CN109196120A - 使用血液中的无细胞dna检测血液病症 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用血液样本中的无细胞DNA，例如使用血浆或血清来检测血液病症的技术。举例来说，分析可以靶向对特定血液细胞谱系(例如，成红细胞)具有特异性的一个或多个差异甲基化区域。可以从所述分析中量化甲基化水平，以确定所述血液样本的无细胞混合物中甲基化或未甲基化DNA片段的量。可以将所述甲基化水平与例如对应于所述特定血液细胞谱系的正常范围的一个或多个截止值进行比较，作为确定血液病症的水平的部分。

Description

使用血液中的无细胞DNA检测血液病症
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月30日提交的标题为“使用血液中的无细胞DNA检测血液病症”的美国临时申请第62/343,050号的优先权且是所述美国临时申请的非临时申请，其全部内容出于所有目的通过引用并入本文中。
背景技术
为确定血液病症(例如，贫血)是否存在于人体中，常规技术进行骨髓活检的组织学检查。然而，骨髓活检是侵入性手术，导致经历这种手术的患者的疼痛和焦虑。因此，期望鉴别用于检测和表征人体的血液病症的新技术。
贫血可以由多个临床病况引起，每个具有其自身的治疗。因此，其将临床上适用于确定贫血病例的原因，以及随后相应地进一步研究或治疗。贫血的一个原因是红细胞生成(产生红血细胞的过程)所必需的营养素的缺乏，例如(但不限于)铁，B12，叶酸等。贫血的另一个原因是失血，其可以是急性的或者是慢性的。失血可由例如月经过多或胃肠道出血引起。贫血也常见于许多慢性病症，也称为慢性疾病贫血，可在癌症和炎症性肠病中发现。
因此，期望提供用于针对血液病症筛选受试者、用于确定血液病症的原因、用于监测患有血液病症的受试者和/或确定对患有血液病症的受试者的恰当治疗的新技术。
发明内容
一些实施例提供用于使用血液样本中的无细胞DNA，例如使用血浆或血清检测血液病症的系统、方法和装置。举例来说，分析可以靶向对特定血液细胞谱系(例如，成红细胞)具有特异性的一个或多个差异甲基化区域。可以从所述分析中量化甲基化水平，以确定所述血液样本的无细胞混合物中甲基化或未甲基化DNA片段的量。可以将所述甲基化水平与例如对应于所述特定血液细胞谱系的正常范围的一个或多个截止值进行比较，作为确定血液病症的水平的部分。一些实施例可使用一种或多种甲基化水平以类似方式测量血液样本中特定血液细胞谱系的DNA(例如，成红细胞DNA)的量。
这种分析可以提供对血液病症的检测而无需进行骨髓活检的侵入性手术。举例来说，我们的结果表明，骨髓细胞对循环无细胞DNA有很大比例的贡献。对循环无细胞DNA中的造血细胞的甲基化标记的分析可反映骨髓细胞的状态。这些实施例可特别适用于监测骨髓对治疗的反应，例如患有缺铁性贫血的患者对口服铁疗法的反应。实施例还可以用于为患者分配不同手术，例如骨髓活检或更小的侵入性研究。
其它实施例涉及与本文中所描述的方法相关的系统和计算机可读媒体。
参考以下详细描述和附图，可以更好地理解本发明实施例的性质和优点。
附图说明
图1显示根据本发明的实施例的亚铁螯合酶(FECH)基因的启动子内的CpG位点的甲基化密度。
图2A和2B显示根据本发明的实施例的使用设计用于检测甲基化和未甲基化DNA的数字PCR分析对普遍甲基化和未甲基化DNA的分析。
图3A是显示根据本发明的实施例的血细胞中的E％与成核RBC(成红细胞)数量之间的相关性的图。图3B是根据本发明的实施例说明通过分析无细胞DNA确定生物样本中特定细胞谱系的细胞量的方法300的流程图。
图4显示根据本发明的实施例的健康非怀孕受试者和不同妊娠期的孕妇的血沉棕黄层和血浆中的Unmeth％。
图5是显示血沉棕黄层和血浆中的Unmeth％之间缺乏相关性的图。
图6A和6B显示根据本发明的实施例的健康受试者中红细胞DNA百分比(E％(FECH))。E％可以定义为与Unmeth％相同。
图7显示血浆DNA的E％(FECH)结果与健康受试者年龄之间缺乏相关性。
图8是根据本发明的实施例的针对患有再生障碍性贫血、β-重型地中海贫血的患者和健康对照受试者中血红蛋白浓度的Unmeth％的图。
图9是根据本发明的实施例的患有缺铁(Fe)性贫血和急性失血的患者中血浆Unmeth％的图。
图10显示根据本发明的实施例的患有再生障碍性贫血、慢性肾衰竭(CRF)、β-重型地中海贫血、缺铁性贫血的患者和健康受试者中血浆中红细胞DNA百分比(E％(FECH))与血红蛋白水平之间的关系。
图11A和11B显示根据本发明的实施例的患有再生障碍性贫血、慢性肾衰竭(CRF)、β-重型地中海贫血和缺铁性贫血的贫血患者中网织红细胞计数/指数和血红蛋白水平之间的关系。
图12是根据本发明的实施例的患有骨髓发育不良综合征和真性红细胞增多症的患者中血浆Unmeth％的图。
图13A显示根据本发明的实施例的患有再生障碍性贫血(AA)和骨髓发育不良综合征(MDS)的患者中血浆中红细胞DNA百分比(E％(FECH))。图13B显示根据本发明的实施例的再生障碍性贫血中治疗反应组和治疗无反应组之间的血浆中红细胞DNA百分比(E％(FECH))。
图14是根据本发明的实施例的针对正常受试者和患有白血病的两名患者中血红蛋白浓度的血浆中Unmeth％的图。
图15A和15B显示根据本发明的实施例的染色体12上的成红细胞特异性DMR内的CpG位点的甲基化密度。
图16显示对来自ENCODE数据库的两个其它成红细胞特异性DMR(Ery-1和Ery-2)的组蛋白修饰(H3K4me1和H3K27Ac)。
图17A和17B显示通过靶向Ery-1标记物(图17A)和Ery-2标记物(图17B)的数字PCR分析测量的β-重型地中海贫血患者的血沉棕黄层DNA中的红细胞DNA序列百分比(E％)与使用自动血液学分析仪测量的所有外周血白细胞中的成红细胞百分比之间的相关性。
图18A和18B显示β-重型地中海贫血患者的血沉棕黄层DNA的E％(FECH)结果与E％(Ery-1)和E％(Ery-2)的相关性。
图19显示根据本发明的实施例的使用靶向三个成红细胞特异性DMR的数字PCR分析的健康受试者和患有再生障碍性贫血和β-重型地中海贫血的患者中红细胞DNA的百分比。
图20A和20B显示根据本发明的实施例的在治疗前状态和治疗后两天接受静脉内铁疗法的缺铁性贫血的血浆DNA中红细胞DNA百分比(E％(FECH))和网织红细胞计数百分比的系列测量值。
图21A显示根据本发明的实施例在接受口服铁治疗的因月经过多导致患有缺铁性贫血的患者中成红细胞DMR处的血浆E％的系列变化。图21B显示治疗后血红蛋白的变化。
图22显示接受重组促红细胞生成素(EPO)或红细胞生成刺激剂(ESA)治疗的患有慢性肾病(CKD)的患者中成红细胞DMR处的血浆Unmeth％的系列变化。
图23A显示根据本发明的实施例的接受抗胸腺细胞球蛋白(ATG)治疗或环孢菌素作为免疫抑制疗法的患有再生障碍性贫血的患者中成红细胞DMR处的血浆Unmeth％的系列变化。图23B显示接受治疗的患有再生障碍性贫血的患者中血红蛋白的系列变化。
图24A和24B显示针对患有再生障碍性贫血的四名患者中血红蛋白浓度的血浆中的Unmeth％的图。
图25说明根据本发明的实施例的显示健康受试者和贫血患者中的FECH基因相关DMR(拷贝/毫升血浆)处的红细胞DNA的绝对浓度的箱须图。
图26是示出根据本发明的实施例的分析哺乳动物的血液样本的方法的流程图。
图27说明根据本发明的实施例的系统2700。
图28示出可与根据本发明的实施例的系统和方法一起使用的实例计算机系统的框图。
具体实施方式
术语
“甲基化组”提供了基因组中多个位点或基因座处的DNA甲基化量的量度。甲基化组可以对应于所有基因组、基因组的大部分或基因组的相对较小部分。
“细胞谱系”表示来自受精胚胎的组织或器官的发育历史。不同类型的组织(例如，不同类型的血细胞)将具有不同的细胞谱系。红血细胞(RBC)通过一系列中间细胞来源于原成红细胞。原成红细胞、原巨核细胞和成髓细胞来源于共同的骨髓祖细胞。淋巴细胞来源于共同的淋巴祖细胞。成核RBC是成红细胞，未成熟的去核RBC是网织红细胞，且成熟的去核RBC是红细胞，红细胞是血流中携带血红蛋白的红细胞。
“无细胞混合物”对应于包括来自各种细胞的无细胞DNA片段的样本。举例来说，无细胞混合物可包括来自各种细胞谱系的无细胞DNA片段。血浆和血清是从血液样本(例如通过离心)获得的无细胞混合物的实例。其它无细胞混合物可来自其它生物样本。“生物样本”是指取自受试者(例如，人类，如孕妇、患有癌症的个人、或疑似患有癌症的个体、器官移植接受者或疑似具有涉及器官的疾病过程(例如心肌梗塞的心脏、中风的大脑、或贫血的造血系统)的受试者)且含有一个或多个相关核酸分子的任何样本。生物样本可以是体液，例如血液、血浆、血清、尿液、阴道液、水囊肿(例如，睾丸)液，或阴道冲洗液、胸膜液、腹水液、脑脊髓液、唾液、汗液、泪液、痰液、支气管肺泡灌洗液等。也可以使用粪便样本。在各种实施方案中，已经富集无细胞DNA的生物样本(例如，通过离心方案获得的血浆样本)中大部分DNA可以是无细胞的(与细胞相对)，例如大于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。离心方案可以包括3,000g×10分钟，获得流体部分，且以30,000g再离心另外10分钟以去除残留的细胞。
“血浆甲基化组”是从动物(例如，人类)的血浆或血清确定的甲基化组。血浆甲基化组是无细胞甲基化组的一实例，因为血浆和血清包括无细胞DNA。血浆甲基化组也是混合甲基化组的一实例，因为其是来自身体内的不同器官或组织或细胞的DNA混合物。在一个实施例中，这些细胞是造血细胞，包括(但不限于)红细胞系(即红细胞)谱系、髓系谱系(例如，嗜中性粒细胞和其前体)和巨核细胞谱系的细胞。在怀孕期间，血浆甲基化组可以含有胎儿和母亲的甲基化组信息。在患有癌症的患者中，血浆甲基化组可以含有来自患者体内的肿瘤细胞和其它细胞的甲基化组信息。“细胞甲基化组”对应于从患者的细胞(例如，血细胞)确定的甲基化组。血细胞的甲基化组称为血细胞甲基化组(或血液甲基化组)。用于确定甲基化组的技术进一步描述于标题为“从血浆非侵入性确定胎儿或肿瘤的甲基化组”的PCT专利申请第WO2014/043763号中，其公开内容出于所有目的通过引用整体并入。
“位点”对应于单个位点，其可以是单个碱基位置或一组相关碱基位置，例如CpG位点。“基因座”可以对应于包括多个位点的区域。基因座可以仅包括一个位点，此将使得所述基因座在此背景下相当于一个位点。
每个基因组位点(例如，CpG位点)的“甲基化指数”可以指覆盖位点的读段总数内的显示所述位点处的甲基化的DNA片段的比例(例如，如从序列读段或探针确定)。“读段”可以对应于从DNA片段获得的信息(例如，位点处的甲基化状态)。可以使用优先与特定甲基化状态的DNA片段杂交的试剂(例如，引物或探针)来获得读段。通常，这些试剂在用根据其甲基化状态差异修饰DNA分子的方法处理之后施用，例如亚硫酸氢盐转化或甲基化敏感性限制酶。读段可以为序列读段。“序列读段”是指从核酸分子的任何部分或全部测序的一串核苷酸。举例来说，序列读段可以是从核酸片段测序的短核苷酸串(例如，20-150个)、在核酸片段的一个或两个末端处的短核苷酸串，或生物样本中存在的整个核酸片段的测序。序列读段可以通过多种方式获得，例如使用测序技术或使用探针(例如，杂交阵列或捕获探针，或扩增技术，例如聚合酶链反应(PCR)或使用单引物的线性扩增或等温扩增)。
区域的“甲基化密度”可以指展示甲基化的区域内位点处的读段数目除以所述区域中覆盖所述位点的读段总数。位点可以具有具体的特征，例如是CpG位点。因此，区域的“CpG甲基化密度”可以指展示CpG甲基化的读段数目除以所述区域中覆盖CpG位点(例如，特定CpG位点、CpG岛内的CpG位点或较大区域)的读段总数。举例来说，人类基因组中每个100-kb组(bin)的甲基化密度可以利用亚硫酸氢盐处理之后的CpG位点处未转化的胞嘧啶(其对应于甲基化胞嘧啶)总数占映射到100kb区域的序列读段所覆盖的所有CpG位点的比例来确定。也可以对其它组尺寸进行这个分析，例如500bp、5kb、10kb、50-kb或1-Mb等。区域可以是全基因组或染色体或染色体的部分(例如，染色体臂)。当一个区域仅包括一个CpG位点时，那个CpG位点的甲基化指数与所述区域的甲基化密度相同。“甲基化胞嘧啶的比例”可以指在分析的胞嘧啶残基的总数内的(即在区域中包括CpG背景外的胞嘧啶)展示甲基化(例如，在亚硫酸氢盐转化之后未转化)的胞嘧啶位点“C's”的数目。甲基化指数、甲基化密度和甲基化胞嘧啶的比例是“甲基化水平”的实例。除亚硫酸氢盐转化之外，所属领域技术人员已知的其它方法可用于查询DNA分子的甲基化状态，包括(但不限于)对甲基化状态敏感的酶(例如，甲基化敏感性限制酶)、甲基化结合蛋白、使用对甲基化状态敏感的平台进行单分子测序(例如，纳米孔测序(Schreiber等人《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sc)》2013；110:18910-18915)和太平洋生物科学(Pacific Biosciences)的单分子实时分析(Flusberg等人《自然方法(Nat Methods)》2010；7:461-465))。
“甲基化谱”(也称为甲基化状态)包括与区域的DNA甲基化有关的信息。与DNA甲基化有关的信息可以包括(但不限于)CpG位点的甲基化指数、区域中CpG位点的甲基化密度、相邻区域上CpG位点的分布、含有超过一个CpG位点的区域内每一个别CpG位点的甲基化模式或水平以及非CpG甲基化。基因组中大部分的甲基化谱可以视为相当于甲基化组。哺乳动物基因组中的“DNA甲基化”通常是指将甲基添加到CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基的5'碳(即5-甲基胞嘧啶)。DNA甲基化可以发生于其它背景中的胞嘧啶中，例如CHG和CHH，其中H是腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。胞嘧啶甲基化还可以呈5-羟甲基胞嘧啶形式。还报道了非胞嘧啶甲基化，例如N6-甲基腺嘌呤。
