CN105143467A - 用于预测间质性肺炎的风险的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用于鉴定被诊断有、怀疑患有间质性肺炎的个体的间质性肺炎(肺纤维化)的不良预后的生物标记、方法和测定系统。

Description

用于预测间质性肺炎的风险的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年2月14日提交的美国临时申请号61/764986的优先权，所述美国临时申请的公开内容整体并入本文。
政府资助的声明
本发明是根据由国立心脏、肺和血液研究所颁发的拨款号R01-HL095393、R01-HL097163、P01-HL092870、RC2-HL101715、U01-HL089897、U01-HL089856、U01-HL108642和P50-HL0894932以及由退伍军人管理局颁发的拨款号1I01BX001534在政府资助下进行。政府享有本发明中的某些权利。
发明领域
本公开大体上涉及用于鉴定和评估患有或怀疑患有间质性肺病的个体的预后的生物标记、方法和测定试剂盒。
发明背景
特发性间质性肺炎(IIP)代表一组特征通常在于肺纤维化或肺泡间质进行性结瘢的肺病，所述特征可由于血氧不足性呼吸功能不全而导致极高罹病率和死亡率。尽管一些形式的肺纤维化与已知环境暴露(例如石棉)、药物毒性、辐射暴露或胶原蛋白血管疾病(例如硬皮病)相关，但IIP不具有已知病因。最常见和重度IIP是在诊断之后具有2-3年的中值存活期的特发性肺纤维化(IPF)。在美国不存在核准使用的IPF药理学疗法，并且肺移植是用以延长生命的唯一干预。尽管所有IIP都具有可变临床过程，但它们常进展成末期肺病和死亡。尽管似乎IIP的风险可能由多种遗传变体和环境毒素决定，但IIP的病因仅仅开始显现。
对鉴定独立或组合起作用的指示间质性肺病的不同组织学类型的遗传变体以及鉴定被诊断患有间质性肺病或怀疑倾向于显现间质性肺病的个体中的这些遗传变体的方法存在需要。本文提供对本领域中这些和其它问题的解决方案。
发明概述
本文提供用于确定受试者(即个体)是否患有间质性肺病或处于显现间质性肺病的风险中的方法和材料，所述间质性肺病如间质性肺炎(例如FIP、IPF或IIP)。也提供确定被诊断有或怀疑患有间质性肺病的个体(例如具有间质性肺炎家族史的个体)的预后的方法。在一些实施方案中，间质性肺病是纤维化间质性肺炎(如特发性肺纤维化)或家族性间质性肺炎。在一些实施方案中，个体是人。
本文也提供检测患有间质性肺病的人受试者中的遗传变体(例如单核苷酸多态性)的方法。方法包括检测人受试者的生物样品中的下述多态性。在一些实施方案中，方法包括获得和/或测定生物样品。如下所述，在一些实施方案中，多态性是rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2301160、rs3829223或rs2857476。在一些实施方案中，遗传变体选自表1和2中所列的任一SNP。
本文也提供使用本文所述的方法治疗需要所述治疗的人受试者，例如被诊断为患有或可能患有间质性肺病的受试者的间质性肺病的方法。方法包括检测人受试者的生物样品中的如下所述的遗传变体，以及施用有效量的间质性肺病治疗。在一些实施方案中，方法包括获得和/或测定生物样品。如下所述，在一些实施方案中，遗传变体是多态性rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2301160、rs3829223和/或rs2857476。在一些实施方案中，遗传变体选自表1和2中所列的任一SNP。
本公开的一个实施方案涉及一种包括检测来自个体的生物样品中的一种或多种遗传变体(例如一种标记基因或多种标记基因中的多态性)的方法。多态性选自rs2736100、rs2076295、rs3778337、rs4727443、rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2034650、rs1992272、rs1981997、rs17563986、rs8070723、rs12610495、rs2109069、rs1379326、rs1881984、rs10936599、rs1997392、rs6793295、rs2609255、rs2853676、rs10484326、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs2301160、rs3829223、rs2857476、rs1278769、rs1007177、rs10518693、rs393152、rs12373139、rs17690703、rs2532274、rs2532269、rs2668692、rs169201、rs199533和rs415430。
在一相关实施方案中，多态性选自由以下组成的组：rs2736100、rs2076295、rs3778337、rs4727443、rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2034650、rs1992272、rs1981997、rs17563986、rs8070723、rs12610495和rs2109069。在一些实施方案中，检测包括检测这些多态性中呈任何组合的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个。
在相关实施方案中，多态性选自由以下组成的组：rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2301160、rs3829223和rs2857476。在一些实施方案中，检测包括检测这些多态性中呈任何组合的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个。
在相关实施方案中，多态性选自由以下组成的组：rs2736100、rs868903、rs1881984和rs2853676。在一些实施方案中，检测包括检测这些多态性中呈任何组合的至少1、2、3或4个。
在相关实施方案中，多态性是rs868903。
在一相关实施方案中，多态性选自由以下组成的组：rs1379326、rs1881984、rs10936599、rs1997392、rs6793295、rs2609255、rs2853676、rs10484326、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs2301160、rs3829223、rs2857476、rs1278769、rs1007177、rs10518693、rs393152、rs12373139、rs17690703、rs2532274、rs2532269、rs2668692、rs169201、rs199533和rs415430。在一些实施方案中，检测包括检测这些多态性中呈任何组合的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个。
在相关实施方案中，方法包括检测来自个体的生物样品中的一种或多种其它多态性，其中多态性是rs35705950。
在相关实施方案中，个体对于一种或多种上述多态性可为纯合的。在其它相关实施方案中，个体对于一种或多种上述多态性可为杂合的。
在这些实施方案中的每一个中，检测到至少一种多态性指示个体具有改变的间质性肺病显现风险(例如个体具有升高或降低的间质性肺病显现风险)。
在一些实施方案中，个体处于升高的散发性间质性肺病显现风险中。在一些实施方案中，个体处于升高的家族性间质性肺病显现风险中。在一些实施方案中，个体处于升高的特发性肺纤维化(IPF)显现风险中。在其它实施方案中，个体处于降低的散发性IIP显现风险中。在一些实施方案中，个体处于降低的家族性IIP显现风险中。在一些实施方案中，个体处于降低的特发性肺纤维化(IPF)显现风险中。
在这些实施方案中，检测到至少一种多态性可指示个体的间质性肺病的进展。在一些实施方案中，检测到至少一种多态性可指示个体的间质性肺病无进展或间质性肺病缓慢进展。在一些实施方案中，检测到至少一种多态性可指示个体的间质性肺病快速进展。
在这些实施方案中的每一个中，可将一种或多种多态性的存在与对照进行比较，所述对照如已与显现间质性肺病的风险、对特定间质性肺病的诊断、间质性肺病的进展、个体的间质性肺病的临床结果、或对间质性肺病治疗的应答相关联的一组标准或参照多态性，如根据用于风险预测的统计程序所确定。
在这个方法的一个实施方案中，可通过自个体获得基因组DNA样品，以及确定在特定基因座处存在或不存在多态性来检测多态性的存在。在一些实施方案中，存在或不存在多态性是通过至少一种选自以下的方法来确定：多路基因座特异性PCR扩增、自基因座特异性扩增子进行多路单碱基延伸(SBE)和使用基质辅助激光解吸/离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱测定法对SBE产物进行多路分辨。
在这个方法的另一实施方案中，通过自生物样品(例如组织样品)获得RNA；自RNA产生cDNA；任选用针对含有多态性的遗传位置的探针或引物扩增cDNA；确定生物样品中存在或不存在至少一种多态性来确定标记的存在。
这些方法可包括将生物样品中一种或多种多态性的存在与已与间质性肺病的显现或确诊个体的疾病(例如稳定IIP疾病或缓慢、重度或快速进展IIP中的一个)的进展相关联的一组标准的一种或多种多态性、或已与不显现间质性肺病或不显现疾病的病理性症状(如肺结瘢(纤维化))相关联的一组对照或标准一种或多种多态性进行比较。在这个实施方案中，如果一种或多种多态性的存在匹配于已与显现间质性肺病的风险或间质性肺病的严重性或进展程度相关联的一组标准的一种或多种多态性，那么个体被鉴定为处于改变的显现或随间质性肺病或间质性肺病的病理性表现形式(肺结瘢(纤维化))的显现而进展(例如快速、缓慢进展或不进展)的风险中(例如处于升高或降低的风险中)。或者，如果一种或多种多态性的存在不匹配于一组标准一种或多种多态性，那么可预测个体具有降低的风险，或不显现间质性肺病，或不随间质性肺病的病理性表现形式而在临床上进展。
确定个体是否处于升高或降低的间质性肺病显现风险中，或处于升高或降低的随肺结瘢(纤维化)的显现而快速进展的风险中的这些方法的一实施方案包括检测至少一种选自上列多态性的多态性的存在，所述多态性如表1和2中所列的SNP中的任何一个或多个，例如rs35705950、rs868903、rs2736100、rs2853676、rs1881984、rs2736100、rs2609255、rs10484326、rs2076295、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs1278769、rs12610495和rs2109069。存在至少一种多态性指示个体将显现肺结瘢(纤维化)和间质性肺病或随其的显现而进展(例如快速进展)。
这些实施方案可包括进行关于个体的追踪步骤，如临床评估、胸部计算机断层照片(胸部CT扫描)和由放射学家复审。
本公开的另一实施方案是一种用于预测被诊断患有间质性肺病的个体对治疗(例如缓解性疗法或肺移植)的需要的测定系统。测定系统包括用以检测至少一种选自由以下组成的组的多态性的存在的工具：rs35705950、rs868903、rs2736100、rs2853676、rs1881984、rs2736100、rs2609255、rs10484326、rs2076295、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs1278769、rs12610495和rs2109069。在测定系统的一个实施方案中，用以检测多态性的工具包括具有包含多态性的核酸序列的至少10至50个连续核酸的核酸探针。核酸探针优选配置在可包括芯片、阵列或流动卡的测定表面上。测定系统可包括选自含有预定多态性或多态性的组的信息的对照，所述信息已与显现间质性肺病的风险、或间质性肺病患者的间质性肺病的进展或预期寿命的增加或降低相关联。
在本公开的任一实施方案中，检测步骤可包括但不限于使用与至少一个包含多态性的遗传位置杂交的核苷酸探针。在一个方面，探针可为嵌合探针(例如与超过一个多态性位置杂交)。在另一方面，检测步骤可包括检测生物样品中的一种或多种细胞中的多态性的拷贝数(即确定个体在多态性方面是杂合的或纯合的)。
在这个实施方案的一个方面，比较步骤包括将生物样品中一种或多种多态性的存在与来自患有快速进展性间质性肺病的患者的一组对照多态性、或来自间质性肺病缓慢进展或不进展的患者的一组对照多态性进行比较。
在本公开的任一实施方案中，可通过评估临床共变量，包括组织学外观和/或个体的肺组织中的标记，出于个体显现间质性肺病的风险和/或出于诊断或预后(例如预测随间质性肺病的病理性特征(如肺结瘢)不进展或缓慢或快速进展)来选择个体。
本文也提供检测患有间质性肺病的人受试者中的一种或多种标记基因(例如生物标记)的表达水平的方法。方法包括检测人受试者的生物样品中的一种或多种下述标记基因的水平。在一些实施方案中，方法包括获得和/或测定生物样品。如下所述，在一些实施方案中，标记基因是TERT、MUC2、TOLLIP、DSP、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体。在一些实施方案中，标记基因选自TERT、MUC2、TOLLIP、其同源物和变体。
本文也提供治疗需要所述治疗的受试者的间质性肺病的方法。方法包括检测人受试者的生物样品中的一种或多种下述标记基因的水平，以及施用有效量的间质性肺病治疗。在一些实施方案中，方法包括获得和/或测定生物样品。如下所述，在一些实施方案中，标记基因是TERT、MUC2、TOLLIP、DSP、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体。
本公开的一个实施方案涉及一种包括检测来自个体的生物样品中的一种标记基因或多种标记基因的基因表达(例如RNA或蛋白质表达)水平的方法。标记基因选自与选自以下的序列具有至少95％序列同一性的标记基因：TERT(端粒酶逆转录酶；NC_000005.9；AY407349)；TOLLIP(toll相互作用蛋白；NC_000011.9；AY419805)、MUC2(粘蛋白2，寡聚粘液/凝胶形成性；NC_000011.9；DQ036653)、DSP(桥粒斑蛋白(desmoplakin)；NC_000006.11；DQ030635)、DISP2(分派同源物2；NC_000015.9)、MAPT(微管相关蛋白τ；NC_000017.10；AY413628)、DPP9(二肽基-肽酶9；NC_000019.9；DQ053109)、CSMD1(CUB和Sushi多结构域1；NC_000008.10；DQ037810)、MYNN(肌神经蛋白；NC_000003.11；AY407169)、LRRC34(含有富亮氨酸重复序列的34；NC_000003.11)、FAM13A(具有序列类似性的家族13，成员A；NC_000004.11)、OBFC1(含有寡核苷酸/寡糖结合折叠的1；NC_000010.10)、ATP11A(ATP酶，VI类，11A型；NC_000013.10)、IVD(异戊酰基-辅酶A脱氢酶；NC_000015.9；AY418331)、CRHR1(促肾上腺皮质激素释放激素受体1；NC_000017.10；AY414327)、IMP5(输入蛋白5；NC_000013.10)、LOC100128977(MAPT反义RNA1；NC_000017.10)、KIAA1267(KAT8调控NSL复合物亚单位1；NC_000017.10；NG_032784)、NSF(N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感因子；NC_000017.10)、WNT3(无翼型MMTV整合位点家族，成员3；NC_000017.10；AY413892)、C17orf69(CRHR1内含子转录物1(非蛋白质编码性；NC_000017.10)。在一些实施方案中，历经所选基因的至少10、15、20、25、30、50、70、80、100、200个或更多个连续核苷酸的跨度，标记基因具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，标记基因是以上至少一个的尽管不同于所选标记基因，但包括相同遗传变异的同源物或变体。
在一相关实施方案中，标记基因选自与某一序列具有至少95％序列同一性的标记基因，所述序列选自多种标记基因(包括MUC5B)和至少一种与选自由TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69组成的组的序列具有至少95％序列同一性(例如历经至少10、15、20、25、30、50、70、80、100、200个或更多个连续核苷酸的跨度，至少96、97、98、99或100％同一性)的标记基因。此外，标记基因可为所选标记基因的包括相同遗传变体的同源物或变体。
在一相关实施方案中，标记基因选自历经至少10、15、20、25、30、50、70、80、100、200个或更多个连续核苷酸的跨度，与选自包括一组基因TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9或其同源物或变体的多种标记基因的序列具有至少95％序列同一性(例如至少96、97、98、99或100％同一性)的标记基因。在一相关实施方案中，标记基因选自与选自包括一组基因TERT、MUC2、TOLLIP或其同源物或变体的多种标记基因的序列具有至少95％序列同一性的标记基因。
