CN113444784B - 重症先天性中性粒细胞减少症检测引物组合物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测重症先天性中性粒细胞减少症基因的引物组合物及其应用，涉及分子生物学技术领域。利用本发明提供的与SCN相关基因突变的基因群，结合高通量测序技术，可一次性检测所述9个基因的252个基因突变位点，覆盖面广，检测效率高，具有操作简便、精确度、准确性、灵敏度高等优点，解决了目前检测准确性低、检测方法局限的技术缺陷，同时可实现在骨髓形态学和血常规检查之外对SCN进行辅助诊断，特别是对于疾病后续的治疗方向和效果做出预判具有特殊的优势，可弥补临床SCN在分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等指导方面的不足。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测重症先天性中性粒细胞减少症基因的引物组合物及其应用。
背景技术
重症先天性中性粒细胞减少症(severe congenital neutropenia，SCN)也称婴儿致死性中性粒细胞减少症，是一类以中性粒细胞减少为主要特征的疾病，属于先天性骨髓衰竭性疾病中的一种类型，患者大部分有家族性遗传病史。中性粒细胞减少症通常定义为由于患者外周血中的中性粒细胞绝对数量(absolute neutrophil count，ANC)减少而引发的一组综合征。对于儿童患者而言，中性粒细胞减少症的诊断标准随年龄而异：出生后2周至1岁婴儿的ANC<1.0×109/L；儿童及成人的ANC<1.5×109/L，即可诊断为中性粒细胞减少症。此外该病可进一步分为轻、中、重和极重型：ANC<1.5×109/L为轻型；ANC<1.0×109/L为中型；ANC<0.5×109/L为重型；ANC<0.2×109/L为极重型。根据临床表现SCN可分为非综合征型和综合征型。多数患者发病年龄早，于出生后2个月至1岁起发病，甚至从新生儿期便反复发生皮肤黏膜、呼吸道、泌尿道等处的细菌性感染，这也构成了SCN患者死亡的主要原因。感染的发生率与粒细胞减少程度呈正相关，但同时还与患者的免疫状态有关，免疫功能正常的患者可不发生严重感染。除感染外，综合征型患者还伴有骨质疏松、神经系统损害、心脏和泌尿生殖系统畸形等。此外，SCN患者还具有向恶性疾病，如骨髓增生异常综合征(myelodysplatic syndrome，MDS)或急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)转化的高风险。
由Kostmann报道的SCN患者为常染色体隐性遗传，但近年来的研究表明SCN是与多个基因突变相关的异质性遗传综合征，有常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传、散发和X染色体连锁隐性遗传等多种遗传方式。对于SCN的诊断，主要包括：①出生至少3个月后，至少3次检测ANC<0.5×109/L；②具有相应的临床表现，如频繁出现的发热、感染、慢性牙龈炎、感染处无脓性分泌物等；③骨髓涂片显示粒系细胞成熟障碍，多停滞在早幼粒阶段；④骨髓细胞染色体核型分析显示正常核型；⑤需排除感染、化疗、药物及其他类型中性粒细胞减少症；⑥基因分子诊断是识别SCN有力的证据。
通常SCN诊断的第一步是进行血常规检查，在严重的中性粒细胞减少症中，白细胞是唯一受影响的血细胞类型，红细胞和血小板一般正常，单核细胞有时也会升高，如果一种以上类型的血细胞受到影响，则应考虑其他诊断(如Shwachman Diamond综合征)。随后通过每周两次血常规检查以排除周期性中性粒细胞减少症。同时骨髓活检也可辅助判断SCN。基因突变分析是SCN诊断的金标准，目前可检测出30-70％的SCN患者。然而，未检出基因突变并不能排除SCN，原因可能是尚存在目前未知的基因，或目前的检测套餐范围尚未能覆盖所有已知的突变。目前检测SCN的方法主要涉及骨髓细胞形态、血常规检查及分子生物学等。其中分子生物学的实验方法主要有巢式PCR、一代测序等。PCR方法不能直观的得到具体的突变序列，而一代测序的方法受到测序通量的影响，无法一次性检测多个基因的全部外显子区域。二代测序作为一种高通量的检测方法，可以一次性准确测量多个基因的外显子序列，使精准治疗成为可能。目前对于SCN在应用二代测序的方法进行基因检测方面的研究屈指可数，而SCN在基因诊断水平的检测尤为重要。
专利CN101448934B公开了一种用于检测抗-HNA抗体的谱细胞，可用于检测粒细胞抗体，但其操作较为复杂，且无法用于粒细胞减少的早期检测或诊断。专利CN106222287A则公开了一种检测先天性中性粒细胞减少症患者ELA2基因突变的引物和方法，用于辅助诊断先天性中性粒细胞减少症，但其漏检的可能性较大准确性较低。
因此，亟需一种精确度、准确性更高的SCN检测试剂盒及方法，以弥补临床SCN在分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等指导方面的不足。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种用于检测重症先天性中性粒细胞减少症基因的引物组合物及其应用。采用本发明所述的引物组合物，检测重症先天性中性粒细胞减少症相关基因，具有操作简便、精确度、准确性、灵敏度高的优点，可弥补临床SCN在分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等指导方面的不足。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种用于检测重症先天性中性粒细胞减少症基因的引物组合物，所述的重症先天性中性粒细胞减少症基因为WAS、ELANE、GFI1、HAX1、G6PC3、VPS45、JAGN1、CSF3R或SBDS中的一种或多种。
具体地，所述的重症先天性中性粒细胞减少症基因的突变位点如下表1所示。
表1重症先天性中性粒细胞减少症基因突变位点
进一步具体地，所述的引物组合物如下表2所示。
表2引物组合物
具体地，所述的引物覆盖整个基因的全部外显子序列。
另一方面，本发明提供了上述引物组合物在制备检测重症先天性中性粒细胞减少症基因的产品中的应用。
又一方面，本发明提供了一种检测重症先天性中性粒细胞减少症基因的产品，所述的产品包括上述引物组合物。
具体地，所述的产品还包括DNA聚合酶、Buffer、ddH2O、dNTP。
具体地，所述的产品为独立试剂或试剂盒。
又一方面，本发明提供了上述引物组合物或产品在检测重症先天性中性粒细胞减少症基因中的应用。
又一方面，本发明提供了一种检测重症先天性中性粒细胞减少症基因的方法，所述的方法为非疾病诊断和治疗方法，所述方法包括利用上述引物组合物或产品对待测样品中重症先天性中性粒细胞减少症基因进行检测。
具体地，所述的方法包括以下步骤：
(1)基因组DNA提取；
(2)多重PCR：用上述引物组合物对步骤(1)得到的基因组DNA进行扩增；
(3)建库；
(4)文库测序及数据处理。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明提供了一种检测重症先天性中性粒细胞减少症基因的引物组合物，利用本发明提供的与SCN相关基因突变的基因群，结合高通量测序技术，可以实现在骨髓形态学和血常规检查之外对SCN进行辅助诊断，特别是对于疾病后续的治疗方向和效果做出预判具有特殊的优势，可弥补临床SCN在分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等指导方面的不足。
(2)本发明所述的引物组合物检测重症先天性中性粒细胞减少症相关基因，具有操作简便、精确度、准确性、灵敏度高等优点，解决了目前检测准确性低，检测方法局限的技术缺陷。
(3)本发明所述的引物组合物可一次性检测所述9个基因的252个基因突变位点，覆盖面广，检测效率高。
附图说明
图1为ELANE基因c.655G>A核苷酸突变示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例1重症先天性中性粒细胞减少症基因、突变位点及其引物组合物
(1)SCN是一类罕见的异质性疾病，分为两型：婴儿遗传性粒细胞缺乏症和重型家族性中性粒细胞减少症。前者为常染色体隐性遗传，多于1岁内死亡；后者则为常染色体显性遗传，婴儿和儿童期均可发病。两者中性粒细胞计数(ANC)均低于0.5×109/L。SCN患者易患严重感染，其中以金黄色葡萄球菌和革兰(氏)阴性细菌感染致死性最高。
采用dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，千人基因组数据库1000Genomes(http://www.1000genomes.org/)，外显子组整合数据库ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)和人类基因突变数据库HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)，以及功能预测工具PolyPhen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和SIFT(http://sift.jcvi.org/)，并采用以下原则筛选致病突变位点：(1)根据突变所在的基因组位置和类型，过滤掉对蛋白产物序列不产生影响的突变；(2)利用1000Genomes数据和ExAC数据，注释每个突变在人群中的比例，如果比例小于等于1％则不认为是多态性位点；(3)检索人类基因突变数据库，查询一个突变在HGMD中是否有记载，其出现在SCN等相关疾病中；(4)利用蛋白质功能预测软件PolyPhen-2和SIFT预测该突变是否影响蛋白功能；(5)如果经过(2)(3)(4)后，一个突变满足“非多态性”、“SCN记载过”和“影响蛋白功能”这三条中至少两条的，将被判为与疾病可能相关；(6)如果一个突变虽然不满足(5)但是在HGMD中有记录，则被判读为意义不明的突变；如果一个突变在文献中被明确记载与疾病高度相关，则直接判为热点突变。
最终筛选得到以下基因：(1)WAS基因：其突变与X连锁先天性严重嗜中性粒细胞减少症有关；(2)ELANE基因：其突变与先天性严重嗜中性粒细胞减少症1型有关；(3)GFI1基因：其突变与先天性严重嗜中性粒细胞减少症2型有关；(4)HAX1基因：其纯合或复合杂合突变与先天性严重嗜中性粒细胞减少症3型有关；(5)G6PC3基因：其纯合或复合杂合突变与先天性严重嗜中性粒细胞减少症4型有关；(6)VPS45基因：其纯合或复合杂合突变与先天性严重嗜中性粒细胞减少症5型有关；(7)JAGN1基因：其纯合或复合杂合突变与先天性严重嗜中性粒细胞减少症6型有关；(8)CSF3R基因：其纯合或复合杂合突变与先天性严重嗜中性粒细胞减少症7型有关；(9)SBDS基因：其突变与先天性严重嗜中性粒细胞减少症有关。