“组织”对应于集合在一起作为功能单元的一组细胞。可以在单一组织中发现超过一种类型的细胞。不同类型的组织可由不同类型的细胞(例如，肝细胞、肺泡细胞或血细胞)组成，而且可对应于来自不同生物体(母亲对比胎儿)的组织或对应于健康细胞对比肿瘤细胞。“参考组织”对应于用于确定组织特异性甲基化水平的组织。可以利用来自不同个体的相同组织类型的多个样本确定这种组织类型的组织特异性甲基化水平。来自相同个体的相同组织在不同时间可能由于生理学(例如，怀孕)或病理学(例如，癌症或贫血或感染或突变)而展现出差异。来自不同个体的相同组织可能由于生理学(例如，年龄、性别)或病理学(例如，癌症或贫血或感染或突变)而展现出差异。
也被称为“病症的分类”的术语“病症的水平”可以指无论病症是否存在，对病症的类型、病症的阶段和/或病症的严重程度的其它量度的分类。水平可以是数字或其它字符。水平可以是零。病症的水平可用于多种方式中。举例来说，筛选可以检查先前不知道患有病症的某人是否存在病症。评定可以研究已经被诊断为患有病症的某人以监测病症随时间推移的发展、研究疗法的效用或确定预后。在一个实施例中，预后可表示为患者死于病症的可能性或所述病症在特定持续时间后进展的可能性。检测可以意指‘筛选’或可以意指检查具有病症的潜在特征(例如，症状或其它阳性测试)的某人是否患有病症。
贫血是指一种其中红血细胞数量或其携氧能力不足以满足生理需要的病况，其可通过年龄、性别、海拔、吸烟和怀孕状态而变化。根据世界卫生组织(World HealthOrganization，WHO)的建议，当男性的血红蛋白浓度低于130g/L且女性的血红蛋白浓度低于110g/L时，可以诊断为贫血。术语“贫血程度”可以通过受试者的血红蛋白浓度来反映。较低的血红蛋白水平表明更严重的贫血程度。根据WHO的建议，严重贫血是指男性的血红蛋白浓度<80g/L，且女性的血红蛋白浓度<70g/L，中度贫血是指男性的血红蛋白浓度为80-109g/L，且女性的血红蛋白浓度是70-99g/L，轻度贫血是指男性的血红蛋白浓度为110-129g/L，且女性的血红蛋白浓度为100-109g/L。
“分离值”对应于涉及两个值(例如，两个贡献率或两个甲基化水平)的差值或比率。分离值可以是简单的差值或比率。分离值可以包括其它因素，例如乘法因子。作为其它实例，可以使用所述值的函数的差值或比率，例如两个值的自然对数(ln)的差值或比率。分离值可以包括差值和比率。
如本文中所使用，术语“分类”是指与样本的特定特性相关的任何数字或其它字符。举例来说，“+”符号(或词语“正”)可以表示样本归类为具有缺失或扩增。分类可以是二进制(例如，正或负)或具有更多的分类水平(例如，从1到10或0到1的标度)。术语“截止值”和“阈值”是指运算中所用的预定数字。阈值可以是一种值，高于或低于所述值则适用特定分类。这些术语中的任一个可以在这些背景中的任一背景下使用。
在一些实施例中，来自成红细胞的无细胞DNA(也称为循环DNA)的贡献使用相对于来自其它组织的无细胞DNA对成红细胞具有特异性的一个或多个甲基化标记(例如，每个标记物一个标记)来定量。标记物(例如，差异甲基化区域，DMR)可以包括一个位点或一组有助于相同标记的位点。
来自成红细胞的无细胞DNA的贡献可用于确定血液病症(例如贫血)的水平。举例来说，实施例可用于分析胎儿、新生儿或儿童的贫血。在贫血症的背景下，实施例可用于研究怀疑患有贫血或已被诊断患有贫血的某人：(i)以阐明贫血的原因；(ii)以监测临床状态随时间推移的进展；(iii)以研究疗法的效果；或(iv)以确定预后。因此，实施例已将红细胞DNA鉴别为迄今未被识别的循环DNA库的主要组分，且作为用于鉴别诊断和监测贫血以及其它血液病症的非侵入性生物标志物。
I.引言
血浆DNA是用于分子诊断的越来越实行的分析物。正在进行关于其临床应用，尤其在非侵入性产前测试(1-7)和肿瘤学(8-12)中的研究工作。尽管有各种各样的临床应用，但尚未完全了解循环DNA的组织来源。
已显示，使用性别不匹配的骨髓移植作为模型系统，循环DNA主要从造血细胞中释放(13、14)。Kun等人最近证实显著比例的血浆DNA具有嗜中性粒细胞和淋巴细胞的甲基化标记(15)。然而，目前还没有关于红细胞来源(成红细胞)的DNA是否也可以在血浆中检测到的信息。
红血细胞(RBC)是血液中最大的造血细胞群体。红血细胞(RBC)的浓度为约每升血液5×1012个。鉴于每个RBC的寿命为约120天，身体需要生产2×1011个RBC/天或9.7×109个RBC/小时。人类中成熟的RBC没有细胞核。
在去核步骤期间，成红细胞失去其核且成熟为骨髓中的网织红细胞(16)。去核过程是一个复杂的多步骤过程，涉及紧密调节的细胞信号传导动作和细胞骨架动作。成红细胞的细胞核材料通过成红细胞岛中(例如，骨髓中)的骨髓巨噬细胞被吞噬且降解(17)。我们假设来自骨髓的红细胞谱系的一些降解DNA材料将释放到循环中。
实施例可以鉴别来自红细胞来源的细胞的DNA的甲基化标记且使用这些标记以确定红细胞DNA在人类血浆中是否是可检测的。不同组织和造血细胞类型的高分辨率参考甲基化组已通过合作项目变为公众可用的，所述项目包括BLUEPRINT项目(18、19)和路线图表观基因组学项目(Roadmap Epigenomics Project)(20)。我们和其它人先前已经证实，有可能通过组织相关的甲基化标记的分析来跟踪血浆DNA的来源(15、21、22)。确定某些组织对无细胞混合物(例如，血浆)的贡献的这种分析的其它细节可发现于标题为“DNA混合物中组织的甲基化模式分析”的PCT专利申请第WO 2016/008451号中，其的公开内容出于所有目的通过引用整体并入。
为验证我们的假设且证实红细胞DNA在血浆中的存在，我们通过分析成红细胞和其它组织类型的甲基化谱来鉴别成红细胞特异性差异甲基化区域(DMR)。基于这些发现，我们开发了靶向成红细胞特异性DMR的数字聚合酶链反应(PCR)分析，以实现对生物样本中红细胞DNA的定量分析。确切地说，使用成红细胞和其它组织类型的高分辨率甲基化谱，发现三个基因组基因座在成红细胞中是低甲基化的但在其它细胞类型中是高度甲基化的。开发数字PCR分析以用于使用每个基因座的差异甲基化区域来测量红细胞DNA。
我们应用这些数字PCR分析以研究健康受试者和患有不同类型贫血的患者的血浆样本。我们还探讨了所述分析在贫血评估中的潜在临床效用。尽管实例使用PCR分析，但也可以使用其它分析，例如测序。
在患有不同病因的贫血的受试者中，我们表明循环红细胞DNA的定量分析(例如，使用甲基化标记物)反映了骨髓中的红细胞生成活性。对于具有减少的红细胞生成活性的患者，如由再生障碍性贫血所示例，循环红细胞DNA的百分比减少。对于具有增加的但失效的红细胞生成的患者，如由β-重型地中海贫血所示例，百分比增加。此外，发现红细胞DNA的血浆水平与再生障碍性贫血和缺铁性贫血的治疗反应相关。使用靶向其它两个差异甲基化区域的数字PCR分析的血浆DNA分析显示了类似的发现。
II.成红细胞的差异甲基化区域(DMR)
我们假设涉及RBC的成熟的红细胞去核过程或其它过程将对循环无细胞DNA库做出显著贡献。为确定来自成红细胞的循环DNA的贡献，我们通过比较成红细胞与其它组织和血细胞的DNA甲基化谱来鉴别成红细胞DNA中的差异甲基化区域(DMR)。我们从BLUEPRINT项目和路线图表观基因组学项目研究了成红细胞和其它血细胞(中性粒细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞)和组织(肝、肺、结肠、小肠、胰腺、肾上腺、食道、心脏、脑和胎盘)的甲基化谱和通过我们组产生的甲基化组(18-20、23)。
在一简单的实例中，可以直接使用一个或多个DMR以例如通过确定甲基化(对于高度甲基化的DMR)或未甲基化(对于低甲基化的DMR)的DNA片段的百分比来确定来自红细胞的循环DNA的贡献。百分比可以直接使用或修改(例如，乘以比例因子)。其它实施例可以执行更复杂的程序，例如对线性方程组求解。如PCT专利申请第WO 2016/008451号所描述，可利用N个基因组位点处的甲基化水平来计算M个组织的贡献，其中M小于或等于N。可针对每个组织计算每个位点处的甲基化水平。可以对线性方程组Ax＝b求解，其中b是N个位点的所测量的甲基化密度的向量，x是M个组织的贡献的向量，且A是M个行和N个列的矩阵，其中每一行在那一行的特定位点处提供N个组织的甲基化密度。如果M小于N，那么可以进行最小二乘方优化。尺寸N×M的矩阵A可以由参考组织的组织特异性甲基化水平形成，如从上述来源所获得。
A.DMR的鉴别
为鉴别差异甲基化区域(DMR)，特定类型的组织/细胞谱系(例如，成红细胞)可被分离，且随后例如使用甲基化感知测序来分析，如本文中所描述。可以分析跨组织类型的位点(例如，仅两种类型的成红细胞和其它)的甲基化密度，以确定是否存在足够的差异，从而鉴别用于DMR中的位点。
在一些实施例中，一个或多个以下标准可以用于鉴别成红细胞的甲基化标记物。(1)如果CpG位点的甲基化密度在成红细胞中小于20％且在其它血细胞和组织中超过80％，则CpG位点在成红细胞中低甲基化，且反之亦然。(2).为成为DMR，可以要求区域包括低甲基化的多个CpG位点(例如，3、4、5或更多个)。因此，可选择DMR内的一段多个CpG位点以通过分析进行分析，以便改善DMR的信噪比和特异性。(3)可以选择DMR具有代表无细胞混合物中的DNA分子的大小。在血浆中，主要是短DNA片段，其中大部分短于200bp(1、24、25)。对于确定血浆中红细胞DNA分子存在的实施例，DMR可以定义在血浆DNA分子的代表性大小内(即166bp)(1)。这些标准的变化可以与这三个标准组合使用，例如除20％和80％之外的不同阈值可用于将CpG位点鉴别为低甲基化。如稍后所讨论，一些结果使用在成红细胞中低甲基化的三个成红细胞特异性DMR内的选定CpG位点。
利用上述定义的标准，我们鉴别了在全基因组中的三个成红细胞特异性DMR。一个DMR在染色体18上的亚铁螯合酶(FECH)基因的内含子区域内。在这个区域中，在所鉴别的三个DMR中，成红细胞和其它细胞类型之间的甲基化密度的差异最大。所述FECH基因编码亚铁螯合酶，其是负责血红素生物合成的最终步骤的酶(26)。如图1所示，成红细胞特异性DMR内的四个选定的CpG位点均在成红细胞中低甲基化，但在其它血细胞和组织中高度甲基化。
图1显示根据本发明的实施例的亚铁螯合酶(FECH)基因的启动子内的CpG位点的甲基化密度。FECH基因位于染色体18上，且CpG位点的基因组坐标显示在X轴上。如所示，CpG位点的甲基化密度在FECH基因的内含子区域内。位于由两条垂直虚线界定的区域110内的四个CpG位点均在成红细胞中低甲基化，但在其它组织或细胞类型中高度甲基化。出于说明的目的，未显示肺、心脏、小肠、结肠、胸腺、胃、肾上腺、食道、膀胱、脑、卵巢和胰腺的个体结果。它们的平均值由“其它组织”表示。
由于位于这个区域内的CpG位点低甲基化，图1中的两条虚线内的所有四个CpG位点的未甲基化序列将富集来源于成红细胞的DNA。因此，DNA样本中低甲基化序列的量将反映来自成红细胞的DNA量。
开发一种分析以检测在所鉴别CpG位点处的甲基化或未甲基化的DNA。血浆DNA分子内的CpG数量越高，分析将更具特异性。大多数血浆DNA分子小于200bp，平均为166bp。因此，CpG位点可以全部在彼此的166bp内，但也可以在彼此的150、140、130、120、110或100bp内。在其它实施例中，仅成对的CpG位点可以在彼此的这种距离内。
在其它实施例中，如果CpG位点的甲基化密度在成红细胞中小于10％(或其它阈值)且在所有其它组织和血细胞中超过90％(或其它阈值)，那么CpG位点可被定义为在成红细胞中低甲基化。如果CpG位点的甲基化密度在成红细胞中高于90％(或其它阈值)且在所有其它组织和血细胞中低于10％(或其它阈值)，那么CpG位点可被定义为在成红细胞中高度甲基化。在一些实施方案中，DMR可以具有100bp内的至少两个CpG位点，所有均显示成红细胞的差异甲基化。
在鉴别诊断上有用的DMR的一个实施方案中，可要求100bp(或一些其它长度)内的所有CpG位点与所有其它组织和血细胞相比较显示在成红细胞中低甲基化或高度甲基化。举例来说，多个CpG位点可在对应于哺乳动物的参考基因组上跨越100bp或更少。作为另一实例，每个CpG位点可在另一个CpG位点的100bp内。因此，CpG位点可跨越超过100bp。
在一些实施例中，一个或多个差异甲基化区域可以下面的方式来鉴别。可为多个细胞谱系中的每一个获得多个位点的甲基化指数(例如，密度)，所述多个细胞谱系包括特定的血液细胞谱系和其它细胞谱系，例如如图1中所展示。在多个位点的每个位点处，可以将多个细胞谱系的甲基化指数与彼此进行比较。基于比较，可鉴别多个位点中的一个或多个位点，每个位点在特定血液细胞谱系中具有低于/高于第一甲基化阈值的甲基化指数和在每个其它细胞谱系中高于/低于第二甲基化阈值的甲基化指数。以这种方式，可鉴别低甲基化位点和/或高度甲基化位点。第一甲基化阈值的实例对于低甲基化位点为10％、15％或20％，其中第二甲基化阈值的实例可为80％、85％或90％。随后可例如使用上文所描述的标准鉴别含有一个或多个位点的差异甲基化区域。
B.检测甲基化和未甲基化的DNA序列
为在成红细胞特异性DMR处检测甲基化和未甲基化的DNA序列，可开发两种数字PCR分析：一个靶向未甲基化序列且另一个靶向甲基化序列。在其它实施例中，其它方法也可用于检测和/或定量DMR的甲基化和未甲基化序列，例如甲基化感知测序(例如，亚硫酸氢盐测序或生物化学或酶促过程之后的测序，其将基于其甲基化状态差异修饰DNA)、实时甲基化特异性PCR、甲基化敏感性限制酶分析和微阵列分析。因此，除PCR分析以外，可以使用其它类型的分析。
在一个实例中，成红细胞DMR可在亚硫酸氢盐处理后检测。可基于检测结果(例如，PCR信号)确定CpG位点的甲基化状态。对于FECH基因，在用于测序的亚硫酸氢盐处理后，以下引物可用于扩增红细胞DMR：5'-TTTAGTTTATAGTTGAAGAGAATTTGATGG-3'和5'-AAACCCAACCATACAACCTCTTAAT-3'。
在另一实例中，为提高分析的特异性，可使用涵盖特定CpG的甲基化和未甲基化状态两种的两个正向引物。下面列出了用于特异性靶向甲基化和未甲基化序列的两种数字PCR分析的这种引物组。
引物/探针 序列
正向引物-1 5'-TTGAAGAGAATTTGATGGTATGGGTA-3'
正向引物-2 5'-TGAAGAGAATTTGATGGTACGGGTA-3'
反向 5'-CTCAAATCTCTCTAATTTCC<u>A</u>AACAC<u>A</u>
荧光探针 5'-FAM-TTG<u>T</u>GTGG<u>T</u>GTAGAGAG-MGB-3'
表1：特异性检测未甲基化序列的分析。
引物 序列