在一相关实施方案中，标记基因选自与选自包括一组基因TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体的多种标记基因的序列具有至少95％序列同一性(例如至少96、97、98、99或100％同一性)的标记基因。在相关实施方案中，方法可进一步包括检测来自个体的生物样品中的一种或多种其它标记基因的基因表达(例如RNA或蛋白质表达)水平。其它标记基因选自与选自MUC5B以及TERC、SFTPC和SFTPA2的序列具有至少95％序列同一性(例如至少96、97、98、99或100％同一性)的标记基因。在相关实施方案中，其它标记基因是MUC5B。
在一相关实施方案中，可通过检测由标记基因编码的多肽和/或标记基因的多肽的片段和/或完全互补于标记基因的至少一部分的多核苷酸(例如mRNA)来进行对标记基因的表达水平的检测。
在一些实施方案中，检测到标记的基因表达升高指示个体具有升高的间质性肺病显现风险。在一些实施方案中，个体处于显现散发性IIP的风险中。在一些实施方案中，个体处于显现家族性IIP的风险中。在一些实施方案中，个体处于显现特发性肺纤维化(IPF)的风险中。
在一些实施方案中，在这些方法中检测的基因与相应标记基因共有100％序列同一性。
在这些实施方案中的每一个中，可测定多种标记中的至少一种的水平，并且与可根据用于风险预测的统计程序确定的基因表达的标准水平或参照范围进行比较。
在这个方法的一个实施方案中，可使用特异性结合多肽或其片段的试剂检测多肽的存在。在一个实施方案中，试剂选自由抗体、抗体衍生物和抗体片段组成的组。
在这个方法的另一实施方案中，通过自受试者的组织样品获得RNA；自RNA产生cDNA；用针对标记基因的探针或引物扩增cDNA；由扩增的cDNA获得样品中的基因或基因表达产物的表达水平来确定标记的存在。
这些方法可包括将生物样品中的一种标记基因或多种标记基因的表达水平与标记基因的对照水平进行比较，所述对照水平包括：标记基因的已与间质性肺病的诊断或显现或进展相关联的对照水平。在这些实施方案中，如果个体的生物样品中的标记基因的表达水平在统计上类似于或大于标记基因的已与间质性肺病的发生或与显现间质性肺病或进行性间质性肺病相关联的对照表达水平，那么预测个体显现或随间质性肺病(如肺结瘢(纤维化))的病理性表现形式而进展。或者，如果个体的生物样品中的标记基因的水平在统计上小于标记基因的已与间质性肺病的发生或与显现间质性肺病或进行性间质性肺病相关联的对照水平，那么个体被预测不显现或可被预测不随间质性肺病的显现而进展或随间质性肺病的显现而缓慢进展。
另外，或作为一替代方案，这些实施方案可包括将生物样品中的一种标记基因或多种标记基因的表达水平与已显现或患有进行性间质性肺病的第二个体中的标记基因的水平进行比较。在这个实施方案中，如果个体的生物样品中的标记基因的表达水平在统计上类似于或大于第二个体中的标记基因的表达水平，那么预测个体显现或患有进行性间质性肺病。或者，如果个体的生物样品中的标记基因的水平小于第二个体中的标记基因的表达水平，那么预测个体不显现或未患有进行性间质性肺病。
确定个体是否将显现或将随肺结瘢(纤维化)和间质性肺病的显现而快速进展的这些方法的一实施方案包括检测来自个体的生物样品中的与MUC5B、DSP和DPP9中的每一个具有至少95％序列同一性的基因的基因表达水平。在一些实施方案中，检测的基因优选与相应标记基因共有100％序列同一性。方法也可通过检测由基因编码的多肽、和/或多肽的片段、和/或完全互补于基因的多核苷酸的水平来进行。在这个实施方案中，多种标记的表达水平升高指示个体将显现肺结瘢(纤维化)和间质性肺病或随其的显现而快速进展。
本公开的另一实施方案是一种通过测量自受试者获得的第一生物样品中的一种或多种(例如多种)上述标记基因的表达水平，以及将表达水平与对照进行比较来监测受试者的间质性肺病的进展的方法。在相关实施方案中，提供一种通过测量自受试者获得的第一生物样品中的多种标记基因的表达水平，测量自所述受试者获得的第二生物样品中的所述多种标记的水平，以及将在所述第一样品中测量的标记的水平与在所述第二样品中测量的标记的水平进行比较来监测所述受试者的间质性肺病的进展的方法。在这个实施方案中，多种标记基因选自与选自如上所述的标记基因的序列具有至少95％序列同一性的标记基因。或者，在这个实施方案中，多种标记基因选自与选自MUC5B、DSP和DPP9或其同源物或变体的序列具有至少95％序列同一性的标记基因。优选地，在迟于获得第一生物样品的时间自受试者获得第二生物样品。或者，历经一定时间范围，自受试者获得第一生物样品和第二生物样品一次以上。
在一相关实施方案中，可通过检测由标记基因编码的多肽、和/或标记基因的多肽的片段、和/或完全互补于标记基因的至少一部分的多核苷酸来进行对标记基因的表达水平的检测。在一些实施方案中，在这些方法中检测的基因与相应标记基因共有100％序列同一性。
这些实施方案可包括进行追踪步骤，如胸部计算机断层照片(胸部CT扫描)和由放射学家复审。
本公开的另一实施方案是一种通过将在自受试者获得的第一样品中测量的基因标记的表达水平与和间质性肺病的显现或进展相关联的对照值进行比较来评估对所述受试者的间质性肺病的治疗的功效的方法。本公开的另一实施方案是一种通过以下方式来评估对受试者的间质性肺病的治疗的功效的方法：将在自所述受试者获得的第一样品中测量的基因标记的表达水平与在稍后时间自所述受试者获得的第二样品中的基因标记的表达水平进行比较，以及进行追踪步骤，如胸部计算机断层照片(胸部CT扫描)或由放射学家复审肺样品。在这个实施方案中，相对于第一样品，第二样品中的标记的水平降低指示治疗有效治疗受试者的间质性肺病。在一些实施方案中，在已向受试者施用治疗之前收集第一样品，并且在已向受试者施用治疗之后获得第二样品。在另一实施方案中，获得样品，并且历经一定时间范围重复比较。在这个实施方案中，多种标记基因选自与选自上述标记基因的序列具有至少95％序列同一性的标记基因。或者，在这个实施方案中，多种标记基因选自与选自MUC5B、DSP和DPP9或其同源物或变体的序列具有至少95％序列同一性的标记基因。
在一相关实施方案中，可通过检测由标记基因编码的多肽、和/或标记基因的多肽的片段、和/或完全互补于标记基因的至少一部分的多核苷酸来进行对标记基因的表达水平的检测。在一些实施方案中，在这些方法中检测的基因与相应标记基因共有100％序列同一性。
本公开的另一实施方案是一种用于预测被诊断患有间质性肺病的个体对肺移植的需要的测定系统。测定系统包括用以检测与选自MUC5B、DSP和DPP9或其同源物或变体的序列具有至少95％序列同一性的一种标记基因或多种标记基因的表达的工具。在一些实施方案中，在这些方法中检测的基因与相应标记基因共有100％序列同一性。
在测定系统的一个实施方案中，用以检测的工具包括具有标记基因的至少10至50个(例如10、15、20、25、30、10-50、20-40、10-100、50-100等)连续核酸或其互补核酸序列的核酸探针。在测定系统的另一实施方案中，用以检测的工具包括特异性检测由标记基因编码的多肽的结合配体。这些结合配体可包括抗体、抗原结合性抗体衍生物或抗原结合性抗体片段。核酸探针和/或结合配体可配置在测定表面，如珠粒、微流体表面、芯片、阵列或流动卡上。
测定系统可包括选自含有标记基因的预定对照水平的已与间质性肺病患者的进展或预期寿命相关联的信息的对照。
在本公开的任一实施方案中，检测步骤可包括但不限于使用与至少一种标记基因杂交的核苷酸探针。在一个方面，探针可为嵌合探针(例如与超过一种生物标记基因杂交)。在另一方面，检测步骤可包括检测生物样品中的一种或多种细胞中每种细胞的生物标记基因的拷贝数，和/或检测生物样品中的一种或多种细胞中每种细胞的标记基因扩增。在实施方案中，如美国专利号6,514,750和6,942,837和7,211,443和7,235,406中所述，检测基因表达的步骤是通过基因标志阵列来进行，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
在这个实施方案的一个方面，比较步骤包括将生物样品中的生物标记水平与一个或多个来自患有快速进展性间质性肺病的患者的对照样品中的生物标记的对照水平进行比较。在一个方面，生物标记的对照水平是已与间质性肺病的缓慢进展或不进展相关联的水平。
在本公开的任一实施方案中，对预测显现或患有进行性间质性肺病的个体的选择可包括评估临床共变量，包括组织学外观和/或个体的肺组织中的标记。
进一步提供用于确定人受试者是否患有间质性肺病或处于显现间质性肺病的风险中的方法，其包括：在来自所述受试者的生物样品中检测以下至少一个：
a)选自由以下组成的组的遗传变体的存在：rs2736100、rs2076295、rs3778337、rs4727443、rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2034650、rs1992272、rs1981997、rs17563986、rs8070723、rs12610495、rs2109069、rs1379326、rs1881984、rs10936599、rs1997392、rs6793295、rs2609255、rs2853676、rs10484326、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs2301160、rs3829223、rs2857476、rs1278769、rs1007177、rs10518693、rs393152、rs12373139、rs17690703、rs2532274、rs2532269、rs2668692、rs169201、rs199533和rs415430；
b)选自由以下组成的组的一种标记基因或多种标记基因的基因表达的水平：与选自由TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体组成的组的序列具有至少95％序列同一性的标记基因；
c)由b)的所述标记基因编码的多肽；
d)c)的多肽的片段；以及
e)完全互补于b)的标记基因的至少一部分的多核苷酸；
其中至少一种遗传变体、多肽、片段和/或互补多核苷酸的存在，和/或标记基因的基因表达增加或降低指示所述受试者患有间质性肺病或处于显现间质性肺病的风险中。在一些实施方案中，遗传变体的存在是通过PCR来确定。在一些实施方案中，遗传变体的存在是通过检测福斯特共振能量转移(FRET)来确定。在一些实施方案中，遗传变体的存在是通过例如使用对多肽具有特异性的抗体、抗原结合性抗体衍生物和抗原结合性抗体片段检测所述多肽的存在或表达水平来确定。在一些实施方案中，间质性肺病是纤维化肺病、特发性肺纤维化(IPF)、家族性间质性肺炎(FIP)或特发性间质性肺炎(IIP)。
也提供用于监测人受试者的间质性肺病的进展的方法，其包括i)测量自所述受试者获得的第一生物样品中的多种基因标记的表达水平，其中所述多种标记包括多种选自由以下组成的组的标记：
a)与选自由以下组成的组的序列具有至少95％序列同一性的标记基因：TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体；
b)由a)的所述标记基因编码的多肽；
c)b)的多肽的片段；以及
d)完全互补于a)的标记基因的至少一部分的多核苷酸；
ii)测量自所述受试者获得的第二生物样品中的所述多种标记的表达水平；以及
iii)将在所述第一样品中测量的所述标记的所述表达水平与在所述第二样品中测量的所述标记的所述水平进行比较。在一些实施方案中，方法进一步包括测量至少一个额外时间自受试者获得的至少一个其它生物样品中的多种标记的表达水平，以及将在第一和第二样品中测量的标记的表达水平与在所述至少一个其它样品中测量的标记的水平进行比较。在一些实施方案中，方法进一步包括当第二样品中的标记的表达水平高于第一样品的标记的表达水平时，推荐针对间质性肺病的治疗。在一些实施方案中，间质性肺病是纤维化肺病、特发性肺纤维化(IPF)、家族性间质性肺炎(FIP)或特发性间质性肺炎。
也提供评估对人受试者的间质性肺病的治疗的功效的方法，所述方法包括：
测定在时间t0自所述受试者获得的第一样品中测量的标记的表达水平，其中所述标记选自由以下组成的组：
a)与选自由以下组成的组的序列具有至少95％序列同一性的标记基因：TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体；
b)由a)的所述标记基因编码的多肽；
c)b)的多肽的片段；以及
d)完全互补于a)的标记基因的至少一部分的多核苷酸；
ii)测定在稍后时间t1自所述受试者获得的第二样品中的所述标记的表达水平；以及
iii)进行追踪步骤，所述追踪步骤选自进行胸部CT扫描以及对来自所述受试者的肺组织进行病理检查；
其中相对于所述第一样品，所述第二样品中的所述标记的所述表达水平的降低指示所述治疗有效治疗所述受试者的间质性肺病。在一些实施方案中，时间t0在已向受试者施用治疗之前，而时间t1在已向受试者施用治疗之后。在一些实施方案中，时间t0在已向受试者施用治疗之后，而时间t1在已向受试者施用治疗之后迟于时间t0。在一些实施方案中，多次施用治疗。在一些实施方案中，历经一定时间范围，重复比较自受试者获得的生物样品。
进一步提供用于预测对针对人受试者的间质性肺病的疗法的应答的测定系统，其包括用以检测以下至少一个的工具：
a)选自由以下组成的组的遗传变体的存在：rs2736100、rs2076295、rs3778337、rs4727443、rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2034650、rs1992272、rs1981997、rs17563986、rs8070723、rs12610495、rs2109069、rs1379326、rs1881984、rs10936599、rs1997392、rs6793295、rs2609255、rs2853676、rs10484326、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs2301160、rs3829223、rs2857476、rs1278769、rs1007177、rs10518693、rs393152、rs12373139、rs17690703、rs2532274、rs2532269、rs2668692、rs169201、rs199533和rs415430；以及
b)选自由以下组成的组的一种标记基因或多种标记基因的基因表达的水平：与选自由TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体组成的组的序列具有至少95％序列同一性的标记基因；
c)由b)的所述标记基因编码的多肽；
d)c)的多肽的片段；以及
e)完全互补于b)的标记基因的至少一部分的多核苷酸。在一些实施方案中，用以检测的工具包括包含标记多态性或基因的至少10至50个连续核酸或其互补核酸序列的核酸探针。在一些实施方案中，用以检测的工具包括与邻近或包含(a)的遗传变体的序列杂交的核酸引物或探针。在一些实施方案中，至少一种引物或探针用福斯特共振能量转移(FRET)接受体标记，并且至少一种引物或探针用FRET供体标记。在一些实施方案中，用以检测的工具包括特异性检测由标记基因编码的多肽的结合配体(例如抗体、抗原结合性抗体衍生物或抗原结合性抗体片段)。在一些实施方案中，用以检测的工具包括配置在测定表面(例如芯片、阵列、珠粒、微流体表面或流动卡)上的核酸探针和/或结合配体中的至少一个。在一些实施方案中，探针包含标记基因的至少10至50个连续核酸的互补核酸序列。
进一步提供用于预测、诊断或预后间质性肺病的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一种用于检测选自由以下组成的组的基因中的遗传变体的核酸探针或引物：TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、MUC5B、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、C17orf69和WNT3。在一些实施方案中，试剂盒包括用于扩增所选遗传变体的试剂，例如扩增所选基因中的核酸的引物、聚合酶(例如热稳定聚合酶，如Taq或其它DNA或RNA聚合酶)、缓冲液等。在一些实施方案中，至少一种探针或引物互补于遗传变体的变异核苷酸(例如隐性SNP)。在一些实施方案中，至少一种探针或引物互补于(与其杂交)所选遗传变异多核苷酸序列或其扩增产物。在一些实施方案中，标记至少一种探针或引物。在一些实施方案中，标记是荧光标记或FRET接受体或供体。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一种用福斯特共振能量转移(FRET)接受体标记的探针或引物以及至少一种用FRET供体标记的探针或引物。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一种各自用于检测呈任何组合的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个上述基因中的遗传变体的探针或引物。在一些实施方案中，至少一种核酸探针或引物被包括在阵列、珠粒、微流体表面或芯片上。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一种对照样品，例如包含具有至少一种所选遗传变体的显性等位基因的核酸，或包含具有至少一种所选遗传变体的多态性等位基因的核酸。
