CN116064782A - 一种用于检测pnh基因的引物组合物及其应用 - Google Patents

一种用于检测pnh基因的引物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学检测技术领域，提供了一种用于检测PNH基因的引物组合物及其应用，包括用于检测PNH基因的引物组合物，PNH基因包括PIGA或PIGT中的一种或两种，针对突变基因的特点设计引物组合，具有覆盖面广，检测效率高的优点，一次性检测2个突变基因的57个基因突变位点；结合高通量测序技术，实现在骨髓形态学和血常规检查之外对PNH进行辅助检测，特别是对于指导疾病后续的治疗方向和效果做出预判具有特殊的优势，可弥补临床PNH在分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等指导方面的不足；具有操作简便、精确度、准确性、灵敏度高等优点，解决了目前监测准确性低，检测方法局限的技术缺陷。

Description

一种用于检测PNH基因的引物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其涉及了一种用于检测PNH基因的引物组合物及其应用。
背景技术
阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是一种由于造血干细胞经获得性体细胞PIGA或PIGT基因突变导致的罕见克隆性疾病，临床上主要表现为慢性血管内溶血，造血功能衰竭和反复血栓形成，部分患者可进展为急性髓系白血病。流式细胞学检测PNH克隆含量是诊断PNH疾病的金标准。另有约15％PNH为PIGT基因导致的显性遗传性疾病。用传统方法难以鉴别这类遗传性PNH。而基因突变分析是遗传性PNH诊断的重要标准，目前可检测出～95％的PNH患者。
目前检测PNH的方法主要涉及血常规、骨髓细胞形态、流式细胞学及分子生物学等。其中分子生物学的实验方法主要有巢式PCR、一代测序等。PCR方法不能直观的得到具体的突变序列，而一代测序的方法受到测序通量的影响，无法一次性检测多个基因的全部外显子区域。而二代测序作为一种高通量的检测方法，可以一次性准确测量多个基因的外显子序列，使精准治疗成为可能。目前对于PNH在应用二代测序的方法进行基因检测鉴别方面的研究屈指可数，而PNH在基因诊断水平的检测尤为重要。
因此，亟需一种精确度、准确性更高的PNH检测试剂盒及方法，以弥补临床PNH在分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等指导方面的不足。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种用于检测PNH基因的引物组合物及其应用。采用本发明所述的引物组合物，检测阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)相关基因，具有操作简便、精确度、准确性、灵敏度高的优点，弥补临床PNH在分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等指导方面的不足。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，提供了一种用于检测PNH基因的引物组合物，所述PNH基因包括PIGA或PIGT中的一种或两种。
具体地，所述PNH基因的突变位点如下表1：
表1 PNH基因突变位点
突变基因 突变位点 突变基因 突变位点 突变基因 突变位点
PIGA p.H65P PIGA p.C183Y PIGA p.L60P
PIGA p.R233G PIGA p.P207R PIGA p.Q327X
PIGA p.Y98X PIGA p.L280Cfs*11 PIGA p.G64Afs*2
PIGA c.1188+1G>C PIGA p.P447Nfs*12 PIGA p.S164L
PIGA p.G47E PIGA p.L243P PIGA p.L347Yfs*6
PIGA p.T123Nfs*7 PIGA p.R415Lfs*8 PIGA p.V403Wfs*21
PIGA p.C36Y PIGA p.G263R PIGA p.H154Ifs*18
PIGA p.C183F PIGA c.715+2T>C PIGA p.Q252X
PIGA p.R81P PIGA c.715+1G>A PIGA p.G86Vfs*14
PIGA p.S155F PIGA p.S351X PIGA p.C348Wfs*5
PIGA p.S368X PIGA p.V67Lfs*2 PIGA p.V352X
PIGA p.K382X PIGA p.L113R PIGT p.T52A
PIGA p.E120A PIGA p.I116V PIGT p.Q417E
PIGA p.F384Lfs*11 PIGA p.E120K PIGT p.P194L
PIGA c.848+1G>A PIGA c.981+1G>A PIGT p.P382L
PIGA p.S127X PIGA p.L359W PIGT p.Y281C
PIGA p.L437_I450dup PIGA p.S309F PIGT p.R573X
PIGA p.R77X PIGA p.N379fs PIGT p.P92L
PIGA p.E338X PIGA c.1189-2A>G PIGT p.P518L
。
具体地，所述引物组合物由下表2所示的引物组成：
表2引物组合物
另一方面，本发明提供了一种用于检测PNH基因的引物组合物在制备检测PNH基因的产品中的应用。