正向 5'-TTGAAGAGAATTTGATGGTATGGGTA-3'
5'-TGAAGAGAATTTGATGGTACGGGTA-3'
反向 5'-CAAATCTCTCTAATTTCC<u>G</u>AACAC<u>G</u>-3'
荧光探针 5'-VIC-TG<u>C</u>GTGG<u>C</u>GTAGAG-MGB-3'
表2：特异性检测甲基化序列的分析
反向引物和探针中的加下划线的核苷酸是CpG位点处的差异甲基化胞嘧啶。由于加下划线的核苷酸处的差异，未甲基化和甲基化分析的反向引物和探针特异性与未甲基化和甲基化序列结合。
C.使用普遍甲基化和普遍未甲基化的DNA进行确认
进行普遍甲基化和普遍未甲基化的DNA的分析，以确认两个分析的准确性。
来自CpGenome人类甲基化DNA(EMD密理博(Millipore))的普遍甲基化序列和来自EpiTect未甲基化人类对照DNA(凯杰(Qiagen))的普遍未甲基化序列用于确认两个数字PCR分析的特异性，所述分析设计用于检测和定量成红细胞特异性DMR处的甲基化和非甲基化序列。从HCT116DKO细胞纯化CpGenome人类甲基化DNA，随后使用M.SssI甲基转移酶对所有CpG核苷酸进行酶促甲基化。普遍甲基化和普遍未甲基化的DNA序列在与阳性和阴性对照相同的板上运行。参考对照物确定阳性荧光信号的截止值。每个样本中的甲基化和未甲基化DNA序列数量使用组合计数从复孔随后泊松校正(Poissoncorrection)来计算(4)。
图2A和2B显示根据本发明的实施例的使用设计用于检测甲基化和未甲基化DNA的数字PCR分析对普遍甲基化和未甲基化DNA的分析。垂直轴对应于未甲基化序列的相对荧光信号的强度。水平轴对应于甲基化序列的相对荧光信号的强度。使用已知甲基化或未甲基化的DNA产生数据。这些分析旨在证实分析对甲基化或未甲基化DNA的特异性。
对于普遍未甲基化DNA的分析，使用针对未甲基化DNA的分析检测到放大信号(对应于阳性FAM信号的图2A的图205中的蓝点210)，其中当使用针对甲基化DNA的分析时未检测到蓝点210(图2B的图255)。为分析普遍甲基化的DNA，使用针对甲基化DNA的分析检测到放大信号(对应于阳性VIC信号的图2B的图250中的绿点220)，其中使用针对未甲基化的DNA的分析未检测到绿点220(图2A的图200)。每个图区中的黑点代表没有任何放大信号的液滴。四个图区中每一个内的粗垂直和水平线代表阳性结果的阈值荧光信号。这些结果证实两个分析对成红细胞特异性DMR的甲基化和未甲基化DNA的特异性。
为基于FECH基因相关DMR进一步评定分析的分析灵敏度，具有未甲基化序列的样本在特定分数浓度(即，FECH基因相关DMR处的所有(未甲基化和甲基化)序列中的未甲基化序列百分比)下连续稀释。每次反应总共有1,000个分子。可在低至甲基化和未甲基化序列总量的0.1％的情况下检测未甲基化序列(参见表3)。
表3：针对靶向FECH基因相关DMR的分析的灵敏度评定，在不同输入浓度的未甲基化序列下测量的浓度(未甲基化序列的百分比)。
此外，为评定潜在的变化(例如，从移液中)，我们在特定分数浓度(未甲基化序列％＝30％)下在20次单独反应中重复测量在甲基化和未甲基化序列的人工混合样本中未甲基化序列的百分比。我们对每个反应使用总共500个甲基化和未甲基化分子。这个数量与我们在血浆DNA样本的数字PCR分析中在甲基化和未甲基化分子总数中观察到的数量相当。我们观察到20次重复测量未甲基化序列百分比的平均值为30.4％且标准偏差为1.7％。分析内变异系数计算为5.7％。
III.针对不同样本的分析的特异性和灵敏度
为确认靶向红细胞DNA的FECH基因相关DMR的数字PCR分析的组织特异性，我们测试了具有不同成红细胞量的各种样本中的数字PCR分析，如使用除这些数字PCR分析之外的技术所测量。通过数字PCR分析检测的未甲基化DNA序列的量应反映红细胞DNA的量。类似地，甲基化序列的量应反映来自其它组织或细胞类型的DNA。因此，我们将生物样本中红细胞DNA的百分比(E％)定义为在成红细胞特异性DMR处的所有所检测(未甲基化和甲基化)序列中未甲基化序列的百分比。因此，使用对DMR区域的甲基化和未甲基化序列具有特异性的分析来分析血液样本，以确定未甲基化序列的百分比Unmeth％(也称为E％)和来自成红细胞的DNA的存在之间的相关性。Unmeth％(E％)是甲基化水平的实例。
红细胞DNA(E％)的百分比计算为：
由于红细胞和其它细胞类型之间的甲基化密度的差异对于FECH基因内的DMR是最大的，我们首先基于这个标记物位点进行E％分析以证明我们的假设。随后，我们基于样本子组中的另外两个成红细胞特异性DMR来分析E％，以验证来自FECH基因相关DMR的E％结果。基于FECH基因内的DMR的E％结果将由E％(FECH)表示。也可使用其它百分比或比率，例如甲基化序列的百分比，或仅甲基化序列与未甲基化序列的比率，其中任一值可以在比率的分子和分母中。
确切地说，使用数字PCR来确定图1的FECH基因上的四个CpG位点处的每个样本中甲基化和未甲基化DNA序列的数量。随后，计算样本中未甲基化DNA的百分比(Unmeth％/E％)。在一个实施例中，对于被认为是未甲基化的DNA片段，所有四个CpG位点都是未甲基化的。
使用两种情况以测试分析信号定量成红细胞的能力。一种情况是脐带血相比于成人血液，因为这两种类型的样本在成红细胞的数量方面不同。并且，对于其它情况，具有β-重型地中海贫血症的受试者在其血液中具有可观数量的成红细胞。
A.富含成红细胞的样本相比于健康受试者的血沉棕黄层
成年人血液中成红细胞的数量极低。脐带血具有更多数量的成红细胞。因此，脐带血中四个CpG位点的E％应大大高于健康患者。因此，为确认靶向红细胞DNA的FECH基因相关DMR的数字PCR分析的组织特异性，我们测试了样本中的数字PCR分析，所述样本包括从12种不同的正常组织类型和富含成红细胞的样本中提取的DNA。我们针对每个组织类型包括来自不同个体的4个样本。由脐带血制备富含成红细胞的样本以用于分析。
确切地说，为确认DMR处的甲基化密度和E％之间的关系，从21名健康受试者和30名孕妇(10名处于早期妊娠，10名处于中期妊娠且10名处于晚期妊娠)收集静脉血液样本。将血液样本以3,000g离心10分钟以分离血浆和血细胞。离心后收集血沉棕黄层。收集血浆样本并以30,000g再次离心以去除残留的血细胞。
至于12种不同的正常组织类型，我们针对每个组织类型包括来自不同个体的4个样本。如表4中所示，来自所有组织DNA的中值E％(FECH)较低(中值范围：0.00％到2.63％)。
组织 中值E％
肝 0.12％
肺 1.33％
食道 2.63％
胃 2.58％
小肠 2.33％
结肠 1.51％
胰腺 0.12％
肾上腺 0.00％
膀胱 1.20％
心脏 0.82％
脑 1.94％
胎盘 0.10％
表4.表格显示4组12种组织类型中红细胞DNA的中值百分比(E％(FECH))，其中每个组织样本从不同个体获得。
用于通过流式细胞术和细胞分选和随后的DNA提取从脐带血富集的实验程序描述如下。在分娩后，从八名孕妇中的每一个收集1-3mL脐带血。在使用Ficoll-Paque PLUS试剂盒(通用电气医疗集团(GE Healthcare))进行密度梯度离心后，从脐带血样本中分离单核细胞。在收集单核细胞后，将1×108个细胞与异硫氰酸荧光素(FITC)共轭的抗CD235a(血型糖蛋白A)和藻红蛋白(PE)共轭的抗CD71抗体(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))的1mL混合物以1:10稀释在磷酸盐缓冲盐水中在暗处在4℃下一起培育30分钟。随后使用BDFACSAria融合细胞分选仪(BD生物科学(BD Biosciences))进行CD235a+CD71+细胞的分选和分析。由于CD235a和CD71特异性地存在于成红细胞中，CD235a+CD71+细胞将富集成红细胞(Bianchi等人《产前诊断(Prenatal Diagnosis)》1993；13:293-300)。
由于从每个个例获得的细胞数量较少，合并来自八个个例的细胞以用于下游分析。这两种抗体对成红细胞具有特异性，且附着到成红细胞的表面。这两种抗体分别与FITC和藻红蛋白共轭。这两种物质与磁珠结合，且可以使用细胞分选仪对珠粒进行分选。因此可以捕获Ab标记的成红细胞。使用流式细胞术和用抗CD71(传递蛋白受体)和抗CD235a(血型糖蛋白A)抗体进行细胞分选(参见补充材料和方法)，从8个脐带血样本中富集成红细胞，随后合并。从合并的样本中提取DNA。
来自合并脐带血样本的DNA的E％(FECH)在CD235a+CD71+细胞(大部分成红细胞)的分析中测试的四个CpG位点处是67％。关于20名健康受试者的血沉棕黄层DNA的E％(FECH)，其外周血中有不可检测数量的成红细胞，血沉棕黄层DNA的中值E％是2.2％(四分位距：1.2-3.1％)。在健康受试者的血沉棕黄层中观察到低比例的成红细胞特异性未甲基化序列符合成熟RBC不具有细胞核的事实。由于CD235a和CD71是对成红细胞具有特异性的细胞表面标记物(Bianchi等人《产前诊断》1993；13:293-300)，富含CD235a和CD71的细胞中的高E％(FECH)显示对成红细胞特异性DMR处的未甲基化DNA的分析能够检测到成红细胞来源的DNA。因此，富含成红细胞的样本的这种高E％，以及来自其它组织类型的DNA和健康受试者的血沉棕黄层DNA的低E％结果显示，未甲基化FECH序列的数字PCR分析对成红细胞来源的DNA具有特异性。
B.对于患有β-重型地中海贫血的患者
在罹患β-重型地中海贫血的患者中，骨髓尝试制造大量红血细胞(RBC)。然而，血红蛋白的产生是有缺陷的。结果，许多RBC并不含有足够的血红蛋白且含有大量过量的α珠蛋白链。这些有缺陷的RBC将从骨髓中去除，且将永远不会变为成熟的RBC。有两种类型的珠蛋白链：α和β。一个血红蛋白分子需要两个α链和两个β链。如果不产生β链，则过量的α链将聚集在一起，且不能形成功能性血红蛋白。
在患有β-重型地中海贫血的患者中，增加的但无效的红细胞生成将导致成熟RBC的产量减少(Schrier等人《血液学的当前意见(Current Opinion in Hematology)》2002；9:123-6)。这伴随着补偿性髓外血细胞生成和成核红细胞在循环中的存在。如下所述，患有β-重型地中海贫血的患者将比健康患者具有更多的成核红细胞。外周血液中成核RBC的数量可以在血涂片上计数且表示为每100个白细胞(WBC)的成核RBC的数量。
由于患有重型地中海贫血的患者通常因为失效的红细胞生成而在外周血液中具有比健康个体更高数量的成红细胞(27)，这类患者也提供了测试分析的特异性和灵敏度的良好机制。因此，我们测试了我们的数字PCR分析在十五名患有β-重型地中海贫血的患者的血沉棕黄层DNA中的敏感性。如通过自动血液学分析仪(UniCel DxH 800库尔特细胞分析系统，贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))测量且通过人工计数确认，所有这些患者都在外周血液中具有可检测数量的成红细胞。
图3A是显示根据本发明的实施例的血细胞中的E％(FECH)与成核RBC(成红细胞)数量之间的相关性的图。通过靶向FECH基因相关DMR的数字PCR分析来测量E％。如轴所示，所述图显示了血沉棕黄层DNA中红细胞DNA序列的百分比(E％(FECH))与所有外周白细胞中成红细胞的百分比之间的相关性，如使用自动血液学分析仪所测量。
如图3A所示，血沉棕黄层DNA的E％(FECH)与通过血液学分析仪测量的外周血白细胞中成红细胞的百分比良好相关(r＝0.94，P&lt;0.0001，皮尔森式相关性(Pearsoncorrelation))。地中海贫血患者的血沉棕黄层中的E％与成红细胞计数之间的良好线性关系显示，数字PCR分析提供了样本中红细胞DNA含量的良好定量测量，因为成红细胞对于DMR未被甲基化且其它血细胞被甲基化。因此，血液样本中成红细胞的比例越高，E％将越高。这个实验的目的是证实分析可用于反映样本中成红细胞来源的DNA量。这些结果进一步支持FECH基因的E％反映了来源于成红细胞的DNA的比例。
这种相关性对于其它患者将同样存在。但是，由于成红细胞的数量对于患有β-重型地中海贫血的患者可能较高，其样本为鉴别这种相关性提供了良好测试。从图3A可以看出，患者具有广泛范围的E％和大量的成红细胞，从而为测试相关性提供了良好机制。
C.确定特定细胞谱系的细胞DNA的量的方法
在一些实施例中，无细胞混合物(例如，血浆或血清样本)中非甲基化或甲基化DNA片段的量可在对特定细胞谱系具有特异性的一个或多个DMR处计数所述量时用于确定特定细胞谱系的细胞数量(或DNA的其它量)。如图3A中所示，在FECH DMR处未甲基化的DNA片段的百分比与血液样本中成红细胞的数量相关。也可以使用绝对浓度。对于高度甲基化的DMR，可使用甲基化DNA片段的量(例如，百分比或绝对浓度)。如本文中所描述，可以使用各种细胞谱系。
为确定细胞的数量的数量，可以使用校准函数。在图3A的实例中，与数据点拟合的线可提供校准函数。举例来说，校准函数可以通过其函数参数(例如，线的斜率和y截距，或者用于其它函数的更多参数)来存储，或者由可以从其获得曲线拟合的一组数据点存储。当确定成红细胞的数量时，数据点(例如，称为校准数据点)可具有细胞谱系的DNA量(例如，细胞数量)的已知值，如可通过另一种技术所确定。
因此，一种方法可确定来自血液样本中特定细胞谱系的DNA量。如本文中所描述，可从分析中确定一种或多种DMR的数个甲基化或未甲基化序列。可确定甲基化水平且将其与校准函数的校准值进行比较。举例来说，可将甲基化水平与线(或其它校准函数)进行比较，以确定函数与甲基化水平的交叉，且因此确定相应的DNA量(例如，图3A的水平轴上的值)。在其它实施例中，可将甲基化水平与各个校准数据点进行比较，例如其具有接近样本的测量甲基化水平的甲基化水平。
图3B是根据本发明的实施例说明通过分析无细胞DNA确定生物样本中特定细胞谱系的细胞量的方法300的流程图。方法300可使用如图3A中所示的那些测量值。方法300的部分可人工地执行，而其它部分可以由计算机系统执行。在一个实施例中，系统可以执行所有步骤。举例来说，系统可以包括机器人元件(例如，以获得样本且执行分析)、用于检测来自分析的信号的检测系统，以及用于分析信号的计算机系统。用于控制这个系统的指令可以存储在一个或多个计算机可读媒体中，例如现场可编程门阵列(field programmable gatearray；FPGA)、快闪存储器和/或硬盘驱动器的配置逻辑。图27示出了这种系统。
