 (RBC)는 혈액에서 조혈 세포의 최대 모집단이다. 적혈구 (RBC)의 농도는 혈액의 리터당 약 5 x 1012이다. 각각의 RBC의 수명이 약 120일이라면, 신체는 하루에 2 x 1011 RBC 또는 시간당 9.7 x 109 RBC를 생성할 필요가 있다. 인간의 성숙한 RBC에는 핵이 없다.
세포핵제거 단계 중에 적혈구모세포는 그것의 핵을 잃어 골수 내의 망상 적혈구로 성숙하게 된다 (16). 세포핵제거 과정은 세포-신호전달의 단단히 조절된 작용 및 세포골격 작용을 포함한 복잡한 다단계 과정이다. 적혈구모세포의 핵 물질은 예를 들어 골수에서 적혈구모세포의 아이슬랜드에서 골수 대식세포에 의해 식균되고 분해된다 (17). 본 발명자들은 골수로부터 적혈구 계통의 분해된 DNA 물질 중 일부가 순환계로 방출될 것이라고 상정한다.
구현예는 적혈구 기원의 세포로부터 DNA의 메틸화 서명을 확인하고, 그리고 인간 혈장에서 적혈구 DNA가 검출가능한지를 결정하기 위해 그러한 서명을 사용할 수 있다. 상이한 조직 및 조혈 세포 유형의 고-해상도 기준 메틸롬은 BLUEPRINT 프로젝트 (18, 19) 및 로드맵 후생유전체 프로젝트 (20)를 포함한 공동연구 프로젝트를 통해 공개적으로 이용가능하게 되었다. 본 발명자들 및 다른 사람들은 이전에 조직-관련된 메틸화 서명의 분석을 통해 혈장 DNA의 기원을 추적하는 것이 가능하다는 것을 실증하였다 (15, 21, 22). 무세포 혼합물 (예를 들어, 혈장)에 대한 특정 조직의 기여를 결정하기 위한 그와 같은 분석의 더 상세한 사항은 "DNA 혼합물에서의 조직의 메틸화 패턴 분석"의 명칭으로 된 PCT 특허 출원 번호 WO 2016/008451에서 발견될 수 있으며, 그것의 개시내용은 그 전문이 모든 목적을 위해 참고로 편입된다.
본 발명자들의 가설을 검증하고 혈장 내 적혈구 DNA의 존재를 입증하기 위해, 본 발명자들은 적혈구모세포 및 다른 조직 유형의 메틸화 프로파일 분석을 통해 적모세포-특이적 차별적으로 메틸화된 영역 (DMR)을 확인하였다. 발견을 바탕으로 본 발명자들은 적모세포-특이적 DMR을 표적으로 하는 디지털 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 검정을 개발하여 생물학적 샘플에서 적혈구 DNA의 정량 분석을 가능하게 하였다. 구체적으로, 적혈구모세포 및 다른 조직 유형의 고-해상도 메틸화 프로파일을 사용하여, 세 개의 유전자 좌위가 적혈구모세포에서 저메틸화되지만 다른 세포 유형에서는 과메틸화되는 것으로 밝혀졌다. 각각의 유전자좌에 대해 차별적으로 메틸화된 영역을 사용하여 적혈구 DNA를 측정하기 위한 디지털 PCR 검정이 개발되었다.
본 발명자들은 건강한 대상체와 상이한 유형의 빈혈로 고통받고 있는 환자의 혈장 샘플을 연구하기 위해 이들 디지털 PCR 검정을 적용했다. 본 발명자들은 또한 빈혈 평가에서 이 검정의 잠재적인 임상 유용성을 탐구했다. 비록 실시예는 PCR 검정을 사용하지만, 서열분석과 같은 다른 검정이 사용될 수 있다.
상이한 원인론의 빈혈을 가진 대상체에서, 본 발명자들은 (예를 들어, 메틸화 마커를 사용하여) 순환하는 적혈구 DNA의 정량 분석이 골수 내에서 적혈구생성 활성을 반영한다는 것을 나타냈다. 재생불량성빈혈에 의해 예시된 바와 같이, 감소된 적혈구생성 활성이 있는 환자의 경우, 순환하는 적혈구 DNA의 백분율은 감소했다. β-종증성 지중해 빈혈에 의해 예시된 바와 같이, 증가되었지만 효과 없는 적혈구생성이 있는 환자의 경우, 백분율은 증가했다. 또한, 적혈구 DNA의 혈장 수준은 재생불량성빈혈과 철 결핍성 빈혈에서 치료 반응과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 다른 2개의 차별적으로 메틸화된 영역을 표적으로 하는 디지털 PCR 검정을 사용한 혈장 DNA 분석은 비슷한 결과를 나타냈다.
II. 적혈구모세포의 차별적으로 메틸화된 영역 (DMR)
본 발명자들은 적모세포 세포핵제거 과정 또는 RBC의 성숙과 관련된 다른 과정이 순환하는 무세포 DNA의 풀에 상당히 기여할 것이라는 가설을 세웠다. 적혈구모세포로부터 순환하는 DNA의 기여를 결정하기 위해, 본 발명자들은 적혈구모세포의 DNA 메틸화 프로파일을 다른 조직 및 혈구에 비교함에 의해 적혈구모세포의 DNA에서 차별적으로 메틸화된 영역 (DMR)을 확인했다. 본 발명자들은 BLUEPRINT 프로젝트 및 로드맵 후생유전체 프로젝트로부터의 적혈구모세포 및 다른 혈구 (중성구, B-림프구 및 T-림프구) 및 조직 (간, 폐, 결장, 소장, 췌장, 부신, 식도, 심장, 뇌 및 태반)의 메틸화 프로파일과 본 발명자들의 그룹에 의해 생성된 메틸롬을 연구했다 (18-20, 23).
간단한 예에 있어서, 하나 이상의 DMR을 직접적으로 사용하여, 예를 들어, 메틸화되거나 (과메틸화된 DMR의 경우) 또는 메틸화되지 않은 (저메틸화된 DMR의 경우) DNA 단편의 백분율을 결정함에 의해 적혈구모세포로부터 순환하는 DNA의 기여를 결정할 수 있다. 백분율은 직접적으로 사용되거나 변형 (예를 들어, 배율 인자에 의한 배수)될 수 있다. 다른 구현예는 보다 복잡한 절차, 예를 들어, 선형 방정식 시스템을 해결하는 것을 수행할 수 있다. PCT 특허 출원 번호 WO 2016/008451에 기재된 바와 같이, N 게놈 부위에서의 메틸화 수준은 M 조직으로부터의 기여를 계산하는데 사용될 수 있으며, 여기서 M은 N보다 작거나 같다. 각각의 부위에서 메틸화 수준은 각각의 조직에 대해 계산될 수 있다. 선형 방정식 시스템 A x = b가 해결될 수 있고, 여기서 b는 N개 부위에서 측정된 메틸화 밀도의 벡터이고, x는 M개의 조직으로부터의 기여의 벡터이며, A는 M개 열과 N개 행의 매트릭스로, 각각의 열은 그 열의 특정한 부위에서 N개 조직에서 메틸화 밀도를 제공한다. M이 N보다 작으면, 최소 자승 최적화가 수행될 수 있다. M에 의한 치수 N의 매트릭스 A는 상기 공급원으로부터 얻어진 바와 같이, 참조 조직의 조직-특이적 메틸화 수준으로 형성될 수 있다.
A. DMR의 확인
차별적으로 메틸화된 영역 (DMR)을 확인하기 위해, 특정 유형/계통 (예를 들어, 적혈구모세포)의 조직을 단리하고 그 다음, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이 메틸화-인식 서열분석을 사용하여 분석할 수 있다. 조직 유형 (예를 들어, 단지 두 유형의 적혈구모세포 및 기타)에 걸친 부위에서의 메틸화 밀도를 분석하여 DMR에서 사용하기 위한 부위를 확인하기 위해 충분한 상이한 것이 존재하는지 여부를 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 다음의 기준 중 하나 이상이 적혈구모세포에 대한 메틸화 마커를 확인하기 위해 사용될 수 있다. (1) CpG 부위의 메틸화 밀도가 적혈구모세포에서 20% 미만이고 다른 혈구와 조직에서는 80% 이상인 경우 적혈구모세포에서 CpG 부위가 저메틸화되고 그리고 그 반대로 된다. (2). DMR이기 위해, 상기 영역은 저메틸화된 다수의 CpG 부위 (예를 들어, 3, 4, 5 또는 그 이상)를 포함하는 것이 요구될 수 있다. 따라서, DMR 내의 다수의 CpG 부위의 스트레치는 DMR의 신호-대-잡음 비 및 특이성을 개선시키기 위해 검정에 의해 분석되도록 선택될 수 있다. (3) DMR은 무세포 혼합물에서 DNA 분자를 대표하는 크기로 선택될 수 있다. 혈장에서, 대다수가 200bp 보다 짧은 주로 짧은 DNA 단편이 있다 (1, 24, 25). 혈장 내 적혈구 DNA 분자의 존재를 결정하는 구현예에 있어서, DMR은 혈장 DNA 분자의 대표적인 크기 (즉, 166bp) 내로 정의될 수 있다 (1). 이러한 기준의 변화가 이들 3가지 기준과 함께 사용될 수 있는데, 예를 들어, 저메틸화된 것으로 CpG 부위를 확인하기 위해 20% 및 80% 이외의 상이한 역치가 사용될 수 있다. 나중에 논의되는 것처럼, 일부 결과는 적혈구모세포에서 저메틸화된 3개의 적모세포-특이적 DMR 내에서 선택된 CpG 부위를 사용한다.
상기-정의된 기준으로, 본 발명자들은 전체의 게놈에 걸쳐서 3개의 적모세포-특이적 DMR을 확인했다. 일 DMR은 18번 염색체 상의 페로킬라타제 (FECH) 유전자의 인트론 영역 내에 존재했다. 이 영역에서, 적혈구모세포와 다른 세포 유형 사이의 메틸화 밀도에서의 차이는 확인된 세 가지 DMR 중 가장 크다. FECH 유전자는 헴 생합성의 최종 단계를 담당하는 효소인 페로킬라타제를 코딩한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 적모세포-특이적 DMR 내의 4개의 선택된 CpG 부위는 적혈구모세포에서 모두 저메틸화되었지만, 다른 혈구 및 조직에서는 과메틸화되었다.
도 1은 본 발명의 구현예에 따른 페로킬라타제 (FECH) 유전자의 프로모터 내의 CpG 부위의 메틸화 밀도를 도시한다. FECH 유전자는 18번 염색체 상에 위치하고 있으며 CpG 부위의 게놈 좌표는 X-축 상에 표시되어 있다. 도시된 바와 같이, CpG 부위의 메틸화 밀도는 FECH 유전자의 인트론 영역 내에 있다. 두 개의 수직 점선에 의해 한정된 영역 (110) 내에 위치한 4개의 CpG 부위는 모두 적혈구모세포에서 저메틸화되었지만 다른 조직 또는 세포 유형에서는 과메틸화되었다. 설명 목적으로, 폐, 심장, 소장, 결장, 가슴샘, 위, 부신, 식도, 방광, 뇌, 난소 및 췌장에 대한 개별 결과는 도시되지 않았다. 그것의 평균값은 "다른 조직"으로 표시되어 있다.
이 영역 내에 위치한 CpG 부위가 저메틸화됨에 따라, 도 1에서 2개의 점선 내의 4개의 CpG 부위 모두에 대해 메틸화되지 않은 서열은 적혈구모세포로부터 유래된 DNA가 풍부해질 것이다. 따라서, DNA 샘플에서 저메틸화된 서열의 양은 적혈구모세포로부터 유래된 DNA의 양을 반영할 것이다.
확인된 CpG 부위에서 메틸화되거나 메틸화되지 않은 DNA를 검출하기 위한 검정이 개발되었다. 혈장 DNA 분자 내의 CpG 수가 많을수록 검정은 더 구체적일 것이다. 대부분의 혈장 DNA 분자는 200bp 미만이며, 평균적으로 166bp이다. 따라서, CpG 부위는 모두 서로 166bp 이내일 수 있지만, 서로 150, 140, 130, 120, 110 또는 100bp 이내일 수 있다. 다른 구현예에서, 단지 쌍의 CpG 부위는 서로 이러한 거리 내에 있을 수 있다.
다른 구현예에서, CpG 부위는 CpG 부위의 메틸화 밀도가 적혈구모세포에서 10% (또는 다른 역치) 미만이고 모든 다른 조직 및 혈구에서 90% (또는 다른 역치)보다 크면 적혈구모세포에서 저메틸화된 것으로 정의될 수 있다. CpG 부위는 CpG 부위의 메틸화 밀도가 적혈구모세포에서 90% (또는 다른 역치)보다 크고 모든 다른 조직 및 혈구에서 10% (또는 다른 역치)보다 낮으면 적혈구모세포에서 과메틸화된 것으로 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, DMR은 100bp 내에 적어도 2종의 CpG 부위를 가질 수 있으며, 모두 적혈구모세포에 대해 차별적인 메틸화를 나타낸다.
DMR을 확인하는 일 구현예에서, 진단적으로 유용하기 위해, 100bp (또는 일부 다른 길이) 내의 모든 CpG 부위는 모든 다른 조직 및 혈구와 비교하여 적혈구모세포에서 저메틸화 또는 과메틸화를 나타내는 것이 요구될 수 있다. 예를 들어, 복수의 CpG 부위는 포유동물에 상응하는 참조 게놈 상에서 100bp 또는 그 미만에 이를 수 있다. 또 다른 예로서, 각각의 CpG 부위는 또 다른 CpG 부위의 100bp 이내에 있을 수 있다. 따라서, CpG 부위는 100bp 초과에 걸쳐있을 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역은 하기 방식으로 확인될 수 있다. 복수의 부위의 메틸화 지수 (예를 들어, 밀도)는, 예를 들어 도 1에 도시된 바와 같이, 특정한 혈액 세포 계통 및 다른 세포 계통을 포함하는 각각의 복수의 세포 계통에 대해 수득될 수 있다. 복수의 부위의 각각의 부위에서, 복수의 세포 계통의 메틸화 지수가 서로에 대하여 비교될 수 있다. 비교에 기초하여, 각각이 제1 메틸화 역치 아래/위인 특정한 혈액 세포 계통에서의 메틸화 지수 및 제2 메틸화 역치 아래/위인 다른 세포 계통의 각각에서 메틸화 지수를 갖는 복수의 부위 중 하나 이상의 부위가 확인될 수 있다. 이런 식으로, 저메틸화된 부위 및/또는 과메틸화된 부위가 확인될 수 있다. 제1 메틸화 역치의 예는 저메틸화된 부위에 대해 10%, 15% 또는 20%이고, 반면 제2 메틸화된 역치의 예는 80%, 85% 또는 90% 일 수 있다. 하나 이상의 부위를 함유하는 차별적으로 메틸화된 영역은 그런 다음, 예를 들어 상기 기재된 기준을 사용하여 확인될 수 있다.
B. 메틸화 및 비메틸화된 DNA 서열의 검출
적모세포-특이적 DMR에서 메틸화 및 비메틸화된 DNA 서열을 검출하기 위해, 두 개의 디지털 PCR 검정이 전개될 수 있다: 하나는 비메틸화된 서열을 표적으로 하고 다른 하나는 메틸화된 서열을 표적으로 한다. 다른 구현예에서, 메틸화-인지 서열분석 (예를 들어, 그것의 메틸화 상태에 기반하여 DNA를 차별적으로 변형할 수 있는 바이설파이트 서열분석 또는 생화학적 또는 효소 과정에 따른 서열분석), 실시간 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 제한 효소 분석, 및 마이크로어레이 분석과 같은, DMR의 메틸화 및 비메틸화된 서열의 검출 및/또는 정량화를 위해 다른 방법이 또한 사용될 수 있다. 따라서, PCR 검정 이외에 다른 유형의 검정이 사용될 수 있다.
일 예에서, 적모세포 DMR은 바이설파이트 처리 후에 검출될 수 있다. CpG 부위의 메틸화 상태는 검출 결과 (예를 들어, PCR 신호)에 기반하여 결정될 수 있다. FECH 유전자에 대해, 서열분석을 위한 바이설파이트 처리 후 적혈구 DMR을 증폭하기 위해 하기 프라이머가 사용될 수 있다: 5'-TTTAGTTTATAGTTGAAGAGAATTTGATGG-3' 및 5'-AAACCCAACCATACAACCTCTTAAT-3'.
또 다른 예에서, 분석의 특이성을 향상시키기 위해, 특정한 CpG의 메틸화 및 비메틸화된 상태를 모두 커버하는 2개의 정방향 프라이머를 사용할 수 있다. 메틸화 및 비메틸화된 서열을 특이적으로 표적화하는 2가지 디지털 PCR 검정에 대해 사용되는 그와 같은 일련의 프라이머 세트가 하기에 열거된다.
비메틸화된 서열의 특정한 검출을 위한 검정
프라이머/탐침 서열
정방향 프라미어-1 5'-TTGAAGAGAATTTGATGGTATGGGTA-3'
정방향 프라미어-2 5'-TGAAGAGAATTTGATGGTACGGGTA-3'
역방향 5'-CTCAAATCTCTCTAATTTCCAAACACA
형광 탐침 5'-FAM-TTGTGTGGTGTAGAGAG-MGB-3'
메틸화된 서열의 특정한 검출을 위한 검정
프라이머 서열
정방향 5'-TTGAAGAGAATTTGATGGTATGGGTA-3'
5'-TGAAGAGAATTTGATGGTACGGGTA-3'
역방향 5'-CAAATCTCTCTAATTTCCGAACACG-3'
형광 탐침 5'-VIC-TGCGTGGCGTAGAG-MGB-3'
역방향 프라이머 및 탐침에서 밑줄친 뉴클레오타이드는 CpG 부위에서 차별적으로 메틸화된 시토신이었다. 비메틸화된 및 메틸화된 검정의 역방향 프라이머 및 탐침은 구체적으로 밑줄친 뉴클레오타이드에서의 차이 때문에 비메틸화된 및 메틸화된 서열에 결합한다.
C. 보편적으로 메틸화된 및 보편적으로 비메틸화된 DNA를 사용한 확인
보편적으로 메틸화된 및 보편적으로 비메틸화된 DNA의 분석을 2개 검정의 정확도를 확인하기 위해 수행하였다.
CpGenome 인간 메틸화된 DNA (EMD Millipore)로부터의 보편적으로 메틸화된 서열 및 EpiTect 비메틸화된 인간 대조 DNA (Qiagen)로부터 보편적으로 비메틸화된 서열을 사용하여, 적모세포-특이적 DMR에서 메틸화 및 비메틸화된 서열의 검출 및 정량화를 위해 설계된 2개의 디지털 PCR 검정의 특이성을 확인하였다. CpGenome 인간 메틸화된 DNA를 HCT116 DKO 세포에서 정제하고 이어서 M.SssI 메틸전달효소를 사용하여 모든 CpG 뉴클레오타이드를 효소적으로 메틸화시켰다. 보편적으로 메틸화된 및 보편적으로 비메틸화된 DNA 서열을 양성 및 음성 대조군과 동일한 플레이트 상에서 실행시켰다. 양성 형광 신호에 대한 컷오프 값은 대조군과 관련하여 결정하였다. 각각의 샘플에서 메틸화 및 비메틸화된 DNA 서열의 수는 복제한 웰들로부터 조합된 계수를 사용하여 계산하였고 이어서 푸와송 정정을 하였다 (4).