具体突变位点如下表3所示。
表3突变位点
(2)根据上述基因及突变位点设计引物组合物及其浓度如下表4所示。
表4引物组合物
(3)复合体系PCR扩增：将上述引物混合至一个反应体系中，并选择在保证模板浓度一定的条件下最合适的引物浓度，使复合体系中的每对引物尽量做到最优扩增。
实施例2一种用于检测SCN的试剂盒及其使用方法
1.复合扩增体系中的扩增引物
复合扩增体系中，各基因及突变位点的正反向扩增引物如上表4所示，为使每个基因及突变位点的扩增效率尽可能的一致，通过调整复合体系中每对引物的浓度，最终调整后的引物浓度如上表4所示。
2.DNA提取：利用DNA提取试剂盒提取外周血或骨髓样本的全基因组DNA。
3.根据实施例1提供的引物组合物对提取的DNA进行复合PCR扩增。
其中，复合扩增体系如下表5所示。
表5复合扩增体系
| 成分 | 体积 |
| AgriSeq<sup>TM</sup> Amplification Mix | 2μL |
| Ion AmpliSeq<sup>TM</sup> Primer Pool | 5μL |
| 稀释后DNA样本(10ng/μL) | 3μL |
DNA来源于所测样本，Primer pool为上述引物的混合物，各引物浓度如表4所示。
复合扩增反应程序如下：99℃，2min；99℃，15s，62℃，4min，2cycles；99℃，15s，60℃，8min，14cycles；10℃，贮存。
4.采用试剂盒将扩增产物制备成可供测序平台测序的DNA文库，完成建库。
4.1对扩增产物进行酶切。酶切体系如下表6所示。
表6酶切体系
| 步骤3复合扩增产物 | 20μL |
| Pre-ligation | 2μL |
酶切反应程序如下：50℃，20min；55℃，20min；60℃，20min；10℃，贮存。反应结束后对产物进行磁珠法纯化。
其中，Pre-ligation购自ThermoFisherScientific，货号为A34141。
4.2末端修复&加A。反应体系如下表7所示。
表7末端修复&加A
| 酶切产物 | 40μL |
| End Repair&A-Tailing Enzyme | 4μL |
| End Repair&A-Tailing Buffer | 6μL |
反应程序如下：20℃，30min；65℃，30min；4℃，贮存。
其中，End Repair&A-Tailing Enzyme及End Repair&A-Tailing Buffer购自那昂达，货号1002103。
4.3接头连接。反应体系如下表8所示。
表8接头连接
| End repair and A-tailing reaction product | 50μL |
| IDT UDI接头(15μM) | 2μL |
| Ligation Buffer | 26μL |
| DNA Ligase | 2μL |
反应程序如下：20℃，20min。反应结束后对产物进行磁珠法纯化。
其中，IDT UDI接头(15μM)、Ligation Buffer、DNA Ligase购自那昂达，接头货号1003227，Ligase货号1002103。
4.4文库富集。反应体系如下表9所示。
表9文库富集
扩增反应程序如下：98℃，2min；98℃，15s，60℃，30s，72℃，30s，7cycles；72℃，2min；4℃，贮存。反应结束后对产物进行磁珠法纯化。
其中，2X HiFi PCR Master Mix购自那昂达，货号1002103。
5.将DNA文库进行测序，得到下机数据，并对下机数据进行生物学分析。
实施例3重复性检测
选取一例经临床症状和相关实验室检查诊断为SCN的患者，其中，经一代测序检测为ELANE基因c.655G>A核苷酸突变，其氨基酸突变为p.V219I。
采用本申请所述的引物组合物及试剂盒重复检测该样本三次，具体步骤及检测方法如下：
1.DNA提取：利用天根DNA提取试剂盒(货号：DP318-03)提取骨髓样本的全基因组DNA。
2.根据实施例1和2提供的引物组合物及试剂盒对提取的DNA进行多重PCR扩增。
3.将扩增产物制备成可供Ion Torrent测序平台测序的DNA文库，具体操作步骤详见Life公司试剂盒(名称：Ion AmpliSeqTM Library Kit，货号：4480441)的使用说明书。
4.对所获得的DNA文库进行测序，得到下机数据：将构建好的测序文库经油包水处理后在Ion Torrent平台上进行高通量测序，油包水处理方法和高通量测序方法参考高通量测序仪Ion Torrent以及其配套设备One Touch的使用说明书进行。
5.对下机数据进行生物信息学分析：首先，使用Ion Report软件(v4.6,ThermoFisher,Carlsbad,CA,USA)过滤低质量的测序片段，并将合格的测序片段比对到人类参考基因组hg19(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html)，使用Torrent VariantCaller(v4.6.0.7)子程序检测突变位点，软件参数使用的是默认的设置。此软件已经被优化用于处理Ion Torrent测序平台特有的错误类型。最后对找出的突变包括SNP和Indel使用ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)软件进行注释，注释内容包括突变在基因组中的位置，关联的基因，基因外显子编号，核苷酸水平变异，对应的蛋白水平变异，以及该突变在dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，千人基因组数据库1000Genomes(http://www.1000genomes.org/)，外显子组整合数据库ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)和人类基因突变数据库HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)中的注释，PolyPhen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和SIFT(http://sift.jcvi.org/)功能预测结果等。
其中，如下表10所示，三次检测结果均为ELANE基因c.655G>A核苷酸突变阳性，检测结果如图1所示，表明本申请所述的引物组合物及试剂盒具有较好的重复性。
表10重复性检测结果
| 检测结果 | 第一次 | 第二次 | 第三次 |
| 突变基因 | ELANE | ELANE | ELANE |
| 核苷酸改变 | c.655G>A | c.655G>A | c.655G>A |
| 氨基酸改变 | p.V219I | p.V219I | p.V219I |
| Bed | chr19:856015:G:A | chr19:856015:G:A | chr19:856015:G:A |
| 测序reads数 | 2765378 | 2764837 | 2767261 |
| 靶标区域覆盖度 | 99.81％ | 99.59％ | 99.77％ |
| 平均测序深度(×) | 1043 | 1035 | 1027 |
| 均一性 | 94.38％ | 94.71％ | 94.65％ |
实施例4特异性检测
4.1.利用实施例1给出的引物及浓度，采用实施例2给出的扩增体系和扩增程序对实施例3提取的DNA样本进行扩增，使用Ion Torrent进行测序，并进一步分析。
4.2.将实施例1给出的引物浓度均修改为50nM，采用相同的扩增体系和扩增程序对实施例3提取的DNA样本进行扩增，使用Ion Torrent进行测序，并进一步分析。
4.3.将实施例1给出的引物浓度均修改为200nM，采用相同的扩增体系和扩增程序对实施例3提取的DNA样本进行扩增，使用Ion Torrent进行测序，并进一步分析。
上述4.1、4.2、4.3的检测结果如下表11所示。
表11特异性检测结果
由表11的检测结果可知，引物浓度过低或过高其测序reads数、测序深度及均一性等结果都较差。
实施例5灵敏度检测
根据实施例2提供的试剂盒，分别采用实施例3提取的不同浓度的DNA样本进行扩增，使用Ion Torrent进行测序，并进一步分析。其中，DNA模板浓度分别为：5ng/μL、2.5ng/μL、1.25ng/μL、0.625ng/μL、0.3125ng/μL、0.15625ng/μL。
检测结果如下表12所示：
表12灵敏度检测结果
由该结果可知：本发明提供的复合扩增体系可以对浓度为0.15625ng/μL的样本进行准确检测，灵敏度为0.64％，远优于一代测序的10％，识别能力强。
实施例6准确性检测
选取在见康华美医学诊断中心2017年11月至2020年2月经临床症状和相关实验室检查诊断为SCN的患者共25例，各收集3mL患者外周血提取基因组DNA待测，该检测经过中心伦理委员会批准，并经患者同意。
根据实施例2和实施例3提供的试剂盒及其使用方法进行样本检测，检测结果如下表13所示。
表13准确性检测结果
由上表可知，上述25例患者中检测到均为重症先天性中性粒细胞减少症，其中有携带WAS基因突变患者5例，携带ELANE基因突变患者6例，携带GFI1基因突变患者1例，携带HAX1基因突变患者6例，携带G6PC3基因突变患者3例，携带VPS45基因突变患者2例，携带CSF3R基因突变患者4例，携带SBDS基因突变患者2例，而且得出的结论与临床最终诊断相一致。由此可见，使用该检测试剂盒能够有效地对重症先天性中性粒细胞减少症患者进行诊断，具有诊断快速、准确、获得信息量大的特点。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 天津见康华美医学诊断技术有限公司
<120> 重症先天性中性粒细胞减少症检测引物组合物及应用
<130> 20210518
<160> 346
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
cgagaaccag cgactctttg ag 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
agaggagatg atggagaggg aaag 24
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
agccaatgaa ggtgagtcct cta 23
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
tatcaatcta cctatccatt cacccactt 29