进一步提供用于预测、诊断或预后间质性肺病的试剂盒，其包括至少一种用于检测选自由以下组成的组的遗传变体的核酸探针或引物：rs2736100、rs2076295、rs3778337、rs4727443、rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2034650、rs1992272、rs1981997、rs17563986、rs8070723、rs12610495、rs2109069、rs1379326、rs1881984、rs10936599、rs1997392、rs6793295、rs2609255、rs2853676、rs10484326、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs2301160、rs3829223、rs2857476、rs1278769、rs1007177、rs10518693、rs393152、rs12373139、rs17690703、rs2532274、rs2532269、rs2668692、rs169201、rs199533和rs415430。在一些实施方案中，试剂盒包括用于扩增包含遗传变体的核酸的试剂(例如在多态性核苷酸的任一侧上的PCR引物、聚合酶、缓冲液等)。在一些实施方案中，至少一种探针或引物互补于遗传变体的变异核苷酸(例如SNP)。在一些实施方案中，至少一种探针或引物互补于(与其杂交)所选遗传变异多核苷酸序列或其扩增产物。在一些实施方案中，标记至少一种探针或引物。在一些实施方案中，标记是荧光标记或FRET接受体或供体。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一种用福斯特共振能量转移(FRET)接受体标记的探针或引物以及至少一种用FRET供体标记的探针或引物。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一种各自用于检测呈任何组合的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个上述遗传变体中的遗传变体的探针或引物。在一些实施方案中，至少一种核酸探针或引物被包括在阵列、珠粒、微流体表面或芯片上。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一种对照样品，例如包含具有至少一种所选遗传变体的显性等位基因的核酸，或包含具有至少一种所选遗传变体的多态性等位基因的核酸。
进一步提供在检测与间质性肺病(例如纤维化肺病、特发性肺纤维化(IPF)、家族性间质性肺炎(FIP)或特发性间质性肺炎(IIP))相关的生物标记(例如遗传变体)时形成的体外复合物。间质性肺病可为纤维化肺病。间质性肺病可为IPF。间质性肺病可为FIP。间质性肺病可为IIP。在一些实施方案中，复合物包含与遗传变异核酸杂交的第一核酸探针，其中所述遗传变异核酸包含遗传变异TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、MUC5B、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3或C17orf69基因序列，其中所述遗传变异核酸是自患有或怀疑患有间质性肺病的人受试者提取，或是自患有或怀疑患有间质性肺病的人受试者提取的核酸的扩增产物。在一些实施方案中，复合物进一步包含与所述遗传变异核酸杂交的第二标记的核酸探针。在一些实施方案中，第一标记的核酸探针包含第一标记，并且所述第二标记的核酸探针包含第二标记，其中所述第一和第二标记能够进行福斯特共振能量转移(FRET)。在一些实施方案中，复合物进一步包含聚合酶(例如热稳定聚合酶或其它DNA或RNA聚合酶)或连接酶。在一些实施方案中，复合物进一步包含与遗传变异核酸杂交的核酸引物。
本公开的其它特征和优势将根据以下详细描述而变得为本领域技术人员显而易知。
附图简述
图1显示根据累加模型，用1616个病例和4683个对照，在439,828个SNP处的GWAS结果。红线以上的SNP是在P＜5×10-8下全基因组显著的。选择这些SNP以及红线与蓝线之间的对应于5×10-8＜P值＜.0001的SNP用于在876个病例和1890个对照中追踪。
图2显示对应于在GWAS发现分析和对发现和重复结果的元分析中达到全基因组显著性的所有基因座的发现GWAS结果的基因座特异性图。
图3显示对应于在对发现和重复结果的元分析之后达到全基因组显著性的四个额外基因座的发现GWAS结果的基因座特异性图。
图4显示来自100个病例和94个对照的肺组织中的DSP的相对表达，a)根据病例/对照状态的相对表达，b)根据DSP中rs2076295处的基因型的相对表达。
图5显示跨越439,828个高质量SNP的GWAS的观察p值分布相对于预期p值分布的分位数-分位数(Q-Q)图。
图6显示全基因组显著的基因座的染色体位置、SNP和基因。
图7显示在11p15处的全基因组显著的SNP与rs35705950之间的连锁不平衡。彩色指示D估计值＝1，白色是D估计值＝0。方块中的数字对应于r2*100。估计值基于如表2和表6的分析中所用的联合病例和对照基因型。
图8概述在患有间质性肺病的家族中进行的全基因组连锁扫描，其中发现rs3570950多态性具有预测性。
图9显示MUC2、MUC5AC和MUC5B中与间质性肺病相关联的SNP的几率比率。
图10显示对各个研究组中MUC5B启动子SNPrs3570950的相关性的确认。
图11显示与携带rs3570950SNP的间质性肺病患者相关的存活持续时间增加。
图12显示不同研究组中与携带rs3570950SNP的间质性肺病患者相关的存活持续时间增加。
图13针对与携带rs3570950SNP的间质性肺病患者相关的存活持续时间增加来比较不同研究组。
图14显示MUC5B基因的结构以及rs3570950SNP的影响。
图15比较正常肺组织相对于IPF肺组织中的MUC5B表达。
图16显示携带野生型MUC5B(GG)基因的个体相对于携带变异MUC5B(GT或TT)基因的个体中，正常肺组织相对于IPF肺组织中的MUC5B表达。
图17显示IPF肺组织中的MUC5B和表面活性蛋白C(SPC)的表达上调。
图18概述与MUC5Brs3570950SNP相关的影响。
图19比较与肺纤维化相关的基因的遗传学影响。
图20显示携带rs3570950SNP的患者的纤维化肺组织。
图21显示携带至少一种变异rs3570950等位基因的患者的间质性肺病的可能性增加。
图22比较与肺纤维化相关的基因的遗传学影响。
图23概述使遗传标记与各种间质性肺病相关联的全基因组关联研究(GWAS)。
图24显示研究中考虑的个体的地理来源。
图25显示GWAS结果的概述。
图26显示与间质性肺病相关联的SNP的遗传位置。
图27显示分析基因型的群体和重复群体中纤维化病状的相对频率。
图28显示重复群体中与间质性肺病相关联的SNP的遗传位置。
图29显示GWAS研究和与间质性肺病相关联的SNP的位置的组合结果。
图30显示世系对染色体17q21中的SNP的影响。
图31显示世系对染色体17q21上的各种SNP的影响的几率比率(OR)和P值。
图32显示MUC5B启动子SNP与间质性肺病关联的OR和P值。
图33概述在SNP位置方面的间质性肺病GWAS研究结果。
图34概述在SNP位置方面的间质性肺病GWAS研究结果。
图35概述在基因功能方面的间质性肺病GWAS研究结果。
详述
除非另外定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与由本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。参见例如Lackie，DICTIONARYOFCELLANDMOLECULARBIOLOGY，Elsevier(第4版2007)；Sambrook等，MOLECULARCLONING，ALABORATORYMANUAL，ColdSpringsHarborPress(ColdSpringsHarbor，NY1989)。术语“一个(种)”意指“一个(种)或多个(种)”。术语“包含(comprise)”及其变化形式(如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”)在位于对步骤或要素的叙述之前时意指添加其它步骤或要素是任选的而非排除的。提供以下定义以有助于理解本文频繁使用的某些术语，并且不意图限制本公开的范围。
术语“受试者”、“患者”、“个体”等不意图具有限制性，并且可大体上相互交换。也就是说，描述为“患者”的个体未必患有给定疾病，而是可仅寻求医学建议。
“对照”、“对照样品”、“标准对照”或“对照值”是指充当用于与测试样品比较的参照(通常是已知参照)的样品。举例来说，测试样品可取自怀疑患有给定肺病的患者，并且与来自已知肺病患者、已知多态性携带者、或已知正常(非疾病)个体的样品进行比较。对照也可代表自类似个体(例如肺病患者或具有类似医学背景、相同年龄、重量等的健康个体)的群体采集的平均值。对照值也可自同一个体，例如自较早获得的样品，在疾病之前，或在治疗之前获得。技术人员将认识到对照可被设计用于评估许多参数。
本领域技术人员将了解在给定情况下哪些对照是有价值的，并且能够基于与对照值的比较分析数据。对照对于确定数据的显著性也有价值。举例来说，如果给定参数的值在对照中广泛变化，那么在测试样品中的变化将不被视为显著。
术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物及其互补序列。本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或语法等效物意指至少两个共价连接在一起的核苷酸。寡核苷酸的长度通常是约5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50个或更多个核苷酸，长度多达约100个核苷酸。核酸和多核苷酸是具有任何长度，包括较长长度，例如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等的聚合物。术语“核苷酸”通常是指多核苷酸的单一单元，即单体。核苷酸可为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰形式。
如本文所用，“遗传变体”是指突变、单核苷酸多态性(SNP)、缺失变体、错义变体、插入变体、倒置或拷贝数变体。遗传变体可用作生物标记，并且可导致表达水平增加或降低或差异性修饰。
术语“生物标记”是指可在生物样品(或自生物样品获得或处理的样品)中检测，并且与对照样品进行比较的作为对特定病状的指示的生物量度。生物标记的实例包括遗传变体、增加或降低的表达水平(通过检测染色质开放、转录产物或翻译产物来测定)、和差异性修饰(例如核酸的甲基化、或蛋白质的磷酸化、糖基化或多聚化)。“标记基因”是受生物标记影响的基因。也就是说，标记基因可在它的基因组形式中包括遗传变异，在较高或较低水平下表达，或被差异性修饰以作为对例如间质性肺病的特定病状的指示。
术语“探针”或“引物”是指其与样品的特异性杂交可被检测的一种或多种核酸片段。视探针或引物将被用于的特定技术而定，它可具有任何长度。举例来说，PCR引物的长度通常在10与40个核苷酸之间，而用于例如DNA印迹的核酸探针的长度可超过100个核苷酸。探针或引物可未标记或如下所述标记以使它与靶标序列的结合可被检测(例如用FRET供体或接受体标记)。可基于染色体的一个或多个特定(预先选择)部分(例如一个或多个克隆)、分离的完整染色体或染色体片段、或一批聚合酶链反应(PCR)扩增产物来设计探针或引物。固定于靶标元件上的核酸的长度和复杂度对本发明来说并不是关键的。技术人员可调整这些因素以提供给定杂交和检测程序的最优杂交和信号产生，并且提供在不同基因或基因组位置之间的所需分辨。
探针和引物也可固定在固体表面(例如硝酸纤维素、玻璃、石英、熔融二氧化硅玻片)上，如在阵列中。用于产生高密度阵列的技术也可用于这个目的(参见例如Fodor(1991)Science767-773；Johnston(1998)Curr.Biol.8：R171-R174；Schummer(1997)Biotechniques23：1087-1092；Kern(1997)Biotechniques23：120-124；美国专利号5,143,854)。技术人员将认识到可根据靶标序列在某一程度上修改特定探针和引物的精确序列以产生与靶标序列“大致上同一”或“大致上互补”，但保留特异性结合(即特异性与其杂交)它们所源于的相同靶标的能力的探针。
如果探针或引物互补于涵盖或邻近于遗传变体的区域，那么它“能够检测”所述遗传变体。举例来说，为检测SNP，可设计在SNP的任一侧上的引物，并且引物延伸用于确定在SNP的位置处的核苷酸的身份。在一些实施方案中，使用FRET标记的引物(至少一种用FRET供体标记，并且至少一种用FRET接受体标记)以使将仅在两种引物杂交后检测到FRET信号。在一些实施方案中，在各种条件下使用探针以便它仅与遗传变体杂交，或仅与显性序列杂交。
此外，在核酸的情形下，术语“能够与...杂交”是指多核苷酸序列与互补序列形成沃森-克里克(Watson-Crick)键。技术人员将了解视多核苷酸的长度、互补区域的长度(例如长度是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多个碱基)和条件的严格性而定，发生杂交不需要互补性百分比是100％。举例来说，多核苷酸(例如引物或探针)可能够结合历经互补区域的链段，具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补性的多核苷酸。在检测遗传变体的情形下，容许的互补性百分比或错配数目将视用于检测的技术(参见下文)而变化。
在核酸的情形下，术语“扩增产物”是指由扩增反应，例如PCR及其变化形式、rtPCR、链置换反应(SDR)、连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)或Qbeta复制产生的核酸(例如多核苷酸)。例如Taq的热稳定聚合酶可用于避免在整个涉及循环或极端温度的扩增程序(例如PCR和它的变化形式)期间重复添加聚合酶。
术语“标记”、“可检测部分”、“可检测试剂”和类似术语是指可通过分光、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。举例来说，适用标记包括荧光染料、发光试剂、放射性同位素(例如32p、3H)、电子密集试剂、酶、生物素、地高辛、或半抗原和蛋白质或可例如通过亲和力来使其可检测的其它实体。可采用本领域中已知的用于使核酸或其它生物分子缀合于标记的任何方法，例如使用Hermanson，BioconjugateTechniques1996，AcademicPress，Inc.，SanDiego中所述的方法。术语“标签”可与术语“标记”同义使用，但通常是指基于亲和力的部分，例如用于纯化的“His标签”或与生物素相互作用的“抗生蛋白链菌素标签”。
“标记的”分子(例如核酸、蛋白质或抗体)是通过接头或化学键共价或通过离子、范德华(vanderWaals)、静电或氢键非共价结合于标记以便可通过检测所述结合于所述分子的标记的存在来检测所述分子的存在的分子。
福斯特共振能量转移(缩写为FRET)，也称为荧光共振能量转移，是一种描述两个发色团之间的能量转移的机理。最初呈它的电子激发状态的供体发色团(FRET供体)可通过非辐射偶极-偶极偶联将能量转移至通常相距小于10nm的接受体发色团(FRET接受体)。当FRET供体和接受体邻近时，转移至FRET接受体的能量被检测为光发射(能量)。因此，“FRET信号”是通过自接受体发射光所产生的信号。分隔距离R的供体与接受体染料之间的福斯特共振能量转移的效率由E＝1/[1+(R/R0)6]给出，其中R0是E＝1/2所处的供体-接受体对的福斯特半径。对于一些通常使用使用的染料对(例如Cy3-Cy5)，R0是约 FRET信号随距离的6次幂而变化。如果供体-接受体对定位于约R0，那么可在最大信噪比下测量在至的范围内的小幅距离变化。使用当前技术，可达成许多单FRET对的1ms或更快并行成像。
“FRET对”是指能够进行FRET检测的FRET供体和FRET接受体对。
除非另外指示，否则术语“荧光团”、“染料”、“荧光分子”、“荧光染料”、“FRET染料”和类似术语在本文中同义使用。
如本文所用，术语“治疗”和“预防”不意图是绝对术语。治疗可指任何延迟发作、降低症状的频率或严重性、改善症状、改进患者舒适性和/或呼吸功能等。可将治疗的作用与未接受给定治疗的一个个体或一组个体，或与在治疗之前或在停止治疗之后的同一患者进行比较。
术语“预防”是指降低患者的肺病症状的发生。如上所指示，预防可为完全的(无可检测症状)，或部分的以致观察到的症状少于将可能在不存在治疗下发生的症状。
如本文所用的术语“治疗有效量”是指治疗剂的足以改善如上所述的病症的量。举例来说，对于给定参数，治疗有效量将显示增加或降低至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％。治疗功效也可表示为增加或降低“倍数”。举例来说，治疗有效量可具有超过对照至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍作用。
术语“诊断”是指受试者中存在肺病的相对概率。类似地，术语“预后”是指某一未来结果可能发生在受试者中的相对概率。举例来说，在本发明的情形下，预后可指个体将显现肺病的可能性，或疾病的可能严重性(例如症状的严重性、功能衰退速率、存活期等)。所述术语不意图是绝对的，如将由医学诊断领域技术人员所了解。
关于确定肺病风险因素的术语“相关联”和“相关”是指将风险因素(例如粘蛋白基因的调控异常或遗传变异)在个体中的存在或量与它在已知罹患肺病或已知处于肺病的风险中的个人中，或在已知无肺病的个人中的存在或量进行比较，以及基于测定结果向个体指定为患有/显现肺病的概率增加或降低。