又一方面，本发明提供了一种用于检测PNH基因的产品，所述产品包括权利要求1-3任一项所述的引物组合物。
具体地，所述产品还包括DNA聚合酶、Buffer、ddH2O、dNTP。
具体地，所述产品为独立试剂或试剂盒。
又一方面，本发明提供了上述引物组合物或上述产品在检测PNH基因中的应用。
又一方面，本发明提供了一种检测PNH基因的方法，所述方法为非疾病诊断和治疗方法，所述方法包括上述引物组合物或上述产品对待测样品中PNH基因进行检测。
具体地，所述方法包括以下步骤：
S1、提取样本全基因组DNA；
S2、扩增，利用权利要求1-3任一项所述的引物组合物对步骤S1中的全基因组DNA进行扩增；
S3、构建DNA文库；
S4、文库测序及数据处理。
本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种用于检测PNH基因的引物组合物，利用本发明提供的与PNH相关基因突变的基因群，针对突变基因的特点设计引物组合，具有覆盖面广，检测效率高的优点，引物组合物可一次性检测所述2个基因的57个基因突变位点，覆盖面广，检测效率高；结合高通量测序技术，实现在骨髓形态学和血常规检查之外对PNH进行辅助检测，特别是对于指导疾病后续的治疗方向和效果做出预判具有特殊的优势，可弥补临床PNH在分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等指导方面的不足。
(2)本发明提供了一种用于检测PNH基因的试剂盒及方法，具有操作简便、精确度、准确性、灵敏度高等优点，解决了目前监测准确性低，检测方法局限的技术缺陷。
附图说明
图1为PIGA基因c.1052C>A核苷酸突变的检测结果示意图。
具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1PNH基因、突变位点及其引物组合物
(1)采用dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，千人基因组数据库1000Genomes(http://www.1000genomes.org/)，外显子组整合数据库ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)和人类基因突变数据库HGMD(http://www.hgm d.cf.ac.uk/ac/index.php)，以及功能预测工具PolyPhen(http://genetics.bwh.harvard.e du/pph2/)和SIFT(http://sift.jcvi.org/)，并采用以下原则筛选致病突变位点：原则1：根据突变所在的基因组位置和类型，过滤掉对蛋白产物序列不产生影响的突变；原则2：利用1000Genomes数据和ExAC数据，注释每个突变在人群中的比例，如果比例小于等于1％则不认为是多态性位点；原则3：检索人类基因突变数据库，查询一个突变在HGMD中是否有记载，其出现在PNH等相关疾病中；原则4：利用蛋白质功能预测软件PolyPhen-2和SIFT预测该突变是否影响蛋白功能；原则5：如果经过原则2、原则3、原则4后，一个突变满足“非多态性”、“PNH记载过”和“影响蛋白功能”这三条中至少两条的，将被判为与疾病可能相关；原则6：如果一个突变虽然不满足原则5但是在HGMD中有记录，则被判读为意义不明的突变；如果一个突变在文献中被明确记载与疾病高度相关，则直接判为热点突变。
最终筛选得到以下基因：(1)PIGA基因：其突变与阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)1型有关，为体细胞突变；(2)PIGT基因：其突变与阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)2型有关，为体细胞突变或显性遗传。
每个突变基因对应的突变位点如表1所示。
(2)根据上述基因及突变位点设计引物组合物，引物组合物的具体引物序列如表2所示，正向引物序列为SEQ IN NO.1-34，反向引物序列为SEQ IN NO.35-68。引物组合物中的各引物的工作浓度均为0.1μM。
(3)复合体系PCR扩增：将上述引物混合至一个反应体系中，并选择在保证模板浓度一定的条件下最合适的引物浓度，使复合体系中的每对引物尽量做到最优扩增。
实施例2一种用于检测PNH的试剂盒及其使用方法
步骤1.复合扩增体系中的扩增引物
复合扩增体系中，各基因及突变位点的正反向扩增引物如表2所示，为使每个基因及突变位点的扩增效率尽可能的一致，通过调整复合体系中每对引物的浓度，最终调整后的各引物浓度均为0.1μM。
步骤2.DNA提取：利用DNA提取试剂盒提取外周血或骨髓样本的全基因组DNA。
步骤3.根据实施例1提供的引物组合物对提取的DNA进行复合PCR扩增。
其中，复合扩增体系如下表3所示。
表3复合扩增体系
成分 体积
<![CDATA[AgriSeq<sup>TM</sup>Amplification Mix]]> 2μL
<![CDATA[Ion AmpliSeq<sup>TM</sup>Primer Pool]]> 5μL
稀释后DNA样本(10ng/μL) 3μL
DNA来源于所测样本，Primer pool为上述引物的混合物，各引物浓度均为0.1μM。
复合扩增反应程序如下：99℃，2min；99℃，15s，62℃，4min，2cycles；99℃，15s，60℃，8min，14cycles；10℃，贮存。
步骤4.采用试剂盒将扩增产物制备成可供测序平台测序的DNA文库，完成建库。