在方框310处，获得生物样本的无细胞混合物。生物样本可以是血液样本，但也可以是包括无细胞DNA的其它样本，如本文中所描述。无细胞混合物的实例包括血浆或血清。无细胞混合物可以包括来自多个细胞谱系的无细胞DNA。
在方框320处，无细胞混合物中的DNA片段与对应于一个或多个差异甲基化区域的分析接触。通过相对于其它细胞谱系低甲基化或高度甲基化，一个或多个差异甲基化区域中的每一个对特定细胞谱系(例如，特定血液细胞谱系，例如成红细胞)具有特异性。
在各种实施例中，分析可以涉及PCR或测序。与DNA片段接触可以涉及流动细胞、液滴、珠粒或其它机制，以提供分析与DNA片段的相互作用。这种分析的实例包括全基因组亚硫酸氢盐测序、靶向亚硫酸氢盐测序(通过杂交捕获或扩增子测序)、其它甲基化感知测序(例如，太平洋生物科学的单分子实时(SMRT)DNA测序)、实时甲基化特异性PCR和数字PCR。本文中(例如，在章节XII中)描述了可用于方法300的分析的其它实例。尽管实例图3A针对成红细胞，可使用其它细胞谱系，包括其它血液细胞谱系。
在方框330处，基于从分析获得的信号，在一个或多个差异甲基化区域处的无细胞混合物中检测到甲基化或未甲基化DNA片段的第一数量。分析可以提供各种信号，例如光信号或电信号。信号可以提供每个DNA片段的特定信号，或指示具有甲基化标记的DNA片段的总数的聚集信号(例如，如在实时PCR中)。
在一个实施例中，测序可用于获得DNA片段的序列读段，且DNA片段可与参考基因组对齐。如果DNA片段与DMR中的一个对齐，那么可以递增计数器。鉴于信号来自特定甲基化的未甲基化分析，可假定DNA片段具有所述甲基化标记。在另一实施例中，来自PCR的读段(例如，来自阳性孔的光信号)可用于递增这种计数器。
在方框340处，使用第一数量来确定第一甲基化水平。第一甲基化水平可以标准化或是绝对浓度，例如每体积的生物样本。图25中提供了绝对浓度的实例。
对于标准化的值，可以使用一个或多个差异甲基化区域处的无细胞混合物中DNA片段的第一数量和总数来确定甲基化水平。如上文所描述，甲基化水平可以是未甲基化DNA片段的百分比。在其它实施例中，百分比可以是甲基化DNA片段的百分比，其将相对于成红细胞的上述实例具有反比关系。在各种实施方案中，甲基化水平可以使用DMR中所有位点的百分比，通过每个位点的个体百分比的平均值或每个位点的加权平均值来确定。
在方框350处，获得一个或多个校准数据点。每个校准数据点可以指定(1)特定血液细胞谱系的细胞量和(2)校准甲基化水平。从多个校准样本确定一个或多个校准数据点。
细胞量可以被指定为特定的量(例如，数字或浓度)或一个范围的量。可以从具有已知细胞量的校准样本确定校准数据点，其可以通过本文中所描述的各种技术测量。至少一些校准样本将具有不同量的细胞，但是一些校准样本可具有相同量的细胞。
在各种实施例中，一个或多个校准点可被定义为一个离散点、一组离散的点、作为函数、作为一个离散点和函数，或任何其它离散或连续值集的组合。作为一实例，可以从具有特定谱系的特定细胞量的样本的一个校准甲基化水平来确定校准数据点。
在一个实施例中，来自相同细胞量的多个样本的相同甲基化水平的测量值可被组合以确定特定细胞量的校准数据点。举例来说，可以从相同细胞量的样本的甲基化数据获得甲基化水平的平均值，以确定特定校准数据点(或提供对应于校准数据点的范围)。在另一实施例中，具有相同校准甲基化水平的多个数据点可用于确定细胞的平均量。
在一个实施方案中，针对许多校准样本测量甲基化水平。确定每个校准样本的甲基化水平的校准值，其中可以针对样本的已知细胞量绘制甲基化水平(例如，如图3A中所示)。随后可以将函数拟合到图的数据点，其中函数拟合限定了用于确定新样本的细胞量的校准数据点。
在方框360处，将第一甲基化水平与至少一个校准数据点处的校准甲基化水平进行比较。可以各种方式进行比较。举例来说，比较可以是第一甲基化水平是高于还是低于校准甲基化水平。比较可以涉及与校准曲线(由校准数据点组成)进行比较，且因此比较可鉴别具有第一甲基化水平的曲线上的点。举例来说，第一甲基化水平的计算值X可以用作函数F(X)的输入，其中F是校准函数(曲线)。F(X)的输出是细胞量。可以提供误差范围，其对于每个X值可以是不同的，从而提供一系列值作为F(X)的输出。
在方框370处，基于比较来估计生物样本中特定细胞谱系的细胞量。在一个实施例中，可以确定第一甲基化水平是高于还是低于阈值校准甲基化水平，从而确定本发明样本的细胞量是高于还是低于对应于阈值校准甲基化水平的细胞量。举例来说，如果计算的生物学的第一甲基化水平X1高于校准甲基化水平XC，那么可以确定生物样本的细胞量N1高于对应于XC的细胞量NC。高于和低于的这种关系可以取决于参数的定义方式。在这个实施例中，可能仅需要一个校准数据点。
在另一实施例中，通过将第一甲基化水平输入到一个校准函数中来完成比较。通过鉴别对应于第一甲基化水平的曲线上的点，校准函数可以有效地将第一甲基化水平与校准甲基化水平进行比较。随后提供估计的细胞量作为校准函数的输出值。
IV.血浆中成红细胞的无细胞DNA的来源
使用Unmeth％和红细胞来源的DNA之间所建立的关系，血浆的Unmeth％可用于定量血浆中红细胞来源的DNA。使用上述分析来确定血浆中的Unmeth％。观察到血沉棕黄层和血浆中Unmeth％的差异。分析显示，血浆中无细胞成红细胞DNA来自骨髓中的红细胞生成，而不是来源于血流中的成红细胞。
确认由两个数字PCR分析确定的Unmeth％准确地反映了样本中成红细胞来源的DNA的量之后，我们进一步比较健康对照受试者和孕妇的血沉棕黄层和血浆中成红细胞来源的DNA的比例。
图4显示根据本发明的实施例的健康非怀孕受试者和不同妊娠期的孕妇的血沉棕黄层和血浆中的Unmeth％。对于每组受试者，血浆样本与血沉棕黄层相比具有明显更高的Unmeth％(对于血浆和血沉棕黄层之间的每对比较的威尔科克森符号秩检验(Wilcoxonsign-rank test)，P&lt;0.01)。
图4的结果显示，成红细胞来源的DNA的量在血细胞中较低，如由于成核RBC的数量较低所预期。出人意料的结果是血浆中成红细胞来源的DNA的量较高。如果血浆中的成红细胞来源的DNA是来源于血细胞，那么可以预期两种量相似。因此，这个数据显示，血浆中成红细胞来源的DNA的来源是来自骨髓中的红细胞生成。
图5是显示血沉棕黄层和血浆中的Unmeth％之间缺乏相关性的图。在血沉棕黄层和血浆DNA的Unmeth％之间没有观察到明显的相关性(R2＝0.002，P＝0.99，皮尔森相关性)。对于所有的受试者可以看出缺乏相关性，所述受试者包括非妊娠受试者、早期妊娠孕妇、中期妊娠孕妇和晚期妊娠孕妇。如同图4中的结果，这是出人意料的，如果成红细胞来源的DNA的来源是来自血流中的血细胞，那么人们会期望这两者是相关的。
血浆DNA具有比血沉棕黄层高得多的Unmeth％且血浆和血沉棕黄层的Unmeth％之间的相关性缺乏的观察结果表明，携带成红细胞甲基化标记的循环无细胞DNA可能在红细胞生成过程期间来源于骨髓，而不是来源于循环血细胞。因此，具有成红细胞甲基化标记的无细胞血浆DNA在骨髓中产生，与由血流中的成核RBC产生相反，这是因为血流中成核RBC的数量在健康受试者中和孕妇中极低。并且，由于白细胞(WBC)对成红细胞甲基化标记的贡献极低，因此这种贡献不提供对具有成红细胞甲基化标记的无细胞血浆DNA的可测量依赖性。
V.甲基化水平作为红细胞生成活性的测量
基于上述观察结果，我们确定在成红细胞DMR处的Unmeth％将反映骨髓中红细胞生成的活性。高Unmeth％将表示高红细胞生成活性。换句话说，血浆/血清中成红细胞DNA的分析将用作骨髓的液体活检。这个分析将特别适用于研究贫血例如以确定贫血是否归因于减少的红细胞生成(例如，再生障碍性贫血)，有缺陷的红细胞生成(例如，地中海贫血中成熟RBC生成失效)或增加的RBC消耗(例如，失血和溶血性贫血)。为此，我们招募了35名健康受试者和75名具有不同病因的贫血患者。进行外周血样本收集和处理、血浆和血沉棕黄层DNA提取和DNA的亚硫酸氢盐转化。关于方法的更多细节描述于章节XII中。
A.测量健康受试者血浆中的无细胞红细胞DNA
在确认我们分析的特异性后，我们使用这些分析来分析健康受试者的血浆。我们分析了35名健康受试者的血浆中的E％(FECH)，包括也提供了血沉棕黄层样本的相同组的20名受试者。血浆DNA的中直E％(FECH)是30.1％(四分位距：23.8-34.8％)。这表明红细胞DNA构成了健康个体血浆中显著比例的循环DNA库。为确定血浆红细胞DNA的来源，我们比较了20名健康受试者的血浆和血沉棕黄层中相应的E％(FECH)结果。
图6A和6B显示健康受试者中红细胞DNA的百分比(E％(FECH))。图6A显示健康受试者的血沉棕黄层DNA和血浆DNA的E％，其中E％的值在血浆(无细胞部分)中比在血沉棕黄层(细胞部分)中更高。血浆DNA的中值E％(中值：26.7％，四分位距：23.7-30.4％)明显高于配对的血沉棕黄层DNA中的值(中值：2.2％，四分位距：1.2-3.1％)(P&lt;0.0001，威尔科克森符号秩检验)。
图6B显示相应健康受试者的血沉棕黄层DNA和血浆DNA中的E％之间缺乏相关性。血浆DNA和血沉棕黄层DNA中配对的E％(FECH)结果之间缺乏相关性(r＝0.002，P＝0.99，皮尔森相关性)。在图6A和图6B中的两个发现显示，循环红细胞DNA不太可能主要来源于外周血中的循环成红细胞。
图7显示血浆DNA的E％(FECH)结果与健康受试者年龄之间缺乏相关性。所述图显示E％(FECH)结果与受试者的年龄无关(r＝0.21，p＝0.23，皮尔森相关性)。
B.β-重型地中海贫血症和再生障碍性贫血患者之间的区别
在确定血浆中的红细胞DNA在循环中不主要从完整成红细胞释放后，我们提出，这些DNA分子更有可能在红细胞生成期间从骨髓释放。我们推断，血浆中红细胞DNA的定量分析能够提供关于骨髓中红细胞生成活性的信息。
为确认使用血浆测量骨髓中红细胞生成活性的能力，从香港的威尔士王子医院(Prince of Wales Hospital)的医疗系(Department of Medicine)招募患有β-重型地中海贫血和再生障碍性贫血的患者。在输血之前收集静脉血液样本。通过数字PCR确定每个患者的血浆DNA的Unmeth％。这些结果与血红蛋白水平相关。血红蛋白水平可以通过所属领域技术人员已知的技术测量，例如通过在自动血细胞计数器上进行的光度测定技术。血红蛋白水平可以从RBC部分测量，例如在离心后获得。
这两个组的患者(β-重型地中海贫血和再生障碍性贫血)代表两个不同的红细胞生成活性谱。在患有β-重型地中海贫血的患者中，红细胞生成具有高度活性。然而，由于功能性β-珠蛋白链的缺陷产生，成熟RBC的产生减少。在患有再生障碍性贫血的患者中，红细胞生成减少，导致RBC产生减少。
图8是根据本发明的实施例的针对患有再生障碍性贫血、β-重型地中海贫血的患者和健康对照受试者中的血红蛋白浓度的Unmeth％的图。在β-地中海贫血患者中，血红蛋白浓度降低，但与健康对照受试者相比，Unmeth％明显增加(P&lt;0.01，曼惠特尼秩和检验(Mann-Whitney rank-sum test))。事实上，11个β-地中海贫血患者中的10个(89％)的Unmeth％值高于所有健康对照受试者的值。这个观察结果与这些患者中增加但有缺陷的红细胞生成一致。
相比之下，对于进行定期输血的患有再生障碍性贫血的六名患者，其Unmeth％低于所有健康对照受试者的值。这个观察结果与这些患者中减少的红细胞生成一致。
对于临床缓解的三名再生障碍性贫血患者，其血红蛋白水平是正常的且不需要定期输血。其Unmeth％值与健康对照受试者的值没有明显差异(P＝0.53，曼惠特尼秩和检验)。因此，血浆中成红细胞特异性DNA的定量分析将适用于监测患有骨髓功能障碍的患者，例如以确定再生障碍性贫血是否缓解。此外，成红细胞特异性DNA的定量分析可用于指导治疗。举例来说，未缓解的患有再生障碍性贫血的患者可以定期输血治疗。
因此，Unmeth％在地中海贫血患者中更高且在再生障碍性贫血患者中更低。对于地中海贫血，骨髓是活性的，因为患者贫血且骨髓想要针对循环产生更多的RBC。因此，红细胞生成率高于未患贫血的健康受试者。对于患有再生障碍性贫血的患者，贫血归因于减少的RBC生成。总之，这些结果表明，成红细胞特异性甲基化谱的分析将适用于反映骨髓中的红细胞生成活性。
可以通过血红蛋白测量值和Unmeth％的组合来诊断患者。举例来说，血红蛋白低于11.8且E％高于50的患者可被分类为患有β-地中海贫血。然而，血红蛋白低于11.8且E％低于25的患者可被分类为患有再生障碍性贫血。
C.缺铁性贫血和治疗
贫血可能归因于营养物(例如，铁、B12、叶酸等)的缺乏、失血(例如，由于月经过多或从胃肠道出血)或慢性疾病(例如，癌症、炎症性肠病)。
图9是患有缺铁(Fe)性贫血和急性失血的患者中血浆Unmeth％的图。研究了三名患有缺铁性贫血的患者和一名患有急性胃肠道血液的患者。在两名缺铁患者中，贫血是由月经过多引起的。对于一名患者，在开始补铁之前收集血液样本。对于另一名患者，在开始补铁疗法后1周收集血液样本。第三名缺铁性贫血患者患有炎症性肠病，且在开始补铁前收集血液样本。
确定每个患者的血浆Unmeth％且与健康对照受试者的值相比较。在患有急性胃肠道出血的患者中观察到血浆Unmeth％增加。对于在开始补铁疗法之前收集样本的两名缺铁患者，尽管其具有低血红蛋白水平，但与健康受试者相比，其血浆Unmeth％值没有增加。对于在开始补铁后1周收集样本的缺Fe患者，观察到血浆Unmeth％增加。
这些结果显示，血浆Unmeth％反映了响应于治疗的红细胞生成活性。举例来说，补充铁的治疗显示增加的红细胞生成活性。此外，这些结果显示，Unmeth％的反应将比血红蛋白水平的上升更快。Unmeth％的使用可以是这种治疗是否有效和因此治疗是否应继续或停止的早期标识。因此，在观察到血红蛋白水平的变化之前，Unmeth％可以提供指导以预测对贫血治疗(例如铁疗法)的反应。
在一些实施例中，血浆Unmeth％可用于反映对贫血治疗的反应。举例来说，在患有缺铁性贫血的患者中，由于通过肠道吸收铁的变化，对不同受试者的口服补铁的反应可能不同。在这种情况下，开始口服补铁后血浆Unmeth％的增加不足可用于指示需要静脉内铁疗法。
D.各种贫血病症的区别