本发明者已发现作为IIP风险的重要促进因素的多态性和基因表达谱。这些研究结果包括八个新型遗传风险基因座(4q22、6p24、7q22、10q24、13q34、15q14-15、17q21和19p13)，以及三个先前报道的基因/基因座(TERC[3q26]、TERT[5p15]和MUC5B[11p15])中的风险变体在IIP中的作用。在这个发现之前，仅有的两个具有可重现IIP相关常见变体的基因是TERT和MUC5B。总的来说，与IIP相关的常见风险变体表明这个疾病主要由宿主防御、细胞-细胞粘着和早期细胞衰老方面的缺陷介导。这些研究结果可用于在这个复杂疾病中指导干预试验和治疗。
根据一种定义，生物标记是“客观测量并评估为对正常生物过程、病原性过程或对治疗干预的药理学应答的指示的特征”。NIH生物标记定义工作组(1998)。生物标记也可包括指示特定生物过程的特征的样式或集合(“标记组”)。标记测量结果可增加或降低以指示特定生物事件或过程。此外，如果标记测量结果通常在不存在特定生物过程下变化，那么恒定测量结果可指示发生那个过程。
标记测量结果可为绝对值(例如生物样品中的分子的摩尔浓度或存在或不存在多态性)或相对值(例如生物样品中的两种分子的相对浓度)。两个或更多个测量结果的商或乘积可用作标记。举例来说，一些医师使用总血液胆固醇作为显现冠状动脉疾病的风险的标记，而其它医师使用总胆固醇与HDL胆固醇的比率。
在本公开中，标记主要用于诊断和预后目的。然而，它们也可用于治疗、药物筛选和个体分层目的(例如用以将个体分组成许多“子组”以供评估)以及本文所述的其它目的，包括评估间质性肺病治疗剂的有效性。
除非另外指示，否则本公开的实施采用属于本领域的技能的分析生物化学、微生物学、分子生物学和重组DNA通常已知技术的常规方法。所述技术在文献中充分说明。(参见例如Sambrook等MolecularCloning：ALaboratoryManual.第3版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，2000；DNACloning：APracticalApproach，第I和II卷(Glover编)；OligonucleotideSynthesis(Gait编，当前版本)；NucleicAcidHybridization(Hames和Higgins编，当前版本)；TranscriptionandTranslation(Hames和Higgins编，当前版本)；CRCHandbookofParvoviruses，第I和II卷(Tijessen编)；FundamentalVirology，第2版，第I和II卷(Fields和Knipe编))。
本文所用的术语用于描述特定实施方案，并且不意图具有限制性。除非内容和上下文另外明确规定，否则如本文所用，单数形式“一个(种)”和“所述”包括复数个指示物。因此，举例来说，提及“一种标记”包括两种或更多种所述标记的组合。除非另外定义，否则所有科学和技术术语都将被理解为具有与它们所属领域中通常所用相同的含义。出于本公开的目的，下文定义以下术语。
如本文所用，术语“标记”包括多肽标记和多核苷酸标记。为本公开的明晰性起见，本公开的各方面将关于“多肽标记”和“多核苷酸标记”加以描述。然而，本文关于“多肽标记”进行的陈述意图适用于本公开的其它多肽。同样，本文关于“多核苷酸”标记进行的陈述意图相应地适用于本公开的其它多核苷酸。因此，举例来说，描述为编码“多肽标记”的多核苷酸意图包括编码以下的多核苷酸：多肽标记、与多肽标记具有大致上序列同一性的多肽、修饰的多肽标记、多肽标记的片段、多肽标记的前体和多肽标记的继体、以及包含多肽标记、同源多肽、修饰的多肽标记或片段、多肽标记的前体或继体的分子(例如融合蛋白)。
如本文所用，术语“多肽”是指具有至少5个连续氨基酸残基，例如长度是5、6、7、8、9、10、11或12个或更多个氨基酸，包括直至多肽的全长的各整数的氨基酸残基聚合物。多肽可由两个或更多个多肽链组成。多肽包括蛋白质、肽、寡肽和氨基酸。多肽可为直链或支链。多肽可包含修饰的氨基酸残基、氨基酸类似物或非天然存在的氨基酸残基，并且可间隔有非氨基酸残基。在定义内包括已被天然或通过干预，例如形成二硫键、糖基化、脂质化、甲基化、乙酰化、磷酸化或通过操作(如与标记组分缀合)来修饰的氨基酸聚合物。也包括由受试者应答于过度表达的多肽标记产生的抗体。
如本文所用，多肽的“片段”是指短于全长多肽的多个氨基酸残基。举例来说，给定多肽的片段可包含全长多肽的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基或至少30个连续氨基酸残基。如本文所用，多核苷酸的“片段”是指包含具有多核苷酸的序列的至少5、10或15个连续核酸残基、至少30个连续核酸残基、至少60个连续核酸残基或至少90％的核酸序列的核酸残基聚合物。在一些实施方案中，片段代表全长多肽的结构域(例如功能结构域)。在一些实施方案中，片段代表全长多肽减去给定结构域。在一些实施方案中，片段是抗原性片段，并且片段的大小将取决于如由抗体识别的表位是线性表位或构象表位的因素。因此，一些抗原性片段将由较长区段组成，而其它抗原性片段将由较短区段(例如长度是5、6、7、8、9、10、11或12个或更多个氨基酸，包括直至多肽的全长的各整数)组成。本领域技术人员通晓用于选择由抗原结合性抗体、抗体衍生物和抗体片段结合的抗原性片段的方法。
在一些实施方案中，多肽标记是生物路径的成员。如本文所用，术语“前体”或“继体”是指在生物路径中位于多肽标记或多核苷酸标记之前或之后的分子。因此，一旦多肽标记或多核苷酸标记被鉴定为一个或多个生物路径的成员，本公开即可包括生物路径的其它前体或继体成员。所述对生物路径和它们的成员的鉴定属于本领域人员的技能。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指单一核苷酸或具有任何长度的核酸残基聚合物。多核苷酸可含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物，并且可为双链或单链。多核苷酸可包含修饰的核酸(例如甲基化)、核酸类似物或非天然存在的核酸，并且可间隔有非核酸残基。举例来说，多核苷酸包括基因、基因片段、cDNA、分离的DNA、mRNA、tRNA、rRNA、分离的具有任何序列的RNA、重组多核苷酸、引物、探针、质粒和载体。在定义内包括已被天然或通过干预来修饰的核酸聚合物。
如本文所用，当用于检测组分的方法在应用于两个样品时提供不同水平或活性时，所述组分(例如标记)被称为相较于另一样品在一个样品中“差异性表达”。如果用于检测组分的方法指示第一样品中的所述组分的水平或活性高于第二样品中(或如果所述组分在第一样品中而非在第二样品中可检测)，那么所述组分被称为在第一样品中“增加”。相反，如果用于检测组分的方法指示第一样品中的所述组分的水平或活性低于第二样品中(或如果所述组分在第二样品中而非在第一样品中可检测)，那么所述组分被称为在第一样品中“降低”。具体来说，如果相较于自非间质性肺病受试者获得的样品(或一组样品)中的标记的水平或参照值或范围，标记的水平或活性分别较高或较低，那么标记被称为在自间质性肺病受试者(或怀疑患有间质性肺病，或处于显现间质性肺病的风险中的受试者)获得的样品(或一组样品)中“增加”或“降低”。
鉴定为在间质性肺病中表达的标记具有显著生物重要性。进行IIP的病例-对照全基因组关联研究(GWAS；1616个病例和4683个对照)和重复研究(876个病例和1890个对照)。所有类型的纤维化IIP都包括在病例组中，因为：a)在IIP诊断之间进行区分常由于大致上临床性、病理性和放射性重叠而成问题；以及b)存在共有遗传易感性的强力证据。家族性IIP与散发性IIP两者均也包括在病例组中，因为MUC5B、TERT、TERC和SFTPC变体提供散发性IIP在遗传上类似于这个疾病的家族性形式的证据。结果指示IIP是由独立或组合起作用的多种遗传变体引起，并且相同遗传变体可导致不同组织学类型的IIP。
如以下详细说明，当将多态性和基因表达谱与和IIP相关的临床参数和常见风险变体进行比较时，结果指示这个疾病主要由宿主防御、细胞-细胞粘着和早期细胞衰老方面的缺陷介导。这些研究结果可用于在这个复杂疾病中指导干预试验。
除发现可个别地或以任何组合用于供间质性肺病的诊断、预后或其它评估或研究用的测定和试剂盒中的生物标记之外，先前未被认识到在间质性肺病的疾病过程中起作用的生物标记现在可被更详细地研究和/或用作用于发现疾病的其它调节剂或治疗剂的靶标。本公开的标记包括多态性：rs1379326、rs1881984、rs10936599、rs1997392、rs6793295、rs2609255、rs2853676、rs10484326、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs2301160、rs3829223、rs2857476、rs1278769、rs1007177、rs10518693、rs393152、rs12373139、rs17690703、rs2532274、rs2532269、rs2668692、rs169201、rs199533和rs415430。本公开的标记也包括以下基因的基因表达升高：TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3和C17orf69。
鉴于基因的名称，可获得(通过无论什么手段)蛋白质(在本文中也称为“完全蛋白质”；指示为“蛋白质”)和所述测量的蛋白质的其它肽片段，并且所述其它肽片段包括在本公开的范围内。本公开的方法可用于评估所列基因的表达产物的片段以及含有整个所列分子或其至少重大部分(例如测量的独特表位)的分子和标记的修饰形式。因此，所述片段、较大分子和修饰形式包括在本公开的范围内。
可通过常规技术来鉴定本公开的标记的同源物和等位基因。如本文所用，基因或多肽的例如来自人或其它动物的同源物与鉴定的基因或多肽具有高度结构和功能类似性。对本文鉴定的多肽标记的人和其它生物体同源物的鉴定将为本领域技术人员所熟悉。一般来说，核酸杂交是一种适于鉴定另一物种(例如人、母牛、绵羊)的对应于已知序列的同源序列的方法。标准核酸杂交程序可用于鉴定具有所选同一性百分比的相关核酸序列。举例来说，可构建自所选组织(例如结肠)的mRNA逆转录的cDNA文库，并且使用编码本文鉴定的多肽的核酸来筛选所述文库中的相关核苷酸序列。筛选优选是使用高严格性条件(在本文其它地方描述)来进行以鉴定就序列同一性来说密切相关的那些序列。可使如此鉴定的核酸翻译成多肽，并且可测试多肽的活性。
另外，本公开包括与本公开的标记具有大致上类似序列同一性的多核苷酸和多肽。如本文所用，两个多核苷酸或多肽在它们的氨基酸序列之间存在至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约95％序列同一性、至少约99％序列同一性或100％序列同一性时，或在多核苷酸(例如编码多肽的多核苷酸)能够在严格杂交条件下彼此形成稳定双链体时具有“大致上序列同一性”。在本公开的情形下，可检测标记基因中的遗传变体，即使所述标记基因具有超过一个遗传变异位点。也就是说，可通过测定包含遗传变体的标记基因的序列，以及与来自对照或对照群体的标记基因的序列进行比较来在例如来自怀疑患有间质性肺病的个体的测试样品中检测所选遗传变体。测试和对照全长标记基因序列可能包括超过一个遗传变体，并且因此可不同于彼此，即可不是100％同一的。技术人员将认识到可例如使用用以扩增标记基因的包括遗传变异位点的片段的PCR或互补于包括遗传变异位点的序列的探针来在小于全长标记基因序列的序列中检测遗传变体。当方面或实施方案涉及序列同一性时，序列同一性可关于如本文公开的序列的一部分(例如长度是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多个核酸碱基或氨基酸)。
可在多肽中进行保守性氨基酸取代以提供前述多肽的功能等效变体，即变体保留多肽的功能性能力。如本文所用，“保守性氨基酸取代”是指不改变其中进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或尺寸特征的氨基酸取代。可根据为本领域普通技术人员所知的用于改变多肽序列的方法制备变体。举例来说，在确定肽是间质性肺病相关多肽后，可对所述肽的氨基酸序列进行保守性氨基酸取代，并且仍然使多肽保留它的特异性抗体结合特征。另外，本领域技术人员将认识到等位基因变体和SNP将产生大致上类似的多肽和相同或大致上类似的多肽片段。
使用各个组的间质性肺病和非间质性肺病(例如“对照”)个体进行许多比较研究以鉴定标记。各表列出被发现以统计显著性存在或差异性表达的标记。因此，这些生物标记是对间质性肺病和疾病进展的指示。当在多个研究中发现多肽标记是统计显著的时，呈现与具有最高统计显著性的观察结果相关的数据。因此，在一个方面，本公开提供间质性肺病的多肽生物标记。在另一实施方案中，本公开提供与多肽标记具有大致上序列同一性的多肽。在另一实施方案中，本公开提供一种包含前述多肽或多核苷酸的分子。如本文所用，当化合物已与至少一种它与之天然相伴的组分分离时，它被称为“分离的”。举例来说，如果多肽与包括代谢物、多核苷酸和其它多肽的污染物分离，那么它可被视为分离的。分离的分子可合成制备或自它们的天然环境纯化。本领域中已知的标准定量方法可用于获得和分离本公开的分子。
一些变化在对标记的物理和化学特征的测量中是固有的。变化的幅度在一定程度上取决于分离手段的重现性以及用于进行测量的检测手段的特异性和灵敏性。优选地，用于测量标记的方法和技术是灵敏的和可重现的。
各表中显示的数据反映用于检测标记的方法。当如实施例中所述处理和分析样品时，标记的保留时间约为对标记陈述的值；也就是说，在陈述的值的约10％内，在陈述的值的约5％内，或在陈述的值的约1％内，并且标记具有约为对标记陈述的值的质量与电荷比率；也就是说，在陈述的值的约10％内，在陈述的值的约5％内，或在陈述的值的约1％内。
本公开的另一实施方案涉及一种测定系统，其包括用于检测在患有间质性肺病的个体中差异性表达的生物标记的表达的多种抗体或其抗原结合片段、或适体。多种抗体或其抗原结合片段、或适体由选择性结合在患有间质性肺病的个体中差异性表达的蛋白质，并且可使用抗体或适体检测为蛋白质产物的抗体或其抗原结合片段、或适体组成。此外，多种抗体或其抗原结合片段、或适体包括选择性结合由来自本文提供的各表的任何基因编码的蛋白质或其部分(肽)的抗体或其抗原结合片段、或适体。
本公开的某些实施方案利用已在本文中鉴定为在患有间质性肺病的受试者中存在或差异性表达的多种生物标记。如本文所用，术语“患者”、“患有间质性肺病的受试者”、“患有间质性肺炎的受试者”、“间质性肺病患者”、“间质性肺炎受试者”等意指已被诊断患有间质性肺病(例如IIP、IPF、FIP)的受试者。术语“非受试者”、“正常个体”、“未患有间质性肺病的受试者”等意指尚未被诊断患有间质性肺病的受试者。非间质性肺病受试者可为健康的，并且未患有其它疾病，或他们可患有除间质性肺病以外的疾病。
以上限制内的多种生物标记包括至少两种或更多种生物标记(例如至少2、3、4、5、6种等，以完整整数增量直至所有公开的生物标记)，并且包括所述生物标记的任何组合。所述生物标记选自本文提供的各表中所列的多态性或多肽以及由各表中所列的任何基因编码的多肽中的任一个。在一些实施方案中，用于本公开中的多种生物标记包括已被证明预测被诊断有或怀疑患有如间质性肺炎的间质性肺病的个体的显现或进展或临床结果的生物标记中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40种或全部。
本公开的多肽和多核苷酸标记适用于用以诊断间质性肺病，确定疾病的程度和/或严重性，监测疾病的进展、对疗法的应答和/或对肺移植的需要的方法中。标记也适用于用以治疗间质性肺病以及用于评估对疾病的治疗的功效的方法中。所述方法可在人和非人受试者中执行。标记也可用作药物组合物或用于试剂盒中。标记也可用于筛选调节它们的表达的候选化合物。标记也可用于筛选用于治疗间质性肺病的候选药物。所述筛选方法可在人和非人受试者中执行。
可通过本领域中已知的任何适合方法来分离多肽标记。可通过本领域中已知的标准方法(例如色谱法、离心、差异性溶解、免疫测定)来自天然来源纯化天然多肽标记。在一个实施方案中，可使用本文公开的色谱方法自血清样品分离多肽标记。在另一实施方案中，可通过使样品与基质结合的特异性结合标记的抗体或适体接触来自所述样品分离多肽标记。
多核苷酸标记可见于基因组DNA、cDNA或mRNA转录物中，并且可包括编码本公开的多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，本公开提供编码多肽标记或包含所述多肽的分子的多核苷酸。在另一实施方案中，本公开提供编码与多肽标记具有大致上序列同一性的多肽或包含所述多肽的分子的多核苷酸。
在另一实施方案中，本公开提供编码是标记的片段、前体、继体或修饰形式的多肽或包含所述多肽的分子的多核苷酸。
在另一实施方案中，本公开提供与编码是标记的片段、前体、继体或修饰形式的多肽或包含所述多肽的分子的多核苷酸具有大致上序列类似性的多核苷酸。两个多核苷酸在它们的氨基酸序列之间存在至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约95％序列同一性或至少99％序列同一性时，或在多核苷酸能够在严格杂交条件下彼此形成稳定双链体时具有“大致上序列同一性”。在本文其它地方描述所述条件。如以上关于多肽所述，本公开包括是等位基因变体，SNP的结果，或因为遗传密码的固有简并性而呈存在于天然物质中的密码子的替代性密码子形式的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核苷酸可用作间质性肺病的替代标记。因此，举例来说，如果间质性肺病受试者中的多肽标记的水平增加，那么可探询编码所述多肽标记的mRNA的增加而非所述多肽标记(例如以诊断受试者的间质性肺病)。