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
cgcttgtctc ctcgccttat tc 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
gcgtatctta gctatgagct gctt 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
ctcgaggagg gaaccagctc 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
tggtccattc ccggagctg 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
ggacctagcc cagctgataa ga 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
cagctgtcca cttgttcatg tg 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
gagctgtact cacagcttgt ct 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
cacctccact ttgcctctga tt 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
gctgtgtgct tcgtgaagga ta 22
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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gggagcgctt ttggatcaaa tc 22
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<211> 22
<212> DNA
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agagggcaag agggtttcac ta 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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caagcgacat ggattgtcgt tg 22
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<211> 22
<212> DNA
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tctctagccc aagcagctca ta 22
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<211> 22
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ggattgtttt gaggccagtg cta 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
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cctccagcta ctggacgttc t 21
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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gctggttgat cacttacatc tcca 24
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cctccatgac catccaacac ac 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 40
ccaatatcag ctttgctgat cttcttctt 29
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cgagccaatc cagcgtctt 19
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<212> DNA
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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ctactgacca ttttcaacac ccaatc 26
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ctatggagag gtgggaacag aac 23
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 59
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 69
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 70
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 71
tgaagtaact gttcagcttt ttgtttacac 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 72
gcctgtggac aagatgtcat tcat 24
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 73
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 74
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 75
cagctccaga tttccagtca ca 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 76
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 77
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 78
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 79
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<211> 19
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<211> 19
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 83
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<211> 19
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 84
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 85
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 86
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<211> 19
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 87
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 88
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 89
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 107
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 108
cattgagtcc cgaagtgtct gt 22
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 110
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 111
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 112
caaagaggct cattcccgta ct 22
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 113
ggctattctg aatggaatta tctcttctgt 30
<210> 114
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 114
acaagtgtac aggaagaaac ttcagg 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 115
cccaccatta ataagcttag cttctcttg 29
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 116
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 117
actttgccac ccatgagttg at 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 118
ctgaagccga agccaaattc ct 22
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 119
agaacttcca ggtcctgagt ca 22
<210> 120
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 120
tattagtggt ctctcacaag ctctca 26
<210> 121