도 2a 및 2b는 본 발명의 구현예에 따라 메틸화 및 비메틸화된 DNA를 검출하기 위해 설계된 디지털 PCR 검정을 사용하여 보편적으로 메틸화 및 비메틸화된 DNA의 분석을 도시한다. 세로축은 비메틸화된 서열에 대한 상대적인 형광 신호의 강도에 대응한다. 가로축은 메틸화된 서열에 대한 상대적인 형광 신호의 강도에 대응한다. 데이터는 메틸화되거나 또는 비메틸화되는 것으로 공지된 DNA를 사용하여 생성되었다. 이들 분석은 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA에 대한 검정의 특이성을 입증하기 위한 것이다.
보편적으로 비메틸화된 DNA의 분석에 대해, 비메틸화된 DNA에 대한 검정을 사용하여 증폭 신호가 검출되었고 (양성 FAM 신호에 상응하는 도 2a의 플롯 (205)에서 청색 점 (210)), 반면 메틸화된 DNA에 대한 검정을 사용하는 경우 청색 점 (210)은 미검출되었다 (도 2b의 플롯 (255)). 보편적으로 메틸화된 DNA의 분석에 대해, 메틸화된 DNA에 대한 검정을 사용하여 증폭 신호가 검출되었고 (양성 VIC 신호에 상응하는 도 2b의 플롯 (250)에서 녹색 점 (220)), 반면 비메틸화된 DNA에 대한 검정을 사용하여 녹색 점 (220)은 미검출되었다 (도 2a의 플롯 (200)). 각각의 패널에서 흑색 점은 임의의 증폭된 신호가 없는 액적을 나타낸다. 4개의 패널 각각 내의 두꺼운 수직 및 수평 라인은 양성 결과에 대한 역치 형광 신호를 나타낸다. 이들 결과는 적모세포-특이적 DMR에서 메틸화 및 비메틸화된 DNA에 대한 두 가지 검정의 특이성을 확인했다.
FECH 유전자-관련 DMR에 기반한 검정의 분석적 민감도를 더 평가하기 위해, 비메틸화된 서열을 갖는 샘플을 특정 분획의 농도 (즉, FECH 유전자-관련 DMR에서 모든 (비메틸화된 및 메틸화된) 서열 중에서 비메틸화된 서열의 백분율)로 연속으로 희석하였다. 반응 당 총 1,000 분자가 있었다. 비메틸화된 서열은 메틸화 및 비메틸화된 서열의 총량 중 0.1% 만큼 낮게 검출될 수 있었다 (표 3 참조).
FECH 유전자-관련 DMR을 표적화하는 검정의 민감도 평가를 위한 비메틸화된 서열의 상이한 유입 농도에서 측정된 농도 (비메틸화된 서열의 백분율).
유입 농도
(% 비메틸화된 서열) 		측정된 농도
(% 비메틸화된 서열)
10.0% 9.83%
5.0% 5.36%
2.0% 2.85%
1.0% 0.99%
0.5% 0.33%
0.1% 0.34%
추가로, (예를 들어 피펫팅으로부터) 잠재적인 변화를 형가하기 위해, 본 발명자들은 20회 개별의 반응에서 특정 분획의 농도 (% 비메틸화된 서열 = 30%)에서 메틸화 및 비메틸화된 서열의 인공적으로 혼합된 샘플 내 비메틸화된 서열의 백분율을 반복적으로 측정하였다. 본 발명자들은 각각의 반응에 대해 총 500의 메틸화 및 비메틸화된 분자를 사용했다. 이 수치는 본 발명자들이 혈장 DNA 샘플에 대한 디지털 PCR 분석에서 메틸화 및 비메틸화된 분자의 총 수에서 관측한 것과 비교할만하다. 본 발명자들은 비메틸화된 서열의 백분율의 20회 반복된 측정에 대해 30.4%의 평균 및 1.7%의 표준 편차를 관측하였다. 내부-검정 변동 계수는 5.7%로 계산된다.
III. 상이한 샘플에 대한 검정의 특이성 및 민감도
적혈구 DNA에 대한 FECH 유전자-관련 DMR을 표적화하는 디지털 PCR 검정의 조직 특이성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 이들 디지털 PCR 검정 이외의 기술을 사용하여 측정한 바와 같이, 적혈구모세포의 상이한 양을 갖는 다양한 샘플에서 디지털 PCR 검정을 시험하였다. 디지털 PCR 검정에 의해 검출된 비메틸화된 DNA 서열의 양은 적혈구 DNA의 양을 반영해야한다. 유사하게, 메틸화된 서열의 양은 다른 조직 또는 세포 유형으로부터의 DNA를 반영해야한다. 따라서, 본 발명자들은 적모세포-특이적 DMR에서 검출된 모든 (비메틸화된 및 메틸화된) 서열 중에서 비메틸화된 서열의 백분율로 생물학적 샘플에서 적혈구 DNA의 백분율 (E%)을 정의했다. 따라서, DMR 영역에 대한 메틸화 및 비메틸화된 서열에 대해 특이적인 검정을 사용하여 혈액 샘플을 분석하여 비메틸화된 서열의 백분율인, 비메틸% (또한 일명 E%)와 적혈구모세포로부터의 DNA의 존재 사이의 상관관계를 결정하였다. 비메틸% (E%)는 메틸화 수준의 예이다.
적혈구 DNA의 백분율 (E%)은 다음과 같이 계산되었다:
Figure pat00001
적혈구모세포와 다른 세포 유형 사이의 메틸화 밀도의 차이가 FECH 유전자 내 DMR에 대해 가장 크기 때문에, 본 발명자들은 먼저 본 발명자들의 가설을 증명하기 위해 이 마커 부위를 기반으로 E% 분석을 진행했다. 후속적으로, 본 발명자들은 FECH 유전자-관련 DMR로부터의 E% 결과를 검증하기 위해 샘플의 하위 세트에서 다른 두 개의 적모세포-특이적 DMR을 기반으로 E%를 분석했다. FECH 유전자 내의 DMR에 기반한 E% 결과는 E%(FECH)로 표시된다. 메틸화된 서열의 백분율 또는 단지 메틸화된 서열 대 비메틸화된 서열의 비율과 같은 다른 백분율 또는 비율이 또한 사용될 수 있는데, 여기서 어느 하나의 값은 비율의 분자 및 분모에 있을 수 있다.
구체적으로, 도 1로부터의 FECH 유전자상의 4개의 CpG 부위에서 각각의 샘플 내 메틸화 및 비메틸화된 DNA 서열의 수는 디지털 PCR을 사용하여 결정하였다. 그런 다음, 샘플 내 비메틸화된 DNA의 백분율 (비메틸%/E%)를 계산하였다. 일 구현예에서, DNA 단편이 비메틸화된 것으로 간주되기 위해서는, 4개의 CpG 부위 모두가 비메틸화되어야 한다.
적혈구모세포를 정량화하기 위한 검정 신호의 능력을 시험하기 위해 두 개의 시나리오가 사용된다. 한 가지 시나리오는 두 가지 유형의 샘플이 적혈구모세포의 수에서 다른 것으로 제대혈 대 성인 혈액이다. 그리고 다른 시나리오의 경우, 베타-종증성 지중해 빈혈을 가진 대상체는 그들의 혈액에 주목할 만한 수의 적혈구모세포를 가지고 있다.
A. 건강한 대상체의 적모세포-농축 샘플 대 버피 코트
성인 혈액 내의 적혈구모세포는 매우 낮다. 제대혈은 훨씬 높은 수의 적혈구모세포를 갖는다. 따라서 4개의 CpG 부위에 대한 E%는 건강한 환자보다 제대혈에서 훨씬 높아야 한다. 따라서 적혈구 DNA에 대한 FECH 유전자-관련 DMR을 표적화하는 디지털 PCR 검정의 조직 특이성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 12개 상이한 정상 조직 유형으로부터 추출된 DNA를 포함한 샘플 및 적모세포-농축한 샘플에서 디지털 PCR 검정을 시험했다. 본 발명자들은 각각의 조직 유형에 대해 상이한 개체로부터 4가지 샘플을 포함시켰다. 적모세포-농축 샘플을 분석을 위해 탯줄 혈액으로부터 준비하였다.
구체적으로, DMR에서 DMR과 E%에서 메틸화 밀도 사이의 관계를 확인하기 위해, 21명의 건강한 대상체 및 30명의 임신한 여성 (제1 삼분기에 있는 10명, 제2 삼분기에는 10명, 제3 삼분기에는 10명)으로부터 정맥 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액 샘플을 3,000g에서 10분 동안 원심분리하여 혈장과 혈구를 분리하였다. 버피 코트는 원심분리 후에 수집되었다. 혈장 샘플을 수집하고 잔존 혈구를 제거하기 위해 30,000g에서 재원심분리했다.
12개의 상이한 정상 조직 유형에 관해서, 본 발명자들은 각각의 조직 유형에 대해 상이한 개체로부터 4개의 샘플을 포함시켰다. 표 4에서 나타낸 바와 같이, 모든 조직 DNA로부터의 중앙 E%(FECH) 값은 낮았다 (중앙 값의 범위: 0.00% 내지 2.63%).
상이한 개체로부터 수득된 각각의 조직 샘플로, 12개의 조직 유형의 4개 세트에서 적혈구 DNA의 중앙 백분율 (E%(FECH))을 나타내는 표.
조직 중앙 E%
간 0.12%
폐 1.33%
식도 2.63%
위 2.58%
소장 2.33%
결장 1.51%
췌장 0.12%
부신 0.00%
비뇨기 방광 1.20%
심장 0.82%
뇌 1.94%
태반 0.10%
유세포측정 및 세포 분류와 후속적인 DNA 추출에 의한 탯줄 혈액으로부터의 농축을 위한 실험적 절차는 하기에 기재되어있다. 아기의 출산 후 8명의 임산부 각각으로부터 1-3mL의 탯줄 혈액을 수집했다. Ficoll-Paque PLUS 키트 (GE Healthcare)를 사용하여 밀도 구배 원심분리 후 제대혈 샘플로부터 단핵 세포를 분리하였다. 단핵 세포의 수집 후, 1 x 108 세포를 4℃에서의 암실에서 30분 동안 인산염-완충 식염수에서 1:10 희석으로 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-접합된 항-CD235a (Glycophorin A) 및 파이코에리트린 (PE)-접합된 항-CD71 항체 (Miltenyi Biotec)의 1mL의 혼합물로 배양하였다. CD235a+CD71+ 세포의 분류 및 분석을 그런 다음 BD FACSAria 융합 세포 정렬기 (BD Biosciences)를 사용하여 수행하였다. CD235a 및 CD71이 적혈구모세포 내에 구체적으로 존재하기 때문에, CD235a+CD71+ 세포는 적혈구모세포가 풍부할 수 있다 (문헌 [Bianchi et al. Prenatal Diagnosis 1993;13:293-300]).
각각의 경우로부터 수득된 세포의 수가 적기 때문에, 8가지 경우로부터의 세포를 다운스트림 분석을 위해 모아두었다. 두 항체는 적혈구모세포에 대해 특이적이고 적혈구모세포의 표면에 부착한다. 2개의 항체는 각각 FITC 및 파이코에리트린과 접합되어 있다. 이들 두 물질은 자기 비드에 결합하며, 본 비드는 세포 정렬기를 사용하여 분류될 수 있다. 따라서 Ab-표지된 적혈구모세포가 포착될 수 있다. 항-CD71 (트랜스페린 수용체) 및 항-CD235a (글리코포린 A) 항체 (보충 자료 및 방법 참조)로 유세포측정 및 세포 분류를 사용하여, 적혈구모세포를 8개의 탯줄 혈액 샘플에서 농축하고 후속적으로 풀링하였다. 풀링된 샘플로부터 DNA를 추출하였다.
풀링된 제대혈 샘플로부터 DNA의 E%(FECH)는 CD235a+CD71+ 세포 (대부분 적혈구모세포)에 대한 검정에서 시험된 4개의 CpG 부위에서 67%였다. 그것의 말초 혈액에서 적혈구모세포의 검출불가능한 수를 갖는 20명의 건강한 대상체의 버피 코트 DNA에서 E%(FECH)에 대해, 버피 코트 DNA에서의 중앙 E%는 2.2% (사분위간 범위: 1.2 - 3.1%)였다. 건강한 대상체의 버피 코트에서 적모세포-특이적 비메틸화된 서열의 낮은 비율의 관찰은 성숙한 RBC가 핵을 보유하지 않는다는 사실과 일치한다. CD235a 및 CD71은 적혈구모세포에 대해 특이적인 세포 표면 마커이기 때문에 (문헌 [Bianchi 등, Prenatal Diagnosis 1993; 13 : 293-300]), CD235a 및 CD71이 풍부한 세포에서 높은 E%(FECH)는 적모세포-특이적 DMR에서 비메틸화된 DNA에 대한 검정은 적모세포-유래된 DNA를 검출할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 건강한 대상체의 버피 코트 DNA와 다른 조직 유형으로부터의 DNA에 대한 낮은 E% 결과와 함께 적모세포-농축된 샘플에 대한 이 높은 E%는 비메틸화된 FECH 서열에 대한 디지털 PCR 검정이 적모세포-유래된 DNA에 대해 특이적이었다는 것을 나타낸다.
B. 베타-종증성 지중해 빈혈이 있는 환자 경우
베타-종증성 지중해 빈혈을 앓고 있는 환자에서, 골수는 많은 적혈구 (RBC)를 만들려고 시도한다. 그러나 헤모글로빈의 생산은 불량성이다. 그 결과, 많은 RBC는 충분한 헤모글로빈을 함유하지 않고 많은 과도한 알파 글로빈 사슬을 함유한다. 이들 불량성 RBC는 골수에서 제거되어 결코 성숙한 RBC로 되지 않을 것이다. 2가지 유형의 글로빈 사슬: 알파 및 베타가 있다. 하나의 헤모글로빈 분자는 두 개의 알파와 두 개의 베타 사슬을 필요로 한다. 만일 베타 사슬이 생성되지 않으면, 과도한 알파 사슬이 함께 응집되어 기능적 헤모글로빈이 형성될 수 없다.
베타-종증성 지중해 빈혈이 있는 환자에 있어서, 증가되었지만 효과없는 적혈구생성은 성숙한 RBC의 감소된 생산을 초래한다 (문헌 [Schrier 등 Current Opinion in Hematology 2002;9:123-6]). 이것은 보상성 골수외 조혈과 순환계에서 유핵의 적혈구의 존재를 동반한다. 아래에 기재된 바와 같이, 베타-종증성 지중해 빈혈이 있는 환자는 건강한 환자보다 많은 유핵의 적혈구를 가질 것이다. 말초 혈액에서 유핵의 RBC의 수는 혈액 도말표본 상에서 계수될 수 있으며 100개의 백혈구 (WBC) 당 유핵의 RBC의 수로 표시된다.
종증성 지중해 빈혈이 있는 환자는 일반적으로 효과없는 적혈구생성 때문에 건강한 개체보다 말초 혈액 내에 더 높은 수의 적혈구모세포를 가지기 때문에 (27), 이러한 환자는 또한 검정의 특이성 및 민감도를 시험하기 위한 양호한 기전을 제공한다. 따라서 본 발명자들은 β-종증성 지중해 빈혈이 있는 15명의 환자의 버피 코트 DNA에서 디지털 PCR 검정의 민감도를 시험했다. 그들 중 모두는 자동화 혈액학 분석기 (UniCel DxH 800 쿨터 세포 분석 시스템, Beckman Coulter)로 측정하여 수동 계수함의해 확인된 말초 혈액에서 적혈구모세포의 검출가능한 수를 가졌다.
도 3a는 본 발명의 구현예에 따라 혈구 내의 E%(FECH)와 유핵의 RBC (적혈구모세포)의 수 사이의 상관관계를 나타내는 플롯이다. E%는 FECH 유전자-관련 DMR을 표적화하는 디지털 PCR 검정에 의해 측정된다. 축으로 나타낸 바와 같이, 플롯은 자동화 혈액학 분석기를 사용하여 측정된 바와 같이, 버피 코트 DNA 내의 적혈구 DNA 서열의 백분율 (E%(FECH))과 모든 주변 백혈구 중 적혈구모세포의 백분율 사이의 상관관계를 도시한다.
도 3a에서 나타낸 바와 같이, 버피 코트 DNA 내의 E%(FECH)는 혈액학 분석기에 의해 측정된 주변 백혈구 중에서 적혈구모세포의 백분율과 잘 상관되었다 (r = 0.94, P < 0.0001, Pearson 상관관계). 지중해빈혈 환자의 버피 코트 내의 E%와 적모세포 수 사이의 양호한 선형 관계는 적혈구모세포가 DMR에 대해 비메틸화되고 다른 혈구는 메틸화됨에 따라, 디지털 PCR 검정이 샘플 내 적혈구 DNA 함량의 양호한 정량적 측정을 제공했다는 것을 나타낸다. 따라서, 혈액 샘플에서 적혈구모세포의 비율이 높을수록 E%가 더 높아질 것이다. 이 실험의 목적은 본 검정이 샘플 내 적모세포-유래 DNA의 양을 반영하는 데 사용될 수 있음을 입증하는 것이다. 이들 결과는 더욱이 FECH 유전자에 대한 E%가 적혈구모세포로부터 유래된 DNA의 비율을 반영한다는 것을 뒷받침한다.
이 상관관계는 다른 환자에게도 존재할 수 있다. 그러나 베타-종증성 지중해 빈혈로 고통받고 있는 환자의 경우 적혈구모세포의 수가 높을 수 있기 때문에, 그것의 샘플은 그와 같은 상관관계를 확인하는데 양호한 시험을 제공한다. 도 3a로부터 알 수 있는 바와 같이, 환자는 넓은 범위의 E% 및 적혈구모세포의 수를 가고, 그렇게 함으로써 상관관계를 시험하기 위한 양호한 기전을 제공한다.
C. 특정 세포 계통의 세포 DNA의 양을 결정하는 방법
일부 구현예에서, 무세포 혼합물 (예를 들어, 혈장 또는 혈청 샘플) 내 비메틸화된 또는 메틸화된 DNA 단편의 양을 사용하여 특정한 세포 계통에 특이적인 하나 이상의 DMR에서 양이 카운트될 때 특정한 세포 계통의 세포 수 (또는 다른 양의 DNA)를 결정할 수 있다. 도 3a에서 나타낸 바와 같이, FECH DMR에서 비메틸화된 DNA 단편의 백분율은 혈액 샘플 내 적혈구모세포의 수와 관련된다. 절대 농도도 또한 사용될 수 있다. 과메틸화된 DMR에 대해, 메틸화된 DNA 단편의 양 (예를 들어, 백분율 또는 절대적인 농도)이 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 다양한 세포 계통이 사용될 수 있다.
세포의 수의 수를 결정하기 위해, 보정 함수가 사용될 수 있다. 도 3a의 예에서, 데이터 포인트에 대한 라인 맞춤은 보정 함수를 제공할 수 있다. 일 예로, 보정 함수는 그것의 함수적 파라미터 (예를 들어, 라인에 대한 슬로프 및 y- 절편, 또는 다른 함수에 대한 더 많은 파라미터)에 의해 저장되거나, 곡선 맞춤이 얻어지는 일련의 데이터 포인트에 의해 저장될 수 있다. 적혈구모세포의 수가 결정됨에 따라, 데이터 포인트 (예를 들어, 보정 데이터 포인트라고 지칭됨)는 다른 기술을 통해 결정될 수 있는 바와 같이 세포 계통의 DNA의 양 (예를 들어, 세포의 수)에 대해 공지된 값을 가질 수 있다.