可通过本领域中已知的任何适合方法来分离多核苷酸标记。可通过本领域中已知的标准方法来自天然来源纯化天然多核苷酸标记。在一个实施方案中，可通过使混合物与基质结合的在杂交条件下互补于多核苷酸标记的探针接触来自所述混合物分离所述多核苷酸标记。
或者，可通过本领域中已知的任何适合化学或重组方法来合成多核苷酸标记。在一个实施方案中，举例来说，可使用有机化学的方法和技术合成标记。在另一实施方案中，可通过聚合酶链反应(PCR)来产生多核苷酸标记。
本公开也涵盖特异性结合本公开的多肽或多核苷酸标记的分子。在一个方面，本公开提供特异性结合多肽标记或多核苷酸标记的分子。如本文所用，术语“特异性结合”是指结合对(例如抗体和抗原或适体和它的靶标)之间的相互作用。在一些实施方案中，相互作用具有至多10-6摩尔/升、至多10-7摩尔/升、或至多10-8摩尔/升的亲和常数。在其它实施方案中，短语“特异性结合”是指一种蛋白质与另一蛋白质(例如抗体、其片段、或结合伴侣与抗原)特异性结合，其中如通过任何标准测定(例如免疫测定)测量的结合水平在统计上显著高于测定的本底对照。举例来说，当进行免疫测定时，对照通常包括含有单独抗体或抗原结合片段(即在不存在抗原下)的反应孔/管，其中由抗体或其抗原结合片段在不存在抗原下达成的反应性(例如与孔的非特异性结合)的量被视为本底。可使用本领域中多种标准方法，包括酶免疫测定(例如ELISA)、免疫印迹测定等测量结合。
结合分子包括抗体、适体和抗体片段。如本文所用，术语“抗体”是指能够结合存在于抗原上的表位的免疫球蛋白分子。所述术语意图不仅涵盖完整免疫球蛋白分子，如单克隆和多克隆抗体，而且也涵盖双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗特发性(抗ID)抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、融合蛋白和前述各物的包含具有所需特异性的抗原识别点的任何修饰形式。如本文所用，适体是对靶标具有合乎需要的作用的非天然存在的核酸。合乎需要的作用包括但不限于结合靶标、催化改变靶标、以改进/改变靶标或靶标的功能活性的方式与靶标反应、如以自杀抑制剂形式共价连接于靶标、促进靶标与另一分子之间的反应。在一些实施方案中，作用是对靶标分子的特异性结合亲和力，所述靶标分子是除通过主要取决于沃森/克里克碱基配对或三螺旋结合的机理结合核酸配体的多核苷酸以外的三维化学结构，其中核酸配体不是具有由靶标分子结合的已知生理功能的核酸。
在一个方面，本公开提供特异性结合SNP标记或包含前述组分的分子(例如包含由标记基因编码的多肽的蛋白质)的抗体或适体。
在另一实施方案中，本公开提供特异性结合与标记基因具有大致上序列同一性的多肽或包含前述多肽的分子的抗体或适体。
在另一实施方案中，本公开提供特异性结合在结构上不同于在本文提供的各表中明确鉴定的标记，但具有相同(或几乎相同)功能或性质的多肽标记或多核苷酸标记，或包含前述组分的分子的抗体或适体。
本公开的另一实施方案涉及用于检测在患有间质性肺炎的个体中差异性表达的生物标记的表达的多种适体、抗体或其抗原结合片段。多种适体、抗体或其抗原结合片段由选择性结合在患有间质性肺病的个体中差异性表达的蛋白质，并且可使用抗体检测为蛋白质产物的抗体或其抗原结合片段组成。此外，多种适体、抗体或其抗原结合片段包括选择性结合由来自本文提供的各表的任何基因编码的蛋白质或其部分(肽)的抗体或其抗原结合片段。
根据本公开，多种适体、抗体或其抗原结合片段是指至少2种，并且更优选至少3种，并且更优选至少4种，并且更优选至少5种，并且更优选至少6种，并且更优选至少7种，并且更优选至少8种，并且更优选至少9种，并且更优选至少10种等，以增量1直至任何适合数目的抗体或其抗原结合片段，在一些实施方案中，包括代表本文所述的所有生物标记的抗体或其抗原结合片段。
特异性结合本公开的多肽标记、多核苷酸标记的某些抗体已可为已知的，和/或可自商业来源购得。在任何情况下，本公开的抗体都可通过本领域中已知的任何适合手段来制备。举例来说，可通过用标记或其免疫原性片段(必要时缀合于载体)使动物宿主免疫来制备抗体。佐剂(例如弗氏佐剂(Freund’sadjuvant))任选可用于增加免疫应答。可接着自免疫的动物分离含有对抗原决定簇具有高亲和力的多克隆抗体的血清并纯化。
或者，可收集来自免疫的宿主的抗体产生性组织，并且可使自器官制备的细胞组织均浆融合于培养的癌细胞。可选择产生对标记具有特异性的单克隆抗体的杂交细胞。或者，可通过化学合成或通过重组表达来产生本公开的抗体。举例来说，编码抗体的多核苷酸可用于构建用于产生抗体的表达载体。也可使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法产生本公开的抗体。
特异性结合本公开的标记的抗体或适体可例如用于用以使用本领域中熟知的方法和技术检测本公开的生物标记的方法中。在一些实施方案中，举例来说，抗体被缀合于检测分子或部分(例如染料和酶)，并且可在ELISA或夹心式测定中用于检测本公开的标记。
在另一实施方案中，针对本公开的多肽标记或多核苷酸标记的抗体或适体可用于测定组织样品(例如薄皮质切片)中的标记。抗体或适体可特异性结合组织切片中存在的标记(如果有的话)，并且允许定位组织中的标记。类似地，用放射性同位素标记的抗体或适体可用于体内成像或治疗应用。
本公开的另一方面提供包含本公开的多肽或多核苷酸标记、对多肽或多核苷酸标记具有特异性的结合分子(例如抗体或适体)、多肽或多核苷酸标记的抑制剂、或可增加或降低多肽标记或多核苷酸标记的水平或活性的其它分子的组合物。所述组合物可为被配制来用作治疗剂的药物组合物。
或者，本公开提供一种包含是本发明的标记的片段、修饰形式、前体或继体的组分或包含前述组分的分子的组合物。
在另一实施方案中，本公开提供一种包含结合多肽的多核苷酸或包含前述多核苷酸的分子的组合物。
在另一实施方案中，本公开提供一种包含特异性结合多肽的抗体或适体或包含前述抗体或适体的分子的组合物。
用于检测遗传变体的方法
本公开也提供检测本公开的生物标记的方法。除非另外指示，否则本公开的实施采用属于本领域的技能的分析生物化学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法。所述技术充分说明于文献中。(参见例如Sambrook，J.等MolecularCloning：ALaboratoryManual.第3版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，2000；DNACloning：APracticalApproach，第I和II卷(D.Glover编)；OligonucleotideSynthesis(N.Gait编，当前版本)；NucleicAcidHybridization(B.Hames和S.Higgins编，当前版本)；TranscriptionandTranslation(B.Hames和S.Higgins编，当前版本)；CRCHandbookofParvoviruses，第I和II卷(P.Tijessen编)；FundamentalVirology，第2版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编))。
本发明方法不限于检测存在或不存在遗传变体(例如SNP)的任何特定方式，并且可采用任何适合方法来检测存在或不存在变体，其中众多检测方法在本领域中是已知的。动态等位基因特异性杂交(DASH)可用于检测遗传变体。DASH基因型分析利用由错配碱基对的不稳定性所致的DNA解链温度的差异。过程可被极大自动化，并且涵盖少许简单原理。因此，本文所述的方面和实施方案提供用于评估来自怀疑患有或显现间质性肺病(例如由于家族史)的受试者的样品(例如生物样品)中存在或不存在SNP的方法。在某些实施方案中，在来自受试者的一种或多种样品中筛选一种或多种SNP。SNP可与一种或多种基因，例如一种或多种如本文公开的与粘液分泌相关的基因或其它基因相关联。
通常，例如通过使用生物素化引物和色谱法来扩增靶标基因组区段并与非靶标序列分离。添加对特定等位基因具有特异性的探针至扩增产物中。探针可被设计来与变异序列或显性等位基因序列特异性杂交。探针可用在结合于双链DNA时发荧光的分子标记，或在所述分子存在下添加。接着随温度增加测量信号强度直至可确定Tm。非匹配序列(视探针设计而定是遗传变体或显性等位基因序列)将产生低于预期的Tm。
DASH基因型分析依赖于可定量Tm变化，并且因此能够测量许多类型的突变，而非仅仅SNP。DASH的其它益处包括它能够与无标记探针一起操作，并且它的设计和执行条件简单。
分子信标也可用于检测遗传变体。这个方法利用特定工程化单链寡核苷酸探针。设计寡核苷酸以使在各末端处存在互补区域，并且探针序列位于之间。这个设计允许探针在它的天然分离状态下采用发夹或茎-环结构。连接于探针的一个末端的是荧光团，并且连接于另一末端的是荧光淬灭剂。由于探针的茎-环结构，荧光团紧密邻近于淬灭剂，由此防止分子发射任何荧光。也使分子工程化以使仅探针序列互补于靶向的基因组DNA序列。
如果在测定期间分子信标的探针序列遇到它的靶标基因组DNA序列，那么它将退火并杂交。由于探针序列的长度，探针的发夹区段将被变性，从而有利于形成更长、更稳定探针-靶标杂交物。这个构象变化允许荧光团和淬灭剂摆脱它们的归因于发夹缔合的紧密邻近，从而允许分子发荧光。
如果在另一方面，探针序列遇到具有少至一个非互补核苷酸的靶标序列，那么分子信标将优先保持它的天然发夹状态，并且将无荧光被观察到，因为荧光团保持被淬灭。这些分子信标的独特设计允许以简单诊断测定来在给定位置处鉴定SNP。如果一分子信标被设计来匹配野生型等位基因，并且另一分子信标被设计来匹配等位基因的突变体，那么两者可用于鉴定个体的基因型。如果在测定期间仅检测到第一探针的荧光团波长，那么个体对于野生型是纯合的。如果仅检测到第二探针的波长，那么个体对于突变等位基因是纯合的。最后，如果检测到两种波长，那么两种分子信标均必定与它们的互补序列杂交，并且因此个体必定含有两种等位基因，且是杂合的。
微阵列也可用于检测遗传变体。几十万个探针可被排列在小芯片上，从而允许同时探询许多遗传变体或SNP。因为SNP等位基因仅在一个核苷酸方面不同，并且因为难以达成阵列上所有探针的最优杂交条件，所以靶标DNA有可能与错配探针杂交。这可通过使用若干冗余探针来探询各SNP加以解决。探针可被设计来在若干不同位置中具有SNP位点以及含有与SNP等位基因的错配。通过比较靶标DNA与这些冗余探针中的每一个的差异性杂交量，有可能确定特定纯合和杂合等位基因。
限制片段长度多态性(RFLP)可用于检测遗传变体和SNP。RFLP利用许多不同限制核酸内切酶以及它们对独特和特定限制位点的高亲和力。通过对基因组样品进行消化以及通过凝胶测定确定片段长度，有可能确定酶是否切割预期限制位点。未能切割基因组样品会产生可识别地大于预期的片段，从而暗示在限制位点的地点处存在致使它被保护免遭核酸酶活性的突变。
基于PCR和扩增的方法可用于检测遗传变体。举例来说，四引物PCR采用两对引物来在一个PCR反应中扩增两种等位基因。设计引物以使两个引物对在SNP位置处重叠，但各自完全匹配于仅一种可能的等位基因。因此，如果给定等位基因存在于PCR反应中，那么对那个等位基因具有特异性的引物对将产生产物，而非具有不同等位基因序列的替代性等位基因。可设计两个引物对以使它们的PCR产物具有显著不同长度，从而允许通过凝胶电泳可易于区分条带，或以使它们被差异性标记。
引物延伸也可用于检测遗传变体。引物延伸首先涉及使探针与紧靠SNP核苷酸的上游的碱基杂交，继之以进行‘小型测序’反应，其中通过添加互补于SNP核苷酸的碱基，DNA聚合酶使杂交的引物延伸。检测的并入碱基确定存在或不存在SNP等位基因。因为引物延伸是基于高度准确的DNA聚合酶，所以方法通常极其可靠。引物延伸能够在极其类似反应条件下分析大多数SNP的基因型，从而使得它也具有高度灵活性。引物延伸方法用于许多测定形式中，并且可使用例如荧光标记或质谱测定法来检测。
引物延伸可涉及并入荧光标记的ddNTP或荧光标记的脱氧核苷酸(dNTP)。关于ddNTP，探针与紧靠SNP核苷酸的上游的靶标DNA杂交，并且添加互补于SNP等位基因的单一ddNTP至探针的3’末端(二脱氧核苷酸中遗漏3′-羟基会防止其它核苷酸被添加)。各ddNTP用不同荧光信号标记，从而允许在同一反应中检测所有四种等位基因。关于dNTP，等位基因特异性探针具有互补于所探询的各SNP等位基因的3’碱基。如果靶标DNA含有互补于探针的3’碱基的等位基因，那么靶标DNA将与探针完全杂交，从而允许DNA聚合酶自探针的3’末端延伸。这是通过将荧光标记的dNTP并于探针的末端上来检测。如果靶标DNA不含有互补于探针的3’碱基的等位基因，那么靶标DNA将在探针的3’末端处产生错配，并且DNA聚合酶将不能够自探针的3′末端延伸。
SNP基因型分析方法采用略微不同的方法，并且依赖于通过质谱仪来检测。以使得可扩增和分析PCR混合物中的许多不同SNP测定物的方式设计延伸探针。延伸反应使用如上ddNTP，但检测SNP等位基因取决于延伸产物的实际质量而非荧光分子。这个方法用于低通量至中等高通量，并且不意图用于完整基因组扫描。
然而，引物延伸方法可经受高通量分析。引物延伸探针可被排列在玻片上，从而允许同时分析许多SNP的基因型。广泛地被称为阵列化引物延伸(APEX)，这个技术具有超过基于探针差异性杂交的方法的若干益处。相比较来说，APEX方法比使用差异性杂交的方法具有更大辨别力，因为常不可能获得DNA微阵列上数千探针的最优杂交条件(通常这通过具有高度冗余的探针来解决)。
寡核苷酸连接测定也可用于检测遗传变体。DNA连接酶催化DNA片段的3′末端连接于紧邻DNA片段的5′末端。这个机理可用于通过以下方式来探询SNP：历经SNP多态性位点使两种探针直接杂交，借此如果探针与靶标DNA同一，那么可发生连接。举例来说，可设计两种探针；等位基因特异性探针与靶标DNA杂交以使它的3′碱基历经SNP核苷酸直接定位，并且第二探针与SNP多态性位点的模板上游(互补链中的下游)杂交，从而提供连接反应的5′末端。如果等位基因特异性探针与靶标DNA匹配，那么它将与靶标DNA完全杂交，并且可发生连接。连接通常不发生在存在错配3′碱基下。可通过凝胶电泳、MALDI-TOF质谱测定法，或通过毛细管电泳来检测连接或未连接的产物。
TaqDNA聚合酶的5’-核酸酶活性可用于检测遗传变体。测定是与PCR反应同时进行，并且结果可被实时读取。测定需要将扩增包括SNP多态性位点的区域的正向和反向PCR引物。等位基因辨别是使用FRET以及一种或两种与SNP多态性位点杂交的等位基因特异性探针达成。探针具有连接于它们的5’末端的荧光团和连接于它们的3’末端的淬灭剂分子。尽管探针是完整的，但淬灭剂将保持紧密邻近于荧光团，从而消除荧光团的信号。在PCR扩增步骤期间，如果等位基因特异性探针完全互补于SNP等位基因，那么它将结合靶标DNA链，接着当Taq聚合酶自PCR引物延伸DNA时，由Taq聚合酶的5’-核酸酶活性降解。探针的降解导致荧光团与淬灭剂分子分开，从而产生可检测信号。如果等位基因特异性探针不完全互补，那么它将具有较低解链温度，并且不同样高效结合。这防止核酸酶作用于探针。
福斯特共振能量转移(FRET)检测可用于在其中使两种标记彼此紧密邻近的引物延伸和连接反应中进行检测。它也可用于5′-核酸酶反应、分子信标反应、以及其中相邻供体/接受体对是通过裂解或破坏将它们固持在一起的茎-环结构来分开的侵袭性裂解反应中。当满足两个条件时发生FRET。首先，荧光供体染料的发射光谱必须与接受体染料的激发波长重叠。其次，两种染料必须彼此紧密邻近，因为能量转移随距离快速减弱。邻近性要求是使得FRET成为一种用于许多等位基因辨别机理的良好检测方法的要素。
多种染料可用于FRET，并且在本领域中是已知的。最常见的染料是荧光素、花青染料(Cy3至Cy7)、若丹明染料(例如若丹明6G)、Alexa系列染料(Alexa405至Alexa730)。这些染料中的一些已用于FRET网络(具有多种供体和接受体)中。用于使所有这些染料成像的光学器件需要自UV至近IR进行检测(例如Alex405至Cy7)，以及Atto系列染料(Atto-TecGmbH)。来自Invitrogen的Alexa系列染料涵盖完整光谱范围。它们是极其明亮和光稳定的。
用于FRET标记的示例性染料对包括Alexa-405/Alex-488、Alexa-488/Alexa-546、Alexa-532/Alexa-594、Alexa-594/Alexa-680、Alexa-594/Alexa-700、Alexa-700/Alexa-790、Cy3/Cy5、Cy3.5/Cy5.5、和若丹明-绿/若丹明-红等。也可使用荧光金属纳米粒子，如银和金纳米团簇(Richards等(2008)JAmChemSoc130：5038-39；Vosch等(2007)ProcNatlAcadSciUSA104：12616-21；Petty和Dickson(2003)JAmChemSoc125：7780-81)。可用的滤光片、二向色镜、多向色镜和激光器可影响对染料的选择。
用于检测标记，包括多核苷酸和多肽表达水平的方法
可通过为本领域技术人员所知的任何方法来检测本公开的标记，所述方法包括不限于LC-MS、GC-MS、免疫测定、杂交和酶测定。检测可为定量的或定性的。广泛多种常规技术是可用的，包括质谱测定法、色谱分离、2-D凝胶分离、结合测定(例如免疫测定)、竞争性抑制测定等。本领域中用于测量多肽或多核苷酸的存在/不存在、水平或活性的任何有效方法都包括在本公开中。属于本领域普通技术人员的能力的是确定哪个方法将最适于测量特定标记。因此，举例来说，ELISA测定可充分适于在医师的办公室中使用，而需要更精密仪器的测量可充分适于在临床实验室中使用。无论所选方法如何，重要的是测量结果是可重现的。