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 121
ctgaagtttc ttcctgtaca cttgtct 27
<210> 122
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 122
tgctcagcag tttctttaca cagat 25
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 123
gtgggaaccc aaggttccat ag 22
<210> 124
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 124
tatttcaccc accaacccac cagaaa 26
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 125
ctgacgcctc gctcaatttc 20
<210> 126
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 126
cagaggatgt ttttccaaaa ataagacgt 29
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 127
cttgtccttt gcttctgcct agt 23
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 128
ccagttcact attccacata tccaagc 27
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 129
tgtgtgtgca tgtggaaagt cat 23
<210> 130
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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cgaaccctaa ccacattggg aa 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 131
gggtgggctt tggagatcag 20
<210> 132
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 132
gggaagtaga acagaaagag gatcttg 27
<210> 133
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 133
ccgttatgtc tcagtttatt ctcttgc 27
<210> 134
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 134
agaaagatcc aggcccagtg ta 22
<210> 135
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 135
cctggtgtgt ctctggttca tt 22
<210> 136
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 136
gctatccacg tgtatccact ca 22
<210> 137
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 137
gggccttctc tctcccagat aa 22
<210> 138
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 138
agatggcaca gagactactg ga 22
<210> 139
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 139
gctgggaaat ggccagaaga ta 22
<210> 140
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 140
gtcacagagt gttggctttg tg 22
<210> 141
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 141
gtgatggcac cctgtaccta at 22
<210> 142
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 142
tgctaagatg aagattcgcg acaa 24
<210> 143
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 143
catgtgtaag ccctggtctc tt 22
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 144
ggttggactc tgaggtttga gtc 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 145
gccctggaga ttatatatcc gcctt 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 146
agccggtact gtttcctcct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 147
taatttttca gaagcatgct ttgtgct 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 148
aagaagagaa agtgttccct ggaaag 26
<210> 149
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 149
aagctcttct cagccaggaa ag 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 150
tgccatgctg ctgtgtctat ta 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 151
gtttccacag gctgagggtt ag 22
<210> 152
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 152
gtctccaaaa agaaacctgg aagaga 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 153
gacttcttgt gtgcctccct tt 22
<210> 154
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 154
gaccaactta tctgggagag agaag 25
<210> 155
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 155
cctggcttat tgcaccttcc ttt 23
<210> 156
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 156
gatgggaaga tcctagactg atcct 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 157
gctaggcacc agcctcatct at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 158
ggtctatgtg aataggtaat gtgtcctttt 30
<210> 159
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 159
ccatcagcct agccttcaag tg 22
<210> 160
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 160
aaattgaaaa tgtagaagag gctgatctga 30
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 161
gtgtggctct ggatcacctt t 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 162
gtgggaaggc ccttgagaca gt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 163
gggcgtgtct aaaatgtaaa tatccc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 164
ggtgtctctg tccttagcag cta 23
<210> 165
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 165
ctgcccagta gggaggaaaa cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 166
tcggctatca cgatgccc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 167
ttaattcttg tgttgccaat ttcccaaa 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 168
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<210> 169
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 169
tttttcactt ctttcaagtt gtctgaaagt 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 170
gattccaaaa gtgttgctta catgaatagt 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 171