步骤4.1对扩增产物进行酶切。酶切体系如下表4所示。
表4酶切体系
步骤3复合扩增产物 20μL
Pre-ligation 2μL
酶切反应程序如下：50℃，20min；55℃，20min；60℃，20min；10℃，贮存。反应结束后对产物进行磁珠法纯化。
其中，Pre-ligation购自ThermoFisherScientific，货号为A34141。
步骤4.2末端修复&加A。反应体系如下表5所示。
表5末端修复&加A
酶切产物 40μL
End Repair&A-Tailing Enzyme 4μL
End Repair&A-Tailing Buffer 6μL
反应程序如下：20℃，30min；65℃，30min；4℃，贮存。
其中，End Repair&A-Tailing Enzyme及End Repair&A-Tailing Buffer购自那昂达，货号1002103。
步骤4.3接头连接。反应体系如下表6所示。
表6接头连接
End repair and A-tailing reaction product 50μL
IDT UDI接头(15μM) 2μL
Ligation Buffer 26μL
DNA Ligase 2μL
反应程序如下：20℃，20min。反应结束后对产物进行磁珠法纯化。
其中，IDT UDI接头(15μM)、Ligation Buffer、DNA Ligase购自那昂达，货号1003227，Ligase货号1002103。
步骤4.4文库富集。反应体系如下表7所示。
表7文库富集
2X HiFi PCR Master Mix 25μL
Amplification Primer Mix(10μM) 5μL
Adapter-ligated library 20μL
扩增反应程序如下：98℃，2min；98℃，15s，60℃，30s，72℃，30s，7cycles；72℃，2min；4℃，贮存。反应结束后对产物进行磁珠法纯化。
其中，2X HiFi PCR Master Mix购自那昂达，货号1002103。
步骤5.将DNA文库进行模板制备以用于测序，得到下机数据，并对下机数据进行生物学分析。
实施例3重复性检测
选取经临床症状和相关实验室检查诊断为PNH的患者1例，其中，经一代测序检测为PIGA基因c.1052C>A核苷酸突变，其氨基酸突变为p.S351X。
采用本申请所述的引物组合物及试剂盒重复检测该样本三次，具体步骤及检测方法如下：
1.DNA提取：利用天根DNA提取试剂盒(货号：DP318-03)提取骨髓样本的全基因组DNA。
2.根据实施例1和2提供的引物组合物及试剂盒对提取的DNA进行复合PCR扩增。
3.将扩增产物制备成可供Ion Torrent测序平台测序的DNA文库，具体操作步骤详见Life公司试剂盒(名称：Ion AmpliSeqTM Library Kit，货号：4480441)的使用说明书。
4.对所获得的DNA文库进行模板制备，进而测序，得到下机数据：将构建好的文库经油包水处理后在Ion Torrent平台上进行高通量测序，油包水处理方法和高通量测序方法参考高通量测序仪Ion Torrent以及其配套设备One Touch的使用说明书进行。
5.对下机数据进行生物信息学分析：首先，使用Ion Report软件(v4.6,ThermoFisher,Carlsbad,CA,USA)过滤低质量的测序片段，并将合格的测序片段比对到人类参考基因组hg19(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html)，使用Torrent VariantCaller(v4.6.0.7)子程序检测突变位点，软件参数使用的是默认的设置。此软件已经被优化用于处理Ion Torrent测序平台特有的错误类型。最后对找出的突变包括SNP和Indel使用ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)软件进行注释，注释内容包括突变在基因组中的位置，关联的基因，基因外显子编号，核苷酸水平变异，对应的蛋白水平变异，以及该突变在dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，千人基因组数据库1000Genomes(http://www.1000genomes.org/)，外显子组整合数据库ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)和人类基因突变数据库HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)中的注释，PolyPhen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和SIFT(http://sift.jcvi.org/)功能预测结果等。
其中，如下表8所示，三次检测结果均为PIGA基因c.1052C>A核苷酸突变阳性，检测结果如图1所示，通过图1检测验证，表明本申请所述的引物组合物及试剂盒具有较好的重复性。
表8重复性检测结果
检测结果 第一次 第二次 第三次
突变基因 PIGA PIGA PIGA
核苷酸改变 c.1052C>A c.1052C>A c.1052C>A
氨基酸改变 p.S351X p.S351X p.S351X
突变位置 NM_002641:Exon5 NM_002641:Exon5 NM_002641:Exon5
测序reads数 834622039 835632678 832453258
靶标区域覆盖度 98.52％ 98.54％ 98.51％