可通过允许以高灵敏度和可重现性直接测量分析物的质谱测定法来测量本公开的标记。许多质谱测定方法是可用的。电喷雾离子化(ESI)例如允许定量一种样品相对于另一样品的各种物质的相对浓度的差异；通过标准化技术(例如使用内部标准物)，绝对定量是可能的。基质辅助激光解吸离子化(MALDI)或相关技术(Ciphergen，Inc.)也可用于确定标记是否存在以及所述标记的相对或绝对水平。允许进行飞行时间(TOF)测量的质谱仪具有高准确度和分辨率，并且能够测量低丰度物质，甚至在如血清或CSF的复杂基质中。
对于蛋白质标记，定量可基于衍生化与称为同位素编码的亲和标签(“ICAT”)的同位素标记组合。在这个和其它相关方法中，两个样品中的特定氨基酸被差异性和同位素标记，并且随后通过固相捕集、洗涤和释放来自肽本底分离。可接着相对于彼此准确定量来自两种来源的具有不同同位素标记的分子的强度。定量也可基于通过掺加与所测量的肽或蛋白质类似的同位素标记的肽或蛋白质进行的同位素稀释方法。此外，也可使用分析物的直接强度与类似基质中的标准物的另一测量结果进行比较，在无同位素标准物下确定定量。
此外，一维和二维凝胶已用于分离蛋白质，并且通过银染色、荧光或放射性标记来定量凝胶斑点。这些差异性染色的斑点已使用质谱测定法加以检测，并且通过串联质谱测定技术加以鉴定。
在一个实施方案中，使用与分离技术关联的质谱测定法，如液相色谱法-质谱测定法或气相色谱法-质谱测定法测量标记。具体来说，使反相液相色谱法与高分辨率、高质量准确度ESI飞行时间(TOF)质谱分析法联用允许测量来自相对少量任何复杂生物材料的许多生物分子的光谱强度。以这个方式分析样品允许确定和定量标记(通过特定RT和m/z来表征)。
如将由本领域技术人员所了解，许多其它分离技术可与质谱测定法关联使用。举例来说，可商购获得分离柱的广泛选择物。此外，可使用定制色谱表面(例如其上已固定标记特异性试剂的珠粒)进行分离。随后可洗脱保留在介质上的分子以通过质谱测定法来分析。
通过液相色谱法-质谱测定法进行的分析产生质量强度光谱，其峰代表样品的各种组分，各组分具有特征性质量与电荷比率(m/z)和保留时间(RT)。存在具有标记的m/z和RT的峰指示存在所述标记。可将代表标记的峰与来自另一光谱(例如来自对照样品)的相应峰进行比较以获得相对测量结果。当需要定量测量时，可使用本领域中的任何标准化技术(例如内部标准物)。“解卷积”软件可用于分开重叠峰。保留时间在某种程度上取决于用于进行液相色谱法分离的条件。实施例中阐述适合条件，即用于获得各表中出现的保留时间的条件。质谱仪优选提供高质量准确度和高质量分辨率。良好校正的MicromassTOF仪器的质量准确度例如据报道是约5mDa，其中分辨率m/Δm超过5000。
在一些实施方案中，可使用标准免疫测定，如使用匹配抗体对和化学发光检测进行的夹心式ELISA来测定标记的水平。通常使用可商购获得或定制的单克隆或多克隆抗体。然而，测定可被改适来供与特异性结合标记的其它试剂一起使用。标准方案和数据分析用于自测定数据确定标记浓度。
以上论述的许多测定采用特异性结合标记的试剂。能够特异性结合标记的任何分子都包括在本公开内。在一些实施方案中，结合分子是抗体或抗体片段。在其它实施方案中，结合分子是非抗体物质，如适体。因此，举例来说，结合分子可为标记是其底物的酶。结合分子可识别靶向的标记的任何表位。
如上所述，可通过本领域中接受的任何方法来鉴定和产生结合分子。用于鉴定和产生对分析物具有特异性的抗体和抗体片段的方法是熟知的。用于鉴定结合分子的其它方法的实例包括用随机肽文库进行的结合测定(例如噬菌体展示)和基于对标记的结构的分析的设计方法。
也可使用本领域中已知的许多化学衍化或反应技术来检测或测量本公开的标记。用于所述技术中的试剂在本领域中是已知的，并且可商购获得以用于某些类别的靶标分子。
最后，上述色谱分离技术也可与除质谱测定法以外的分析技术联用，所述分析技术如荧光检测标记的分子、NMR、毛细管UV、蒸发光散射或电化学检测。
可通过本领域中已知的任何方法来测量本公开的RNA或蛋白质标记的相对量(参见例如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning：ALaboratoryManual.第2版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989；以及CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等编JohnWiley&Sons：1992)。用于RNA检测的典型方法包括自细胞或组织样品提取RNA，随后使对靶标RNA具有特异性的标记的探针(例如互补多核苷酸)与提取的RNA杂交，以及检测探针(例如RNA印迹)。用于蛋白质检测的典型方法包括自细胞或组织样品提取蛋白质，随后使对靶标蛋白质具有特异性的标记的探针(例如抗体)与蛋白质样品杂交，以及检测探针。标记基团可为放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。除为本领域技术人员所熟知的许多其它技术之外，也可通过凝胶电泳、柱色谱法、直接测序或定量PCR(在多核苷酸的情况下)来评估对特定蛋白质和多核苷酸的检测。
可使用本领域中已知的任何方法来对本公开的标记基因的全部或一部分的存在或拷贝数进行检测。通常，便于通过DNA分析来评估DNA或cDNA的存在和/或量，其中提取来自细胞或组织样品的总DNA，使其与标记的探针(例如互补DNA分子)杂交，并且检测探针。标记基团可为放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。其它适用DNA检测和/或定量方法包括直接测序、凝胶电泳、柱色谱法和定量PCR，如由本领域技术人员所知。
可通过单链核酸与互补或部分互补序列之间的杂交来评估多核苷酸类似性。所述实验在本领域中是熟知的。如本文提及的高严格性杂交和洗涤条件是指允许分离与用于在杂交反应中探测的核酸分子具有至少约80％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即允许约20％或更少核苷酸错配的条件)。
如本文提及的极高严格性杂交和洗涤条件是指允许分离与用于在杂交反应中探测的核酸分子具有至少约90％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即允许约10％或更少核苷酸错配的条件)。如上所讨论，本领域技术人员可使用Meinkoth等(同上)中的公式来计算适于达成这些特定核苷酸错配水平的杂交和洗涤条件。所述条件将随形成DNA：RNA或DNA：DNA杂交物而变化。DNA：DNA杂交物的计算解链温度比DNA：RNA杂交物的计算解链温度小10℃。在特定实施方案中，DNA：DNA杂交物的严格杂交条件包括在约20℃与约35℃之间(较低严格性)，更优选在约28℃与约40℃之间(更严格)，并且甚至更优选在约35℃与约45℃之间(甚至更严格)的温度下在离子强度6×SSC(0.9MNa+)下，以适当洗涤条件进行杂交。在特定实施方案中，DNA：RNA杂交物的严格杂交条件包括在约30℃与约45℃之间，更优选在约38℃与约50℃之间，并且甚至更优选在约45℃与约55℃之间的温度下在离子强度6×SSC(0.9MNa+)下，以类似严格洗涤条件进行杂交。这些值是基于对大于约100个核苷酸的分子的解链温度、0％甲酰胺和约40％的G+C含量的计算结果。或者，可如Sambrook等(上文)第9.31至9.62页中所阐述凭经验计算Tm。一般来说，洗涤条件应尽可能严格，并且应适于所选杂交条件。举例来说，杂交条件可包括盐和温度条件(低于特定杂交物的计算Tm约20-25℃)的组合，并且洗涤条件通常包括盐和温度条件(低于特定杂交物的计算Tm约12-20℃)的组合。适于与DNA：DNA杂交物一起使用的杂交条件的一个实例包括在约42℃下于6×SSC(50％甲酰胺)中杂交2-24小时，继之以包括在室温下于约2×SSC中洗涤一次或多次的洗涤步骤，继之以在较高温度和较低离子强度下额外洗涤(例如在约37℃下于约0.1×-0.5×SSC中洗涤至少一次，继之以在约68℃下于约0.1×-0.5×SSC中洗涤至少一次)。其它杂交条件以及例如关于核酸阵列最适用的杂交条件将为本领域技术人员所知。
诊断、监测和治疗间质性肺病
本公开包括诊断间质性肺病，如间质性肺炎、特发性间质性肺炎、家族性间质性肺炎、特发性肺纤维化等，将患者在不同类型的间质性肺病之间分层，和/或排除导致类似症状以及在胸部放射照片上显示类似异常的其它类型的肺病的方法以及相关方法。一般来说，预期本文所述的生物标记将与间质性肺病的其它征象、症状和临床测试(如放射照片、肺组织的病理学评估、或文献中报道的间质性肺病生物标记)组合加以测量。同样，可组合测量超过一种本公开的生物标记。连同本领域中已知的任何其它标记(包括本文未明确列出的那些)一起测量本公开的生物标记属于本公开的范围。适于这个实施方案的标记包括已被鉴定为相较于来自正常或对照样品的样品，在自生物样品，并且尤其肺样品获得的样品中存在或增加的那些。适于这个实施方案的其它标记包括所述标记的片段、前体、继体和修饰形式，与所述标记具有大致上序列同一性的多肽。适于这个实施方案的其它标记将为本领域技术人员鉴于本文公开内容而显而易知。
术语“间质性肺病”或“ILD”在本文中是根据它在本领域中的普通和平常含义加以使用。间质性肺病是影响间质的肺病。ILD的特征可在于呼吸短促、长期咳嗽、疲劳和虚弱、食欲不振和/或损失快速。当本文中的一方面或实施方案涉及ILD时，所述ILD可为IIP。当本文中的一方面或实施方案涉及ILD时，所述ILD可为FIP。当本文中的一方面或实施方案涉及ILD时，所述ILD可为IPF。当本文中的一方面或实施方案涉及ILD时，所述ILD可为IIP。其它纤维化肺病包括急性间质性肺炎(AlP)、呼吸性细支气管炎相关的间质性肺病(RBILD)、脱屑性间质性肺炎(DIP)、非特异性间质性肺炎(NSIP)、闭塞性细支气管炎伴有机化性肺炎(BOOP)。AIP是一种快速进行性且在组织学上不同的间质性肺炎形式。病理学样式是扩散肺泡损害(DAD)的有机化性形式，此也见于急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和病因已知的其它急性间质性肺炎中(参见ClinicalAtlasofInterstitialLung Disease(2006版)第61-63页)。
RBILD的特征在于吸烟者的呼吸性细支气管的炎症性病变。RBILD的组织学外观的特征在于色素沉着的巨噬细胞在呼吸性细支气管和周围空间内积累；可变地，支气管周纤维化肺泡隔膜增厚；以及最小相关的附壁炎症(参见Wells等(2003)SemRespir.Crit.CareMed.第24卷)。
DIP是一种特征在于巨噬细胞在肺泡间隙中大量积累，伴有间质性炎症和/或纤维化的罕见间质性肺病。巨噬细胞常含有浅棕色色素。淋巴结节是常见的，稀疏但独特的嗜酸性粒细胞浸润也是常见的。DIP最常见于吸烟者中(参见Tazelaar等(2010年9月21日)Histopathology)。
NSIP的病理学特征在于历经短暂时期显现均一间质性炎症和纤维化。NSIP不同于其它间质性肺病，因为它具有大体上良好的预后。此外，NSIP中所见的实质变化的颞叶均一性与通常间质性肺炎的颞叶异质性形成极大对比(参见Coche等(2001)BritJRadio174：189)。
不同于NSIP，BOOP可在首次急性症状的数天内具有致命性。它的特征在于急性呼吸窘迫综合征的快速发作；因此，在临床上，快速进行性BOOP可难以与急性间质性肺炎区分。组织学特征包括形成肉芽组织并堵塞远端气道和肺泡间隙的单核炎症性细胞的群集。肉芽组织的这些堵塞物可形成在肺泡管内迁移的息肉，或可集中附着于壁。(参见White和Ruth-Saad(2007)Crit.CareNurse27：53)。
关于这些疾病的可用特征和疗法的其它细节可例如见于美国肺联合会的在lungusa.org/lung-disease/pulmonary-fibrosis处的网站上。肺病症的诊断指示包括活检(例如VATS或手术肺活检)、高分辨率计算机断层摄影术(HRTC)或呼吸量度，如用力呼气量(FEV1)、肺活量(VC)、用力肺活量(FVC)和FEV1/FVC。
特发性间质性肺炎(IIP)可包括特发性肺纤维化和家族性间质性肺炎(FIP)。特发性间质性肺炎(IIP)是一个子组的病因未知的弥漫性间质性肺病(术语“特发性”指示起源未知)。IIP的特征在于间质区室(即肺实质的夹在上皮基底膜与内皮基底膜之间的部分)的膨胀，伴有浸润。浸润可伴有呈异常胶原蛋白沉积或能够合成胶原蛋白的成纤维细胞的增生形式的纤维化。
特发性肺纤维化(IPF)发生在全世界数千人中，其中历经过去10年发病率加倍。IPF的发作发生在约50至70岁，并且以进行性呼吸短促和低血氧症起始。IPF中值存活期是约3-5年。病状的病因和发病机理未被充分了解。所有IPF病例中的约5-20％具有家族史，并且遗传似乎是常染色体显性的。
本文提供用于确定受试者是否患有间质性肺病的方法。在另一方面，本公开提供用于诊断受试者的间质性肺病的方法。这些方法包括自怀疑患有间质性肺炎，或处于显现间质性肺病的风险中的受试者获得生物样品，检测所述样品中的一种或多种生物标记的存在或水平或活性，以及将结果与自对照或正常受试者获得的样品中的标记的存在、水平或活性，或与参照范围或值进行比较。如本文所用，术语“生物样品”包括来自任何体液或组织(例如粘液、全血、外周血液单核细胞(PBMC)、血清、血浆、血液、脑脊髓液、尿、唾液、肺组织)的样品。
本领域技术人员将了解血液样品或面颊拭擦物预期携带与肺细胞相同的遗传序列信息。对于检测给定表达水平，通常使用肺组织样品和其它生物流体。生物样品可包括肺粘膜样品或生物流体，如血液或血液组分(血浆、血清)、痰、粘液、尿、唾液等。可使用本领域中已知的方法(例如支气管上皮刷或呼出的呼吸冷凝物)获得肺粘膜样品。其它方法包括支气管活检、支气管洗涤、支气管肺泡灌洗、完整肺灌洗、经内镜活检、经喉镜导管和经气管洗涤。Busse等(2005)AmJRespirCritCareMed172：807-816中提供对通常使用的技术的综述，包括比较和安全问题。对于灌洗技术，支气管镜可被插入至气道的所需程度。释放小体积的无菌生理可接受的流体(例如缓冲盐水)，并且立刻吸出。洗涤材料含有来自粘膜和上部上皮的细胞(Riise等(1996)EurRespJ9：1665)。对于使用支气管上皮刷，可使用无菌非刺激性(例如尼龙)细胞学刷。可采用多次刷拂以确保代表性取样。接着将刷于生理可接受的流体中搅动，并且使用常规方法分离细胞和碎片(Riise等(1992)EurRespJ5：382)。可使用本领域中已知的方法，例如离心来分离细胞组分。类似地，可使用已知方法或商业分离产品(可自BioCat，SystemBio，Bioscientific，etc.获得)分离亚细胞组分(例如外体或囊泡)。一示例性方法例如由Thery等(2006)CurrentProt.CellBiol所述。
通常，标准生物标记水平或参照范围是通过测量一组正常对照中的相同一种标记或多种标记来获得。测量标准生物标记水平或参照范围无需同时进行；其可为历史测量。优选地，使正常对照关于某一(一些)属性(例如年龄)来匹配于个体。视测量的水平与标准水平或参照范围之间的差异而定，个体可被诊断为患有间质性肺病或未患有间质性肺病。在一些实施方案中，如果个体样品中的一种或多种生物标记的表达水平与一种或多种已与间质性肺病相关联的生物标记的表达水平的类似性在统计上大于与一种或多种生物标记的已与正常对照相关联的表达水平的类似性，那么在个体中确诊间质性肺病。
目前被称为间质性肺病的肺病包括许多相关但可区分的病状。可进行分类，并且这些类型可被进一步区分为亚型。间质性肺病的各种形式中的任何和所有都意图在本公开的范围内。实际上，通过提供一种用于基于生物标记测量水平来亚设置个体的方法，本公开的组合物和方法可用于揭示和定义疾病的各种形式。
本公开的方法可独立于其它信息而用于进行间质性肺炎诊断，所述信息如个体的症状或其它临床或副临床测试的结果。然而，本公开的方法可连同所述其它数据点一起使用。
因为诊断很少仅基于单一测试的结果，所以方法可用于基于生物标记的测量水平与标准水平或参照范围之间的差异来确定受试者是否比未患有间质性肺病更可能患有间质性肺病，或比患有另一疾病更可能患有间质性肺病。因此，举例来说，鉴于通过本公开的方法提供的信息，具有推定间质性肺病诊断的个体可被诊断为“更可能”患有间质性肺病，或患有间质性肺病的“可能性较小”。如果测量多种生物标记，那么对于受试者被诊断为患有(或更可能患有)间质性肺病，至少一种，并且直至所有测量的生物标记必须在适当方向上有差异。在一些实施方案中，所述差异是统计显著的。
生物样品可为任何组织或流体，包括血清或组织样品，但可使用其它生物流体或组织。可能的生物流体包括但不限于粘液、全血、外周血液单核细胞(PBMC)、血浆、尿、唾液和肺组织。在一些实施方案中，可将标记的水平与不同组织、流体或生物“区室”中的另一标记或某一其它组分的水平进行比较。因此，可对组织和血清中的标记进行差异性比较。也在本公开的范围内的是将标记的水平与相同区室内的另一标记或某一其它组分的水平进行比较。
如将为本领域普通技术人员显而易知，以上描述不限于对间质性肺病进行初始诊断，而且也可适用于确认对间质性肺病的临时诊断或“排除”所述诊断。此外，自怀疑患有间质性肺病，或处于显现间质性肺病的风险中(例如具有遗传倾向性)的受试者获得的样品中的标记的水平或活性增加或降低指示所述受试者患有间质性肺病或处于显现间质性肺病的风险中。