cattaggctt taactatcag gcccttt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 172
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 173
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 174
gcactctgga aagatcaatc cgatt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 175
tggtccagtt aaaccactta taaaataggg 30
<210> 176
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 176
tccgacggaa ttcaaacagt tca 23
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 177
aagtttatgg aatgactatt cttggtgct 29
<210> 178
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 178
ctgtaagccc ttgagttgtt ctagata 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 179
ggcaggcgtt tgttgagaat ta 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 180
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 181
ctggtgatgc tttatgcttt acattatgag 30
<210> 182
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 182
catcaggaag cccatttcat aagaaaataa 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 183
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<210> 184
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 184
agtggcttac gctgtaatcc c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 185
cagtatggat gttgtagtgc tcaac 25
<210> 186
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 186
aaccaccgtt tcatcttctg ct 22
<210> 187
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 187
aaaaagaggg ttagatgtgc tacttgt 27
<210> 188
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 188
ttcagatcag agtgttctgc atctg 25
<210> 189
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 189
ccgcctatta atgacgcaat ga 22
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 190
cctcgcgaaa tgaggaacct 20
<210> 191
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 191
tctcagccgg atttttccat cc 22
<210> 192
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 192
tcacagcaaa aaccacgttc atg 23
<210> 193
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 193
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<210> 194
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 194
taatgaaaag cagaaagggt taagggaaga 30
<210> 195
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 195
ttgtctctga taaaggcaag caact 25
<210> 196
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 196
tttgtggagc attacactta tggctaa 27
<210> 197
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 197
gaaatgggct tcctgatgcc ta 22
<210> 198
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 198
gcctcaagga cttcaactgt tct 23
<210> 199
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 199
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<210> 200
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 200
aagttattga tgatatgaag ggctcaatga 30
<210> 201
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 201
actctgtgta tgtaagtcac agtcctt 27
<210> 202
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 202
gggaatttaa gctttatcct ctgggaa 27
<210> 203
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 203
gccatggtcc acgaactact ag 22
<210> 204
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 204
ctatcatcct ttcacatgaa atcccatg 28
<210> 205
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 205
tttttaacaa aaagggtcga aattggga 28
<210> 206
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 206
cctaacatac aatcatctcc ttggttgtaa 30
<210> 207
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 207
ttaattctcc cacgttgact gttgt 25
<210> 208
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 208
ggttcacagc aatgtaatca ccataaaatt 30
<210> 209
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 209
ggaagggctg tagggtactt gt 22
<210> 210
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 210
tgtaaggttg agagggttcc ttca 24
<210> 211
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 211
aaaaactcag tctaccaaca tataccagt 29
<210> 212
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 212
ctttgaaaca gtcccagaca ttttct 26
<210> 213
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 213
gatctaaggc attgtacaac agatgact 28
<210> 214
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 214
atcattagtc ctggcaggct attg 24
<210> 215
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 215
ccctgcctgg tttcgaactc 20
<210> 216
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 216
tggcaagaca gccttcttta taatataaaa gtt 33
<210> 217
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 217
tcgttcctgc ttccaagcaa a 21
<210> 218
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 218
gtagttccgc tggagtgtac ag 22
<210> 219
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 219
aatcatttga tgtacatacc acactcctt 29
<210> 220