따라서, 방법은 혈액 샘플에서 특정 세포 계통으로부터의 DNA 양을 결정할 수 있다. 하나 이상의 DMR의 수많은 메틸화된 또는 비메틸화된 서열은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 검정으로부터 결정될 수 있다. 메틸화 수준이 결정되고 보정 함수의 보정 값에 비교될 수 있다. 예를 들어, 메틸화 수준은 그 메틸화 수준과 함수의 교차점을 결정하기 위해 라인 (또는 다른 보정 함수), 및 따라서 DNA의 상응하는 양 (예를 들어, 도 3a의 가로축상의 값)에 비교될 수 있다. 다른 구현예에서, 메틸화 수준은, 예를 들어, 샘플의 측정된 메틸화 수준에 가까운 메틸화 수준을 갖는 개별 보정 데이터 포인트에 비교될 수 있다.
도 3b는 본 발명의 구현예에 따라 무세포 DNA를 분석함으로써 생물학적 샘플에서 특정 세포 계통의 세포의 양을 결정하는 방법 (300)을 나타내는 순서도이다. 방법 (300)은 도 3a에 도시된 것과 같은 측정치를 사용할 수 있다. 방법 (300)의 일부는 수작업으로 수행될 수 있고 다른 부분은 컴퓨터 시스템에 의해 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 시스템은 모든 단계들을 수행할 수 있다. 예를 들어, 시스템은 (예를 들어, 샘플을 얻고 검정을 수행하는) 로보트 요소, 검정으로부터의 신호를 검출하기 위한 검출 시스템, 및 신호를 분석하기 위한 컴퓨터 시스템을 포함할 수 있다. 그와 같은 시스템을 제어하기 위한 명령들은 하나 이상의 컴퓨터 판독가능 매체, 예컨대 필드 프로그래밍가능한 게이트 어레이 (FPGA), 플래시 메모리, 및/또는 하드 드라이브의 구성 로직에 저장될 수 있다. 도 27은 그와 같은 시스템을 나타낸다.
블록 (310)에서, 생물학적 샘플의 무세포 혼합물이 수득된다. 생물학적 샘플은 혈액 샘플일 수 있지만, 또한 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이 무세포 DNA를 포함하는 다른 샘플일 수도 있다. 무세포 혼합물의 예는 혈장 또는 혈청을 포함한다. 무세포 혼합물은 복수의 세포 계통으로부터의 무세포 DNA를 포함할 수 있다.
블록 (320)에서, 무세포 혼합물 내의 DNA 단편은 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역에 상응하는 검정과 접촉된다. 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역의 각각은 다른 세포 계통에 비해 저메틸화되거나 과메틸화됨으로써 특정 세포 계통 (예를 들어, 특정 혈액 세포 계통, 예컨대 적혈구모세포)에 특이적이다.
다양한 구현예에서, 검정은 PCR 또는 서열분석을 포함할 수 있다. DNA 단편을 접촉하는 것은 유동 세포, 액적, 비드, 또는 다른 기전을 포함하여 DNA 단편과 함께 검정의 상호작용을 제공할 수 있다. 그와 같은 검정의 예는 전체의-게놈 바이설파이트 서열분석, 표적화된 바이설파이트 서열분석 (하이브리드화 캡쳐 또는 앰플리콘-서열분석에 의함), 다른 메틸화-소비 서열분석 (예를 들어 Pacific Biosciences에 의한 단일 분자 실시간 (SMRT) DNA 서열분석), 실시간 메틸화-특정 PCR, 및 디지털 PCR을 포함한다. 방법 (300)에 사용할 수 있는 검정의 추가 예는 본 명세서에, 예를 들어 부문 XII에 기재되어 있다. 예를 들어 도 3a는 적혈구모세포에 대한 것이지만, 다른 혈액 세포 계통을 포함한 다른 세포 계통이 사용될 수 있다.
블록 (330)에서, 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA 단편의 제1 수가 검정으로부터 수득된 신호에 기반하여 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역에서 무세포 혼합물에서 검출된다. 이 검정은 다양한 신호, 예컨대 광 또는 전기 신호를 제공할 수 있다. 신호는 DNA 단편당 특정 신호, 또는 메틸화 서명 (예를 들어, 실시간 PCR에서와 같음)을 갖는 DNA 단편의 총 수를 나타내는 총합 신호를 제공할 수 있다.
일 구현예에서, DNA 단편에 대한 서열 판독치를 수득하기 위한 서열분석이 사용될 수 있고, 그리고 DNA 단편은 기준 게놈에 정렬될 수 있다. DNA 단편이 DMR 중 하나에 정렬되면, 계수기가 증분될 수 있다. 신호가 비메틸화된 검정의 특정 메틸화된 것으로부터의 것이라면, DNA 단편은 메틸화 서명을 가지는 것으로 추정될 수 있다. 또 다른 구현예에서, PCR로부터의 판독 (예를 들어, 양의 웰로부터의 광 신호)은 그와 같은 계수기를 증분시키는데 사용될 수 있다.
블록 (340)에서, 제1 메틸화 수준은 제1 수를 사용하여 결정된다. 제1 메틸화 수준은 정규화될 수 있거나 또는, 예를 들어 생물학적 샘플의 용적당 절대 농도일 수 있다. 절대 농도의 예는 도 25에 제공된다.
정규화된 값에 대해, 메틸화 수준은 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역에서 무세포 혼합물 내 DNA 단편의 제1 수 및 총 수를 사용하여 결정될 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이, 메틸화 수준은 비메틸화된 DNA 단편의 백분율일 수 있다. 다른 구현예에서, 백분율은 메틸화된 DNA 단편의 백분율일 수 있어, 적혈구모세포에 대한 상기 예에 대비하여 역전 관계를 가질 것이다. 다양한 실행에서, 메틸화 수준은 DMR 내 모든 부위에 걸친 백분율을 사용하여, 각각의 부위에서 개별 백분율의 평균 또는 각각의 부위에서 가중 평균에 의해 결정될 수 있다.
블록 (350)에서, 하나 이상의 보정 데이터 포인트가 수득된다. 각각의 보정 데이터 포인트는 (1) 특정한 혈액 세포 계통의 세포의 양 및 (2) 보정 메틸화 수준을 특정할 수 있다. 하나 이상의 보정 데이터 포인트는 복수의 보정 샘플로부터 결정된다.
세포의 양은 특정 양 (예를 들어, 수 또는 농도) 또는 양의 범위로서 명시될 수 있다. 보정 데이터 포인트는 공지된 세포의 양을 갖는 보정 샘플로부터 결정될 수 있어, 본 명세서에서 기재된 다양한 기술을 통해 측정될 수 있다. 적어도 일부의 보정 샘플은 상이한 양의 세포를 갖지만 일부 보정 샘플은 동일한 양의 세포를 가질 수 있다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 보정 포인트는 하나의 이산 포인트, 일련의 이산 포인트, 함수, 하나의 이산 포인트 및 함수, 또는 이산 또는 연속 세트의 값의 임의의 다른 조합으로서 정의될 수 있다. 예로서, 교정 데이터 포인트는 특정한 계통의 세포의 특정 양을 갖는 샘플에 대한 하나의 보정 메틸화 수준으로부터 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 동일한 양의 세포에서 다중 샘플들로부터의 동일한 메틸화 수준의 측정된 값은 특정 양의 세포에 대한 보정 데이터 포인트를 결정하기 위해 조합될 수 있다. 예를 들어, 메틸화 수준의 평균은 특정 보정 데이터 포인트를 결정하기 위해 (또는 보정 데이터 포인트에 상응하는 범위를 제공하기 위해) 동일한 양의 세포에서 샘플의 메틸화 데이터로부터 수득될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 동일한 보정 메틸화 수준을 갖는 다중 데이터 포인트가 평균 세포 양을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
일 실행에서, 메틸화 수준은 많은 보정 샘플에 대해 측정된다. 메틸화 수준의 보정 값은 각각의 보정 샘플에 대해 결정되어, 여기서 메틸화 수준은 (예를 들어, 도 3a에서와 같이) 샘플의 공지된 세포 양에 대해 플롯될 수 있다. 그런 다음 함수가 플롯의 데이터 포인트에 조정될 수 있어, 여기서 함수의 조정은 신규한 샘플에 대한 세포의 양을 결정하는 데 사용되는 보정 데이터 포인트를 정의한다.
블록 (360)에서, 제1 메틸화 수준은 적어도 하나의 보정 데이터 포인트의 보정 메틸화 수준과 비교된다. 비교는 여러 가지의 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 비교는 제1 메틸화 수준이 보정 메틸화 수준보다 더 높은지 또는 더 낮은지 여부일 수 있다. 비교는 (보정 데이터 포인트로 구성된) 보정 곡선과 비교하는 것을 포함할 수 있으며, 따라서 비교는 제1 메틸화 수준을 갖는 곡선상의 포인트를 식별할 수 있다. 예를 들어, 제1 메틸화 수준의 계산된 값 X는 함수 F(X)에 입력으로 사용될 수 있고, 여기서 F는 보정 함수 (곡선)이다. F(X)의 출력은 세포의 양이다. 오차 범위가 제공될 수 있으며, 이는 각각의 X 값에 대해 상이할 수 있으며, 그렇게 함으로써 F(X)의 출력으로서 값의 범위를 제공한다.
블록 (370)에서, 생물학적 샘플 내의 특정한 세포 계통의 세포의 양이 비교에 기초하여 추정된다. 일 구현예에서, 제1 메틸화 수준이 역치 보정 메틸화 수준보다 높거나 낮은지를 결정할 수 있고, 그렇게 함으로써 본 샘플의 세포의 양이 역치 보정 메틸화 수준에 상응하는 세포의 양보다 높거나 낮은지를 결정할 수 있다. 예를 들어, 생물학적인 것에 대해 계산된 제1 메틸화 수준 X1이 보정 메틸화 수준 XC 이상인 경우, 생물학적 샘플의 세포 N1의 양은 XC에 상응하는 세포 NC의 양보다 높은 것으로 결정될 수 있다. 높은 및 낮은 이 관계는 파라미터가 어떻게 정의되는지에 의존할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 단 하나의 보정 데이터 포인트가 필요할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 비교는 제1 메틸화 수준을 보정 함수에 입력함으로써 달성된다. 보정 함수는 제1 메틸화 수준에 상응하는 곡선상의 포인트를 식별함으로써 제1 메틸화 수준을 보정 메틸화 수준과 효과적으로 비교할 수 있다. 추정된 세포의 양은 그런 다음 보정 함수의 출력 값으로서 제공된다.
IV. 혈장 내 적혈구모세포로부터 무세포 DNA의 기원
비메틸%와 적모세포-유래된 DNA 사이의 확립된 관계를 사용하여, 혈장 내 적모세포-유래된 DNA를 정량하기 위해 혈장의 비메틸%가 사용될 수 있다. 혈장 내 비메틸%는 상기 검정을 사용하여 결정되었다. 버피 코트와 혈장 내 비메틸%에서의 차이가 나타난다. 본 분석은 혈장 내 무세포 적모세포 DNA가 골수 내 적혈구생성으로부터 유래하고 혈류 내에 있는 적모세포로부터 유래된 것이 아님을 보여준다.
2개의 디지털 PCR 검정에 의해 결정된 비메틸%가 샘플 내 적모세포-유래된 DNA의 양을 정확하게 반영한다는 것을 확인한 후, 본 발명자들은 건강한 대조군 대상체 및 임신한 여성의 버피 코트 및 혈장 내의 적모세포-유래된 DNA의 비율을 비교하였다.
도 4는 본 발명의 구현예에 따라 상이한 삼 분기에서 건강한 비-임신한 대상체 및 임신한 여성의 버피 코트 및 혈장 내의 비메틸%를 도시한다. 혈장 샘플은 대상체의 각각의 군에 대한 버피 코트와 비교하여 상당히 더 높은 비메틸%를 가졌다 (P<0.01, 혈장과 버피 코트 사이 각각의 쌍으로 된 비교에 대한 Wilcoxon 징후-등급 시험).
도 4의 결과는 유핵의 RBC의 수가 낮기 때문에 기대된 바와 같이, 적모세포-유래된 DNA의 양이 혈구에서 낮다는 것을 도시한다. 놀라운 결과는 혈장 내 적모세포-유래된 DNA의 양이 많다는 것이다. 혈장 내 적모세포-유래된 DNA가 혈구로부터 유래된 것이라면, 두 양은 비슷할 것으로 기대될 수 있다. 따라서, 이 데이터는 혈장 내 적모세포-유래된 DNA의 기원이 골수 내 적혈구생성으로부터의 것임을 나타낸다.
도 5는 버피 코트 및 혈장 내의 비메틸% 사이의 상관관계의 결여를 나타내는 플롯이다. 버피 코트와 혈장 DNA에 대한 비메틸% 사이에는 상당한 상관관계가 관측되지 않았다 (R2=0.002, P=0.99, Pearson 상관관계). 상관관계의 결여는 비-임신한 대상체, 1차 삼 분기 임신한 여성, 2차 삼 분기 임신한 여성, 및 3차 삼 분기 임신한 여성을 포함한 모든 대상체에 대해 관찰될 수 있다. 도 4의 결과와 같이, 이것은 적모세포-유래된 DNA의 기원이 혈류 내의 혈구로부터 나온 것이라면 두 개가 상관되어 있을 것으로 기대하기 때문에 놀라운 것이다.
혈장 DNA가 버피 코트보다 훨씬 높은 비메틸%를 갖는다는 관찰과 혈장 및 버피 코트의 비메틸% 사이의 상관관계의 결여는 적모세포 메틸화 서명을 수반하는 순환하는 무세포 DNA가 순환하는 혈구로부터 유래되기 보다는 적혈구생성의 과정 동안 골수로부터 유래될 것 같다는 것을 시사한다. 따라서, 적모세포 메틸화 서명을 갖는 무세포 혈장 DNA는, 혈류 내의 유핵의 RBC의 수가 건강한 대상체 및 임신한 여성에서 아주 낮기 때문에 혈류 내 유핵의 RBC로부터 생성되어 지는 것과는 대조적으로 골수 내에서 생성된다. 그리고, 백혈구 (WBC)로부터 적모세포 메틸화 서명에의 기여는 매우 낮기 때문에, 이 기여는 적모세포 메틸화 서명을 갖는 무세포 혈장 DNA에 아무런 측정가능한 의존을 제공하지 않는다.
V. 적혈구생성의 활성의 측정으로 메틸화 수준
상기 관찰에 기반하여, 본 발명자들은 적모세포 DMR에서 비메틸%가 골수에서 적혈구생성의 활동을 반영할 것이라고 결정했다. 높은 비메틸%는 적혈구생성의 높은 활성을 나타낼 것이다. 환언하면, 혈장/혈청 내 적모세포 DNA의 분석은 골수의 액체 생검으로 역할할 것이다. 이 분석은 빈혈의 조사, 예를 들어 빈혈이 감소된 적혈구생성 (예를 들어 재생불량성빈혈), 불량성 적혈구생성 (예를 들어, 지중해빈혈에서 성숙된 RBC의 생산의 실패), 또는 증가된 RBC의 소비 (예를 들어 혈액 손실 및 용혈성 빈혈)에 기인한 것인지를 결정하는데 특히 유용할 수 있다. 이를 위해, 본 발명자들은 35명의 건강한 대상체 및 75명의 상이한 병력을 갖는 빈혈 환자를 동원했다. 말초 혈액 샘플 수집 및 처리, 혈장 및 버피 코트 DNA 추출 및 DNA의 바이설파이트 전환이 수행되었다. 방법에 대한 추가의 세부사항은 XII 부분에 기재되어 있다.
A. 건강한 대상체의 혈장에서 무세포 적혈구 DNA의 측정
본 검정의 특이성을 확인한 후, 본 발명자들은 이들 검정을 사용하여 건강한 대상체의 혈장을 분석하였다. 본 발명자들은 또한 버피 코트 샘플을 제공한 20명 대상체의 동일한 그룹을 포함한 35명의 건강한 대상체의 혈장에서 E%(FECH)를 분석했다. 혈장 DNA의 중앙 E%(FECH)는 30.1% (사분위간 범위: 23.8 - 34.8%)였다. 이것은 적혈구 DNA가 건강한 개체의 혈장에서 순환하는 DNA 풀의 상당한 비율을 구성한다는 것을 제안했다. 혈장 적혈구 DNA의 기원을 결정하기 위해, 본 발명자들은 20명의 건강한 대상체의 버피 코트와 혈장 내 상응하는 E%(FECH) 결과를 비교했다.
도 6a 및 6B는 건강한 대상체에서의 적혈구 DNA의 백분율 (E%(FECH))을 도시한다. 도 6a는 건강한 대상체의 버피 코트 DNA 및 혈장 DNA 내 E%를 도시하고, 여기서 E%의 값은 버피 코트 (세포 부분)에서보다 혈장 (무세포 부분)에서 더 높다. 혈장 DNA 내 중앙 E% (중앙: 26.7%, 사분위간 범위: 23.7 - 30.4%)는 쌍으로 된 버피 코트 DNA 내의 것 (중앙: 2.2%, 사분위간 범위: 1.2 - 3.1%)보다 상당히 더 높았다 (P < 0.0001, Wilcoxon 징후의 등급 시험).
도 6b는 상응하는 건강한 대상체의 버피 코트 DNA 및 혈장 DNA 내의 E% 사이의 상관관계의 결여를 도시한다. 혈장 DNA 및 버피 코트 DNA 내의 쌍으로 된 E%(FECH) 결과 사이의 상관관계의 결여가 있었다 (r = 0.002, P = 0.99, Pearson 상관관계). 도 6a 및 6B에서의 양 발견은 순환하는 적혈구 DNA가 말초 혈액 내 순환하는 적혈구모세포로부터 우세하게 유래되기가 쉽지않았다는 것을 나타낸다.
도 7은 혈장 DNA 내 E%(FECH) 결과와 건강한 대상체의 나이 사이의 상관관계의 결여를 도시한다. 플롯은 E%(FECH) 결과가 대상체의 나이와 상관되지 않는다는 것을 나타낸다 (r=0.21, p=0.23, Pearson 상관관계).
B. 베타-종증성 지중해 빈혈과 재생불량성빈혈 환자 사이의 식별력
혈장 내 적혈구 DNA가 순환계 내의 온전한 적혈구모세포로부터 우세하게 방출되지 않았다는 것을 결정한 후, 본 발명자들은 이들 DNA 분자가 적혈구생성 과정에서 골수로부터 보다 방출되기 쉽다는 것을 제안했다. 본 발명자들은 혈장 내 적혈구 DNA의 정량 분석이 골수 내 적혈구생성 활성에 대한 정보를 제공할 수 있을 것이라고 추론했다.