我们招募了患有再生障碍性贫血(AA)、慢性肾功能衰竭(CRF)、归因于慢性失血的缺铁性贫血以及β-重型地中海贫血的贫血患者。招募不同的疾病实体以代表骨髓中红细胞生成活性谱的两端。
图10显示根据本发明的实施例的患有再生障碍性贫血、慢性肾衰竭(CRF)、β-重型地中海贫血、缺铁性贫血的患者和健康受试者中的血浆中红细胞DNA百分比(E％(FECH))与血红蛋白水平之间的关系。针对血红蛋白水平绘制贫血患者和35名健康对照者的血浆DNA的E％(FECH)。水平虚线表示健康受试者中值E％。垂直线对应于患有贫血的受试者和未患贫血的受试者之间测量的血红蛋白水平的截止值(11.5，如图所示)。
我们分析了满足诊断标准(28)但未能对免疫抑止性疗法作出反应的13名AA患者中的血浆DNA的E％。AA组的血浆DNA的中值E％是12.4％(四分位距：7.5-13.7％)，其明显低于健康对照者的中值E％(P&lt;0.0001，曼惠特尼秩和检验；图10)。类似地，需要透析的18名CRF患者的中值E％结果是16.8％(四分位距：12.2-21.0％)，其也明显低于健康对照者的中值E％(P&lt;0.0001，曼惠特尼秩和检验；图10)。这些发现与AA(28、29)和CRF患者(30)中减少的红细胞生成活性的病理生理学一致。
对于患有β-重型地中海贫血的患者，骨髓正在尝试用增加但是失效的红细胞生成补偿低氧应激(31)。在17名招募的β-重型地中海贫血患者中，血浆DNA的中值E％是65.3％(四分位距：60.1-78.9％)，其明显高于健康对照者的中值E％(P&lt;0.0001，曼惠特尼秩和检验；图10)。
对于缺铁性贫血的受试者，我们招募了由于月经过多或消化性溃疡病而罹患缺铁性贫血的11名患者(转铁蛋白饱和度&lt;16％或血清铁蛋白水平＜30ng/ml)。其血浆DNA的中值E％是37.8％(四分位距：31.8-43.0％)，其明显高于健康对照者的中值E％(P＝0.002，曼惠特尼秩和检验；图10)。这个发现可通过骨髓红细胞生成活性的补偿性增加解释为对慢性失血的反应(32)。
因此，可以通过血红蛋白测量值和E％的组合来诊断患者。举例来说，血红蛋白低于11.5(或其它值)且E％高于50的患者可以分类为具有增加的红细胞生成活性的贫血，例如β-地中海贫血。然而，血红蛋白水平低于11.5且E％低于50且高于28的患者可以分类为具有中度红细胞生成活性的贫血，例如缺铁性贫血。然而，血红蛋白水平低于11.5且E％低于28的患者可以分类为具有减少的红细胞生成活性的贫血，例如再生障碍性贫血或慢性肾衰竭。
在一些实施例中，为确定血液病症的分类，可测量血液样本的血红蛋白水平。可将血红蛋白水平与血红蛋白阈值(例如，11.5)进行比较。因此，除了甲基化水平之外，血液病症的分类可进一步基于血红蛋白水平与血红蛋白阈值的比较。
对受试者的E％(FECH)、红血细胞和网织红细胞参数的概述分别显示于表5和表6以及图11A和图11B中。
表5.表概述了健康受试者和贫血患者的血浆DNA中红细胞DNA的中值百分比(E％(FECH))。
在下面表6中，示出了中值和四分位距(括号内)。使用以下缩写：血细胞比容为Hct，平均红细胞体积为MCV，平均细胞血红蛋白为MCH，平均细胞血红蛋白浓度为MCHC，以及红细胞分布宽度为RDW。
表6.招募的健康对照者和贫血患者的红血细胞(RBC)参数。
图11A和11B显示患有再生障碍性贫血、慢性肾衰竭(CRF)、β-重型地中海贫血和缺铁性贫血的贫血患者中网织红细胞计数/指数与血红蛋白水平之间的关系。网织红细胞指数计算如下：网织红细胞计数×血细胞比容/正常血细胞比容。可以看出，血液中网织红细胞(未成熟RBC)的量不提供不同病症的可靠区别。这些结果显示，网织红细胞计数和网织红细胞指数不能够区分不同病因的贫血，例如区分地中海贫血和再生障碍性贫血。
E.骨髓增生异常综合征和红细胞增多症
图12是患有骨髓发育不良综合征和红细胞增多症的患者中的血浆Unmeth％的图。在患有骨髓发育不良综合征的患者中，在减少的血红蛋白水平下观察到增加的血浆Unmeth％。在患有红细胞增多症的患者中也观察到增加的血浆Unmeth％。这些结果显示，对血浆中成红细胞DNA甲基化标记的检测和定量适用于检测和监测涉及骨髓母细胞性细胞的骨髓的异常增殖或发育不良。
因此，如可以看到，这两个血液病症也显示出更高的成红细胞的无细胞DNA，从而允许检测血液病症。在一些实施例中，精确诊断可基于骨髓活检的组织学检查。因此，可以响应于检测到高Unmeth％来进行骨髓活检。类似地，可以响应于在贫血存在但营养缺乏(例如，缺铁、缺维生素B12或缺叶酸)不存在下检测到低Unmeth％来进行骨髓活检。用于骨髓活检的这些基质可以减少这些活检的数量，同时仍然允许监测骨髓的健康。因此，Unmeth％将更适用于监测治疗反应。
F.贫血的其它区别
其它病症之间的区别也是可能的。
1.再生障碍性贫血(AA)和骨髓发育不良综合征(MDS)
再生障碍性贫血和MDS两种都是骨髓衰竭病况。不管其类似的各类血细胞减少的临床特征，这两种疾病实体具有不同的病理生理机制。在AA中，存在细胞减少的骨髓而无发育不良特征。在MDS，通常存在细胞过多的骨髓和涉及一个或多个谱系的发育不良(33)，但也识别出细胞减少的MDS。
图13A显示根据本发明的实施例的患有再生障碍性贫血(AA)和骨髓发育不良综合征(MDS)的患者中的血浆中红细胞DNA百分比(E％(FECH))。来自8名MDS患者的血浆DNA的中值E％是50.3％(范围：37.4-60.8％)。两例具有单谱系发育不良的MDS，4例具有多谱系发育异常，且2例具有过量胚细胞的MDS(34)。所有其先前的骨髓活检显示红细胞细胞过多。MDS患者的中值E％明显高于13名招募的AA患者的中值E％(P&lt;0.0001，曼惠特尼秩和检验；图13A)。MDS患者中的中值E％结果与MDS的骨髓活检发现和无效红细胞生成的病理生理学一致。
因此，使用E％或其它甲基化水平可将MDS与再生障碍性贫血进行区分。举例来说，截止值30可用于将样本分类为对应于再生障碍性贫血或MDS。
2.AA的治疗反应组和治疗无反应组
图13B显示根据本发明的实施例的再生障碍性贫血中治疗反应组和治疗无反应组之间的血浆中红细胞DNA百分比(E％(FECH))。我们分析了对免疫抑制治疗作出反应的另外8名再生障碍性贫血患者，从而提高了血红蛋白水平。治疗反应组的血浆DNA的中值E％是22.5％(四分位距：17.2-27.1％)，其高于无反应组(中值：12.3％；四分位距：7.5-13.7％)(P＝0.0003，曼惠特尼秩和检验；图13B)。治疗反应组和健康对照者的E％结果之间存在微小但显著的差异(P＝0.01，曼惠特尼秩和检验)。
这些结果反映了骨髓中红细胞生成活性的恢复。由于E％的恢复可比血红蛋白水平更早出现，因此E％可用于早期确定患者是否对免疫抑制疗法作出反应。当患者没有反应时，可以进行其它治疗(例如，更侵袭性的治疗)，例如进行干细胞移植或处方骨髓刺激剂(例如，沙格司亭(sargramostim)、非格司亭(filgrastim)和乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim))。
G.白血病
也可以使用成红细胞特异性DMR例如在FECH中检测到除白血病以外的其它血液病症。
图14是根据本发明的实施例的针对正常受试者和患有白血病的两名患者中的血红蛋白浓度的血浆Unmeth％的图。使用FECH DMR来确定Unmeth％。患有白血病或骨髓增生性病症的患者的血浆中的Unmeth％值高于正常受试者的血浆的中值Unmeth％。这个观察结果与患有白血病的患者中增加的但有缺陷的红细胞生成的观察结果一致。因此，约45的截止值可用于Unmeth％以区分健康受试者和患有白血病的受试者，从而确定血液病症的水平。也可以使用血红蛋白水平，例如血红蛋白低于8的患者可以被鉴别为患有白血病而不是β-地中海贫血，所述β-地中海贫血通常具有8与约11.8之间的血红蛋白水平，如图10中所示。
VI.其它甲基化标记物的结果
我们基于样本子组血浆中的其它两个DMR分析E％，以验证来自FECH基因相关DMR的以上E％结果。使用其它两个成红细胞特异性DMR作为FECH基因中的DMR，观察到健康受试者与再生障碍性贫血和β-重型地中海贫血患者之间的血浆中红细胞DNA百分比的类似差异。
A.其它两个成红细胞特异性DMR
位于染色体12上的其它两个DMR也低甲基化。与这两个DMR相关的基因组区域先前未被鉴别为在任何标注的基因内。
图15A和15B显示根据本发明的实施例的染色体12上的成红细胞特异性DMR内的CpG位点的甲基化密度。图15A显示染色体12上的基因组坐标处的区域1510：48227688-48227701，其包括3个位点。图15B显示染色体12上的基因组坐标处的区域1560：48228144-48228154，其也包括3个位点。基因组坐标对应于人类参考基因组hg19。位于阴影区域内的所选CpG位点均在成红细胞中低甲基化，但在其它组织或细胞类型中高度甲基化。其它组织代表肺、结肠、小肠、胰腺、肾上腺、食道、心脏和脑。
这两个其它成红细胞特异性DMR标记为Ery-1和Ery-2。基于其它两个DMR(染色体12：48227688-48227701和染色体12：48228144-48228154)的E％将分别由E％(Ery-1)和E％(Ery-2)表示。
图16显示对来自ENCODE数据库的两个其它成红细胞特异性DMR(Ery-1和Ery-2)的组蛋白修饰(H3K4me1和H3K27Ac)。我们审阅了关于来自ENCODE数据库的成红细胞类型中这两个DMR的组蛋白修饰和CHIP-seq数据集的公用数据。Ery-1和Ery-2DMR由两个增强子相关的组蛋白修饰(H3K4me1和H3K27Ac)标记，其表明具有调节功能，尤其是增强子的调节功能。最近的下游基因是HDAC7基因，距离大约15kb。
B.富含成红细胞的样本
我们在来自先前描述的8个脐带血样本的富含成红细胞样本中分析了基于其它两个DMR的红细胞DNA的百分比。从合并样本提取的DNA的E％(Ery-1)和E％(Ery-2)是66.5％和68.5％。这些E％值类似于基于FECH基因相关DMR的E％，即67％。鉴于来自所有三个DMR的类似发现，低于预期的E％值(即，当进行富集时低于预期)可能归因于富集方案的不完全选择性。
C.β-重型地中海贫血患者中血沉棕黄层的E％与成红细胞的相关性
在同一组的β-重型地中海贫血患者的血沉棕黄层DNA中分析基于两个的DMR的红细胞DNA的百分比。血沉棕黄层DNA中两个DMR的E％以与图3A类似的方式与成红血细胞的百分比良好相关。
图17A和17B显示通过靶向Ery-1标记物(图17A)和Ery-2标记物(图17B)的数字PCR分析测量的β-重型地中海贫血患者的血沉棕黄层DNA中红细胞DNA序列百分比(E％)与使用自动血液学分析仪测量的所有外周血白细胞中成红细胞百分比之间的相关性。血沉棕黄层DNA的E％(Ery-1)和E％(Ery-2)与通过血液学分析仪测量的外周血白细胞中成红细胞百分比良好相关(r＝0.938和r＝0.928，两个P&lt;0.0001，皮尔森相关性)。
图18A和18B显示β-重型地中海贫血患者的血沉棕黄层DNA的E％(FECH)结果与E％(Ery-1)和E％(Ery-2)的相关性。来源于这两个DMR的E％结果也与来源于15名β-重型地中海贫血患者的血沉棕黄层DNA中的FECH基因标记物位点的成对E％结果良好相关。
C.健康受试者和贫血患者的血浆中E％
我们分析了健康受试者和患有再生障碍性贫血和β-重型地中海贫血的患者中血浆DNA的E％(Ery-1)和E％(Ery-2)。分析了同一组健康受试者、7名再生障碍性贫血和9名β-重型地中海贫血患者中的基于三个成红细胞特异性DMR的E％结果。
图19显示根据本发明的实施例的使用靶向三个成红细胞特异性DMR的数字PCR分析的健康受试者和患有再生障碍性贫血和β-重型地中海贫血的患者中红细胞DNA的百分比。13名健康受试者的血浆DNA的中值E％(Ery-1)是为16.7％(四分位距：10.9-23.5％)，且同一组健康受试者的中值E％(Ery-2)是25.0％(四分位距：22.2-27.3％)。基于Ery-1标记物，患有再生障碍性贫血和β-重型地中海贫血的患者的E％(Ery-1)分别是13.78％和61.69％。基于Ery-2标记物，患有再生障碍性贫血和β-重型地中海贫血的患者的E％(Ery-2)分别是14.13％和64.95％。使用两个成红细胞特异性DMR作为FECH基因中的DMR，观察到健康受试者与再生障碍性贫血和β-重型地中海贫血患者之间血浆中红细胞DNA百分比的类似差异。
VII.治疗结果
如上文所描述，E％可用于监测贫血的治疗功效。
A.在铁疗法之前和之后对缺铁性贫血患者中血浆DNA的E％(FECH)的测量
我们监测4名患有缺铁性贫血的患者中血红蛋白水平、网织红细胞计数和血浆DNA的E％的系列变化，所述患者由于对口服铁的肠胃副作用不耐受而接受静脉内铁疗法。代替口服铁疗法的患者，我们选择观察这组患者的变化以避免由于胃肠道吸收变化引起不同治疗反应的可能混淆因素。我们在治疗前和治疗后两天测量这些参数。
图20A和20B显示根据本发明的实施例的在治疗前状态和治疗后两天接受静脉内铁疗法的缺铁性贫血的血浆DNA中红细胞DNA百分比(E％(FECH))和网织红细胞计数百分比的系列测量值。图20A显示血浆DNA的E％的系列变化。图20B显示网织红细胞计数百分比的系列变化。
除受试者1以外，血浆DNA的E％和网织红细胞计数增加，同时血红蛋白水平仅在治疗开始后的最初保持静态。至于血红蛋白水平的最终变化，受试者3和4最终的水平发生了剧变，分别为84.7％和75.3％。受试者2默认随访且在治疗后未提供用于血红蛋白测量的额外样本。血浆DNA的E％变化极小的受试者1的血红蛋白水平增加最少(12.2％)。因此，血浆DNA的E％的变化可证实骨髓红细胞生成活性对铁疗法的动态反应，且可以用作患者对治疗反应的早期预测因子。
受试者1的网织红细胞计数增加缺乏表明RBC生产没有充分对铁疗法作出反应。对铁疗法的反应的缺乏也可以通过E％的增加的缺乏来反映，其对应于骨髓活性。但是，对于受试者1，铁疗法开始前的血红蛋白水平高于其它3个受试者且更接近健康受试者的参考范围。受试者1的E％(FECH)的上升的缺乏可以反映出骨髓中红细胞生成活性中不存在补偿性增加，这是因为血红蛋白水平的缺乏较正常水平更小。受试者1的网织红细胞最初与其它受试者大致相同，且因此不表示骨髓活性具有足够的水平。因此，对于具有中度红细胞生成活性的贫血，健康患者的正常上限的E％可表示对治疗的阳性反应，或至少表示不确定的反应，且因此在这种情况下可能不会停止治疗。