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 220
ccacctcata aattcccata aattagcc 28
<210> 221
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 221
caaggagagc tctcaagtca cat 23
<210> 222
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 222
agatgggctc agacttattg ttagga 26
<210> 223
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 223
tctctcaccc acagcaagtg ata 23
<210> 224
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 224
aaaaataagg aggcaaataa atggaccatg 30
<210> 225
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 225
ctaaaaggcg ttccctttgt tca 23
<210> 226
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 226
cgaaacagtg gtcgagattc gt 22
<210> 227
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 227
agaaaatatc aaaggaaatg tggcaagaac 30
<210> 228
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 228
gcatgatcat atagctccat ttcctca 27
<210> 229
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 229
caagtatgaa atcaagaagc tgatctacgt 30
<210> 230
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 230
ggaaaagagt cccatgctga tca 23
<210> 231
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 231
caaggcctac cgtttcctct tt 22
<210> 232
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 232
tcaccagaag ggattttgga acc 23
<210> 233
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 233
acagctatga aacaaatttc agctgtt 27
<210> 234
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 234
gggcagggcc atctttattg ag 22
<210> 235
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 235
agcagtggcc atagagaagt aga 23
<210> 236
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 236
ccgaggtact ttaaaattct tttggatgc 29
<210> 237
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 237
gctccaggga aagtcataga atatatcag 29
<210> 238
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 238
cggctccgtg aagagaactt 20
<210> 239
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 239
gcgactttca gcaccgg 17
<210> 240
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 240
acttggcagg tgagcgg 17
<210> 241
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 241
actttttcct cctctgttct ttgtgt 26
<210> 242
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 242
ttagcaacca gcagcagcca ta 22
<210> 243
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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cccgcaacaa cattagctac ct 22
<210> 244
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 244
acaccaggta catgatggaa acg 23
<210> 245
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 245
ggacatccca tcgaatgaaa ggac 24
<210> 246
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 246
cgaagctcat tcttaaagaa aaacctcaaa 30
<210> 247
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 247
tggtctcctc tgcaaagcat tt 22
<210> 248
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 248
gctgtaggtt acaactatga cttaggttc 29
<210> 249
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 249
tgttaactgg gtatcagtta tgagtctact 30
<210> 250
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 250
aaatcaagtg caaagagaca cattatctt 29
<210> 251
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 251
gagtcggtcc tccagagaca 20
<210> 252
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 252
cttcatacct catctggtag tgcatg 26
<210> 253
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 253
ttgagcagtg gcccaaagac ac 22
<210> 254
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 254
accagcgatc aggtccttta tg 22
<210> 255
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 255
ttgggtgcca agcagaggaa ga 22
<210> 256
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 256
ctgcctcatg aacctcacaa c 21
<210> 257
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 257
gttaatggct cagcctctga ca 22
<210> 258
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 258
caaagctttg agctcaggaa atcc 24
<210> 259
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 259
cccagacctg ttggagtcct a 21
<210> 260
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 260
ggagcagcca acagtatcca g 21
<210> 261
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 261
cagctcgagc ccgactta 18
<210> 262
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 262
cactccttgc agtgaaactg ga 22
<210> 263
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 263
cccagtctcc acagaatctg tg 22
<210> 264
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 264
cctagattat agcccagctc tgcta 25
<210> 265
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 265
ccaaagtttg ggaaggctgg aa 22
<210> 266
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 266
agccttccca acatgcattc ta 22
<210> 267
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 267