혈장을 이용하여 골수 내 적혈구생성의 활성을 측정하는 능력을 확인하기 위해, 베타-종증성 지중해 빈혈 및 재생불량성빈혈로부터 고통받고 있는 환자를 홍콩의 프린스 오브 웨일즈 병원의 의약 부서에서 동원하였다. 수혈 전에 정맥 혈액 샘플을 채취했다. 혈장 DNA의 비메틸%는 각각의 환자에 대한 디지털 PCR에 의해 결정되었다. 이들 결과는 헤모글로빈 수준과 상관 관계가 있었다. 헤모글로빈 수준은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기술, 예를 들어 자동화 혈구 카운터에서 수행되는 측광 기술을 통해 측정될 수 있다. 헤모글로빈 수준은, 예를 들어, 원심분리 후에 수득된 RBC 부분으로부터 측정될 수 있다.
이들 두 그룹의 환자 (베타-종증성 지중해 빈혈 및 재생불량성빈혈)는 2개의 상이한 적혈구생성 활성의 스펙트럼을 나타낸다. 베타-종증성 지중해 빈혈이 있는 환자에서 적혈구생성은 매우 활성적이다. 그러나, 기능적 베타-글로빈 사슬의 불량성 생산에 기인하여, 성숙한 RBC의 생산이 감소된다. 재생불량성빈혈이 있는 환자에서 적혈구생성이 감소되어 RBC의 감소된 생산을 야기한다.
도 8은 본 발명의 구현예에 따라 재생불량성빈혈, 베타-종증성 지중해 빈혈이 있는 환자, 및 건강한 대조군 대상체에서 헤모글로빈 농도에 대한 비메틸%의 플롯이다. 베타-지중해빈혈 환자에서, 헤모글로빈 농도는 감소 되었지만, 비메틸%는 건강한 대조군 대상체와 비교하여 상당히 증가되었다 (P<0.01, Mann-Whitney 등급-합 시험). 사실상, 11명의 베타-지중해빈혈 환자 중의 10명 (89%)에서의 비메틸% 값은 모든 건강한 대조군 대상체의 값보다 더 높았다. 이 관찰은 이들 환자에서 증가된 그러나 불량성인 적혈구생성과 일치한다.
그에 반해서, 규칙적 수혈을 받는 재생불량성빈혈이 있는 환자 6명에 대하여, 이들의 비메틸% 값은 모든 건강한 대조군 대상체의 값보다 낮았다. 이 관찰은 이들 환자에서 감소된 적혈구생성과 일치한다.
임상 차도가 있는 3명의 재생불량성빈혈 환자에 대해, 이들의 헤모글로빈 수준은 정상이며 규칙적 수혈을 필요하지 않았다. 이들의 비메틸% 값은 건강한 대조군 대상체의 값과 유의성 있는 차이가 없었다 (P=0.53, Mann-Whitney 등급-합 시험). 따라서 혈장 내 적모세포-특이적 DNA의 정량 분석은, 예를 들어 재생불량성빈혈이 차도가 있는지 여부를 결정하기 위해 골수 기능이상이 있는 환자의 모니터링에 유용할 것이다. 또한, 적모세포-특이적 DNA의 정량 분석은 치료를 안내하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 차도가 없는 재생불량성빈혈을 가진 환자는 규칙적 수혈로 치료될 수 있다.
따라서, 비메틸%는 지중해빈혈 환자에서 더 높고 재생불량성빈혈 환자에서 낮다. 지중해빈혈의 경우, 환자는 빈혈이 있고 골수가 순환계에 더 많은 RBC를 생성하기를 요구하기 때문에 골수는 활성이다. 따라서 적혈구생성의 속도는 빈혈이 없는 건강한 대상체보다 더 높다. 재생불량성빈혈이 있는 환자의 경우, 빈혈은 RBC의 감소된 생산에 기인한다. 전반적으로, 이들 결과는 적모세포-특이적 메틸화 프로파일의 분석이 골수 내 적혈구생성 활성을 반영하는데 유용할 수 있다는 것을 나타낸다.
환자는 헤모글로빈 측정과 비메틸%의 조합을 통해 진단될 수 있다. 예를 들어, 11.8 이하의 헤모글로빈과 50 이상의 E%가 환자는 β-지중해빈혈로 분류될 수 있다. 반면에, 11.8 이하의 헤모글로빈 및 25 이하의 E%가 환자는 재생불량성빈혈을 갖는 것으로 분류될 수 있다.
C. 철 결핍성 빈혈 및 치료
빈혈은 영양소 (예를 들어 철, B12, 폴레이트, 등)의 결핍, 혈액 손실 (예를 들어 월경과다 또는 위장관으로부터의 출혈에 기인함) 또는 만성 장애 (예를 들어 암, 염증성 장 질환)에 기인할 수 있다.
도 9는 철 (Fe) 결핍 빈혈 및 급성 혈액 손실이 있는 환자에서 혈장 비메틸%의 플롯이다. 철 결핍성 빈혈이 있는 환자 3명과 급성 위장 혈액을 나타내는 환자가 연구되었다. 두 명의 철 결핍 환자에서, 빈혈은 월경과다에 기인했다. 한 명의 환자의 경우 철 보충을 시작하기 전에 혈액 샘플을 채취했다. 다른 한 명의 경우, 혈액 샘플은 철 보충 요법을 시작한 후 1주에 수집되었다. 세 번째 철 결핍성 빈혈 환자는 염증성 장 질환으로 고통받았고, 혈액 샘플은 철 보충을 시작한 후에 수집되었다.
혈장 비메틸%은 각각의 환자에 대해 결정하였고 건강한 대조군 대상체의 값과 비교하였다. 증가된 혈장 비메틸%는 급성 위장관 출혈이 있는 환자에서 관측되었다. 철 보충 요법 시작 전에 수집된 샘플을 갖는 두 명의 철 결핍된 환자의 경우, 이들의 혈장 비메틸% 값은 낮은 헤모글로빈 수준을 가졌음에도 불구하고 건강한 대상체와 비교하여 증가되지 않았다. 철 보충 시작 1주 후에 수집된 샘플을 갖는 Fe 결핍된 환자의 경우, 증가된 혈장 비메틸%이 관측되었다.
이들 결과는 혈장 비메틸%가 치료에 반응하여 적혈구생성 활성을 반영한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 철 보충물의 치료는 증가된 적혈구생성 활성을 보여준다. 또한, 이들 결과는 비메틸%에서의 반응이 헤모글로빈 수준에서의 상승보다 빠르다는 것을 보여준다. 비메틸%의 사용은 그와 같은 치료가 효과적인지 여부, 그리고 따라서 그것이 계속되어야하는지 또는 중단되어야하는지의 여부의 초기 식별자일 수 있다. 따라서 비메틸%는 헤모글로빈 수준의 변화가 관찰되기 전에, 빈혈의 치료, 예를 들어 철 요법에 대한 반응을 예측하는 가이드를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 혈장 비메틸%는 빈혈에 대한 치료에 대한 반응을 반영하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 철 결핍성 빈혈이 있는 환자의 경우, 경구 철 보충물에 대한 반응은 장관을 통한 철 흡수에서의 변화 때문에 상이한 대상체에 걸쳐 다를 수 있었다. 그와 같은 시나리오에서, 경구 철 보충을 시작한 후 혈장 비메틸%에서의 증가의 결여는 정맥내 철 요법에 대한 필요성을 나타내기 위해 사용될 수 있다.
D. 다양한 빈혈 장애들 중 식별력
본 발명자들은 재생불량성빈혈 (AA), 만성 신부전 (CRF), 만성 혈액 손실에 기인한 철-결핍 빈혈, 및 β-종증성 지중해 빈혈로부터 고통받고 있는 빈혈 환자를 동원했다. 골수에서 적혈구생성 활성 범위의 2개의 말단을 나타내는 상이한 질환 독립체를 동원했다.
도 10은 본 발명의 구현예에 따라 재생불량성빈혈, 만성 신부전 (CRF), 베타-종증성 지중해 빈혈, 철 결핍성 빈혈이 있는 환자 및 건강한 대상체 중에서 헤모글로빈 수준과 혈장 내 적혈구 DNA의 백분율 (E%(FECH)) 사이의 관계를 도시한다. 빈혈 환자 및 35명의 건강한 대조군에 대한 혈장 DNA의 E%(FECH)는 헤모글로빈 수준에 대해서 플롯되었다. 수평 점선은 건강한 대상체의 중앙 E%를 나타낸다. 수직선은 빈혈이 있는 대상체와 빈혈이 없는 대상체 사이의 측정된 헤모글로빈 수준의 컷오프 값 (도시된 바와 같이, 11.5)에 상응한다.
본 발명자들은 진단 기준 (28)을 충족하였고 면역억제성 요법에 반응하지 못한 13 AA 환자에서 혈장 DNA의 E%를 분석했다. AA 그룹의 혈장 DNA의 중앙 E%는 12.4%였고 (사분위간 범위: 7.5 - 13.7%), 이것은 건강한 대조군의 것보다 상당히 낮았다 (P < 0.0001, Mann-Whitney 등급 합 시험; 도 10). 유사하게, 투석을 요하는 18 CRF 환자의 중앙 E% 결과는 16.8%였고 (사분위간 범위: 12.2 - 21.0%), 이것은 또한 건강한 대조군의 것보다 상당히 낮았다 (P < 0.0001, Mann-Whitney 등급 합 시험; 도 10). 이들 발견은 AA (28, 29)와 CRF 환자 (30)에서 감소된 적혈구생성 활성의 병리생리학과 일치한다.
β-종증성 지중해 빈혈이 있는 환자의 경우, 골수는 증가되었지만 효과 없는 적혈구생성으로 저산소증 스트레스를 보상하려고 시도하고 있다 (31). 동원된 β-종증성 지중해 빈혈 환자 17명 중, 혈장 DNA의 중앙 E%는 65.3%였고 (사분위간 범위: 60.1 - 78.9%), 이것은 건강한 대조군의 것보다 상당히 더 높았다 (P < 0.0001, Mann-Whitney 등급 합 시험; 도 10).
철 결핍성 빈혈이 있는 대상체에 대해, 본 발명자들은 월경과다 또는 위궤양 질환에 기인한 철 결핍성 빈혈 (트랜스페린 포화 < 16% 또는 혈청 페리딘 수준 < 30 ng/ml)로 고통을 받는 11명의 환자를 동원했다. 이들의 혈장 DNA의 중앙 E%는 37.8%였고 (사분위간 범위: 31.8 - 43.0%), 이것은 건강한 대조군의 것보다 상당히 더 높았다 (P = 0.002, Mann-Whitney 등급 합 시험; 도 10). 본 발견은 만성 혈액 손실에 대한 반응으로서의 골수 적혈구생성 활성에서 보상성 증가에 의해 설명될 수 있다 (32).
따라서, 환자는 헤모글로빈 측정 및 E%의 조합을 통해 진단될 수 있다. 예로서, 11.5 (또는 다른 값) 이하의 헤모글로빈 및 50 초과의 E%를 갖는 환자는 증가된 적혈구생성 활성의 빈혈, 예를 들어, β-지중해빈혈을 갖는 것으로 분류될 수 있다. 반면에, 11.5 이하의 헤모글로빈 수준 및 50 이하 및 28 초과의 E%를 갖는 환자는 중간 적혈구생성 활성의 빈혈, 예를 들어, 철 결핍된 빈혈을 갖는 것으로 분류될 수 있다. 그리고 11.5 이하의 헤모글로빈 수준 및 28 이하의 E%를 갖는 환자는 감소된 적혈구생성 활성의 빈혈, 예를 들어, 재생불량성빈혈 또는 만성 신부전을 갖는 것으로 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, 혈액 장애의 분류를 결정하기 위해, 혈액 샘플의 헤모글로빈 수준이 측정될 수 있다. 헤모글로빈 수준은 헤모글로빈 역치 (예를 들어, 11.5)에 비교될 수 있다. 혈액 장애의 분류는 따라서 메틸화 수준에 부가하여, 추가로 헤모글로빈 역치에 헤모글로빈 수준을 비교하는 것에 기반될 수 있다.
대상체의 E%(FECH), 적혈구, 및 망상적혈구 파라미터의 요약은 각각 표 5 & 6과 도 11a 및 11B에 도시되어 있다.
건강한 대상체 및 빈혈 환자의 혈장 DNA 내 적혈구 DNA의 중앙 백분율 (E%(FECH))을 요약한 표.
E% (FECH) 중앙 E% (사분위간 범위)
건강한 대조군 30.1% (23.8 - 34.8%)
재생불량성빈혈 -
치료에 비-반응성 		12.4% (7.5 - 13.7%)
재생불량성빈혈 -
치료에 반응성 		22.5% (17.2 - 27.1%)
만성 신부전 16.8% (12.2 - 21.0%)
철 결핍성 빈혈 37.8% (31.8 - 43.0%)
β-종증성 지중해 빈혈 65.3% (60.1 - 78.9%)
골수이형성 증후군 50.3% (37.4 - 60.8%)
아래 표 6에서, 중앙 값 및 사분위간 범위 (괄호로 묶음)가 도시되어 있다. 하기 약어가 사용된다: Hct로는 적혈구용적률, MCV로는 평균 혈구 용적, MCH로는 평균 세포 헤모글로빈, MCHC로는 평균 세포 헤모글로빈 농도, 그리고 RDW로는 적혈구 분포 폭.
동원된 건강한 대조군 및 빈혈 환자의 적혈구 (RBC) 파라미터.
건강 및 질환 상태 RBC 수
(x1012/L)		 Hct
(L/L)		 MCV
(fL)		 MCH
(pg)		 MCHC
(g/dL)		 RDW
(%)
건강한 대조군 4.60
(4.36 - 4.95)		 0.412
(0.396 - 0.437)		 91.2
(87.5 - 94.1)		 30.0
(29.1 - 31.2)		 33.1
(32.5 - 33.7)		 13.3
(12.8 - 13.6)
재생불량성빈혈 2.49
(2.37 - 2.74)		 0.244
(0.238 - 0.285)		 97.8
(89.4 - 103.1)		 34.0
(31.2 - 35.5)		 34.5
(33.8 - 34.8)		 17.9
(14.5 - 21.5)
만성 신부전 2.82
(2.63 - 3.22)		 0.252
(0.222 - 0.269)		 87.2
(83.1 - 92.9)		 29.3
(27.5 - 30.9)		 33.2
(32.5 - 33.7)		 15.6
(14.2 - 17.1)
철 결핍성 빈혈 4.04
(3.90 - 4.31)		 0.272
(0.253 - 0.311)		 66.6
(65.1 - 70.8)		 19.9
(19.5 - 21.7)		 30.2
(30.1 - 30.7)		 18.6
(17.5 - 20.0)
β-종증성 지중해 빈혈 3.19
(3.08 - 3.41)		 0.253
(0.248 - 0.282)		 81.0
(77.4 - 81.8)		 27.3
(26.3 - 28.1)		 33.9
(33.4 - 34.1)		 16.7
(14.4 - 18.2)
골수이형성 증후군 2.31
(2.16 - 2.50)		 0.218
(0.207 - 0.238)		 89.9
(86.3 - 99.8)		 30.4
(29.0 - 33.6)		 33.7
(33.0 - 33.8)		 19.6
(16.0 - 22.7)
도 11a 및 11b는 재생불량성빈혈, 만성 신부전 (CRF), β-종증성 지중해 빈혈, 및 철 결핍성 빈혈이 있는 빈혈 환자 중에서 망상적혈구 수/지수와 헤모글로빈 수준 사이의 관계를 도시한다. 망상적혈구 지수는 다음과 같이 계산된다: 망상적혈구 수 × 적혈구용적률/ 정상 적혈구용적률. 도시된 바와 같이, 혈액 내 망상적혈구 (미성숙한 RBC)의 양은 상이한 질환들 중에서 신뢰할 수 있는 식별력을 제공하지 않는다. 이들 결과는 망상적혈구 수 및 망상적혈구 지수가 상이한 병인의 빈혈을 구별, 예를 들어, 재생불량성빈혈로부터 지중해빈혈을 구별할 수 없다는 것을 나타낸다.
E. 골수이형성 증후군 및 진성적혈구 과다증
도 12는 골수이형성 증후군 및 진성적혈구 과다증이 있는 환자 내 혈장 비메틸%의 플롯이다. 골수이형성 증후군 환자에서, 증가된 혈장 비메틸%은 감소된 헤모글로빈 수준과 함께 관측되었다. 증가된 혈장 비메틸%는 또한 진성적혈구 과다증이 있는 환자에서 관측되었다. 이들 결과는 혈장 내 적혈구모세포의 DNA 메틸화 서명의 검출 및 정량화가 골수아세포 세포를 포함한 골수의 비정상 증식 또는 이형성증의 검출 및 모니터링에 유용하다는 것을 나타낸다.
따라서, 알 수 있는 바와 같이, 이들 2개의 혈액 장애는 또한 적혈구모세포의 더 높은 무세포 DNA를 나타내고, 그렇게 함으로써 혈액 장애의 검출이 가능하다. 일부 구현예에서, 정확한 진단은 골수 생검의 조직학적 검사에 기초할 수 있다. 따라서 높은 비메틸%를 검출하기 위한 반응으로 골수 생검을 수행할 수 있다. 유사하게, 빈혈은 존재하지만, 영양 결핍, 예를 들어 철 결핍, 비타민 B12 결핍, 또는 폴레이트 결핍의 부재에서 낮은 비메틸%를 검출하기 위한 반응으로 골수 생검을 수행할 수 있다. 골수 생검을 위한 그와 같은 기반은 골수의 건강상태를 여전히 모니터링하면서 이러한 생검의 횟수를 줄일 수 있다. 따라서 비메틸%는 치료 반응을 모니터하는 데 더 유용할 것이다.
F. 빈혈에 대한 다른 식별력
다른 질환들 사이의 식별이 또한 가능하다.
1. 재생불량성빈혈 (AA) 및 골수이형성 증후군 (MDS)
재생불량성빈혈 및 MDS 둘 모두는 골수 손상 상태이다. 범혈구감소증의 그것의 유사한 임상적 특징에도 불구하고, 이 두 질환 독립체는 상이한 병리생리학적 기전을 갖는다. AA에는, 이형성증의 특징이 없는 저세포 골수가 있다. MDS에는, 하나의 또는 다수의 계통을 포함한 과세포 골수 및 이형성증이 일반적으로 있지만 (33), 저세포 MDS도 또한 인식되어 있다.
도 13a는 본 발명의 구현예에 따른 재생불량성빈혈 (AA) 및 골수이형성 증후군 (MDS)이 있는 환자들 사이의 혈장 내 적혈구 DNA의 백분율 (E%(FECH))을 나타낸다. 8명의 MDS 환자에서 혈장 DNA의 중앙 E%는 50.3% (범위: 37.4 - 60.8%)였다. 두 가지 사례는 단계열 이형성증이 있는 MDS를 가졌고, 4 사례는 다계열 이형성증을 가졌고, 2 사례는 과다 모세포가 있는 MDS를 가졌다 (34). 이들의 이전의 모든 골수 생검은 적혈구 과다 세포가 관찰되었다. MDS 환자의 중앙 E%는 13명의 동원된 AA 환자의 것보다 상당히 더 높았다 (P < 0.0001, Mann-Whitney 등급 합 시험; 도 13a). MDS 환자 중 더 높은 중앙 E% 결과는 골수 생검 발결 및 MDS에서의 비효율적인 적혈구생성의 병리생리학과 일치한다.
따라서, MDS는 E% 또는 다른 메틸화 수준을 사용하여 재생불량성빈혈과 구별될 수 있다. 예를 들어, 30의 컷오프 값은 재생불량성빈혈 또는 MDS에 상응하는 것으로 샘플을 분류하는 데 사용할 수 있다.