为使血红蛋白水平恢复正常，需要增加RBC生产。因此，在缺铁性贫血中，E％的正常范围可被认为是不合适的。受试者2-4的E％的增加表明在铁疗法后的适当反应，因为将针对患有缺铁性贫血的受试者预期正常(参见图10)或刚好高于正常的更高范围中的E％。因此，用于确定治疗是否有效的E％的阈值可取决于E％的起始值。E％的阈值可以指定值相对于初始值的特定变化，其中变化量可以取决于初始值。
也研究了铁的口服治疗的影响。例如由于月经过多患有慢性失血的患者将罹患缺铁性贫血。铁补充剂将用于校正缺铁状态。
图21A显示根据本发明的实施例的在接受口服铁治疗的患有因月经过多导致的缺铁性贫血的患者中成红细胞DMR的血浆E％的系列变化。在铁治疗之前和之后七天分析接受铁治疗的患有缺铁性贫血的患者的血浆的E％。在图21A中，在接受铁治疗后，E％增加。这些结果表明，血浆E％可以反映响应于治疗的红细胞生成活性。
图21B显示口服铁治疗后血红蛋白的变化。血红蛋白水平尚未显著增加，而治疗后同一时间点的E％(FECH——增加。这与图20A类似，其显示E％可以用作治疗是否有效的早期检测。
B.慢性肾病(CKD)的治疗
在CKD患者，贫血的一个主要原因是肾损害导致的促红细胞生成素生产的减少。促红细胞生成素是通过肾脏响应于低组织氧水平而产生的激素。其刺激骨髓产生红血细胞。外源性促红细胞生成素可以用于治疗CKD贫血。
图22显示接受重组促红细胞生成素(EPO)或红细胞生成刺激剂(ESA)治疗的患有慢性肾病(CKD)的患者中成红细胞DMR处的血浆Unmeth％的系列变化。在EPO治疗之前和之后7到14天分析接受EPO治疗的七名CKD患者的血浆Unmeth％。不同形状(颜色)的线对应于不同的患者。所有患者在接受EPO治疗后显示Unmeth％增加。Unmeth％值显示不同患者的不同功效水平。这些结果显示血浆Unmeth％反映了响应于治疗的红细胞生成活性。
C.再生障碍性贫血的ATG治疗
再生障碍性贫血患者的免疫抑止性疗法可能会导致60-70％的患者血液恢复(Young等人《血液(Blood)》2006；108(8):2509-2519)。在免疫抑制疗法开始前以及之后的2个月和4个月分析接受免疫抑制疗法的患有再生障碍性贫血的4名患者的血浆的Unmeth％值。所有患者并不对治疗作出反应，且血红蛋白水平在此期间未恢复到正常水平；所有四名患者都需要定期输血。
图23A显示根据本发明的实施例的接受抗胸腺细胞球蛋白(ATG)治疗或环孢菌素作为免疫抑制疗法的患有再生障碍性贫血的患者中成红细胞DMR处的血浆Unmeth％的连续变化。在三名患者中，血浆中的Unmeth％没有变化。一名患者表现出Unmeth％的显著增加。这与阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)克隆(即传送含有血红蛋白的深色尿液)的症状出现同时发生。即使Unmeth％增加，这种症状可用于确定患者不对治疗作出反应。PNH因其在再生障碍性贫血患者中的出现而闻名，且具有溶血性贫血的病理生理机制。Unmeth％的增加反映了由于PNH溶血导致的红细胞生成活性的增加。
图23B显示接受治疗的患有再生障碍性贫血的患者中血红蛋白的系列变化。血红蛋白水平不会显著增加。这些结果显示，血浆Unmeth％反映了治疗过程期间红细胞生成活性的变化，其在红细胞生成活性中没有变化，这是因为所有患者不对治疗作出反应，如图23B中所示的血红蛋白变化的缺乏所示例。
图24A和24B显示针对患有再生障碍性贫血的四名患者的血红蛋白浓度的血浆的Unmeth％的图。每条线对应一名患者，且追踪治疗前和治疗4个月后Unmeth％和血红蛋白水平的变化。图23A显示除患有PNH的患者之外，Unmeth％没有显著变化。图23B显示血红蛋白水平确实改变，但不明显。
VIII.红细胞DNA的绝对浓度的使用
为测量的血浆/血清中红细胞DNA的量，一些实施例使用低甲基化标记物处的参数E％(也称为Unmeth％)，但(如果存在)也可使用对细胞谱系具有特异性的高度甲基化标志物。E％对应于标准化为样本中DNA的总量(其大部分是高度甲基化的)的成红细胞DNA的量。
替代参数是测量每单位体积血浆的红细胞DNA的绝对浓度。为了计算E％，实施例可测量未甲基化的DNA绝对浓度和甲基化的DNA绝对浓度。在数字PCR分析中，每个点可代表一个DNA分子(例如，如图2A和图2B中所示)。可直接计数甲基化和未甲基化DNA的计数。在先前的章节中，计算了标准化值(例如，E％)，但实施例还可以使用低甲基化标记物的未甲基化分子的绝对浓度或高度甲基化标记物的甲基化分子的绝对浓度。
图25说明根据本发明的实施例的显示健康受试者和贫血患者中的FECH基因相关DMR(拷贝/毫升血浆)处的红细胞DNA的绝对浓度的箱须图。箱图和内部线分别代表四分位距和中值。顶部和底部须代表最大值和最小值。
如图25中所示，虽然可使用红细胞DNA的绝对浓度观察不同患者组之间的单独集群，但标准化值允许各组之间更好的分离。理论上，血浆的E％参数也可受非红细胞来源的循环DNA(例如骨髓或淋巴来源的DNA)的浓度影响。举例来说，在其它造血谱系也受影响的贫血病况(例如，再生障碍性贫血或骨髓发育不良综合征)中，在某些病例中可能会掩盖改变的红细胞DNA释放。
IX.其它血液谱系
用于血液学评定的这种基于血浆DNA的方法可以推广到其它血液细胞谱系的标志物，例如骨髓、淋巴和巨核细胞系。关于使用血液系谱系特异性DNA甲基化标记物的先前研究主要集中于全血或血细胞(Houseman EA等人《2015年当前环境健康报告(CurrentEnvironmental Health Reports 2015)》；2：145-154)。我们上面呈现的数据清楚地显示，血浆DNA确实含有血细胞中不存在的信息。因此，使用来自多个血液细胞谱系的表观遗传标记物分析血浆DNA可以提供关于个体血液系统的有价值的诊断信息。因此，其是骨髓活检的非侵入性替代物。可以设计特异性检测血浆或血清中特定细胞谱系的甲基化标记的分析，使得可以监测骨髓中不同细胞谱系的活性。
这个方法适用于许多临床情境的评定，包括(但不限于)以下病症。为病症提供了实例相关谱系。
1.恶性血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤(淋巴细胞谱系)
2.骨髓病症，如再生障碍性贫血、骨髓纤维化(骨髓细胞和淋巴细胞谱系)
3.监测免疫系统和其功能：例如免疫缺陷和疾病和治疗期间免疫反应的建立(淋巴细胞谱系)
4.药物对骨髓的影响，例如硫唑嘌呤(骨髓细胞谱系)
5.具有血液学表现的自身免疫病症，例如免疫性血小板减少症(ITP)，其是以低血小板计数但具有正常骨髓为特征的病症。使用血液谱系标记物(例如，巨核细胞标记物)的血浆DNA分析将提供关于这种病况的有价值的诊断信息。(巨核细胞标记物)
6.感染有血液系统并发症，例如感染细小病毒B19，其可能并发红细胞生成减少或甚至更严重的再生不全危机。(红细胞谱系)
X.方法
图26是示出根据本发明的实施例的分析哺乳动物的血液样本的方法2600的流程图。方法2600的部分可以人工地执行，而其它部分可以由计算机系统执行。在一个实施例中，系统可以执行所有步骤。举例来说，系统可以包括机器人元件(例如，以获得样本且执行分析)、用于检测来自分析的信号的检测系统，以及用于分析信号的计算机系统。用于控制这个系统的指令可以存储在一个或多个计算机可读媒体中，例如现场可编程门阵列(FPGA)、快闪存储器和/或硬盘驱动器的配置逻辑。图27示出这种系统。
在方框2610处，获得血液样本的无细胞混合物。无细胞混合物的实例包括血浆或血清。无细胞混合物可以包括来自多个细胞谱系的无细胞DNA。
在一些实施例中，分离血液样本以获得无细胞的混合物。血浆和血清是不同的。两者都对应于血液的流体部分。为获得血浆，将抗凝血剂添加到血液样本中以防止其凝结。为获得血清，允许血液样本凝结。因此，在凝血期间将消耗凝血因子。关于循环DNA，一些DNA将在凝血期间会从血细胞释放到流体部分。因此，与血浆相比，血清具有更高的DNA浓度。凝血期间细胞的DNA可能会稀释对血浆具有特异性的DNA。因此，血浆可能是有利的。
在方框2620处，无细胞混合物中的DNA片段与对应于一个或多个差异甲基化区域的分析接触。通过相对于其它细胞谱系低甲基化或高度甲基化，一个或多个差异甲基化区域(DMR)中的每一个对特定血液细胞谱系具有特异性。本文提供了成红细胞谱系的DMR的实例。
在各种实施例中，分析可涉及PCR或测序，且因此是PCR分析或测序分析。与DNA片段接触可涉及流动细胞、液滴、珠粒或其它机制，以提供分析与DNA片段的相互作用。这种分析的实例包括全基因组亚硫酸氢盐测序、靶向亚硫酸氢盐测序(通过杂交捕获或扩增子测序)、其它甲基化感知(例如，太平洋生物科学的单分子实时(SMRT)DNA测序)、实时甲基化特异性PCR和数字PCR。本文中(例如，在章节XII中)描述了可用于方法300的分析的其它实例。尽管实例使用成红细胞，但也可使用其它细胞谱系，包括其它血液细胞谱系。
在方框2630处，基于从分析获得的信号，在一个或多个差异甲基化区域处在无细胞混合物中检测到甲基化或未甲基化DNA片段的第一数量。分析可以提供各种信号，例如光信号或电信号。信号可以提供每个DNA片段的特定信号，或指示具有甲基化标记的DNA片段总数的聚集信号(例如，如在实时PCR中)。
在一个实施例中，测序可用于获得DNA片段的序列读段，且所述DNA片段可与参考基因组对齐。如果DNA片段与DMR中的一个对齐，那么可以递增计数器。鉴于信号来自特定甲基化的未甲基化分析，可假定DNA片段具有所述甲基化标记。在另一实施例中，来自PCR的读段(例如，来自阳性孔的光信号)可用于递增这种计数器。
在方框2640处，使用第一数量来确定甲基化水平。第一甲基化水平可以标准化或是绝对浓度，例如每体积的生物样本。图25中提供了绝对浓度的实例。标准化的甲基化水平的实例包括E％(也称为Unmeth％)。
对于标准化的值，可以使用一个或多个差异甲基化区域处的无细胞混合物中的DNA片段的第一数量和总数来确定甲基化水平。如上文所描述，甲基化水平可以是未甲基化DNA片段的百分比。在其它实施例中，百分比可以是甲基化DNA片段的百分比，其将相对于成红细胞的上述实例具有反比关系。在各种实施方案中，甲基化水平可以使用DMR中所有位点的百分比，通过每个位点的个体百分比的平均值或每个位点的加权平均值来确定。
在方框2650处，甲基化水平与一个或多个截止值相比较，作为确定哺乳动物中的血液病症的分类的部分。可以从经验数据中选择一个或多个截止值，例如，如图8-10和图12-14所示。可以选择截止值以提供最佳灵敏度和特异性，以提供血液病症的准确分类，例如，基于从已知正常且具有病症的样本的数据集中的监督学习。
作为用于确定截止值的一实例，可获得多个样本。已知每种样本具有血液病症的特定分类，例如，通过所属领域技术人员已知的其它技术。多个样本具有至少两种血液病症的分类，例如患有所述病症和没有所述病症。还可以包括不同类型的病症，例如，如图10所示。可以针对多个样本中的每一个来确定一个或多个差异甲基化区域的甲基化水平，作为图8-10和图12-14中的数据点。
第一组样本可以鉴别具有血液病症的第一分类，例如为健康的第一分类。第一组可以聚集在一起，例如，如图8-10和图12-14中所示。第二组样本可以鉴别具有血液病症的第二分类。第二组可以是患有所述病症或与第一分类不同类型的病症的患者。这两种分类可以对应于具有相同病症的不同程度。当第一组样本共同具有统计学上高于第二组样本的甲基化水平时，可以确定截止值，其在特定的特异性和灵敏度内区分第一组样本和第二组样本。因此，可以使用特异性和灵敏度之间的平衡来选择合适的截止值。
XI.总结
RBC是在外周血液中最丰富的细胞类型，但不具有细胞核。在本公开中，我们确定红细胞谱系的细胞贡献了显著比例的血浆DNA库。在这项研究之前，已知造血细胞明显地贡献于循环DNA库(13、14)，但是许研究者假定这种造血DNA仅来自白细胞谱系(15)。使用DNA甲基化标记的最新结果已经显示，血浆DNA携带嗜中性粒细胞和淋巴细胞的DNA甲基化标记(15)。
使用包括成红细胞的数个组织的高分辨率参考甲基化组(18、20)，我们将红细胞来源的DNA分子与血浆DNA库中的其它组织类型的DNA进行了区分。我们基于成红细胞特异性甲基化标记的数字PCR分析使我们能够对血浆中的这些DNA分子进行定量分析。这种方法使我们能够证实健康受试者的血浆DNA库中存在大量的红细胞DNA。
我们的结果与骨髓中红细胞谱系的细胞向血浆中贡献DNA的结果一致。这个假设的推论是血浆中红细胞DNA的定量分析反映了骨髓红细胞生成活性，且因此可以帮助鉴别贫血的诊断。我们已经确立了健康受试者血浆中红细胞DNA的参考值。我们进一步证实，贫血患者可能会增加或减少循环红细胞DNA的比例，这取决于他们的病理和治疗的确切性质。特别来说，我们可以通过分析血浆中红细胞DNA的百分比来区分我们招募的患者中的两种骨髓衰竭综合征，即再生障碍性贫血(AA)和骨髓发育不良综合征(MDS)。
网织红细胞计数可用以提供关于在贫血患者骨髓反应的信息。在我们研究的11名β-地中海贫血患者中，四名患者的外周血液中网织红细胞计数低于1％，即检测极限。对于其它七名患者，网织红细胞计数范围介于1％到10％。对于患有再生障碍性贫血的所有九名患者，无论是否接受定期输血，其网织红细胞计数均低于1％。因此，网织红细胞计数可能由于自动化方法的高度不精确性在低浓度的网织红细胞下不明确地限定骨髓中正常和减少的红细胞生成活性(35、36)。
我们已经证实，对网织红细胞计数或网织红细胞指数的分析不能区分我们的患者群体中伴随减少的红细胞生成活性的贫血原因(图11A和图11B)。我们的结果表明，血浆Unmeth％(例如，如图10中所示)在反映骨髓中的红细胞生成活性方面比网织红细胞计数更准确。在测量两个参数的所有患者中，血浆Unmeth％和网织红细胞计数或网织红细胞指数之间不存在相关性(P＝0.3，线性回归)，如图11A和图11B所示。
类似地，在外周血液中异常高数量的成红细胞的存在意味着异常的红细胞生成应激(37)。然而，外周血液中不存在成红细胞并不意味着正常或减少的红细胞生成活性。相反，血浆成红细胞来源的DNA的定量分析产生关于骨髓红细胞生成活性的信息，这是外周血液的常规血液参数所不提供的。
对于β-地中海贫血和再生障碍性贫血，这两种病况通常通过分析血液和血红蛋白图案中的铁来诊断。但是，β-地中海贫血和再生障碍性贫血两个都表现出低血红蛋白水平，因此这种技术不能区分β-地中海贫血和再生障碍性贫血。使用Unmeth％，可以通过实现这两种病症之间的区分来提供更多的特异性，如图8和图10所示。