平均测序深度(×) 967 982 959
均一性 96.58％ 96.61％ 96.56％
实施例4特异性检测
4-1.利用实施例1给出的引物及浓度，采用实施例2给出的扩增体系和扩增程序对实施例3提取的DNA样本进行扩增，使用Ion Torrent进行测序，并进一步分析。
4-2.将实施例1给出的引物浓度均修改为0.05μM，采用相同的扩增体系和扩增程序对实施例3提取的DNA样本进行扩增，使用Ion Torrent进行测序，并进一步分析。
4-3.将实施例1给出的引物浓度均修改为0.2μM，采用相同的扩增体系和扩增程序对实施例3提取的DNA样本进行扩增，使用Ion Torrent进行测序，并进一步分析。
上述4-1、4-2、4-3的检测结果如下表9所示。
表9特异性检测结果
检测结果 4-1 4-2 4-3
突变基因 PIGA PIGA PIGA
核苷酸改变 c.1052C>A c.1052C>A c.1052C>A
氨基酸改变 p.S351X p.S351X p.S351X
突变位置 NM_002641:Exon5 NM_002641:Exon5 NM_002641:Exon5
测序reads数 834622039 636158758 657547333
靶标区域覆盖度 98.52％ 74.85％ 76.31％
平均测序深度(×) 967 703 736
均一性 96.58％ 79.92％ 82.65％
由表7的检测结果可知，引物浓度过低或过高其测序reads数、测序深度及均一性等结果都较差。
实施例5灵敏度检测
根据实施例2提供的试剂盒，分别采用实施例3提取的不同浓度的DNA样本进行扩增，使用Ion Torrent进行测序，并进一步分析。其中，DNA模板浓度分别为：5ng/μL、2.5ng/μL、1.25ng/μL、0.625ng/μL、0.3125ng/μL、0.15625ng/μL。
检测结果如下表10所示：
表10灵敏度检测结果
由该结果可知：本发明提供的复合扩增体系可以对浓度为0.15625ng/μL的样本进行准确检测，灵敏度为0.64％，远优于一代测序的灵敏度(10％)，识别能力强。
实施例6准确性检测
选取在见康华美医学诊断中心经临床症状和相关实验室检查诊断为PNH的患者共29例，对29例患者依次编号为编号1-编号29，各收集3mL患者外周血提取全基因组DNA待测，该检测经过中心伦理委员会批准，并经患者同意。
根据实施例2提供的试剂盒及其使用方法进行样本检测，检测结果如下表11所示。
表11准确性检测结果
由上表可知，上述29例患者中检测到均为PNH，其中编号1、编号2、编号3、编号6、编号8、编号9、编号12、编号21、编号22和编号24的患者为同一基因上出现至少两个突变位点，其中PIGA基因突变的阵发性睡眠性血红蛋白尿患者24例，PIGT基因突变的阵发性睡眠性血红蛋白尿患者5例，而且得出的结论与临床最终诊断相一致。由此可见，使用该检测试剂盒能够有效地对阵发性睡眠性血红蛋白尿患者进行诊断，具有诊断快速、准确、获得信息量大的特点。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可做出若干变形和改进，这些都属于本发明保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于检测PNH基因的引物组合物，其特征在于，所述PNH基因包括PIGA或PIGT中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测PNH基因的引物组合物，其特征在于，所述PNH基因的突变位点如下：
。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测PNH基因的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物由下表所示的引物组成：
Figure FDA0004062957650000011
Figure FDA0004062957650000021
Figure FDA0004062957650000031
4.权利要求1-3任一项所述的一种用于检测PNH基因的引物组合物在制备检测PNH基因的产品中的应用。
5.一种用于检测PNH基因的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-3任一项所述的引物组合物。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测PNH基因的产品，其特征在于，所述产品还包括DNA聚合酶、Buffer、ddH2O、dNTP。
7.根据权利要求6所述的一种用于检测PNH基因的产品，其特征在于，所述产品为独立试剂或试剂盒。
8.权利要求1-3任一项所述的引物组合物或权利要求5所述的产品在检测PNH基因中的应用。
9.一种检测PNH基因的方法，所述方法为非疾病诊断和治疗方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1-3任一项所述的引物组合物或权利要求5所述的产品对待测样品中PNH基因进行检测。
10.根据权利要求9所述的一种检测PNH基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、提取样本全基因组DNA；
S2、扩增，利用权利要求1-3任一项所述的引物组合物对步骤S1中的全基因组DNA进行扩增；
S3、构建DNA文库；
S4、文库测序及数据处理。
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