2. AA의 치료 반응성 및 치료 비-반응성 군
도 13b는 본 발명의 구현예에 따른 재생불량성빈혈에서 치료-반응성 및 치료 비-반응성 군 사이의 혈장 내 적혈구 DNA의 백분율 (E%(FECH))을 나타낸다. 본 발명자들은 면역억제성 요법에 반응하고, 그렇게 함으로써 헤모글로빈 수준을 증가시킨 재생불량성빈혈 환자 8명을 추가로 분석하였다. 치료-반응성 군의 혈장 DNA의 중앙 E%는 22.5% (사분위간 범위: 17.2 - 27.1%)였고, 이것은 비-반응성 군의 것 (중앙: 12.3%; 사분위간 범위: 7.5 - 13.7%)보다 더 높았다 (P = 0.0003, Mann-Whitney 등급 합 시험; 도 13b). 치료-반응성 군과 건강한 대조군의 E% 결과 간에는 적은 유의미한 차이가 있었다 (P = 0.01, Mann-Whitney 등급-합 시험).
이들 결과는 골수에서 적혈구생성 활성의 회복을 반영한다. E%의 회복은 헤모글로빈 수준보다 일찍 나타날 수 있으므로, E%는 환자가 면역억제성 요법에 반응하는지 여부를 조기에 결정하기 위해 사용될 수 있다. 환자가 반응하지 않을 때, 예를 들어, 줄기 세포 이식을 수행하거나 또는 골수 자극제 (예를 들어, 사르그라모스팀, 필그라스팀, 및 페그필그라스팀)를 처방하는 것과 같은 다른 치료 (예를 들어, 보다 공격적인 치료)가 추구될 수 있다.
G. 백혈병
백혈병 이외의 다른 혈액 장애는 또한 FECH와 같은 적모세포-특이적 DMR을 사용하여 검출될 수 있다.
도 14는 본 발명의 구현예에 따른 정상 대상체 및 2명의 백혈병이 있는 환자에서 헤모글로빈 농도에 대한 혈장 내 비메틸%의 플롯이다. 비메틸%는 FECH DMR을 사용하여 결정된다. 백혈병 또는 골수증식성 장애가 있는 환자의 혈장 내 비메틸% 값은 정상 대상체의 혈장에서 중앙 비메틸%다 더 높다. 이 관찰은 백혈병이 있는 환자에서 증가되었지만 결핍성인 적혈구생성의 것인 관찰과 일치한다. 따라서, 비메틸%에 대한 약 45의 컷오프 값은 건강한 대상체와 백혈병을 갖는 대상체를 구별하여, 그렇게 함으로써 혈액 장애의 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 헤모글로빈 수준이 또한 사용될 수 있는데, 그 예는 8 이하의 헤모글로빈을 갖는 환자는, 일반적으로 도 10에서 나타낸 바와 같이 8 내지 11.8 사이의 헤모글로빈 수준을 갖는 베타-지중해빈혈과는 대조적으로 백혈병을 갖는 것으로 확인될 수 있다.
IV. 다른 메틸화 마커에 대한 결과
본 발명자들은 FECH 유전자-관련된 DMR로부터 상기 E% 결과를 검증하기 위해 샘플의 서브셋의 혈장 내 다른 두 개의 DMR에 기초하여 E%를 분석하였다. 건강한 대상체와 재생불량성빈혈 및 β-종증성 지중해 빈혈 환자 사이의 혈장 내 적혈구 DNA의 백분율의 유사한 차이는 FECH 유전자 내 DMR로 다른 두 개의 적모세포-특이적 DMR을 사용하여 관측되었다.
A. 다른 두 개의 적모세포-특이적 DMR
염색체 12 상에 위치한 다른 두 개의 DMR이 또한 저메틸화된다. 이들 두 개의 DMR과 연관된 게놈 영역은 이전에 임의의 주석을 단 유전자 내에서 확인되지 않았다.
도 15a 및 15b는 본 발명의 구현예에 따른 염색체 12 상의 적모세포-특이적 DMR 내의 CpG 부위의 메틸화 밀도를 도시한다. 도 15a는 3개의 부위를 포함하는, 염색체 12상의 게놈 좌표: 48227688 - 48227701에서의 영역 (1510)을 도시한다. 도 15b는 또한 3개의 부위를 포함하는, 염색체 12상의 게놈 좌표: 48228144 - 48228154에서의 영역 (1560)을 도시한다. 게놈 좌표는 인간 참조 게놈 hg19에 해당한다. 음영 영역 내에 위치한 선택된 CpG 부위는 모두 적혈구모세포에서 저메틸화되었지만, 다른 조직 또는 세포 유형에서는 과메틸화되었다. 다른 조직은 폐, 결장, 소장, 췌장, 부신, 식도, 심장 및 뇌를 나타낸다.
이들 두 개의 다른 적모세포-특이적 DMR은 Ery-1 및 Ery-2로 표지된다. 다른 두 개의 DMR에 기반된 E% (chr 12: 48227688 - 48227701 및 chr 12: 48228144 - 48228154)는 각각 E%(Ery-1) 및 E%(Ery-2)로 표시될 수 있다.
도 16은 ENCODE 데이터베이스로부터 두 개의 다른 적모세포-특이적 DMR (Ery-1 및 Ery-2)에 대한 히스톤 변형 (H3K4me1 및 H3K27Ac)을 도시한다. 본 발명자들은 ENCODE 데이터베이스로부터 적모세포 세포 유형 내 이들 두 개의 DMR에 대한 히스톤 변형 및 CHIP-seq 데이터세트 상에서 공공연하게 이용가능한 데이터를 검토했다. Ery-1 및 Ery-2 DMR은 두 개의 인핸서-관련된 히스톤 변형 (H3K4me1 및 H3K27Ac)에 의해 마킹되는데, 이는 조절 기능, 특히 인핸서의 조절 기능을 시사한다. 최근접한 다운스트림 유전자는 대략 15kb 떨어진 HDAC7 유전자이다.
B. 적모세포-농축 샘플
본 발명자들은 이전에 기재된 8개의 탯줄 혈액 샘플로부터 적모세포-농축 샘플에서 다른 두 개의 DMR을 기반으로 한 적혈구 DNA의 백분율을 분석했다. 풀링된 샘플로부터 추출된 DNA의 E%(Ery-1) 및 E%(Ery-2)는 66.5%와 68.5%였다. 이들 E% 값은 FECH 유전자-관련된 DMR에 기반한 E%, 즉 67%와 유사하였다. 3개의 DMR 모두로부터 유사한 발견이 주어지면, 농축 프로토콜의 불완전한 선택성으로 인해 기대보다 낮은 E% 값 (즉, 농축이 수행될 때 기대된 값보다 낮음)이 될 수 있다.
C. β-종증성 지중해 빈혈 환자의 버피 코트 내 E% 대 적혈구모세포의 상관관계
두 개의 DMR에 기초한 적혈구 DNA의 백분율을 β-종증성 지중해 빈혈 환자의 동일한 군의 버피 코트 DNA에서 분석하였다. 버피 코트 DNA에서 두 개의 DMR에 대한 E%는 도 도 3a와 유사한 방식으로 적혈구모세포의 백분율과 잘 상관되었다.
도 17a 및 17b는 Ery-1 마커 (도 17a) 및 Ery-2 마커 (도 17a)를 표적화하는 디지털 PCR 검정에 의해 측정된 β-종증성 지중해 빈혈 환자의 버피 코트 DNA 내 적혈구 DNA 서열의 백분율 (E%)과 자동화 혈액 분석기를 사용하여 측정된 모든 주변 백혈구 중 적혈구모세포의 백분율 사이의 상관관계를 도시한다. 버피 코트 DNA 내 E%(Ery-1) 및 E%(Ery-2)는 혈액 분석기에 의해 측정된 주변 백혈구 중 적혈구모세포의 백분율과 잘 상관되었다 (r = 0.938 & r = 0.928, 둘 모두 P < 0.0001, Pearson 상관관계).
도 18a 및 18b는 β-종증성 지중해 빈혈 환자의 버피 코트 DNA 내 E%(FECH) 결과와 E%(Ery-1) 및 E%(Ery-2)의 상관관계를 도시한다. 이들 두 개의 DMR로부터 유래된 E% 결과는 15명의 β-종증성 지중해 빈혈 환자의 버피 코트 DNA 내의 FECH 유전자 마커 부위로부터 유래된 쌍으로 된 E% 결과와 또한 잘 상관되었다.
D. 건강한 대상체 및 빈혈 환자의 혈장 내 E%
본 발명자들은 건강한 대상체와 재생불량성빈혈 및 β-종증성 지중해 빈혈이 있는 환자의 혈장 DNA 내 E%(Ery-1) 및 E%(Ery-2)를 분석했다. 건강한 대상체, 7명의 재생불량성빈혈, 및 9명의 β-종증성 지중해 빈혈 환자의 동일한 군 내 세 개의 적모세포-특이적 DMR에 기반한 E% 결과가 분석되었다.
도 19는 본 발명의 구현예에 따라 세 가지 적모세포-특이적 DMR을 표적화하는 디지털 PCR 분석을 사용하여 건강한 대상체와 재생불량성빈혈 및 베타-종증성 지중해 빈혈이 있는 환자에서 적혈구 DNA의 백분율을 도시한다. 13명의 건강한 대상체의 혈장 DNA 내 중앙 E%(Ery-1)는 16.7% (사분위간 범위: 10.9 - 23.5%)였고 건강한 대상체의 동일한 군 내 중앙 E%(Ery-2)는 25.0% (사분위간 범위: 22.2 - 27.3%)였다. Ery-1 마커에 기초하여, 재생불량성빈혈 및 β-종증성 지중해 빈혈이 있는 환자의 E%(Ery-1)는 각각 13.78% 및 61.69%였다. Ery-2 마커에 기초하여, 재생불량성빈혈 및 β-종증성 지중해 빈혈이 있는 환자의 E%(Ery-2)는 각각 14.13% 및 64.95%였다. 건강한 대상체와 재생불량성빈혈 및 β-종증성 지중해 빈혈 환자 사이의 혈장 내 적혈구 DNA의 백분율에서 유사한 차이가 FECH 유전자 내 적모세포-특이적 DMR과 같은 두 개의 적모세포-특이적 DMR을 사용하여 관측되었다.
VII. 치료 결과
상기에 기재된 바와 같이, E%는 빈혈에 대한 치료 효능을 모니터하기 위해 사용될 수 있다.
A. 철 요법 전후 철 결핍성 빈혈 환자에서 혈장 DNA 내 E%(FECH)의 측정
본 발명자들은 경구용 철로부터 위장 부작용에 대한 불내성이 기인하여 정맥내 철 요법을 받은 4명의 철 결핍성 빈혈 환자에서 혈장 DNA의 헤모글로빈 수치, 망상적혈구 수 및 E%의 연속적인 변화를 모니터링했다. 경구용 철 요법에 대한 환자 대신에, 본 발명자들은 다양한 위장 흡수에 기인한 상이한 치료 반응의 가능한 교란 인자를 피하기 위해 이 환자군에서의 변화를 관찰하는 것을 선택한다. 본 발명자들은 치료 전과 치료 후 2일째에 이들 파라미터를 측정했다.
도 20a 및 20b는 본 발명의 구현예에 따라 치료-전 상태와 치료 후 2일째에 정맥내 철 요법을 받은 철 결핍성 빈혈의 혈장 DNA 내 적혈구 DNA의 백분율 (E%(FECH)) 및 망상적혈구 수의 백분율의 연속적인 측정을 도시한다. 도 20a는 혈장 DNA의 E%의 연속적인 변화를 도시한다. 도 20b는 망상적혈구 수의 백분율의 연속적인 변화를 도시한다.
대상체 1을 제외하고, 혈장 DNA의 E% 및 망상적혈구 수는 증가하였고, 반면 헤모글로빈 수준은 치료의 시작 직후에 초기로 정적 유지되었다. 헤모글로빈 수준에서의 최종적인 변화에 관하여, 대상체 3 및 4는 결국 각각 84.7%와 75.3%의 수준으로 급격한 변화를 가졌다. 대상체 2는 치료 후 헤모글로빈 측정을 위한 추가 샘플을 제공하지 않았으며, 추적 조사를 실패했다. 혈장 DNA의 E%에서 최소 변화를 갖는 대상체 1은 헤모글로빈 수준에서 가장 적게 증가했다 (12.2%). 따라서, 혈장 DNA의 E%에서의 변화는 철 요법에 대한 골수 적혈구생성 활성에서의 동적 반응을 입증할 수 있으며, 치료에 대한 환자 반응의 초기 예측변수로 사용될 수 있다.
대상체 1의 망상적혈구 수에서의 증가의 결여는 RBC 생산이 철 요법에 적절하게 반응하지 않았음을 시사한다. 철 요법에 대한 반응의 결여는 또한 골수 활성에 해당하는 E%에서 증가의 결여에 의해서도 반영될 수 있다. 그러나, 대상체 1의 경우 철 요법의 개시 전의 헤모글로빈 수준이 다른 3명의 대상체의 것보다 더 높았으며 건강한 대상체의 참조 범위에 더 가까웠다. 대상체 1에서의 E%(FECH) 내 상승의 결여는 헤모글로빈 수준이 정상 수준으로부터의 더 적은 결손 때문에 골수에서 적혈구생성 활성에서의 보상성 증가의 부재를 반영할 수 있다. 대상체 1의 망상적혈구는 초기에 다른 대상체와 거의 동일하였고 따라서 골수 활성이 충분한 수준의 것임을 나타내지는 않았다. 따라서, 중간 적혈구생성 활성을 갖는 빈혈의 경우, 건강한 환자에 대한 정상의 상단에서의 E%는 치료에 대한 긍정적인 반응 또는 적어도 불확정한 반응을 나타낼 수 있으며, 따라서 그와 같은 사례에서 치료는 중단되지 않을 수 있다.
헤모글로빈 수준을 정상으로 되돌리려면, RBC 생산의 증가가 요구된다. 따라서 철 결핍성 빈혈에서 E%에 대한 정상 범위는 부적절한 것으로 간주될 수 있다. 대상체 2-4에 대한 E%의 증가는 정상군의 것에 대한 더 높은 범위의 E%로서, 철 요법 후 적절한 반응을 나타낼 수 있거나 (도 10 참조), 또는 그 바로 그 위의 범위로, 철 결핍성 빈혈이 있는 대상체에 대해 기대될 수 있다. 따라서 치료가 효과적인지 여부를 결정하기 위한 E%에 대한 역치는 E%에 대한 개시 값에 따라 달라질 수 있다. E%에 대한 역치는 초기 값에 대비한 값에서의 특정 변화를 특정할 수 있고, 변화의 양은 초기 값에 따라 달라질 수 있다.
철의 경구 치료의 효과가 또한 조사되었다. 예를 들어 월경과다에 기인한, 만성 혈액 손실이 있는 환자는 철 결핍성 빈혈이 생길 수 있다. 철 보충은 철 결핍 상태의 교정을 위해 사용될 수 있다.
도 21a는 본 발명의 구현예에 따라 경구 철 치료를 받은 월경과다에 기인한 철 결핍성 빈혈이 있는 환자에서의 적모세포 DMR에서 혈장 E%(FECH)의 연속적인 변화를 도시한다. 철 치료를 받은 철 결핍성 빈혈이 있는 환자의 혈장 내 E%는 철 치료 전과 치료 후 7일째에 분석되었다. 도 21a에서, 철 치료를 받은 후 E%에서의 증가가 있었다. 이들 결과는 혈장 E%가 치료에 대한 반응에서 적혈구생성 활성을 반영할 수 있었다는 것을 시사한다.
도 21b는 경구 철 치료 후 헤모글로빈에서의 변화를 도시한다. 헤모글로빈 수준은 여전히 극적으로 증가되지 않았고, 반면에 치료 후 동시 시점에서 E%(FECH)에서의 증가가 있었다. 이것은 치료가 효과적인지 여부의 초기 검출로서 E%가 사용될 수 있다는 것을 나타내는 도 20a에 유사하다.
B. 만성 신장 질환 (CKD)에 대한 치료
CKD 환자에서, 빈혈의 주요 원인은 신장 손상에 기인한 에리트로포이에틴 생산의 감소이다. 에리트로포이에틴은 낮은 조직 산소 수준에 반응하여 신장에 의해 생성되는 호르몬이다. 이것은 적혈구를 생성하도록 골수를 자극한다. 외인성 에리트로포이에틴은 CKD의 빈혈 치료에 사용된다.
도 22는 재조합 에리트로포이에틴 (EPO) 또는 적혈구생성-자극제 (ESA) 치료를 받은 만성 신장 질환 (CKD)이 있는 환자에서의 적모세포 DMR에서 혈장 비메틸%의 연속적인 변화를 도시한다. EPO 치료를 받은 일곱 명 CKD 환자의 혈장 내 비메틸%는 EPO 치료 전과 치료 7 내지 14일 후에 분석되었다. 상이한 형상 (색상)의 라인은 상이한 환자에 대응한다. 모든 환자는 EPO 치료를 받은 후 비메틸%의 증가를 나타냈다. 비메틸% 값은 상이한 환자에 대해 다양한 수준의 효능을 나타냈다. 이들 결과는 혈장 비메틸%가 치료에 반응하여 적혈구생성 활성을 반영한다는 것을 나타낸다.
C. 재생불량성빈혈에 대한 ATG 치료
재생불량성빈혈 환자의 면역억제성 요법은 환자의 60-70%에서 혈액성 회복을 초래할 수 있다 (문헌 [Young 등, Blood, 2006; 108(8):2509-2519]). 면역억제성 요법을 받은 재생불량성빈혈이 있는 환자 4명의 혈장 내 비메틸% 값을 면역억제성 요법 개시 전뿐만 아니라 요법 후 2개월 및 4개월에 분석되었다. 모든 환자는 치료에 반응하지 않았으며, 헤모글로빈 수준은 이 기간 동안 정상 수준으로 회복되지 않았다; 4명의 환자 모두는 규칙적 수혈이 필요했다.
도 23a는 본 발명의 구현예에 따라 면역억제성 요법으로 사이클로스포린 또는 항-흉선세포 글로불린 (ATG) 치료를 받은 재생불량성빈혈이 있는 환자에서의 적모세포 DMR에서 혈장 비메틸%의 연속적인 변화를 도시한다. 3명의 환자 중에서, 혈장 내 비메틸%에서의 변화는 없었다. 한 명의 환자는 비메틸%에서 유의미한 증가를 실증했다. 이것은 발작성 야행성 혈색소뇨증 (PNH) 클론의 증상, 즉 헤모글로빈을 함유하는 어두운 소변 배설의 출현과 동시에 발생했다. 그와 같은 증상은 비메틸%가 증가되었음에도 불구하고 환자가 치료에 반응하지 않는다는 것을 결정하는 데 사용될 수 있다. PNH는 재생불량성빈혈이 있는 환자에서 발생하는 것으로 공지되어 있으며 용혈성 빈혈의 병리생리학적 기전을 가진다. 비메틸%의 증가는 PNH로부터의 용혈의 결과로 적혈구생성 활성의 증가를 반영한다.