Unmeth％也可用于监测治疗。举例来说，对患有缺铁性贫血的患者的Unmeth％的分析可用于监测骨髓对口服铁疗法的反应，如图9所示。在一些患者中，口服铁补充剂可能有效地通过胃肠道吸收。结果，在开始治疗后不会增加红细胞生成。Unmeth％的增加不存在可以用作对口服铁治疗的不良反应的指标，使得可以开始其它治疗，例如肠胃外铁治疗(例如，右旋糖酐铁、葡萄糖酸铁和蔗糖铁)。或者，Unmeth％增加的不存在可用于中止(停止)治疗，从而节省无效治疗的成本。在另一个实施方案中，Unmeth％增加的不存在可用于鉴别何时增加治疗剂量，例如增加铁的剂量。当Unmeth％增加时，可以继续治疗。如果Unmeth％的增加足够高(例如，基于阈值)，那么可以停止治疗，因为可以假定红细胞生成活性达到足以最终将血红蛋白水平恢复到健康水平的水平，从而避免昂贵又可能有害的过量治疗。
因此，可响应于确定血液病症的分类指示哺乳动物具有血液病症来治疗哺乳动物的所述血液病症。在治疗之后，可以重复分析以确定更新的甲基化水平，且可以基于更新的甲基化水平确定是否继续进行治疗。在一个实施例中，确定是否继续进行治疗可以包括：当更新的甲基化水平相对于甲基化水平没有改变到指定阈值内时，停止治疗、增加治疗剂量或进行不同治疗。在另一实施例中，确定是否继续进行治疗可以包括：当更新的甲基化水平相对于甲基化水平改变到指定阈值内时继续治疗。
作为监测治疗的另一实例，Unmeth％分析可以用于确定地中海贫血患者的无效红细胞生成是否已通过治疗，例如通过输血被充分地抑制。髓外红细胞生成是地中海贫血患者骨骼畸形的原因。髓外红细胞生成可以通过输血和血红蛋白水平的恢复来抑制。Unmeth％可以显示患者对这些治疗的反应，且未能抑制Unmeth％可以用于指示应加强治疗。
Unmeth％也可用于将仅缺铁的患者与缺铁以及其它贫血原因(例如，归因于慢性病的贫血)的患者进行区分。预计仅缺铁的患者在铁治疗后会增加Unmeth％，但是多种贫血原因的那些患者不会显示Unmeth％升高的反应。
因此，我们已经证实，循环红细胞DNA的百分比在患有缺铁性贫血的患者中响应于铁疗法增加，因此反映了骨髓红细胞生成活性的增加。红细胞DNA比例的动态变化显示，血浆红细胞DNA的定量允许非侵入性监测相关的细胞过程。血浆DNA的快速动力学(例如，有几十分钟的半衰期次序(38、39))表明，这种监测可提供几乎实时结果。类似地，其它细胞谱系的循环无细胞DNA的百分比也允许对其它细胞谱系的骨髓中的相关细胞过程进行非侵入性监测。
当前的研究充当证据以证实在循环中造血祖细胞和前驱细胞的细胞核材料的存在。此外，也可以使用从其它造血谱系的前驱细胞释放的循环DNA的存在。
总之，我们已经证实，红细胞DNA贡献了显著比例的血浆DNA库。这个发现填补了我们对循环核酸基础生物学理解的重要空白。临床上，血浆中红细胞DNA的测量为研究和监测不同类型的贫血开辟了一条新途径，且预示着一个新的无细胞DNA血液测试家族的开始。
XII.材料和方法
这个章节描述了已经使用和可用于实施实施例的技术。
A.样本收集和准备
在一些实施例中，从匿名手术标本中撷取福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的各自具有四种病例的12种类型的正常组织(肝、肺、食道、胃、小肠、结肠、胰腺、肾上腺、膀胱、心脏、脑和胎盘)。收集的组织在组织学检查中被证实是正常的。在修改制造商的固定组织方案的情况下，使用QIAamp DNA迷你试剂盒(凯杰)从FFPE组织方案中提取DNA。使用脱蜡溶液(凯杰)代替二甲苯以去除石蜡。在用缓冲液ATL和蛋白酶K裂解以逆转核酸的甲醛修饰后，进行在90℃下培育1小时的额外步骤。
为制备用于分析的红细胞富集样本，分娩后立即从八名孕妇中的每一个中将1-3毫升的脐带血液收集到含EDTA的管中。使用Ficoll-Paque PLUS溶液(通用电气医疗集团)进行密度梯度离心，从脐带血样本中分离单核细胞。将1×108个经分离单核细胞与两种抗体：异硫氰酸荧光素(FITC)共轭的抗CD235a(美天旎生物技术公司)和藻红蛋白(PE)共轭的抗CD71抗体(美天旎生物技术公司)的1mL混合物以1:10稀释在磷酸盐缓冲盐水中在暗处在4℃下一起培育30分钟。CD235a+和CD71+细胞随后通过BD FACSAria融合流式细胞仪(BD生物科学)分选以用于富集成红细胞(1)。合并来自八个病例的CD235a+CD71+细胞以用于下游分析。使用QIAamp DNA Blood迷你试剂盒(凯杰)用制造商的说明从合并的CD235a+CD71+细胞中提取DNA。
将外周血液样本收集到含有EDTA的管中并立即存储在4℃下。从每位患者收集10mL外周静脉血。在抽血后6小时内进行血浆分离。从4mL血浆中提取血浆DNA。如先前所述获得血浆和血沉棕黄层DNA(2)。简单来说，首先将血液样本在4℃下以1,600g离心10分钟，且将血浆部分在4℃下以16,000g再离心10分钟。在以2,500g再离心10分钟后收集血细胞部分以去除任何残留的血浆。分别使用QIAamp DSP DNA迷你试剂盒(凯杰)和QIAamp DNA血液迷你试剂盒(凯杰)提取来自血浆和血沉棕黄层的DNA。
B.DNA的亚硫酸氢盐转化
从血细胞和FFPE组织中提取的血浆DNA和基因组DNA根据制造商的说明书使用Epitect Plus亚硫酸氢盐试剂盒(凯杰)进行两轮的亚硫酸氢盐处理(3)。
在一个实施例中，从生物样本中提取的DNA首先用亚硫酸氢盐处理。亚硫酸氢盐处理将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，同时保持甲基化的胞嘧啶不变。因此，在亚硫酸氢盐转化后，可以基于CpG二核苷酸处的序列差异来区分甲基化序列和未甲基化序列。为了分析本申请的选定实施例中呈现的血浆样本，从2-4mL血浆中提取DNA。为了分析从血细胞中提取的DNA，在实例中将1μgDNA用于下游分析。在其它实施例中，可以使用其它体积的血浆和一定量的DNA。
在本申请中的实例中，根据制造商的说明书使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒对每个样本进行两轮的亚硫酸氢盐处理。将亚硫酸氢盐转化的血浆DNA在50μL水中洗脱。将亚硫酸氢盐转化的细胞DNA在20μL水中洗脱，然后稀释100倍以用于下游分析。
C.甲基化状态
各种甲基化分析可用于从特定的细胞谱系定量DNA的量。
1.PCR分析
进行两个数字PCR分析，针对三个成红细胞特异性DMR中的每一个，一个靶向亚硫酸氢盐转化的未甲基化序列且另一个靶向甲基化序列。用于分析的引物和探针设计列于补充表7中。
FECH基因标记位点(染色体18:55250563-55250585)
Ery-1标记位点(chr 12:48227688-48227701)
Ery-2标记位点(染色体12:48228144-48228154)
表7.成红细胞特异性DMR的甲基化和未甲基化序列的数字PCR分析的寡核苷酸序列。反向引物和探针中加下划线的核苷酸代表CpG位点处的差异甲基化胞嘧啶。VIC和FAM表示2个荧光报导子。
作为实例，PCR反应可以包括50μL用3μL亚硫酸氢盐转化的模板DNA、最终浓度为0.3μM的每个引物、0.5μM的MgCl2和25μL的2×KAPA HiFi HotStart Uracil ReadyMix。可以使用以下PCR热曲线：95℃持续5分钟和35个循环的98℃持续20秒，57℃持续15秒和72℃持续15秒，随后最后延伸步骤72℃持续30秒。在其它实施例中，非优先全基因组测序可以与比对组合进行，但是这样的程序可能不具有成本效益。
在一些实施例中，对于样本的数字PCR分析，在亚硫酸氢盐处理后制备20μL反应混合物。在一个实施例中，反应混合物含有8μL模板DNA，两种正向引物中的每一种的终浓度为450nM，反向引物为900nM，且探针为250nM。在其它实施例中，制备总体积为20μL的每种反应混合物，其含有8uL模板DNA、最终浓度为900nM的正向引物、900nM的反向引物和250nM的探针。随后使用BioRad QX200ddPCR液滴产生器将反应混合物用于产生液滴。通常，每个样本将产生20,000个液滴。在一些实施方案中，将液滴转移到干净的96孔板中，随后使用用于甲基化和未甲基化特定分析的相同条件进行热循环：95℃×10分钟(1个循环)、40个循环的94℃×15秒和60℃×1分钟、98℃×10分钟(1个循环)，随后进行12℃保持步骤。在PCR之后，通过BioRad QX200液滴读取器分析每个样本的液滴，并使用QuantaSoft(版本1.7)软件解释结果。
2.其它甲基化分析的实例
甲基感知测序的其它实例包括使用单分子测序平台，其将允许直接地阐明DNA分子(包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶)的甲基化状态而无需亚硫酸氢盐转换(AB Flusberg等人2010《自然方法》；7：461-465；J Shim等人2013《科学报道(SciRep)》；3:1389)；或通过甲基化胞嘧啶的免疫沉淀(例如，通过使用针对甲基胞嘧啶的抗体或通过使用甲基化DNA结合蛋白或肽(LG Acevedo等人2011年《实验胚胎学(Epigenomics)》；3：93-101)随后进行测序；或者通过使用甲基化敏感性限制酶，随后进行测序。
在一些实施例中，DNA混合物中的基因组位点的甲基化水平可以使用全基因组亚硫酸氢盐测序法来确定。在其它实施例中，基因组位点的甲基化水平可以使用甲基化微阵列分析，例如Illumina HumanMethylation450系统，或通过使用甲基化免疫沉淀(例如，使用抗甲基胞嘧啶抗体)或用甲基化结合蛋白处理，随后进行微阵列分析或DNA测序，或通过使用甲基化敏感性限制酶处理，随后进行微阵列或DNA测序，或通过使用甲基化感知测序，例如使用单分子测序方法(例如，通过纳米孔测序(Schreiber等人《美国国家科学院院刊》2013；110:18910-18915)或通过太平洋生物科学单分子实时分析(Flusberg等人《自然方法》2010；7:461-465))来确定。组织特异性甲基化水平可以用相同方式测量。作为另一实例，靶向亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性PCR、基于非亚硫酸氢盐的甲基化感知测序(例如，通过单分子测序平台(Powers等人高效准确的全基因组装配和大肠杆菌的甲基化组分析(Efficient and accurate whole genome assembly and methylome profiling ofE.coli.)《BMC基因组学(BMC Genomics)》2013；14:675)可用于分析血浆DNA的甲基化水平以用于血浆DNA甲基化反卷积分析。因此，可以以多种方式获得甲基化感知测序结果。
D.统计分析
皮尔森氏相关性用于研究通过血液学分析器在β-重型地中海贫血患者中量测的外周血白细胞中的红细胞DNA百分比(E％(FECH))和成红细胞百分比之间的相关性。皮尔森氏相关性也用于研究健康对照者的血浆DNA与血沉棕黄层DNA中配对的E％(FECH)结果之间的相关性。威尔科克森符号秩检验用于比较健康受试者的血浆DNA和配对血沉棕黄层DNA中E％之间的差异。曼惠特尼秩和检验用于比较健康受试者和不同疾病组的贫血患者的血浆DNA中E％之间的差异。
我们还开发了生物信息传递途径(pipeline)以基于我们正文中所描述的标准挖掘成红细胞特异性DMR。生物信息传递途径可以在各种平台中实现，例如Perl平台。
XIII.实例系统
图27说明根据本发明的实施例的系统2700。所示系统包括样本2705，例如样本架2710内的无细胞DNA分子，其中样本2705可与分析2708接触以提供物理特征2715的信号。样本架的实例可以是流动槽，其包括分析的探针和/或引物或液滴通过其移动的管(液滴包括分析)。来自样本的物理特征2715(例如荧光强度值)由检测器2720检测。检测器可以间隔(例如，周期性间隔)进行测量以获得构成数据信号的数据点。在一个实施例中，模数转换器多次将来自检测器的模拟信号转换成数字形式。数据信号2725从检测器2720发送到逻辑系统2730。数据信号2725可以存储在本地存储器2735、外部存储器2740或存储装置2745中。
逻辑系统2730可以是或可以包括：计算机系统、ASIC、微处理器等。其还可包括显示器(例如，监测器、LED显示器等)和用户输入装置(例如，鼠标、键盘、按钮等)或与其耦接。逻辑系统2730和其它组件可以是独立或网络连接的计算机系统的一部分，或者其可以直接连接或结合在热循环仪装置中。逻辑系统2730还可以包括在处理器2750中执行的优化软件。逻辑系统1030可以包括存储用于控制系统1000以执行本文中描述的任何方法的指令的计算机可读媒体。
本文中提及的任何计算机系统中的任一种都可以利用任何合适数目的子系统。计算机系统10中的这些子系统的实例显示于图28中。在一些实施例中，计算机系统包括单个计算机装置，其中子系统可以是计算机装置的组件。在其它实施例中，计算机系统可以包括具有内部组件的多个计算机装置，每个计算机装置是子系统。计算机系统可以包括台式计算机和膝上型计算机、平板电脑、移动电话和其它移动装置。
图28中所示的子系统通过系统总线75互连。示出了额外的子系统，如打印机74、键盘78、一个或多个存储装置79、耦接到显卡82的监测器76等。耦接到I/O控制器71的周边装置和输入/输出(I/O)装置可以通过所属领域已知的各种方式(例如，输入/输出(I/O)端口77(例如，USB，))连接到计算机系统。举例来说，可以使用I/O端口77或外部接口81(例如，以太网、Wi-Fi等)将计算机系统10连接到广域网(例如因特网)、鼠标输入装置或扫描仪。通过系统总线75的互连允许中央处理器73与每个子系统通信并且控制来自系统存储器72或存储装置79(例如，固定磁盘，如硬盘驱动器或光盘)的多个指令的执行，以及子系统之间的信息交换。系统存储器72和/或一个或多个存储装置79可以体现为计算机可读媒体。另一子系统为数据收集装置85，如相机、麦克风、加速计等。在此提及的任何数据可以从一个组件输出到另一个组件且可以输出到用户。
计算机系统可以包括例如通过外部接口81或通过内部接口连接在一起的多个相同组件或子系统。在一些实施例中，计算机系统、子系统或设备可以经由网络通信。在这些情况下，一个计算机可以视为客户端并且另一个计算机视为服务器，其中每一个可以是同一计算机系统的部分。客户端和服务器可以各自包括多个系统、子系统或组件。