基于诊断，从业者可进一步确定间质性肺病的治疗过程。疗法选项是有限的，但可包括缓解性措施、解充血剂、止痛剂、免疫抑制、肺移植。此外，基于本公开，治疗可包括旨在使公开的生物标记的表达降低或修正至更正常水平的靶向基因或抗体疗法。视对受试者的持续监测，例如目前公开的生物标记的表达水平的测量结果，或如放射学、氧容量、舒适性程度等的其它量度而定，可随时间调整治疗。
本公开也提供一种用于确定受试者显现间质性肺病的风险的方法，所述方法包括自受试者获得生物样品，检测所述样品中的标记的存在、水平或活性，以及将结果与自非间质性肺病受试者获得的样品中的所述标记的存在、水平或活性，或与参照范围或值进行比较，其中所述标记的存在或增加或降低与显现间质性肺病的风险相关联。
本公开也提供用于确定间质性肺病的时期或严重性的方法，所述方法包括自受试者获得生物样品，检测所述样品中的标记的存在、水平或活性，以及将结果与自正常或对照受试者获得的样品中的所述标记的存在、水平或活性，或与参照范围或值进行比较，其中所述标记的存在或增加或降低与疾病的时期或严重性相关联。
在另一方面，本公开提供用于监测患有间质性肺病的受试者的疾病的进展的方法，所述方法包括自受试者获得第一生物样品，检测所述样品中的标记的水平或活性，以及将结果与在稍后时间自所述受试者获得的第二样品中的所述标记的水平或活性，或与参照范围或值进行比较，其中所述标记的增加与疾病的进展相关联。
一种或多种基因标记的测量值的升高方面的显著差异指示个体患有(或更可能患有间质性肺病，或处于患有间质性肺病的风险中，或处于显现间质性肺病的风险中，或处于显现进行性间质性肺病的风险增加下)间质性肺病。如果仅测量一种生物标记，那么那个值必须增加以指示间质性肺病。如果测量超过一种生物标记，那么可通过仅一种生物标记、所有生物标记、或在之间的任何数目的生物标记的变化来指示对间质性肺炎的诊断。在一些实施方案中，测量多种标记，并且通过多种标记的变化来指示对间质性肺病的诊断。举例来说，一组标记可包括相较于非间质性肺病受试者样品，在间质性肺病受试者样品中的水平或活性增加的标记。测量结果可为(i)本公开的生物标记，(ii)本公开的生物标记和已知与间质性肺病相关的另一要素(例如CT扫描)；(iii)本公开的多种生物标记，(iv)包含至少一种本公开的生物标记和至少一种文献中报道的生物标记的多种生物标记；(v)本公开的一种生物标记或多种生物标记和至少一种可包括个体的年龄、病理学评估结果的临床共变量，和(vi)前述事项的任何组合。此外，生物标记水平的变化量可为对相对疾病进展可能性的指示。
可通过本领域中已知的任何适合方法(例如免疫测定、杂交测定)来在自受试者获得的任何生物样品中检测标记。优选地，在自个体获得的全血的样品中检测标记。
在本公开的一替代性实施方案中，提供一种用于随时间监测个体的间质性肺病以确定疾病是否进展的方法。用于执行这个实施方案的特定技术类似于上述实施方案中使用的那些。方法是通过以下方式来执行：在某一时间(t1)自受试者获得生物样品，如血清或肺组织；测量所述生物样品中的至少一种生物标记的水平；以及将测量水平与在较早时间(t0)关于自所述受试者获得的生物样品测量的水平进行比较。视测量水平之间的差异而定，可观察到标记水平历经间隔(t1-t0)已增加、降低或保持恒定。标记在指示间质性肺炎的方向上的另一偏差或其它增加的间质性肺病标记的测量结果将表明疾病在间隔期间进展。可根据需要历经时间范围t2至tn多次进行随后样品获取和测量。
能够通过进行连续标记水平测定来监测个体将代表一种有价值的临床工具。胜于通过单一测试提供的有限“快照(snapshot)”，所述监测将揭示标记水平随时间的趋势。除指示疾病的进展之外，追踪个体中的标记水平可用于预测恶化或指示疾病的临床过程。举例来说，如将为本领域技术人员显而易知，可进一步探究本公开的生物标记以区分任何或所有已知形式的间质性肺病或疾病的任何稍后描述类型或亚型。此外，可关于将间质性肺病与其它疾病区分或预测复发或缓解来进一步探究本公开的任何方法的灵敏性和特异性。
以类似方式，可鉴于本公开的测定结果来评估或再评估药物或药物组合的施用。举例来说，可向不同受试者群体差异性施用药物，并且分析对应于施用的测量结果以确定本发明生物标记标志在药物施用之前和之后的差异是否是显著的。由不同药物方案所致的结果也可彼此直接进行比较。或者，测定结果可指示一种药物方案超过另一方案的合乎需要性，或指示特定药物方案应或不应向间质性肺炎个体施用。在一个实施方案中，本公开的标记基因在间质性肺病个体中的水平升高的研究结果指示不良预后。在另一实施方案中，本公开的标记基因在间质性肺病个体中不存在水平升高指示良好预后。
在另一方面，本公开提供用于筛选在间质性肺病的治疗中用作治疗性化合物的候选化合物的方法。在一个实施方案中，方法包括筛选候选化合物中的在向来自其的肺样品已显示具有升高水平的本公开的标记的间质性肺病患者施用之后提供临床进展的那些。
以类似方式，本公开的标记可用于评估治疗干预在受试者中的功效。上述相同方法将在第二测量之前(即在t0之后以及在t1之前)使用，例外之处是将开始适合治疗，或将改变进行中的治疗。治疗可为任何治疗干预，如药物施用、饮食限制或手术，并且可历经如适于干预的任何时期遵循任何适合时程。可接着比较之前和之后的测量结果以确定治疗是否具有作用。如将由本领域技术人员所了解，测定可被其它叠加过程(例如在相同时期期间疾病恶化)搞混乱。
在另一实施方案中，标记可用于例如在临床试验中筛选候选药物以确定候选药物是否有效治疗间质性肺病。在时间t0，自被诊断有间质性肺炎的受试者的群体中的各受试者获得生物样品。接着，对各受试者的样品进行测定以测量生物标记的水平。在一些实施方案中，仅监测单一标记，而在其它实施方案中，监测标记的组合，直至本文提供的总体数目的标记。接着，向相同受试者群体的一部分或子群体施用预定剂量的候选药物。药物施用可历经任何时期遵循任何适合时程。在一些情况下，向子群体内的不同受试者施用不同剂量，或通过不同途径来施用药物。在药物施用之后，在时间t1，自子群体获取生物样品，并且如先前所进行对生物样品进行相同测定以获得测量值。如前所述，可根据需要历经时间范围t2至tn多次进行随后样品获取和测量。在所述研究中，受试者群体的不同子群体充当向其施用安慰剂的对照组。接着使对照组遵循相同程序：获得生物样品，处理样品，以及测量生物标记以获得测量图表。
也可考查特定剂量和递送途径。通过以下方式来执行方法：在指定剂量或递送途径下向患有间质性肺病的受试者施用候选药物；自所述受试者获得生物样品，如血清或组织；测量所述生物样品中的每一个中的至少一种生物标记的水平；以及将各样品的测量水平与其它样品和/或标准水平进行比较。通常，通过在药物施用之前测量受试者中的相同一种标记或多种标记来获得标准水平。视测量水平与标准水平之间的差异而定，药物可被视为对间质性肺病具有作用。如果测量多种生物标记，那么对于药物被视为有效，至少一种，并且直至所有生物标记必须在预期方向上变化。优选地，对于药物被视为有效，多种标记必须变化，并且优选地，所述变化是统计显著的。
如将为本领域普通技术人员显而易知，以上描述不限于候选药物，而是可适用于确定任何治疗干预是否有效治疗间质性肺病。
在一典型实施方案中，选择患有间质性肺病的受试者群体用于研究。通常使用用于选择临床试验受试者的标准方案选择群体。举例来说，受试者大体上是健康的，未服用其它药物，并且在年龄和性别方面均匀分布。受试者群体也可被分成多个组；举例来说，不同子群体可罹患不同类型或不同程度的候选药物所解决的病症。可基于本公开的生物标记的水平对个体群体进行分层。
一般来说，在设计试验时必须进行许多统计考虑以确保在药物施用之后可检测到生物标记测量结果的统计显著变化。生物标记的变化量取决于许多因素，包括药物的强度、药物的剂量和治疗时程。将为在统计学方面熟练者显而易知的是如何确定适当受试者群体大小。优选地，研究被设计来检测相对较小的作用大小。
持续适合时期，受试者任选可自任何先前药物使用“洗脱”。洗脱移除任何先前药物的作用以使可获取准确基线测量结果。在时间t0，自群体中的各受试者获得生物样品。接着，对各受试者的样品进行一种测定或多种测定以测量本公开的特定生物标记的水平。测定可使用如上所述的常规方法和试剂。如果样品是血液，那么测定通常是对血清或血浆进行。对于其它流体或组织，必要时在进行测定之前包括其它样品制备步骤。测定测量至少一种本文所述的生物标记的值。在一些实施方案中，仅监测单一标记，而在其它实施方案中，监测要素的组合，直至总体数目的标记。也可连同与间质性肺病相关的其它测量结果和要素(例如MRI成像)一起监测标记。其值被测量的生物标记的数目例如取决于测定试剂、生物流体和其它资源的可用性。
接着，向相同受试者群体的一部分或子群体施用预定剂量的候选药物。药物施用可历经任何时期遵循任何适合时程，并且子群体可包括群体中的一些或所有受试者。在一些情况下，向子群体内的不同受试者施用不同剂量，或通过不同途径来施用药物。适合剂量和施用途径取决于药物的特定特征。在药物施用之后，在时间t1，自子群体获取另一生物样品(“t1样品”)。通常，样品是相同类型的样品，并且以与在药物施用之前自受试者群体获取的样品(“to样品”)相同的方式处理。对t1样品进行与对t0样品相同的测定以获得测量值。可根据需要历经时间范围t2至tn多次进行随后样品获取和测量。
通常，受试者群体的不同子群体用作向其施用安慰剂的对照组。接着使对照组遵循相同程序：获得生物样品，处理样品，以及测量生物标记以获得测量值。另外，可向许多不同子群体施用不同药物以比较多种药物的作用。如将为本领域普通技术人员显而易知，以上描述是对涉及临床试验的方法的高度简化描述。临床试验具有许多更具程序性的要求，并且应了解方法通常是遵循所有所述要求来执行。
各受试者的各种生物标记的成对测量结果现在是可用的。比较并分析不同测量值以确定是否药物组而非安慰剂组的生物标记在预期方向上变化，从而指示候选药物有效治疗疾病。在一些实施方案中，所述变化是统计显著的。将接受候选药物的组在时间t1的测量值与标准测量值，优选是在对所述组给与药物之前，即在时间t0的测量值进行比较。通常，比较采用对整个群体在施用药物或安慰剂之前和之后的测量值的统计分析的形式。任何常规统计方法都可用于确定生物标记值的变化是否是统计显著的。举例来说，视数据的分布而定，可使用参数成对t检验或非参数符号或符号秩检验对各生物标记进行成对比较。
此外，可进行检验以确保见于药物组中的统计显著变化不也见于安慰剂组中。在不进行所述检验下，不能确定观察到的变化是否发生在所有个体中，并且因此不是候选药物施用的结果。
取自患有间质性肺病的个体的样品中的基因标记表达值较高。一种或多种基因表达标记的测量值的显著降低指示药物是有效的。如果仅测量一种生物标记，那么那个值必须降低以指示药物功效。如果测量超过一种生物标记，那么可通过仅一种生物标记、所有生物标记、或在之间的任何数目的生物标记的变化来指示药物功效。在一些实施方案中，测量多种标记，并且通过多种标记的变化来指示药物功效。测量结果可为本公开的两种生物标记和与间质性肺病相关的其它测量结果和要素。此外，基因生物标记水平的降低量可为对药物的相对功效的指示。
除确定特定药物是否有效治疗间质性肺病之外，本公开的生物标记也可用于考查候选药物的剂量作用。存在可考查不同剂量的许多不同方式。举例来说，可向不同受试者群体施用不同剂量的药物，并且分析对应于各剂量的测量结果以确定本发明生物标记在药物施用之前和之后的差异是否是显著的。以这个方式，可估计为实现变化所需的最小剂量。此外，可将由不同剂量所致的结果彼此比较以确定各生物标记如何随剂量而变来表现。基于药物筛选的结果，本公开的标记可用作治疗诊断剂；也就是说，它们可用于使医学治疗个别化。
试剂盒
在另一方面，本公开提供一种用于检测本公开的多核苷酸或多肽标记的试剂盒。所述试剂盒可被制备成用以提供使用者以评估本公开的标记的表达水平的手段的测定系统，其包括测定试剂、测定对照、方案、示例性测定结果或这些组成部分的组合中的任一个。
在另一方面，本公开提供一种用于诊断个体的间质性肺病的试剂盒，其包括用于检测来自受试者的生物样品中的至少一种多肽或多核苷酸标记的试剂。
本公开的试剂盒可包括以下中的一种或多种：抗体，其中所述抗体特异性结合多肽标记；针对所述抗体的标记的结合伴侣；所述抗体或它的结合伴侣被固定于其上的固相；可与多核苷酸标记杂交的多核苷酸探针；在适当反应条件下可引发多核苷酸标记或编码多肽标记的多核苷酸的至少一部分的扩增(例如通过PCR)的数对引物；关于如何使用试剂盒的说明书；以及指示规章核准供诊断或治疗使用的标签或插页。
本公开进一步包括多核苷酸或多肽微阵列，其包括本公开的多肽、本公开的多核苷酸、或特异性结合本公开的多肽或多核苷酸的分子，如抗体。在本公开的这个方面，微阵列技术的标准技术用于评估多肽生物标记的表达和/或鉴定结合所述多肽的生物组分。蛋白质微阵列技术为本领域普通技术人员所熟知，并且是基于但不限于在固定基质上获得一系列鉴定的肽或蛋白质，使靶标分子或生物组分结合于肽，以及评估所述结合。多核苷酸阵列，特别是结合本公开的多肽的阵列，也可用于诊断应用，如用于鉴定患有特征在于多肽生物标记的表达的病状，例如间质性肺病的受试者。
本公开的测定系统可包括用于在肺细胞的样品中检测标记基因的扩增水平和/或标记基因的多体性水平的工具。测定系统优选也包括一种或多种对照。对照可包括：(i)用于检测个体的间质性肺病的对照样品；(ii)用于检测不存在间质性肺病的对照样品；以及，(iii)含有待关于间质性肺病的诊断或进展测量的基因标记的预定对照水平的信息。
在另一实施方案中，用于检测本公开的标记的表达水平的工具可通常为任何类型的试剂，其可包括但不限于抗体及其抗原结合片段、肽、结合伴侣、适体、酶和小分子。也可包括适用于使用所述检测工具进行测定的其它试剂，如用于进行免疫组织化学或另一结合测定的试剂。
可使本公开的测定系统的检测工具缀合于可检测标签或可检测标记。所述标签可为允许检测用于检测目标基因或蛋白质的试剂的任何适合标签，并且包括但不限于可通过分光、光化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物或标记。适用于本公开中的标记包括：用于用标记的抗生蛋白链菌素缀合物染色的生物素、磁性珠粒(例如DynabeadsTM)、荧光染料(例如荧光素、得克萨斯红(texasred)、若丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和通常用于ELISA中的其它酶)、以及比色标记，如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠粒。
此外，可使本公开的测定系统的检测工具固定在基质上。所述基质可包括任何适于固定检测试剂的基质，如将用于任何先前所述检测方法中的基质。简要来说，适于固定检测工具的基质包括可与所述检测工具形成键，而不显著影响所述检测工具检测所需靶标分子的活性和/或能力的任何固体载体，如任何固体有机、生物聚合物或无机载体。示例性有机固体载体包括聚合物，如聚苯乙烯、尼龙、苯酚-甲醛树脂和丙烯酸系共聚物(例如聚丙烯酰胺)。试剂盒也可包括适合的用于检测试剂和/或用于标记阳性或阴性对照的试剂、洗涤溶液、稀释缓冲液等。测定系统也可包括用于使用系统以及解释结果的一组书面说明。
测定系统也可包括用于检测是所取样的细胞类型的特征的对照标记的工具，其可通常为可用于如通过用于检测本公开的生物标记的存在的方法来检测样品中存在已知标记(在核酸或蛋白质水平上)的方法中的任何类型的试剂。具体来说，工具的特征在于它鉴定所分析的细胞类型的阳性鉴定所述细胞类型的特定标记。举例来说，在间质性肺病测定中，合乎需要的是针对生物标记表达水平和/或生物活性来筛选肺细胞。因此，用于检测对照标记的工具鉴定是肺细胞的特征的标记，以使所述细胞与其它细胞类型区分。所述工具增加本公开的测定的准确度和特异性。所述用于检测对照标记的工具包括但不限于：在严格杂交条件下与编码蛋白质标记的核酸分子杂交的探针；扩增所述核酸分子的PCR引物；特异性结合靶标分子上构象不同位点的适体；和/或选择性结合样品中的对照标记的抗体、其抗原结合片段、或抗原结合肽。许多细胞标记的核酸和氨基酸序列在本领域中是已知的，并且可用于产生所述检测试剂。
在一些实施方案中，视所选检测方法而定，试剂盒包括以下(或基本上由以下组成)：能够检测例如如上所述的遗传变体的引物或至少一种探针。在一些实施方案中，试剂盒包括能够检测选自由以下组成的组的区域中的遗传变体的引物或至少一种探针：5p15、6p24、7q22、11p15、15q14-15、17q21、19p13和8p23。在一些实施方案中，试剂盒包括能够检测6p24中的至少一种遗传变体(例如rs2076295或rs3778337)的引物或至少一种探针。在一些实施方案中，试剂盒包括能够检测7q22中的至少一种遗传变体(例如rs4727443)的引物或至少一种探针。在一些实施方案中，试剂盒包括能够检测11p15中的至少一种遗传变体(例如rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs2334659、rs7122936)的引物或至少一种探针。在一些实施方案中，试剂盒包括能够检测5p15中的至少一种遗传变体(例如rs2736100)的引物或至少一种探针。在一些实施方案中，试剂盒包括能够检测15q14-15中的至少一种遗传变体(例如rs2034650、rs1992272)的引物或至少一种探针。在一些实施方案中，试剂盒包括能够检测17q21中的至少一种遗传变体(例如rs1981997、rs17563986、rs8070723)的引物或至少一种探针。在一些实施方案中，试剂盒包括能够检测19p13中的至少一种遗传变体(例如rs12610495、rs2109069)的引物或至少一种探针。在一些实施方案中，试剂盒包括能够检测8p23中的至少一种遗传变体(例如rs1379326)的引物或至少一种探针。在一些实施方案中，试剂盒包括能够检测呈任何组合的5p15、6p24、7q22、11p15、15q14-15、17q21、19p13和8p23中超过一种(例如2、3、4、5、5-10、10-20种、或更多种)遗传变体的引物或探针。