도 23b는 치료를 받는 재생불량성빈혈이 있는 환자의 헤모글로빈의 연속적인 변화를 도시한다. 헤모글로빈 수준은 상당하게 증가하지 않았다. 이들 결과는 혈장 비메틸%가 치료 과정 중 적혈구생성 활성의 변화를 반영한다는 것을 보여주며, 이는 모든 환자가, 도 23b에 도시된 헤모글로빈의 변화의 결여에 의해 예시된 바와 같이, 치료에 반응하지 않았기 때문에 적혈구생성 활성에서 변화하지 않는다.
도 24a 및 24b는 재생불량성빈혈이 있는 환자 4명에서 헤모글로빈 농도에 대한 혈장 내 비메틸%을 도시한다. 각각의 라인은 한 명의 환자에 해당하며 치료 전과 치료 4개월 후 비메틸% 및 헤모글로빈 수준에서의 변화를 추적한다. 도 23A는 PNH를 갖는 환자를 제외하고 비메틸%가 상당히 변화하지 않았음을 나타낸다. 도 23B는 헤모글로빈 수준이 변화하였으나 상당하지 않은 것을 나타낸다.
VIII. 적혈구 DNA의 절대 농도의 사용
혈장/혈청 내 적혈구 DNA의 양을 측정하기 위해, 비록 세포 계통에 특이적인 과메틸화 마커도 또한 존재하면 사용될 수 있지만, 일부 구현예는 저메틸화 마커에서 파라미터 E% (또한 일명 비메틸%)를 사용한다. E%는 샘플에서 (주로 과메틸화된) DNA의 총량에 대해 정규화된 적모세포 DNA의 양에 해당한다.
대안적인 파라미터는 혈장의 단위 용적당 적혈구 DNA의 절대 농도를 측정하는 것이다. E%의 계산을 위해, 구현예는 비메틸화된 DNA 절대 농도 및 메틸화된 DNA 절대 농도를 측정할 수 있다. 디지털 PCR 검정에서, 각각의 점은 (예를 들어, 도 2a 및 2B에 나타낸 바와 같이) 하나의 DNA 분자를 나타낼 수 있다. 메틸화 및 비메틸화된 DNA의 수는 직접적으로 카운트될 수 있다. 이전 부문에서, 정규화된 값 (예를 들어, E%)이 계산되었지만, 구현예는 또한 저메틸화 마커에 대한 비메틸화된 분자의 절대 농도 또는 과메틸화 마커에 대한 메틸화된 분자의 절대 농도를 사용할 수 있다.
도 25는 본 발명의 구현예에 따라 건강한 대상체 및 빈혈 환자에서의 FECH 유전자-관련 DMR (복제물/ml 혈장)에서의 적혈구 DNA의 절대 농도를 나타내는 박스-및-위스커 플롯을 예시한다. 박스들과 내부 라인들은 각각 사분위간 범위와 중앙 값을 나타낸다. 상단 및 하단 위스커는 최대 및 최소 값을 나타낸다.
도 25에서 나타낸 바와 같이, 다른 환자군 사이에 별개의 클러스터가 적혈구 DNA의 절대 농도를 사용하여 관측될 수 있었지만, 정규화된 값은 군들 간의 더 나은 분리를 허용한다. 이론적으로, 혈장의 E% 파라미터는 또한 비-적혈구 기원의 순환하는 DNA, 예를 들어, 골수- 또는 림프양-유래 DNA의 농도에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 다른 조혈 계통이 또한 영향을 받는 빈혈 상태 (예를 들어 재생불량성빈혈 또는 골수이형성 증후군)에서, 적혈구 DNA의 변경된 방출은 이들 사례 중 일부에서 마스킹될 수 있다.
IX. 다른 혈액 계통
혈액 평가를 위한 이 혈장 DNA-기반 접근법은 다른 혈액 세포 계통, 예를 들어 골수, 림프양, 및 거핵구성 시리즈의 마커에 대해 일반화될 수 있다. 혈액 계통-특정 DNA 메틸화 마커를 사용하는 이전의 연구는 전혈 또는 혈구에 집중되어 왔다 (문헌 [Houseman EA, 등, Current Environmental Health Reports 2015; 2: 145-154]). 위에 제시된 본 발명자들의 데이터는 혈장 DNA가 혈구에 존재하지 않는 정보를 포함하고 있음을 명확하게 보여준다. 그러므로, 여러 혈액 세포 계통에서의 후생유전자 마커를 사용한 혈장 DNA의 분석은 개인의 혈액 시스템에 관한 귀중한 진단 정보를 제공할 수 있다. 따라서 이것은 골수 생검의 비침습성 대체이다. 혈장 또는 혈청의 특정 세포 계통의 메틸화 서명을 구체적으로 검출하여 골수 내 다른 세포 계통의 활성을 모니터링할 수 있는 검정이 설계될 수 있다.
그와 같은 접근법은 비제한적으로 하기 장애를 포함하는, 많은 임상 시나리오의 평가에 유용할 것이다. 장애에 대한 관련된 계통의 예가 제공된다.
1. 혈액 악성 종양, 예를 들어, 백혈병 및 림프종 (림프양 세포 계통)
2. 골수 장애, 예를 들어 재생불량성빈혈, 골수섬유증 (골수 세포 및 림프양 세포 계통)
3. 면역계 및 그것의 기능의 모니터링: 예를 들어 질환 및 치료 동안 면역결핍 및 면역 반응의 탑재 (림프양 세포 계통)
4. 골수, 예를 들어 아자티오프린 (골수 세포 계통)에 대한 약물 효과
5. 정상의 골수를 가지지만 낮은 혈소판 수를 특징으로 하는 증상인, 혈액 징후가 있는 자가면역 장애, 예를 들어 면역 혈소판감소증 (ITP). 혈액 계통 마커, 예를 들어 거핵구성 마커를 사용한 혈장 DNA 분석은 그와 같은 증상에 대한 귀중한 진단 정보를 제공한다. (거핵구 마커)
6. 적혈구생성에서의 감소 또는 심한 보다 중증의 재생불량성 위기와 얽힐 수 있는, 혈액 합병증을 갖는 감염, 예를 들어 파보바이러스 B19로 감염. (적혈구 계통)
X. 방법
도 26은 본 발명의 구현예에 따라 포유동물의 혈액 샘플을 분석하는 방법 (2600)을 예시하는 순서도이다. 방법 (2600)의 일부분은 수작업으로 수행될 수 있고 다른 부분은 컴퓨터 시스템에 의해 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 시스템은 모든 단계들을 수행할 수 있다. 예를 들어, 시스템은 (예를 들어, 샘플을 얻고 검정을 수행하는) 로보트 요소, 검정으로부터의 신호를 검출하기 위한 검출 시스템, 및 신호를 분석하기 위한 컴퓨터 시스템을 포함할 수 있다. 그와 같은 시스템을 제어하기 위한 명령들은 하나 이상의 컴퓨터 판독가능 매체, 예컨대 필드 프로그래밍가능한 게이트 어레이 (FPGA), 플래시 메모리, 및/또는 하드 드라이브의 배치형태 로직에 저장될 수 있다. 도 27은 그와 같은 시스템을 도시한다
블록 (2610)에서, 혈액 샘플의 무세포 혼합물이 수득된다. 무세포 혼합물의 예는 혈장 또는 혈청을 포함한다. 무세포 혼합물은 복수의 세포 계통으로부터의 무세포 DNA를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 혈액 샘플을 분리시켜 무세포 혼합물을 수득한다. 혈장과 혈청은 상이하다. 둘 다 혈액의 액체 부분에 해당한다. 혈장을 얻기 위해, 항응고제가 혈액 샘플에 첨가되어 혈액이 응고되는 것을 방지한다. 혈청을 얻기 위해, 혈액 샘플을 응고되도록 한다. 따라서, 응고 인자는 응고 과정 동안 소비된다. 순환하는 DNA에 관하여, 일부 DNA는 응고 동안 유체 부분으로 혈구에서 방출될 것이다. 따라서, 혈청은 혈장과 비교하여 더 높은 DNA 농도를 갖는다. 응고 과정에서 세포로부터의 DNA는 혈장에 특이적인 DNA를 희석시킬 수 있다. 따라서, 혈장이 유리할 수 있다.
블록 (2620)에서, 무세포 혼합물 내의 DNA 단편은 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역에 상응하는 검정과 접촉된다. 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역 (DMR) 각각은 다른 세포 계통에 비해 저메틸화되거나 과메틸화됨으로써 특정 혈액 세포 계통에 특이적이다. 적모세포 세포 계통에 대한 DMR의 예가 본 명세서에 제공되어 있다.
다양한 구현예에서, 검정은 PCR 또는 서열분석을 포함할 수 있고, 따라서 PCR 검정 또는 서열분석 검정일 수 있다. DNA 단편을 접촉하는 것은 유동 세포, 액적, 비드 또는 다른 기전을 포함하여 DNA 단편과 검정의 상호작용을 제공할 수 있다. 그와 같은 검정의 예는 전체의-게놈 바이설파이트 서열분석, 표적화된 바이설파이트 서열분석 (하이브리드화 캡쳐 또는 앰플리콘-서열분석에 의함), 다른 메틸화-인지 서열분석 (예를 들어 Pacific Biosciences에 의한 단일 분자 실시간 (SMRT) DNA 서열분석), 실시간 메틸화-특정 PCR, 및 디지털 PCR을 포함한다. 방법 (300)에 사용가능한 검정의 추가 예는, 예를 들어 부문 XII에서, 본 명세서에 기재되어 있다. 예에서는 적혈구모세포를 사용하지만 다른 혈액 세포 계통을 포함한 다른 세포 계통이 사용될 수 있다.
블록 (2630)에서, 제1 수의 메틸화 또는 비메틸화된 DNA 단편이 검정으로부터 수득된 신호에 기초하여 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역에서 무세포 혼합물에서 검출된다. 본 검정은 다양한 신호, 예컨대 광 또는 전기 신호를 제공할 수 있다. 신호는 DNA 단편당 특정 신호를 제공할 수 있거나, (예를 들어, 실시간 PCR에서와 같이) 메틸화 서명을 갖는 DNA 단편의 총 수를 나타내는 응집체 신호를 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 서열분석은 DNA 단편에 대한 서열 판독을 얻기 위해 사용될 수 있으며, DNA 단편은 참조 게놈에 정렬될 수 있다. DNA 단편이 DMR 중 하나에 정렬되면 계수가 증분될 수 있다. 신호가 비메틸화된 검정의 특정 메틸화된 검정에서 나온 것이면, DNA 단편은 그 메틸화 서명을 갖는다고 추정될 수 있다. 또 다른 구현예에서, PCR로부터의 판독 (예를 들어, 양성 웰로부터의 광 신호)은 그와 같은 계수를 증분시키는데 사용될 수 있다.
블록 (2640)에서, 메틸화 수준은 제1 수를 사용하여 결정된다. 제1 메틸화 수준은 정규화될 수 있거나 또는, 예를 들어, 생물학적 샘플의 용적당, 절대 농도일 수 있다. 절대 농도의 예는 도 25에 제공된다. 정규화된 메틸화 수준의 예는 E% (또한 일명 비메틸%)를 포함한다.
정규화된 값의 경우, 메틸화 수준은 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역에서 무세포 혼합물 내의 DNA 단편의 제1 수 및 총 수를 사용하여 결정될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 메틸화 수준은 비메틸화된 DNA 단편의 백분율일 수 있다. 다른 구현예에서, 백분율은 메틸화된 DNA 단편의 것일 수 있으며, 이는 적혈구모세포에 대한 상기 예에 대비해 역전 관계를 가질 것이다. 다양한 실행에서, 메틸화 수준은 DMR 내 모든 부위에 걸친 백분율을 사용하여, 각각의 부위에서 개체 백분율의 평균 또는 각각의 부위에서 계량된 평균에 의하여 결정될 수 있다.
블록 (2650)에서, 메틸화 수준은 포유동물에서 혈액 장애의 분류를 결정하는 부분으로서 하나 이상의 컷오프 값에 비교된다. 하나 이상의 컷오프 값은, 예를 들어 도 8-10 및 12-14에서 나타낸 바와 같이, 경험적 데이터로부터 선택될 수 있다. 컷오프 값은, 예를 들어, 정상인 및 장애가 있는 것으로 공지된 샘플의 데이터세트로부터의 감독된 학습에 기반하여, 혈액 장애의 정확한 분류를 제공하기 위한 최적의 감도 및 특이성을 제공하도록 선택될 수 있다.
컷오프 값을 결정하는 예로서, 복수의 샘플이 수득될 수 있다. 각각의 샘플은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이, 예를 들어, 다른 기술을 통해 혈액 장애의 특정 분류를 갖는 것으로 공지되어 있다. 복수의 샘플은 혈액 장애의 적어도 2종의 분류, 예를 들어, 장애를 갖는 것 및 장애를 갖지 않는 것이다. 예를 들어, 도 10에서 나타낸 바와 같이, 상이한 유형의 장애가 또한 포함될 수 있다. 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역의 메틸화 수준은 도 8-10 및 12-14에서의 데이터 포인트와 같이, 복수의 샘플 각각에 대해 결정될 수 있다.
혈액 장애의 제1 분류, 예를 들어 건강한 것인 제1 분류를 갖는 제1 세트의 샘플이 확인될 수 있다. 제1 세트는 예를 들어, 도 8-10 및 12-14에서 나타낸 바와 같이 함께 클러스터링될 수 있다. 혈액 장애의 제2 분류를 갖는 제2 세트의 샘플이 확인될 수 있다. 제2 세트는 장애가 있는 환자 또는 제1 분류와 상이한 유형의 장애일 수 있다. 두 가지 분류는 동일한 장애가 있는 가변 정도에 대응할 수 있다. 제1 세트의 샘플이 집합적으로 제2 세트의 샘플보다 통계적으로 더 높은 메틸화 수준을 갖는 경우, 지정된 특이성 및 민감도 내에서 제1 세트의 샘플 및 제2 세트의 샘플 간을 구별하는 컷오프 값이 결정될 수 있다. 따라서, 특이성과 민감도 사이의 균형은 적절한 컷오프 값을 선택하기 위해 사용될 수 있다.
XI. 요약
RBC는 말초 혈액에서 가장 풍부한 세포 유형이지만 핵을 갖지 않는다. 본 개시내용에서, 본 발명자들은 적혈구 계통의 세포가 상당한 비율의 혈장 DNA 풀에 기여한다고 결정했다. 이 연구 이전에는, 조혈 세포가 순환하는 DNA 풀에 상당히 기여한다고 공지되었지만 (13,14), 많은 연구자들은 그러한 조혈 DNA가 단지 백색 세포 계통으로부터 유래했다고 추정했다 (15). DNA 메틸화 마커를 사용한 보다 최근의 결과는 혈장 DNA가 중성구 및 림프구의 DNA 메틸화 서명을 운반한다는 것을 보여주었다 (15).
적혈구모세포를 포함하는 다수의 조직의 고-해상도 참조 메틸롬을 사용하여 (18, 20), 본 발명자들은 혈장 DNA 풀 내 다른 조직 유형의 DNA로부터 적혈구-유래 DNA 분자를 구별하였다. 적모세포-특이적 메틸화 서명에 기반된 본 발명자들의 디지털 PCR 검정은 혈장 내 이러한 DNA 분자의 정량 분석을 수행하는 것을 가능하게 했다. 이 접근법은 본 발명자들이 건강한 대상체의 혈장 DNA 풀에서 상당한 양의 적혈구 DNA의 존재를 입증할 수 있게 했다.
본 발명자들의 결과는 골수 내 적혈구 계통의 세포가 혈장 안으로 DNA를 제공하는 것과 일치한다. 이 가설의 필연적 결과는 혈장 내 적혈구 DNA의 정량 분석이 골수의 적혈구생성 활성을 반영하고 따라서 빈혈의 차별적인 진단에 도움이 될 수 있다는 것이다. 본 발명자들은 건강한 대상체의 혈장에서 적혈구 DNA에 대한 확립된 참고 값을 가진다. 본 발명자들은 빈혈 환자가 그들의 병리학 및 치료의 정확한 특성에 따라 순환하는 적혈구 DNA의 비율을 증가 또는 감소시켰음을 추가로 실증했다. 특히 본 발명자들은 혈장 내 적혈구 DNA의 백분율의 분석을 통하여, 본 발명자들의 동원된 환자 중에서 두 가지 골수 부전 증후군, 즉, 재생불량성빈혈 (AA) 및 골수이형성 증후군 (MDS)을 구별할 수 있었다.
망상적혈구 수는 빈혈 환자에서 골수 반응에 대한 정보를 제공하는 데 사용될 수 있었다. 본 발명자들이 연구한 베타-지중해빈혈이 있는 환자 11명 중에서, 4명 환자는 말초 혈액에서 검출 한계인 1% 미만의 망상적혈구 수를 가졌다. 다른 7명 환자의 경우, 망상적혈구 수는 1% 내지 10%의 범위였다. 재생불량성빈혈이 있는 환자 9명 모두에 대해, 그것의 망상적혈구 수는 이들이 규칙적 수혈을 받았는지 아닌지 여부에 무관하게 1% 미만이었다. 따라서 망상적혈구 수는 낮은 농도의 망상적혈구에서 자동화 방법의 높은 부정확성에 기인하여 골수에서 정상적이고 감소된 적혈구생성 활성을 명확하게 정의하지 못할 수 있다 (35, 36).
본 발명자들은 망상적혈구 수 또는 망상적혈구 지수의 분석이 본 발명자들의 환자 집단에서 감소된 적혈구생성 활성을 갖는 빈혈 원인을 구별할 수 없음을 실증하였다 (도 11a 및 11b). 본 발명자들의 결과는 (예를 들어, 도 10에서 나타낸 바와 같이) 혈장 비메틸%가 망상적혈구 수보다 골수 내 적혈구생성 활성을 반영함에 있어 망상적혈구 수보다 더 정확함을 나타낸다. 도 11a 및 11b에서 나타낸 바와 같이, 측정된 둘 모두의 파라미터를 가진 모든 환자 중에서 혈장 비메틸%와 망상적혈구 수 또는 망상적혈구 지수 사이에는 상관 관계가 없었다 (P=0.3, 선형 회귀).
유사하게, 말초 혈액에서 비정상적으로 많은 수의 적혈구모세포의 존재는 비정상적인 적혈구생성 스트레스를 의미한다 (37). 그러나, 말초 혈액에서 적혈구모세포의 부재는 정상 또는 감소된 적혈구생성 활성을 의미하지는 않는다. 반대로, 혈장 적모세포-유래 DNA의 정량 분석은 말초 혈액으로부터의 통상적인 혈액 파라미터에 의해 제공되지 않는 골수의 적혈구생성 활성에 대한 정보를 산출한다.
베타-지중해빈혈 및 재생불량성빈혈의 경우, 이들 두 상태는 전형적으로 혈액 및 헤모글로빈 패턴에서 철 분석에 의해 진단된다. 그러나 베타-지중해빈혈 및 재생불량성빈혈 둘 모두는 낮은 헤모글로빈 수준을 나타내고, 따라서 그와 같은 기술은 베타-지중해빈혈과 재생불량성빈혈 사이를 구분하지 못한다. 비메틸%를 사용하는 것은, 도 8 및 10에서 나타낸 바와 같이, 이들 두 질환들 간의 식별을 가능하게 함에 의해 보다 특이성을 제공할 수 있다.