实施例的各方面可以使用硬件的控制逻辑(例如，专用集成电路或现场可编程门阵列)的形式和/或使用具有通用可编程处理器的计算机软件以模块或集成方式来实施。如本文中所使用，处理器包括单核处理器、在同一集成芯片上的多核处理器，或在单个电路板上或网络化的多个处理单元。基于本公开和本文中所提供的教示，所属领域的普通技术人员将知道并且理解使用硬件和硬件与软件的组合来实施本发明的实施例的其它方式和/或方法。
本申请中描述的软件组件或功能中的任一种中可以实施为使用任何适当计算机语言(例如，Java、C、C++、C#、Objective-C、Swift)或脚本语言(例如，Perl或Python)使用例如传统的或面向对象的技术由处理器执行的软件代码。软件代码可以存储为用于存储和/或传输的计算机可读媒体上的一系列指令或命令。适合的非暂时性计算机可读媒体可以包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、如硬盘驱动器或软盘的磁性媒体或如光盘(CD)或DVD(数字通用光盘)的光学媒体、快闪存储器等。计算机可读媒体可以是这类存储装置或传输装置的任何组合。
这些程序还可以使用适合于通过符合多种协议的有线、光学和/或无线网络(包括因特网)传输的载波信号来编码和传输。因此，计算机可读媒体可以使用以这些程序编码的数据信号产生。用程序代码编码的计算机可读媒体可与兼容装置一起封装或与其它装置分开提供(例如，通过因特网下载)。任何这样的计算机可读媒体可以驻留在单个计算机产品(例如，硬盘驱动器、CD或整个计算机系统)上或内部，且可以存在于系统或网络内的不同计算机产品上或内部。计算机系统可以包括用于向用户提供本文中提及的结果中的任一个的监测器、印刷机或其它合适显示器。
可以利用包括一个或多个处理器的计算机系统来完全或部分地执行本文描述的方法中的一种，所述一个或多个处理器可以被配置成执行这些步骤。因此，实施例可以涉及被配置成执行本文描述的方法中的任一种的步骤的计算机系统，所述计算机系统潜在地具有执行相应步骤或相应的一组步骤的不同组件。尽管以编号的步骤呈现，但是可以在同一时间或以不同顺序执行本文的方法的步骤。另外，这些步骤的部分可以与其它方法的其它步骤的部分一起使用。而且，步骤的全部或部分可以是任选的。另外，任何方法的步骤中的任一个步骤可以利用用于执行这些步骤的模块、电路或其它装置来执行。
在不脱离本发明的实施例的精神和范围的情况下，可以任何合适的方式组合特定实施例的具体细节。然而，本发明的其它实施例可以涉及与每个单独方面或这些单独方面的具体组合有关的具体实施例。
为了说明和描述的目的，已经呈现了本发明的示例性实施例的以上描述。这并不意味着是穷举的并且并不意味着将本发明限制为所描述的精确形式，并且鉴于以上教示，许多修改和变化是可能的。
除非特别地有相反指示，否则“一(a/an)”或“所述”的叙述旨在表示“一个或多个”。除非特别地有相反指示，否则“或”的使用旨在表示“包括性的或”，而不是“排除性的或”。对“第一”组件的引用不一定要求提供第二组件。此外，除非明确说明，否则对“第一”或“第二”组件的引用不将所引用的组件限制到特定位置。
出于所有目的，本文提及的所有专利、专利申请、出版物和描述的全部内容通过引用并入。没有一篇被承认是现有技术。
XIV.参考文献
以下参考上面提到的并出于所有目的通过引用的方式整体并入。
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35.Buttarello M.，《贫血的实验室诊断：新老红细胞参数在分类和治疗中是否有用，如何有用？(Laboratory diagnosis of anemia:Are the old and new red cellparameters useful in classification and treatment,how？)》，《国际实验室血液学杂志(Int J Lab Hematol)》2016；38增刊1:123-32。
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39.To EW，Chan KC，Leung SF，Chan LY，To KF，Chan AT等人《鼻咽癌手术治疗后血浆Epstein-Barr病毒DNA的快速清除(Rapid clearance of plasma Epstein-Barrvirus DNA after surgical treatment of nasopharyngeal carcinoma)》，《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》2003；9:3254-9。

Claims (35)

1.一种分析哺乳动物的血液样本的方法，所述方法包含：
获得所述血液样本的无细胞混合物，所述无细胞混合物包括来自多个细胞谱系的无细胞DNA；
使所述无细胞混合物中的DNA片段与对应于一个或多个差异甲基化区域的分析接触，所述一个或多个差异甲基化区域中的每一个通过相对于其它细胞谱系低甲基化或高度甲基化而对特定血液细胞谱系具有特异性；
基于从所述分析获得的信号，在所述一个或多个差异甲基化区域处检测所述无细胞混合物中的甲基化或未甲基化DNA片段的第一数量；
使用所述第一数量确定甲基化水平；和
将所述甲基化水平与一个或多个截止值进行比较，作为确定所述哺乳动物中的血液病症的分类的部分。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包含：
确定在所述一个或多个差异甲基化区域的所述无细胞混合物中DNA片段的总数；和
使用所述第一数量和所述总数确定所述甲基化水平。
3.根据权利要求1所述的方法，进一步包含：
确定所述无细胞混合物的体积，其中所述甲基化水平确定所述无细胞混合物的所述第一数量和所述体积。
4.根据权利要求1所述的方法，其中获得所述无细胞混合物包括：
将所述无细胞混合物与所述血液样本分离，所述无细胞混合物包含血浆或血清。
5.根据权利要求1所述的方法，进一步包含通过以下来鉴别所述一个或多个差异甲基化区域：
获得多个细胞谱系中的每一个的多个位点的甲基化指数，所述多个细胞谱系包括所述特定血液细胞谱系和所述其它细胞谱系；
在所述多个位点的每个位点处，比较所述多个细胞谱系的所述甲基化指数；
鉴别所述多个位点中的一个或多个位点，所述位点在所述特定血液细胞谱系中具有低于/高于第一甲基化阈值的甲基化指数，且在所述其它细胞谱系中的每一个中具有高于/低于第二甲基化阈值的甲基化指数；和
鉴别含有所述一个或多个位点的差异甲基化区域。
6.根据权利要求1所述的方法，进一步包含确定所述一个或多个截止值，包括：
获得多个样本，每个样本已知具有所述血液病症的特定分类，所述多个样本具有所述血液病症的至少两种分类；
确定所述多个样本中的每一个的所述一个或多个差异甲基化区域的甲基化水平；
鉴别具有所述血液病症的第一分类的第一组样本；
鉴别具有所述血液病症的第二分类的第二组样本，所述第一组样本共同具有比所述第二组样本统计学上更高的甲基化水平；和
确定在特定特异性和灵敏度内区分所述第一组样本和所述第二组样本的截止值。
7.根据权利要求1所述的方法，其中确定所述血液病症的所述分类包括鉴别所述血液病症的特定类型。
8.根据权利要求1所述的方法，进一步包含：
响应于确定所述血液病症的所述分类指示所述哺乳动物具有所述血液病症，治疗所述哺乳动物的所述血液病症；
治疗之后，重复所述分析以确定更新的甲基化水平；和
基于所述更新的甲基化水平确定是否继续进行所述治疗。
9.根据权利要求8所述的方法，其中确定是否继续进行所述治疗包括：
当所述更新的甲基化水平相对于所述甲基化水平没有改变到指定阈值内时，停止所述治疗、增加所述治疗的剂量或进行不同的治疗。
10.根据权利要求8所述的方法，其中确定是否继续进行所述治疗包括：
当所述更新的甲基化水平相对于所述甲基化水平改变到指定阈值内时，继续所述治疗。
11.根据权利要求1所述的方法，进一步包含：
基于将所述甲基化水平与一个或多个截止值进行比较来确定存在血液病症；和
响应于确定存在所述血液病症而进行骨髓活检。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析是PCR分析或测序分析。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个差异甲基化区域包含CpG位点。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述一个或多个差异甲基化区域的第一区域包含在彼此的100bp内的多个CpG位点，且其中所述多个CpG位点皆为低甲基化或高度甲基化。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述多个CpG位点在对应于所述哺乳动物的参照基因组上跨越100bp或更少。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述特定血液细胞谱系是红血细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，进一步包含：
测量所述血液样本的血红蛋白水平；
将所述血红蛋白水平与血红蛋白阈值进行比较；和
进一步基于所述血红蛋白水平与所述血红蛋白阈值的所述比较，确定所述血液病症的所述分类。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述一个或多个差异甲基化区域中的一个在FECH基因中。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述一个或多个差异甲基化区域中的一个在基因组坐标48227688-48227701处的染色体12中。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述一个或多个差异甲基化区域中的一个在基因组坐标48228144-48228154处的染色体12中。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述血液病症是贫血。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述血液病症的所述分类对应于增加的红细胞生成活性、中度红细胞生成活性或减少的红细胞生成活性。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述血液病症的所述分类是β地中海贫血的红细胞生成活性增加。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述血液病症的所述分类是来自缺铁性贫血的中度红细胞生成活性。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述血液病症的所述分类是再生障碍性贫血或慢性肾衰竭的红细胞生成活性减少。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个差异甲基化区域是低甲基化的。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述无细胞混合物是血浆。
28.一种测量生物样本中特定细胞谱系的细胞量的方法，所述方法包含：
获得所述生物样本的无细胞混合物，所述无细胞混合物包括来自多个细胞谱系的无细胞DNA；
使所述无细胞混合物中的DNA片段与对应于一个或多个差异甲基化区域的分析接触，所述一个或多个差异甲基化区域中的每一个通过相对于其它细胞谱系低甲基化或高度甲基化而对特定细胞谱系具有特异性；
基于从所述分析获得的信号，在所述一个或多个差异甲基化区域处检测所述无细胞混合物中的甲基化或未甲基化DNA片段的第一数量；
使用所述第一数量确定第一甲基化水平；
获得一个或多个校准数据点，其中每个校准数据点指定(1)所述特定细胞谱系的细胞量和(2)校准甲基化水平，且其中所述一个或多个校准数据点由多个校准样本确定；
将所述第一甲基化水平与至少一个校准数据点的校准甲基化水平进行比较；和
基于所述比较估计所述生物样本中所述特定细胞谱系的细胞量。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述特定细胞谱系是特定血液细胞谱系。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述一个或多个校准数据点是多个校准数据点，且其中所述校准数据点形成校准曲线。
31.一种计算机产品，包含计算机可读媒体，所述计算机可读媒体存储多个用于控制系统以执行根据权利要求1到30中任一项所述的方法的指令。
32.一种系统，包含：
根据权利要求31所述的计算机产品；和
一个或多个处理器，用于执行存储在所述计算机可读媒体上的指令。
33.一种系统，被配置成执行根据权利要求1到30中任一项所述的方法。
34.一种计算机产品，包含计算机可读媒体，所述计算机可读媒体储存多个用于控制系统以通过执行以下来分析哺乳动物的血液样本的指令：
基于从分析获得的信号，在一个或多个差异甲基化区域处检测所述血液样本的无细胞混合物中甲基化或未甲基化DNA片段的第一数量，所述一个或多个差异甲基化区域中的每一个通过相对于其它细胞谱系低甲基化或高度甲基化而对特定血液细胞谱系具有特异性；
使用所述第一数量确定甲基化水平；和
将所述甲基化水平与一个或多个截止值进行比较，作为确定所述哺乳动物中血液病症的分类的部分。
35.一种计算机产品，包含计算机可读媒体，所述计算机可读媒体储存多个用于控制系统以通过执行以下来测量生物样本中特定细胞谱系的细胞量的指令：
基于从分析获得的信号，在一个或多个差异甲基化区域处检测所述生物样本的无细胞混合物中甲基化或未甲基化DNA片段的第一数量，所述一个或多个差异甲基化区域中的每一个通过相对于其它细胞谱系低甲基化或高度甲基化而对特定细胞谱系具有特异性；
使用所述第一数量确定第一甲基化水平；
获得一个或多个校准数据点，其中每个校准数据点指定(1)所述特定细胞谱系的细胞量和(2)校准甲基化水平，且其中所述一个或多个校准数据点由多个校准样本确定；
将所述第一甲基化水平与至少一个校准数据点的校准甲基化水平进行比较；和
基于所述比较估计所述生物样本中所述特定细胞谱系的细胞量。
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