ccaatgtgct ttagatgcag ct 22
<210> 268
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 268
aatccctggg aaaaatgagg ctt 23
<210> 269
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 269
ccggctggta atattcttat tagtattggc 30
<210> 270
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 270
ggacccagga atctatcatc acc 23
<210> 271
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 271
ggtctctgag ctgttatggg act 23
<210> 272
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 272
caagtggtac cctttgtgtt cca 23
<210> 273
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 273
cagggtgagg actgtactgt tg 22
<210> 274
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 274
tccttctgtg agtctatcct cagttc 26
<210> 275
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 275
ccagctgcac ctttctttgt ct 22
<210> 276
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 276
ctgcatccca cgcaaacacc t 21
<210> 277
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 277
cggccaatag gactagattt aaccc 25
<210> 278
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 278
cccttgtggc ctataactca gc 22
<210> 279
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 279
aacaacaaaa actgcaaacc aaaaactag 29
<210> 280
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 280
cttcttgggc ctgcctctta aa 22
<210> 281
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 281
aaggatcaag aaaggctgga gaatc 25
<210> 282
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 282
cctcagggct atgtgattga gtg 23
<210> 283
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 283
ggccgatatg cagagaggtt tg 22
<210> 284
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 284
agggctaaat gcctttacca aaataatct 29
<210> 285
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 285
gcgcagctca cacttctgat tta 23
<210> 286
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 286
gacagatggt gaaccacaga ca 22
<210> 287
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 287
tacctctgct ttctgagaag acca 24
<210> 288
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 288
ttgactcaag atgagctgca cat 23
<210> 289
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 289
tccaggtctt gttgctattg ctc 23
<210> 290
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 290
gcctgcattc ttttcacctt catt 24
<210> 291
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 291
gccggaagaa gttagaatgc atg 23
<210> 292
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 292
cagtctgtat cacatccacc tcat 24
<210> 293
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 293
ggagtcacag cggagatagt g 21
<210> 294
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 294
gctggaggag gatgaaaaga agc 23
<210> 295
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 295
catgtggcag tgcaaggaaa tt 22
<210> 296
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 296
cctagtcaaa gctgcacagt ga 22
<210> 297
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 297
ggtagttttt agtcatgggc ttatgga 27
<210> 298
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 298
ccaagtccta tgagaacctc tggtt 25
<210> 299
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 299
agggctggaa gtatggtagg aa 22
<210> 300
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 300
cattagcaca ggttaggccc taa 23
<210> 301
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 301
ggcctggact ggatactgtt g 21
<210> 302
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 302
ctcgagctgg ccctagaatg 20
<210> 303
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 303
cttcagaagg tgtcccttca ct 22
<210> 304
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 304
ccagcttctt ctctctgcac taag 24
<210> 305
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 305
ggtgttggag gcagagtagt tg 22
<210> 306
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 306
cctgcatcat caagcagaac tg 22
<210> 307
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 307
cagcataggc ctggatggta aa 22
<210> 308
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 308
gcacctctct cttcccatag ct 22
<210> 309
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 309
gcacccagat gcccatattc t 21
<210> 310
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 310
cctcgctttc ttcctctgct t 21
<210> 311
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 311
ccctcctcac ttgaaactct tca 23
<210> 312
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 312
cagaggaagc tttctgagtg gt 22
<210> 313
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 313
caggattcca gctctccatc a 21
<210> 314
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 314
ctcggaaggt gttgcaatcc 20
<210> 315
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 315