비메틸%는 또한 치료를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 철 결핍성 빈혈이 있는 환자에서 비메틸%의 분석은 도 9에서 나타낸 바와 같이, 경구 철 요법에 대한 골수 반응의 모니터링을 위해 사용될 수 있다. 일부 환자에서, 경구 철 보충제가 위장관을 통해 효과적으로 흡수되지 않을 수 있다. 그 결과, 치료 시작 후 적혈구생성이 증가되지 않을 것이다. 비메틸%에서 증가의 부재는 경구 철 치료에 대한 열악한 반응에 대한 지표로서 사용될 수 있어 다른 치료, 예컨대 비경구 철 치료 (예를 들어, 철 덱스트란, 제이철 글루코네이트, 및 철 수크로스)가 개시될 수 있다. 대안적으로, 비메틸%에서 증가의 부재는 치료를 중단하는데 (멈추는데) 사용될 수 있고, 그렇게 함으로써 비효과적인 치료의 절감 비용을 할 수 있다. 또 다른 실행에서, 비메틸%에서 증가의 부재는 치료의 용량을 증가시킬 때, 예를 들어 철의 투약량을 증가시키는 경우를 확인하는데 사용될 수 있다. 비메틸%에서 증가가 있는 경우 치료는 계속될 수 있다. 만일 비메틸%에서 증가가 (예를 들어, 역치에 기반하여) 충분히 높으면, 적혈구생성 활성이 헤모글로빈 수준을 건강한 수준으로 결국 되돌리는 충분한 수준에 도달했다고 추정될 수 있으므로 치료는 중단될 수 있고, 그렇게 함으로써 고비용이거나 또는 잠재적으로 유해한 과잉의 치료를 회피할 수 있다.
따라서, 포유동물은 포유동물이 혈액 장애가 있는 것을 나타내는 혈액 장애의 분류를 결정하는 것에 반응하여 혈액 장애가 치료될 수 있다. 치료 후, 검정은 업데이트된 메틸화 수준을 결정하기 위해 반복될 수 있으며, 그리고 업데이트된 메틸화 수준에 기초하여 치료를 계속할 것인지 여부가 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 치료를 계속 수행할 것인지 여부를 결정하는 단계는: 업데이트된 메틸화 수준이 메틸화 수준에 대해 지정된 역치 내에서 변화되지 않은 경우, 치료를 중단하거나, 치료의 용량을 증가시키거나, 또는 상이한 치료를 추구하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 치료를 계속 수행할 것인지 여부를 결정하는 단계는: 업데이트된 메틸화 수준이 메틸화 수준에 대해 지정된 역치 내에서 변화하는 경우, 치료를 계속하는 단계를 포함할 수 있다.
치료를 모니터링하는 또 다른 예로서, 지중해빈혈 환자에서 효과없는 적혈구생성이 치료에 의해, 예를 들어, 수혈에 의해 적절하게 억제되었는지를 결정하기 위해 비메틸% 분석이 사용될 수 있다. 골수외 적혈구생성은 지중해빈혈 환자에서 뼈 기형의 원인이다. 골수외 적혈구생성은 수혈과 헤모글로빈 수준의 회복에 의해 억제될 수 있다. 비메틸%는 이들 치료에 대한 환자의 반응을 나타낼 수 있고, 그리고 비메틸%를 억제하지 못하는 것은 치료가 강화되어야 한다는 것을 나타내기 위해 사용될 수 있다.
비메틸%는 또한 빈혈의 다른 원인, 예를 들어, 만성 질환으로 인한 빈혈과 함께 철 결핍이 있는 이들로부터 철 결핍 단독만 있는 환자를 구분하기 위해 사용될 수 있다. 철 결핍 단독만 있는 환자는 철 치료 후 증가된 비메틸%를 가질 것으로 기대되지만, 여러 가지 빈혈 원인은 비메틸%의 상승의 반응을 나타내지 않을 것이다.
따라서, 본 발명자들은 철-결핍성 빈혈이 있는 환자에서 철 요법에 반응하여 순환하는 적혈구 DNA의 백분율이 증가하고, 따라서 골수 적혈구생성 활성에서의 증가를 반영한다는 것을 실입하였다. 적혈구 DNA 비율에서의 동적 변화는 혈장 적혈구 DNA의 정량화가 관련된 세포 과정의 비침습적 모니터링을 허용한다는 것을 나타낸다. 혈장 DNA의 빠른 동력학 (예를 들어 수십 분(38, 39)의 반감기를 가짐)은 그러한 모니터링이 거의 실시간 결과를 제공할 수 있다는 것을 시사한다. 유사하게, 다른 세포 계통의 순환하는 무세포 DNA의 백분율은 또한 다른 세포 계통에 대한 골수에서의 관련된 세포 과정의 비침습적 모니터링을 허용한다.
현재의 연구는 순환에서 조혈 선조 및 전구체 세포의 핵 물질의 존재를 입증하는 증거로서의 역할을 한다. 게다가, 다른 조혈 계통의 전구체 세포로부터 방출된 순환하는 DNA의 존재도 또한 사용될 수 있다.
요약하면, 본 발명자들은 적혈구 DNA가 혈장 DNA 풀의 상당한 부분에 기여한다는 것을 실증했다. 이 발견은 순환하는 핵산의 기본 생물학에 대한 본 발명자들의 이해에서 중요한 차이를 메웠다. 임상적으로, 혈장 내 적혈구 DNA의 측정은 상이한 유형의 빈혈의 조사 및 모니터링을 위한 신규한 접근법을 개척하였으며 신규한 계열의 무세포 DNA-기반 혈액 테스트의 시작을 알린다.
XII. 물질 및 방법
이 부문은 구현예를 구현하기 위해 사용되었고 사용될 수 있는 기술을 설명한다.
A. 샘플 수집 및 준비
일부 구현예에서, 각각이 4가지 사례를 갖는, 12 유형의 포르말린-고정 파라핀-포매된 (FFPE) 정상 조직 (간, 폐, 식도, 위, 소장, 결장, 췌장, 부신, 비뇨기 방광, 심장, 뇌 및 태반)을 익명의 외과적 시료에서 회수하였다. 수집된 조직은 조직학적 시험 상 정상인 것으로 확인되었다. QIAamp DNA 미니 키트 (Qiagen)을 사용하여 고정된 조직에 대한 제조자의 프로토콜의 변형으로 FFPE 조직 프로토콜로부터 DNA를 추출하였다. 파라핀을 제거하기 위해 자일렌 대신에 탈파라핀화 용액 (Qiagen)을 사용했다. 핵산의 포름알데하이드 변형의 역전을 위해 완충액 ATL 및 프로테아제 K로 용리 후 90℃에서 1시간 동안 배양의 추가의 단계를 수행하였다.
분석을 위한 적모세포-농축한 샘플을 제조하기 위해, 출산 직후 여덟 명의 임산부 각각으로부터 1-3mL의 탯줄 혈액을 EDTA-함유 튜브 안에 수집했다. 단핵 세포를 Ficoll-Paque PLUS 용액 (GE Healthcare)으로 밀도 구배 원심분리를 사용하여 제대혈 샘플에서 단리하였다. 1 x 108 단리된 단핵 세포를 4℃에서 암실에서 30분 동안 포스페이트-완충 식염수 (PBS) 내에 1:10 희석으로 두 개의 항체: 플루오르세인 이소티오시아네이트 (FITC)-접합된 항-CD235a (Miltenyi Biotec) 및 파이코에리트린 (PE)-접합된 항-CD71 (Miltenyi Biotec)의 1mL의 혼합물로 배양했다. CD235a+ 및 CD71+ 세포는 그런 다음 적혈구모세포의 농축을 위해 BD FACSAria 융합 흐름 세포측정기 (BD Biosciences)로 분류하였다 (1). 여덟 개의 사례로부터 CD235a+CD71+ 세포를 다운스트림 분석을 위해 풀링했다. 제조자의 지침으로 QIAamp DNA 혈액 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 풀링된 CD235a+CD71+ 세포로부터 DNA를 추출했다.
말초 혈액 샘플을 EDTA-함유 튜브 안으로 수집하고 즉시 4℃에 저장하였다. 각각의 환자로부터 10mL의 말초 정맥 혈액을 수집하였다. 혈장 단리는 혈액 회수 후 6시간 이내에 수행되었다. 혈장 DNA는 4mL의 혈장에서 추출하였다. 이전에 기재된 바와 같이 혈장 및 버피 코트 DNA를 수득하였다 (2). 간단히 말해서, 혈액 샘플을 먼저 1,600g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하고, 혈장 부분을 4℃에서 16,000g에서 10분 동안 재-원심분리하였다. 혈구 부분을 2,500g에서 10분 동안 재-원심분리한 후 수집하여 임의의 잔존 혈장을 제거하였다. 혈장과 버피 코트로부터 DNA는 각각 QIAamp DSP DNA 미니 키트 (Qiagen) 및 QIAamp DNA 혈액 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 추출하였다.
B. DNA의 바이설파이트 전환
혈구 및 FFPE 조직으로부터 추출된 혈장 DNA 및 게놈 DNA를 Epitect Plus Bisulfite Kit (Qiagen)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 2회의 바이설파이트 처리를 하였다.
일 구현예에서, 생물학적 샘플로부터 추출된 DNA는 먼저 바이설파이트로 처리된다. 바이설파이트 처리는 메틸화된 시토신을 변화시키지 않으면서 비메틸화된 시토신을 우라실로 전환시킬 것이다. 따라서, 바이설파이트 전환 후, CpG 디뉴클레오타이드에서 서열 차이에 기초하여 메틸화 및 비메틸화된 서열이 분화될 수 있다. 본원의 선택된 실시예에 제시된 혈장 샘플의 분석을 위해, DNA를 2-4mL 혈장으로부터 추출하였다. 혈구로부터 추출된 DNA의 분석을 위해, 실시예에서 다운스트림 분석을 위해 1μg의 DNA를 사용했다. 다른 구현예에서, 다른 용적의 혈장 및 DNA의 양이 사용될 수 있다.
본원의 실시예에서, 제조자의 지침에 따라 EpiTect Bisulfite Kit를 사용하여 각각의 샘플에서 2회의 바이설파이트 처리를 수행하였다. 바이설파이트-전환된 혈장 DNA는 50μL 물에서 용출되었다. 바이설파이트-전환된 세포 DNA는 20μL 물에서 용출되었고, 그 다음에는 다운스트림 분석을 위해 100배로 희석되었다.
C. 메틸화 검정
특정 세포 계통으로부터 DNA의 양을 정량하기 위해 다양한 메틸화 검정이 사용될 수 있다.
1. PCR 검정
세 개의 적모세포-특이적 DMR 각각에 대해, 두 가지 디지털 PCR 검정이 개발되어, 하나는 바이설파이트-전환된 비메틸화된 서열을 표적화하고, 다른 하나는 메틸화된 서열을 표적화한다. 검정을 위한 프라이머 및 프로브 디자인은 보충의 표 7에 열거되어 있다.
표 7. 적모세포-특이적 DMR의 메틸화 및 비메틸화된 서열에 대한 디지털 PCR 검정에 대한 올리고뉴클레오타이드 서열. 역방향 프라이머 및 프로브 내 밑줄친 뉴클레오타이드는 CpG 부위에서 차별적으로 메틸화된 시토신을 나타낸다. VIC 및 FAM은 2 형광 리포터를 표시한다.
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예로, PCR 반응은 3μL의 바이설파이트 전환된 템플레이트 DNA, 최종 농도 0.3μM의 각각의 프라이머, 0.5μM의 MgCl2, 및 25μL의 2x KAPA HiFi HotStart Uracil ReadyMix와 함께 50μL를 포함할 수 있다. 하기 PCR 열적 프로파일은: 5분 동안 95℃, 및 98℃ 20초의 35 사이클, 15초 동안 57℃, 및 15초 동안 72℃, 이어서 30초 동안 72℃의 최종 연장 단계가 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 비-우선적인 게놈-전체 서열분석은 정렬과 조합하여 수행될 수 있지만, 그와 같은 절차는 비용-효과적이지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플의 디지털 PCR 분석을 위해, 20μL 반응 혼합물을 바이설파이트 처리 후 제조하였다. 일 구현예에서, 반응 혼합물은 8μL의 템플레이트 DNA, 최종 농도 450nM의 각각의 두 정방향 프라미어, 900nM의 역방향 프라이머, 및 프로브에 대해 250nM을 함유했다. 다른 구현예에서, 8uL의 템플레이트 DNA, 최종 농도 900nM의 정방향 프라미어, 900nM의 역방향 프라이머 및 250nM의 프로브를 함유하는 총 용적 20μL의 각각의 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물은 그 다음 BioRad QX200 ddPCR 액적 발생제를 사용하여 액적 생성을 위해 사용되었다. 전형적으로 각각의 샘플에 대해 20,000 액적이 되었다. 일부 실행에서, 액적은 깨끗한 96-웰 플레이트로 이송하고 이어서 메틸화 및 비메틸화된 특정 검정 둘 모두에 대해 동일한 조건: 95℃ Х 10분 (1 사이클), 94℃ Х 15초 및 60℃ Х 1분의 40 사이클, 98℃ Х 10분 (1 사이클), 이어서 12℃ 유지 단계를 사용하여 열적 순환시켰다. PCR 후, 각각의 샘플에 대한 액적을 BioRad QX200 액적 판독기로 분석하고 그 결과는 QuantaSoft (버전 1.7) 소프트웨어를 사용하여 해석하였다.
2. 다른 메틸화 검정의 실시예
메틸화-인지 서열분석의 다른 실시예는 DNA 분자 (N6-메틸아데닌, 5-메틸시토신 및 5-하이드록시메틸시토신을 포함함)의 메틸화 상태가 바이설파이트 전환 없이 직접적으로 설명될 수 있거나 (문헌 [AB Flusberg 등 2010 Nat Methods; 7: 461-465]; 문헌 [J Shim 등 2013 Sci Rep; 3:1389]); 또는 (예를 들어 메틸시토신에 대한 항체를 사용함에 의해 또는 메틸화된 DNA 결합 단백질 또는 펩타이드를 사용함에 의해 메틸화된 시토신의 면역침강 (문헌 [LG Acevedo 등 2011 Epigenomics; 3: 93-101])과 이어서 서열분석을 통해; 또는 메틸화-민감성 제한 효소의 사용과 이어서 서열분석을 통해 설명될 수 있는 단일 분자 서열분석 플랫폼을 사용하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, DNA 혼합물 내 게놈 부위의 메틸화 수준은 전체의 게놈 바이설파이트 서열분석을 사용하여 결정될 수 있다. 다른 구현예에서, 게놈 부위에 대한 메틸화 수준은 메틸화 마이크로어레이 분석, 예컨대 Illumina HumanMethylation450 시스템을 사용하거나, 또는 메틸화 면역침강 (예를 들어 항-메틸시토신 항체를 사용함) 또는 메틸화-결합 단백질로 처리와 이어서 마이크로어레이 분석 또는 DNA 서열분석을 사용함에 의해, 또는 메틸화-민감성 제한 효소 처리와 이어서 마이크로어레이 또는 DNA 서열분석을 사용함에 의해, 또는 예를 들어 (예를 들어 나노포어 서열분석 (문헌 [Schreiber 등 Proc Natl Acad Sci 2013; 110: 18910-18915])에 의하거나 또는 Pacific Biosciences 단일 분자 실시간 분석 (문헌 [Flusberg 등 Nat Methods 2010; 7: 461-465)에 의한) 단일 분자 서열분석 방법을 사용한 메틸화 인지 서열분석을 사용함에 의해 결정될 수 있다. 조직-특이적 메틸화 수준은 동일한 방법으로 측정될 수 있다. 또 다른 예로서, (예를 들어 단일 분자 서열분석 플랫폼 (문헌 [Powers 등 Efficient and accurate whole genome assembly and methylome profiling of E. coli. BMC Genomics. 2013;14:675])에 의한 표적화된 바이설파이트 서열분석, 메틸화-특정 PCR, 비-바이설파이트 기반 메틸화-인지 서열분석이 혈장 DNA 메틸화 디콘볼루션 분석을 위한 혈장 DNA의 메틸화 수준의 분석을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 메틸화-인지 서열분석 결과는 여러 가지의 방식으로 수득될 수 있다.
D. 통계적인 분석
Pearson의 상관관계는 β-종증성 지중해 빈혈 환자에서 혈액학 분석기에 의해 측정된 주변 백혈구 중에 적혈구 DNA의 백분율 (E%(FECH))과 적혈구모세포의 백분율 사이의 상관관계를 연구하기 위해 사용되었다. Pearson의 상관관계는 또한 건강한 대조군의 버피 코트 DNA와 혈장 DNA에서 쌍으로 된 E%(FECH) 결과들 사이의 상관관계를 연구하기 위해 사용되었다. Wilcoxon 징후-등급 시험을 사용하여 혈장 DNA 내 E%와 건강한 대상체의 쌍으로 된 버피 코트 DNA 사이의 차이를 비교했다. Mann-Whitney 등급-합 검정을 사용하여 건강한 대상체와 상이한 질환 군의 빈혈 환자의 혈장 DNA 내 E% 사이의 차이를 비교했다.
본 발명자들은 또한 본문에 기재된 본 발명자들의 기준에 기초하여 적모세포-특이적 DMR을 채굴하기 위한 생물정보학 파이프라인을 개발하였다. 생물정보학 파이프라인은 다양한 플랫폼, 예를 들어 Perl 플랫폼에서 시행될 수 있다.
XIII. 실시예 시스템
도 27은 본 발명의 일 구현예에 따른 시스템 (2700)을 도시한다. 도시된 바와 같은 시스템은 샘플 홀더 (2710) 내의 무세포 DNA 분자와 같은 샘플 (2705)을 포함하며, 여기서 샘플 (2705)은 물리적 특징 (2715)의 신호를 제공하기 위해 검정 (2708)과 접촉될 수 있다. 샘플 홀더의 예는 검정의 프로브 및/또는 프라이머를 포함하는 유동 세포 또는 액적이 (검정을 포함하는 액적과 함께) 이동하는 튜브일 수 있다. 샘플로부터의 형광 강도 값과 같은 물리적 특징 (2715)은 검출기 (2720)에 의해 검출된다. 검출기는 데이터 신호를 구성하는 데이터 포인트를 얻기 위해 간격 (예를 들어, 반복 간격)으로 측정을 할 수 있다. 일 구현예에서, 아날로그 대 디지털 변환기는 검출기로부터의 아날로그 신호를 복수의 시간들에서 디지털 형태로 변환한다. 데이터 신호 (2725)는 검출기 (2720)로부터 로직 시스템 (2730)으로 전송된다. 데이터 신호 (2725)는 로컬 메모리 (2735), 외부 메모리 (2740) 또는 저장 장치 (2745)에 저장될 수 있다.