ctgagagcta gcagaaggaa gca 23
<210> 316
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 316
gccttttgtg cttgtttcct ataacttc 28
<210> 317
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 317
gggaatgtgg caacgatgtc 20
<210> 318
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 318
gcagtgagta ttgggttaca caattc 26
<210> 319
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 319
gattcacaca tttgtctgcc acaatag 27
<210> 320
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 320
ggagaggatg aaatttaatt ttctctccat 30
<210> 321
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 321
cgtcggaaac ggaaacactt ta 22
<210> 322
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 322
ggaagttaaa gctgagttta ttctgtgtct 30
<210> 323
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 323
tgatcagtgg cttgagcttt tctt 24
<210> 324
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 324
atggaaacta ctttgttttt gaaaacctta tga 33
<210> 325
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 325
ttcagttctc ctgacaactc ccta 24
<210> 326
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 326
ctgagaaaca gatatagaaa aattgtgccg 30
<210> 327
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 327
cattacgata ccataatgac cctcagaac 29
<210> 328
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 328
gtctaaatcc taaagcaaaa ttgaaactcc aa 32
<210> 329
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 329
tggcaacctg acctttagaa acattta 27
<210> 330
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 330
gaaaaagaaa actgccctct acactaaag 29
<210> 331
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 331
gtttttgtag caggcgattt cgaa 24
<210> 332
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 332
gatcggtcgt taccgcga 18
<210> 333
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 333
tctgacgttt acaacatcta aatgtttgc 29
<210> 334
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 334
ggttcatcct tccagtcaat gaagg 25
<210> 335
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 335
cccagaccca ttattttaat gatttcttca 30
<210> 336
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 336
acacacaact ggagcagatg tttag 25
<210> 337
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 337
aaccaccaag ttctttatta ttagaagtga ca 32
<210> 338
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 338
cgatgaagtt ctgcagaccc a 21
<210> 339
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 339
accaaataaa gaagaaaccc ttggct 26
<210> 340
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 340
gtggtacgga tgaagcgtg 19
<210> 341
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 341
ctcgcggtaa cgaccgat 18
<210> 342
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 342
cgtcatcgct cacttttccc 20
<210> 343
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 343
gaataatcta agttatggca gcatgttcaa tg 32
<210> 344
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 344
aaaagaaaac atatgatgct tcatttctac tt 32
<210> 345
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 345
agtagcaaaa tgccactctg gac 23
<210> 346
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 346
tgaatgacac ccatcaatct cttcac 26
Claims (7)
1.一种用于检测重症先天性中性粒细胞减少症基因的引物组合物，其特征在于：
所述的重症先天性中性粒细胞减少症基因的突变位点如下表所示：
所述的引物组合物由下表所示的引物组成：
2.权利要求1所述的引物组合物在制备检测重症先天性中性粒细胞减少症基因的产品中的应用。
3.一种检测重症先天性中性粒细胞减少症基因的产品，其特征在于：所述的产品包括权利要求1所述的引物组合物。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：所述的产品还包括DNA聚合酶、Buffer、ddH2O、dNTP。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述的产品为独立试剂或试剂盒。
6.一种检测重症先天性中性粒细胞减少症基因的方法，所述的方法为非疾病诊断和治疗方法，其特征在于：所述的方法包括利用权利要求1所述的引物组合物或权利要求3所述的产品对待测样品中重症先天性中性粒细胞减少症基因进行检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
(1)基因组DNA提取；
(2)多重PCR：用权利要求1所述的引物组合物对步骤(1)得到的基因组DNA进行扩增；
(3)建库；
(4)文库测序及数据处理。
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| Title |
|---|
| 《Novel HAX1 mutations in patients with severe congenital neutropenia reveal isoform-dependent genotype-phenotype associations》;Germeshausen Manuela等;《BLOOD》;20080515;第111卷(第10期);第4954-4957页 * |
| 《Prevalence of mutations in ELANE, GFI1, HAX1, SBDS, WAS and G6PC3 in patients with severe congenital neutropenia》;Xia Jun等;《BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY》;20091231;第147卷(第4期);第535-542页 * |
| 《Severe congenital neutropenia-associated JAGN1 mutations unleash a calpain-dependent cell death programme in myeloid cells》;Khandagale Avinash等;《BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY》;20210131;第192卷(第1期);第200-211页 * |
| 《Severe congenital neutropenias》;Skokowa Julia等;《NATURE REVIEWS DISEASE PRIMERS》;20170608;第3卷;图2和表1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113444784A (zh) | 2021-09-28 |
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