로직 시스템 (2730)은 컴퓨터 시스템, ASIC, 마이크로프로세서 등일 수 있거나 또는 포함할 수 있다. 이것은 또한 디스플레이 (예를 들어, 모니터, LED 디스플레이 등) 및 사용자 입력 장치 (예를 들어, 마우스, 키보드, 버튼 등)과 연결될 수 있거나 포함할 수 있다. 로직 시스템 (2730) 및 다른 성분은 독립형 또는 네트워크 연결된 컴퓨터 시스템의 일부일 수 있거나, 또는 열주기장치 디바이스에 직접적으로 부착되거나 여기에 통합될 수 있다. 로직 시스템 (2730)은 또한 프로세서 (2750)에서 실행되는 최적화 소프트웨어를 포함할 수 있다. 로직 시스템 (1030)은 본 명세서에서 기재된 임의의 방법을 수행하도록 시스템 (1000)을 제어하기 위한 명령어를 저장하는 컴퓨터 판독가능 매체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 언급된 임의의 컴퓨터 시스템은 임의의 적합한 수의 서브시스템을 이용할 수 있다. 이러한 서브시스템의 예는 도 28에 컴퓨터 시스템 (10)으로 도시된다. 일부 구현예에서, 컴퓨터 시스템은 단일 컴퓨터 장치를 포함하며, 여기서 서브시스템은 컴퓨터 장치의 구성요소일 수 있다. 다른 구현예에서, 컴퓨터 시스템은 다수의 컴퓨터 장치를 포함할 수 있으며, 각각은 내부 구성요소를 갖는 서브시스템이다. 컴퓨터 시스템은 데스크탑 및 랩톱 컴퓨터, 태블릿, 휴대폰 및 기타 모바일 디바이스를 포함할 수 있다.
도 28에 도시된 서브 시스템은 시스템 버스 (75)를 통해 상호연결된다. 추가의 서브시스템 예컨대 프린터 (74), 키보드 (78), 저장 장치(들) (79), 디스플레이 어댑터 (82)에 연결된 프린터 (74) 및 기타가 도시되어 있다. I/O 컨트롤러 (71)에 연결되는 주변장치 및 입력/출력 (I/O) 디바이스는 입력/출력 (I/O) 포트 (77)와 같은 당해 분야에 공지된 임의의 수의 수단 (예를 들어, USB, FireWire®)에 의해 컴퓨터 시스템에 연결될 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템 (10)을 인터넷, 마우스 입력 장치 또는 스캐너와 같은 광역 네트워크에 연결하기 위해 I/O 포트 (77) 또는 외부 인터페이스 (81) (예를 들어, 이더넷, 와이파이 등)가 사용될 수 있다. 시스템 버스 (75)를 통한 상호연결은 중앙 프로세서 (73)가 각각의 서브시스템과 통신하고 시스템 메모리 (72) 또는 저장 장치(들) (79) (예를 들어, 고정된 디스크, 예컨대 하드 드라이브, 또는 광 디스크)로부터의 복수의 명령의 실행뿐만 아니라 서브시스템 간의 정보의 교환을 제어할 수 있게 한다. 시스템 메모리 (72) 및/또는 저장 장치(들) (79)는 컴퓨터 판독가능 매체를 구현할 수 있다. 또 다른 서브시스템은 데이터 수집 디바이스 (85), 예컨대 카메라, 마이크로폰, 가속도계, 및 기타 동종의 것이다. 본 명세서에서 언급된 임의의 데이터는 한 구성요소에서 또 다른 구성요소로 출력될 수 있으며 사용자에게 출력될 수 있다.
컴퓨터 시스템은, 예를 들어 외부 인터페이스 (81)에 의해 또는 내부 인터페이스에 의해 함께 접속된 복수의 동일한 구성요소들 또는 서브시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 컴퓨터 시스템, 서브시스템 또는 장치는 네트워크를 통해 통신할 수 있다. 그와 같은 사례에서, 하나의 컴퓨터는 클라이언트로, 그리고 다른 컴퓨터는 서버로 간주될 수 있어, 여기서 각각은 동일한 컴퓨터 시스템의 일부일 수 있다. 클라이언트와 서버는 각각 복수의 시스템, 서브시스템 또는 구성요소를 포함할 수 있다.
구현예의 양태들은 하드웨어 (예를 들어, 주문형 특정 집적회로 또는 현장 프로그래밍 가능한 게이트 어레이)를 사용하는 제어 로직 및/또는 모듈러 또는 통합된 방식으로 일반적으로 프로그래밍 가능한 프로세서를 갖는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하는 제어 로직의 형태로 시행될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 프로세서는 단일-코어 프로세서, 동일한 집적 칩 상의 다중-코어 프로세서, 또는 단일 회로 기판 또는 네트워크된 다중 처리 장치를 포함한다. 본 명세서에 제공된 개시내용 및 교시에 기초하여, 당해 분야의 숙련가는 하드웨어 및 하드웨어와 소프트웨어의 조합을 사용하여 본 발명의 구현예를 실행하는 다른 방식 및/또는 방법을 알고 인정할 것이다.
본원에 기재된 임의의 소프트웨어 구서요소 또는 기능은 예를 들어 Java, C, C++, C#, Objective-C, Swift, 또는 스크립팅 언어, 예컨대 예를 들어, 통상적인 또는 객체-지향 기술을 사용한 Perl 또는 Python과 같은 임의의 적합한 컴퓨터 언어를 사용하는 프로세서에 의해 실행되는 소프트웨어 코드로서 구현될 수 있다. 소프트웨어 코드는 저장 및/또는 전송을 위해 컴퓨터 판독가능 매체상에 일련의 지침 또는 명령들로서 저장될 수 있다. 적합한 비-일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 랜덤 액세스 메모리 (RAM), 읽기 전용 메모리 (ROM), 자기 매체 예컨대 하드-드라이브 또는 플로피 디스크, 또는 광학 매체 예컨대 컴팩트 디스크 (CD) 또는 DVD (디지털 다용도 디스크), 플래시 메모리, 및 기타 동종의 것을 포함할 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체는 그러한 저장 또는 전송 장치의 임의의 조합일 수 있다.
그러한 프로그램은 또한 인터넷을 포함하는 여러 가지의 프로토콜을 따르는 유선, 광 및/또는 무선 네트워크를 통한 전송에 적합한 캐리어 신호를 사용하여 인코딩되고 전송될 수 있다. 이와 같이, 컴퓨터 판독가능 매체는 그러한 프로그램들로 인코딩된 데이터 신호를 사용하여 생성될 수 있다. 프로그램 코드로 인코딩된 컴퓨터 판독가능 매체는 호환 장치로 패키징되거나 (예를 들어, 인터넷 다운로드를 통해) 다른 장치와는 별도로 제공될 수 있다. 임의의 그러한 컴퓨터 판독가능 매체는 단일 컴퓨터 제품 (예를 들어 하드 드라이브, CD, 또는 전체 컴퓨터 시스템) 상에 또는 그 내에 상주할 수 있고, 그리고 시스템 또는 네트워크 내의 다른 컴퓨터 제품 내에 존재할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 본 명세서에 언급된 임의의 결과를 사용자에게 제공하기 위해 모니터, 프린터 또는 다른 적합한 디스플레이를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 기재된 임의의 방법은 단계들을 수행하도록 구성될 수 있는 하나 이상의 프로세서들을 포함하는 컴퓨터 시스템으로 전적으로 또는 부분적으로 수행될 수 있다. 따라서, 구현예는 잠재적으로 각각의 단계들 또는 각각의 단계들의 군을 수행하는 상이한 구성요소로 본 명세서에서 기재된 임의의 방법의 단계들을 수행하도록 구성된 컴퓨터 시스템에 대한 것이다. 넘버링된 단계들로 제시되었지만, 본 명세서에서의 방법 단계들은 동시에 또는 상이한 순서로 수행될 수 있다. 추가로, 이들 단계들의 일부는 다른 방법으로부터의 다른 단계들의 일부로 사용될 수 있다. 또한, 단계의 전부 또는 일부는 선택적 일 수 있다. 추가로, 임의의 방법의 임의의 단계는 이들 단계들을 수행하기 위한 시스템의 모듈, 유닛, 회로 또는 다른 수단으로 수행될 수 있다.
특정 구현예의 특정 세부사항은 본 발명의 구현예의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 그러나, 본 발명의 다른 구현예는 각각의 개별 양태, 또는 이들 개별 양태의 특정 조합에 관한 특정 구현예에 대한 것일 수 있다.
본 발명의 예시적인 구현예들의 상기 설명은 실례 및 설명의 목적으로 제시되었다. 본 발명을 기재된 정확한 형태에 한정하거나 포괄적인 것으로 의도되지 않고, 상기 교시에 비추어 많은 변형 및 변화가 가능하다.
"a", "an" 또는 "the"의 인용은 달리 구체적으로 반대로 나타내지 않는 한 "하나 이상"을 의미하는 것으로 의도된다. "또는"의 사용은 달리 구체적으로 반대로 나타내지 않는 한 "포괄적이거나", 및 "배타적이거나"가 아님을 의미하는 것으로 의도된다. "제1" 성분에 대한 언급은 제2 성분이 제공될 것을 반드시 요하지는 않는다. 더욱이 "제1" 또는 "제2" 성분에 대한 언급은 명확히 언급되지 않는 한 언급된 성분을 특정 위치로 제한하지 않는다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공보, 및 설명은 모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 편입된다. 어느 것도 선행 기술인 것으로 인정되지 않는다.
XIV. 참조문헌
하기 참조문헌은 상기에 언급되어 있고 모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 편입된다.
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Claims (35)

  1. 포유동물의 혈액 샘플을 분석하는 방법으로서,
    상기 혈액 샘플의 무세포 혼합물을 수득하는 단계로서, 상기 무세포 혼합물은 복수의 세포 계통으로부터의 무세포 DNA를 포함하는 것인 단계;
    상기 무세포 혼합물 내 DNA 단편을 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역에 상응하는 검정(assay)과 접촉시키는 단계로서, 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역의 각각은 다른 세포 계통에 비하여 저메틸화되거나 또는 과메틸화됨에 의해 특정 혈액 세포 계통에 특이적인 것인 단계;
    상기 검정으로부터 수득된 신호에 기초하여 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역에서 상기 무세포 혼합물 내 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA 단편의 제1 수를 검출하는 단계;
    상기 제1 수를 사용하여 메틸화 수준을 결정하는 단계; 및
    상기 메틸화 수준을 상기 포유동물 내 혈액 장애의 분류를 결정하는 부분으로서 하나 이상의 컷오프 값과 비교하는 단계
    를 포함하는, 포유동물의 혈액 샘플을 분석하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역에서 상기 무세포 혼합물 내 DNA 단편의 총 수를 결정하는 단계; 및
    상기 제1 수 및 상기 총 수를 사용하여 상기 메틸화 수준을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 무세포 혼합물의 용적을 결정하는 단계를 더 포함하며, 상기 메틸화 수준은 상기 무세포 혼합물의 상기 용적과 상기 제1 수를 결정하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 무세포 혼합물을 수득하는 단계는,
    상기 혈액 샘플로부터 상기 무세포 혼합물을 분리하는 단계를 포함하며, 상기 무세포 혼합물은 혈장 또는 혈청을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 하기 단계들에 의해 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역을 확인하는 단계를 더 포함하는 방법:
    상기 특정 혈액 세포 계통 및 상기 다른 세포 계통을 포함하는 복수의 세포 계통의 각각에 대한 복수의 부위의 메틸화 지수를 수득하는 단계;
    상기 복수의 부위의 각각의 부위에서, 상기 복수의 세포 계통의 메틸화 지수들을 비교하는 단계;
    제1 메틸화 역치 미만/초과인 상기 특정 혈액 세포 계통의 메틸화 지수와 제2 메틸화 역치 초과/미만인 상기 다른 세포 계통의 각각의 메틸화 지수를 갖는 상기 복수의 부위 중 하나 이상의 부위를 확인하는 단계; 및
    상기 하나 이상의 부위를 포함하는 차별적으로 메틸화된 영역을 확인하는 단계.
  6. 제1항에 있어서, 하기 단계들을 포함하는, 상기 하나 이상의 컷오프 값을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법:
    복수의 샘플을 수득하는 단계로서, 각각의 샘플이 특정 분류의 혈액 장애를 갖는 것으로 공지되어 있고, 상기 복수의 샘플은 적어도 2종의 분류의 혈액 장애를 갖는 것인 단계;
    상기 복수의 샘플의 각각에 대해 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역의 메틸화 수준을 결정하는 단계;
    제1 분류의 혈액 장애를 갖는 샘플의 제1 세트를 확인하는 단계;
    제2 분류의 혈액 장애를 갖는 샘플의 제2 세트를 확인하는 단계로서, 상기 샘플의 제1 세트는 상기 샘플의 제2 세트보다 통계적으로 더 높은 메틸화 수준을 집합적으로 가지는 것인 단계; 및
    지정된 특이성 및 민감성 내에서 상기 샘플의 제1 세트와 상기 샘플의 제2 세트 간을 식별하는 컷오프 값을 결정하는 단계.
  7. 제1항에 있어서, 상기 혈액 장애의 분류를 결정하는 단계는 상기 혈액 장애의 특정 유형을 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 혈액 장애의 분류가 상기 포유동물이 상기 혈액 장애를 가지는 것을 나타낸다는 결정에 응하여 상기 혈액 장애에 대해 상기 포유동물을 치료하는 단계;
    치료 후, 업데이트된 메틸화 수준을 결정하기 위하여 상기 검정을 반복하는 단계; 및
    상기 업데이트된 메틸화 수준에 기초하여 상기 치료를 수행하는 것을 지속할지의 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 치료를 수행하는 것을 지속할지의 여부를 결정하는 단계는,
    상기 업데이트된 메틸화 수준이 상기 메틸화 수준에 비하여 지정된 역치 내로 변화되지 않는 경우, 상기 치료를 중단하거나, 상기 치료의 용량을 증가시키거나, 또는 상이한 치료를 속행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 치료를 수행하는 것을 지속할지의 여부를 결정하는 단계는,
    상기 업데이트된 메틸화 수준이 상기 메틸화 수준에 비하여 지정된 역치 내로 변화된 경우, 치료를 지속하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 메틸화 수준을 하나 이상의 컷오프 값과 비교한 것에 기초하여 혈액 장애가 존재하는 것을 결정하는 단계; 및
    상기 혈액 장애가 존재한다는 결정에 응하여 골수 생검을 수행하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 검정은 PCR 검정 또는 서열분석 검정인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역은 CpG 부위를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역 중 제1 영역은 서로 100bp 이내인 복수의 CpG 부위를 포함하고, 그리고 상기 복수의 CpG 부위는 모두 저메틸화되거나 또는 과메틸화된 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 복수의 CpG 부위는 상기 포유동물에 상응하는 참조 게놈 상에 100bp 또는 그 미만의 범위에 걸쳐 있는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 특정 혈액 세포 계통은 적혈구인 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 혈액 샘플의 헤모글로빈 수준을 측정하는 단계;
    상기 헤모글로빈 수준을 헤모글로빈 역치와 비교하는 단계; 및
    상기 헤모글로빈 수준을 헤모글로빈 역치와 비교한 것에 추가로 기초하여 상기 혈액 장애의 분류를 결정하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역 중 하나는 FECH 유전자 내에 있는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역 중 하나는 염색체 12 내에 게놈 좌표 48227688 - 48227701에 있는 것인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역 중 하나는 염색체 12 내에 게놈 좌표 48228144 - 48228154에 있는 것인 방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 혈액 장애는 빈혈인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 혈액 장애의 분류는 증가된 적혈구생성 활성, 중간 적혈구생성 활성, 또는 감소된 적혈구생성 활성에 상응하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 혈액 장애의 분류는 β-지중해빈혈로부터의 증가된 적혈구생성 활성인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 혈액 장애의 분류는 철 결핍성 빈혈로부터의 중간 적혈구생성 활성인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 혈액 장애의 분류는 재생불량성빈혈 또는 만성 신부전으로부터의 감소된 적혈구생성 활성인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역은 저메틸화된 것인 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 무세포 혼합물은 혈장인 방법.
  28. 생물학적 샘플에서 특정 세포 계통의 세포의 양을 측정하는 방법으로서,
    생물학적 샘플의 무세포 혼합물을 수득하는 단계로서, 상기 무세포 혼합물은 복수의 세포 계통으로부터의 무세포 DNA를 포함하는 것인 단계;
    상기 무세포 혼합물 내 DNA 단편을 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역에 상응하는 검정과 접촉시키는 단계로서, 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역의 각각은 다른 세포 계통에 비하여 저메틸화되거나 또는 과메틸화됨에 의해 특정 혈액 세포 계통에 특이적인 것인 단계;
    상기 검정으로부터 수득된 신호에 기초하여 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역에서 상기 무세포 혼합물 내 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA 단편의 제1 수를 검출하는 단계;
    상기 제1 수를 사용하여 제1 메틸화 수준을 결정하는 단계;
    하나 이상의 보정 데이터 포인트를 수득하는 단계로서, 각각의 보정 데이터 포인트는 (1) 상기 특정 세포 계통의 세포의 양 및 (2) 보정 메틸화 수준을 특정하고, 그리고 상기 하나 이상의 보정 데이터 포인트는 복수의 보정 샘플로부터 결정되는 것인 단계;
    상기 제1 메틸화 수준을 적어도 하나의 보정 데이터 포인트의 보정 메틸화 수준과 비교하는 단계; 및
    상기 비교에 기초하여 상기 생물학적 샘플 내 상기 특정 세포 계통의 세포의 양을 추정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 특정 세포 계통은 특정 혈액 세포 계통인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 보정 데이터 포인트는 복수의 보정 데이터 포인트이고 그리고 상기 보정 데이터 포인트는 보정 곡선을 형성하는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령어를 저장하는 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하는 컴퓨터 제품.
  32. 제31항의 컴퓨터 제품; 및
    컴퓨터 판독가능 매체 상에 저장된 명령어를 실행하기 위한 하나 이상의 프로세서
    를 포함하는 시스템.
  33. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 구성된 시스템.
  34. 하기 단계들을 수행함에 의해 포유동물의 혈액 샘플을 분석하는 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령어를 저장하는 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하는 컴퓨터 제품:
    검정으로부터 수득된 신호에 기초하여 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역에서 상기 혈액 샘플의 무세포 혼합물 내 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA 단편의 제1 수를 검출하는 단계로서, 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역의 각각은 다른 세포 계통에 비하여 저메틸화되거나 또는 과메틸화됨에 의해 특정 혈액 세포 계통에 특이적인 것인 단계;
    상기 제1 수를 사용하여 메틸화 수준을 결정하는 단계; 및
    상기 메틸화 수준을 상기 포유동물 내 혈액 장애의 분류를 결정하는 부분으로서 하나 이상의 컷오프 값과 비교하는 단계.
  35. 하기 단계들을 수행함에 의해 생물학적 샘플 내 특정 세포 계통의 세포의 양을 측정하는 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령어를 저장하는 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하는 컴퓨터 제품:
    검정으로부터 수득된 신호에 기초하여 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역에서 상기 생물학적 샘플의 무세포 혼합물 내 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA 단편의 제1 수를 검출하는 단계로서, 상기 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역의 각각은 다른 세포 계통에 비하여 저메틸화되거나 또는 과메틸화됨에 의해 특정 세포 계통에 특이적인 것인 단계;
    상기 제1 수를 사용하여 제1 메틸화 수준을 결정하는 단계;
    하나 이상의 보정 데이터 포인트를 수득하는 단계로서, 각각의 보정 데이터 포인트는 (1) 상기 특정 세포 계통의 세포의 양 및 (2) 보정 메틸화 수준을 특정하고, 그리고 상기 하나 이상의 보정 데이터 포인트는 복수의 보정 샘플로부터 결정되는, 상기 보정 데이터 포인트를 수득하는 단계;
    상기 제1 메틸화 수준을 적어도 하나의 보정 데이터 포인트의 보정 메틸화 수준과 비교하는 단계; 및
    상기 비교에 기초하여 상기 생물학적 샘플 내 상기 특정 세포 계통의 세포의 양을 추정하는 단계.
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