在一些实施方案中，例如用荧光标记或FRET标记来标记引物和/或探针。在一些实施方案中，引物和/或探针是未标记的。在一些实施方案中，试剂盒包括例如用不同标记在所选遗传变异位点处检测变异等位基因序列与显性等位基因序列两者，或被设计来产生具有不同质量的扩增或引物延伸产物的引物和/或探针。
在一些实施方案中，试剂盒进一步包括至少一种对照样品，例如在所选遗传变异位点处具有显性等位基因的样品，或在所选遗传变异位点处具有变异等位基因的样品。
体外复合物
本文提供例如在体外测定中形成以指示存在遗传变异序列的核酸复合物。技术人员将了解核酸复合物也可被形成来视探针或引物的设计而定例如在测定中检测显性等位基因序列的存在以区分纯合受试者和杂合受试者。
在一些实施方案中，复合物包含与遗传变异核酸杂交的第一核酸，其中所述遗传变异核酸是选自5p15、6p24、7q22、11p15、15q14-15、17q21、19p13和8p23的区域中，或选自TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、MUC5B、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF和WNT3的基因中的遗传变体。在一些实施方案中，遗传变异核酸是扩增产物。在一些实施方案中，遗传变异核酸在例如来自患有或怀疑患有间质性肺病的受试者的基因组DNA上。在一些实施方案中，第一核酸是扩增产物或引物延伸产物。在一些实施方案中，标记第一核酸。在一些实施方案中，核酸复合物进一步包含与遗传变异核酸杂交的第二核酸。在一些实施方案中，例如用FRET或其它荧光标记来标记第二核酸。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在与遗传变异序列杂交时形成FRET对。
在一些实施方案中，核酸复合物进一步包含酶，如DNA聚合酶(例如标准DNA聚合酶或热稳定聚合酶，如Taq)或连接酶。
本公开包括但不限于以下实施方案：
1.一种用于确定个体是否被预测显现间质性肺炎和/或随间质性肺炎而快速进展的方法，其包括：在来自所述个体的生物样品中检测以下至少一个：
a)选自由以下组成的组的标记多态性的存在：rs2736100、rs2076295、rs3778337、rs4727443、rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2034650、rs1992272、rs1981997、rs17563986、rs8070723、rs12610495、rs2109069、rs1379326、rs1881984、rs10936599、rs1997392、rs6793295、rs2609255、rs2853676、rs10484326、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs2301160、rs3829223、rs2857476、rs1278769、rs1007177、rs10518693、rs393152、rs12373139、rs17690703、rs2532274、rs2532269、rs2668692、rs169201、rs199533和rs415430；以及，
b)选自由以下组成的组的一种标记基因或多种标记基因的基因表达的水平：与至少一种选自由MUC5B、TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体组成的组的序列具有至少95％序列同一性的标记基因：
c)由b)的所述标记基因编码的多肽
d)c)的多肽的片段；以及
e)完全互补于b)的标记基因的至少一部分的多核苷酸；
其中所述多种标记的存在指示个体是否将显现间质性肺炎或显现进行性IIP疾病。
2.如实施方案1所述的方法，其中所述检测的基因与b)中的所述相应标记基因共有100％序列同一性。
3.如实施方案1所述的方法，其中确定所述多种标记中的至少一种的所述存在或水平，并且与标准水平或参照集进行比较。
4.如实施方案1所述的方法，其中所述标准水平或参照集是根据用于风险预测的统计程序来确定。
5.如实施方案4所述的方法，其中所述用于风险预测的统计程序包括使用由比例危险系数加权的所述一种标记或多种标记的所述基因表达的总和或一组标记的存在或不存在。
6.如实施方案1所述的方法，其中所述至少一种标记的所述存在是通过检测多肽的存在或不存在或表达水平来确定。
7.如实施方案6所述的方法，其中所述方法进一步包括使用特异性结合所述多肽或其片段的试剂检测所述多肽的所述存在。
8.如实施方案7所述的方法，其中所述试剂选自由抗体、抗体衍生物和抗体片段组成的组。
9.如实施方案1所述的方法，其中所述标记的所述存在是通过在所述多态性的基因座处获得基因组DNA的序列来确定。
10.如实施方案1所述的方法，其中所述标记的所述存在是通过以下方式来确定：自所述生物样品获得RNA；自所述RNA产生cDNA；用针对标记基因的探针或引物扩增所述cDNA；由所述扩增的cDNA获得所述样品中的所述基因或基因表达产物的所述表达水平。
11.如实施方案1中任一个所述的方法，其中所述个体是人。
12.如实施方案1中任一个所述的方法，其进一步包括：
a)将所述生物样品中的所述一种标记基因或多种标记基因的所述表达水平与所述标记基因的选自由以下组成的组的对照水平进行比较：
所述标记基因的已与间质性肺病、显现IIP的风险、或患有进行性间质性肺炎相关联的对照水平；以及
所述标记的已与间质性肺病或间质性肺炎的缓慢进展或不进展、或显现IIP的低风险相关联的对照水平；以及
b)如果所述个体的生物样品中的所述标记基因的所述表达水平在统计上类似于或大于所述标记基因的表达的已与间质性肺病或快速间质性肺炎进展相关联的所述对照水平，那么将所述个体选择为被预测在间质性肺炎的显现中快速进展，或
c)如果所述个体的生物样品中的所述标记基因的所述水平在统计上小于所述标记基因的已与间质性肺病或快速间质性肺炎进展相关联的所述对照水平，那么将所述个体选择为被预测不显现间质性肺炎，或缓慢进展。
13.如实施方案1所述的方法，其进一步包括：
将所述生物样品中的多态性的所述存在与来自已显现间质性肺炎的个体或对照组的一组遗传变体或多态性标记进行比较，以及，
如果所述生物样品中存在的所述多态性标记与来自所述个体或对照组的一组多态性标记相同或在统计上类似，那么将所述个体选择为被预测显现或随间质性肺炎而进展，或，
如果所述生物样品中存在的所述多态性标记不与来自所述个体或对照组的所述组遗传变体或多态性标记相同或在统计上类似，那么将所述个体选择为被预测显现或随间质性肺炎而快速进展。
14.一种用于监测受试者的间质性肺病或间质性肺炎的进展的方法，其包括：
i)测量自所述受试者获得的第一生物样品中的多种基因标记的表达水平，其中所述多种标记包括多种选自由以下组成的组的标记：与选自由MUC5B、TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体组成的组的序列具有至少95％序列同一性的标记基因；
b)由a)的所述标记基因编码的多肽
c)d)的多肽的片段；以及
e)完全互补于b)的标记基因的至少一部分的多核苷酸；
ii)测量自所述受试者获得的第二生物样品中的所述多种标记的表达水平；以及
iii)将在所述第一样品中测量的所述标记的所述表达水平与在所述第二样品中测量的所述标记的所述水平进行比较。
15.如实施方案14所述的方法，其中所述检测的标记基因与a)中的所述相应标记基因共有100％序列同一性。
16.如实施方案14所述的方法，其进一步包括进行选自由以下组成的组的追踪步骤：胸部CT扫描以及对来自所述受试者的肺组织的病理检查。
17.如实施方案14所述的方法，其中所述来自所述受试者的第一生物样品是在时间t0获得，并且所述来自所述受试者的第二生物样品是在稍后时间t1获得。
18.如实施方案14所述的方法，其中所述第一生物样品和所述第二生物样品是自所述受试者获得，历经一定时间范围获得一次以上。
19.一种评估对受试者的间质性肺病或间质性肺炎的治疗的功效的方法，所述方法包括比较：
i)在时间t0自所述受试者获得的第一样品中测量的标记的表达水平，其中所述标记选自由以下组成的组：
a)与选自由以下组成的组的序列具有至少95％序列同一性的标记基因：TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体；
b)由a)的所述标记基因编码的多肽
c)b)的多肽的片段；以及
d)完全互补于a)的标记基因的至少一部分的多核苷酸；
ii)在时间t1自所述受试者获得的第二样品中的所述标记的水平；以及，
iii)进行选自以下的追踪步骤：胸部CT扫描以及对来自所述受试者的肺组织的病理检查；
其中相对于所述第一样品，所述第二样品中的所述标记的所述水平的降低指示所述治疗有效治疗所述受试者的间质性肺炎。
20.如实施方案19所述的方法，其中所述检测的基因与a)中的所述相应标记基因共有100％序列同一性。
21.如实施方案19所述的方法，其中所述时间t0在已向所述受试者施用所述治疗之前，而所述时间t1在已向所述受试者施用所述治疗之后。
22.如实施方案19所述的方法，其中历经一定时间范围重复所述比较。
23.一种用于预测针对间质性肺炎的个体预后疗法的测定系统，其包括用以检测以下至少一个的工具：
a)选自由以下组成的组的标记多态性的存在：rs2736100、rs2076295、rs3778337、rs4727443、rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2034650、rs1992272、rs1981997、rs17563986、rs8070723、rs12610495、rs2109069、rs1379326、rs1881984、rs10936599、rs1997392、rs6793295、rs2609255、rs2853676、rs10484326、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs2301160、rs3829223、rs2857476、rs1278769、rs1007177、rs10518693、rs393152、rs12373139、rs17690703、rs2532274、rs2532269、rs2668692、rs169201、rs199533和rs415430；以及，
b)选自由以下组成的组的一种标记基因或多种标记基因的基因表达的水平：与选自由TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体组成的组的序列具有至少95％序列同一性的标记基因；
c)由b)的所述标记基因编码的多肽
d)c)的多肽的片段；以及
e)完全互补于b)的标记基因的至少一部分的多核苷酸。
24.如实施方案23所述的测定系统，其中所述用以检测的工具包括包含所述标记多态性或基因的至少10至50个连续核酸或其互补核酸序列的核酸探针。
25.如实施方案23所述的测定系统，其中所述用以检测的工具包括特异性检测由所述标记基因编码的多肽的结合配体。
26.如实施方案23所述的测定系统，其中所述检测的基因与b)中的所述相应标记基因共有100％序列同一性。
27.如实施方案23所述的测定系统，其中所述用以检测的工具包括配置在测定表面上的核酸探针和结合配体中的至少一种。
28.如实施方案27所述的测定系统，其中所述测定表面包括芯片、阵列或流动卡。
29.如实施方案28所述的测定系统，其中所述探针包含所述标记基因的至少10至50个核酸的序列的互补核酸序列。
30.如实施方案28所述的测定系统，其中所述结合配体包括抗体或其结合片段。
31.如实施方案23所述的测定系统，其进一步包括：选自含有预定对照水平或一组遗传变体或多态性标记的已与间质性肺病或IIP患者的诊断、显现、进展或预期寿命相关联的信息的对照。
32.一种检测患有间质性肺炎的人受试者中的一种或多种标记基因的基因表达的水平的方法，其包括：
自患有间质性肺炎的人个体获得生物样品；
检测来自所述来自所述个体的生物样品的一种或多种细胞中的选自TERT、MUC2、TOLLIP、MUC5B、DPP9、DSP及其同源物或变体的基因的所述表达水平。
33.如实施方案32所述的方法，其进一步包括检测来自所述来自所述个体的生物样品的一种或多种细胞中的选自TERT、MUC2、TOLLIP、MUC5B、DPP9、DSP及其同源物或变体的基因的所述表达水平。
34.如实施方案32所述的方法，其进一步包括检测来自所述来自所述个体的生物样品的一种或多种细胞中的选自MUC5B、TERC、SFTPC、SFTPA2及其同源物或变体的基因的所述表达水平。
35.一种治疗需要所述治疗的受试者的间质性肺炎的方法，其包括：
检测自所述人受试者获得的生物样品中的一种或多种选自TERT、MUC2、TOLLIP、MUC5B、DPP9、DSP或其同源物或变体的标记基因的水平；以及，
施用有效量的间质性肺炎治疗剂。
36.如实施方案35所述的方法，其进一步包括检测来自所述来自个体的生物样品的一种或多种细胞中的选自TERT、MUC2、TOLLIP、MUC5B、DPP9、DSP及其同源物或变体的基因的所述表达水平。
37.如实施方案35所述的方法，其进一步包括检测来自所述来自个体的生物样品的一种或多种细胞中的选自MUC5B、TERC、SFTPC、SFTPA2及其同源物或变体的基因的所述表达水平。
随后实施例说明本公开的特定实施方案及其各种用途。它们仅是出于说明性目的来阐述，并且不应被视为限制本公开。
实施例
本文提供对IIP个体(包括所有类型的纤维化IIP)的病例-对照全基因组关联研究(GWAS；1616个病例和4683个对照)和重复研究(876个病例和1890个对照)。在研究中包括不同类型的IIP，因为：a)在IIP诊断之间进行区分常由于大致上临床性、病理性和放射性重叠而成问题；以及b)存在共有遗传易感性的强力证据(例如超过40％的患有FIP的家族在受影响的家族成员之中具有超过一种类型的IIP)。在这个GWAS研究中包括家族性IIP个体样品与散发性IIP个体样品两者，因为MUC5B、TERT、TERC和SFTPC变体提供散发性IIP在遗传上类似于这个疾病的家族性形式的证据。
在鉴定共同增进我们对IIP的了解的其它遗传风险因素的目标下，本发明者已完成IIP的病例-对照全基因组关联研究(GWAS；1616个病例和4683个对照)和重复研究(876个病例和1890个对照)。在病例组中包括所有类型的纤维化IIP。本发明者也包括家族性IIP与散发性IIP两者。
研究群体
病例定义。我们使用由美国胸科学会/欧洲呼吸学会建立的标准准则来确定发现和重复阶段中所有患者的诊断分类。我们排除具有对显现纤维化IIP的已知解释，包括感染、全身性病症或相关暴露(例如石棉)的病例。为使考验力最大以及使由世系所致的潜在混乱最小，我们在GWAS和重复中仅包括非西班牙裔白种人(NHW)参与者。所有受试者都给出书面知情同意书作为IRB核准的针对他们的招募的方案的一部分，并且GWAS研究由国立犹太健康中心IRB和科罗拉多联合机构审查委员会(COMIRB)核准。
GWAS发现。我们分析来自7个群组(家族性间质性肺炎[n＝566]，国立犹太健康中心IIP群体[n＝238]，InterMuneIPF试验[n＝720]，UCSF[n＝66]，范德比尔特大学(VanderbiltUniversity)IIP群体[n＝105]，以及国立心脏、肺和血液研究所肺组织科研联合体[n＝219])的1914名IIP患者的基因型，并且将它们与来自4683个研究外对照的基因型进行比较。在基因型质量控制之后，我们在分析中包括1616个病例。
通过在3个支系内遗传相关的个体中存在至少2例确定或可能IIP来定义患有家族性间质性肺炎(FIP)的家族。建立在三个主要转诊中心(范德比尔特大学、杜克大学和国立犹太健康中心)的家族招募已自1999年以来进行。我们仅包括第一支系亲属之中的1个IIP病例。国立犹太健康中心IIP群组由在国立犹太健康中心在临床上被评估和招募作为进行中的与临床护理相关的研究方案的一部分的散发性IIP患者组成。已详述针对来自IntermuneIPFγ-干扰素干预试验的病例的招募准则的细节。简要来说，合格患者患有IPF，40至79岁，具有临床症状至少3个月，并且在先前12个月内具有疾病进展的迹象。无论治疗分配如何，我们都包括所有可用病例。国立心脏、肺和血液研究所肺组织科研联合体(NHLBILTRC)被建立来为研究团体提供肺组织和DNA。我们包括来自那些诊断有IIP的受试者的DNA。
我们使用在人多态性研究中心(Centred’duPolymorphismeHumain，CEPH)产生的去身份化对照基因型作为其它研究的一部分。潜在对照是作为NHW，已在相同平台上被基因型分析为我们的病例，并且被适当核准用作其它研究中的对照的那些。我们基于与通过我们的基因型分析质量控制阈值(参见以下统计分析)的病例的遗传类似性选择一子组对照，对应于1个病例约3个对照。
重复。对于对来自GWAS的顶尖SNP的重复，我们分析总计1027个NHWIIP病例和2138个NHW对照的基因型。重复对照来自个别重复组(n＝138)和来自慢性阻塞性肺病(COPD)基因研究的一子组(n＝2000)对照。我们基于年龄和性别来选择对照以频率匹配于重复病例。在质量控制之后，我们在分析中包括876个病例和1890个对照。
表达。我们对来自GWAS的一子组肺组织科研联合体和国立犹太健康中心IIP病例(n＝100)和国立犹太健康中心对照(n＝94)测量基因表达。自国际医学促进研究所(Edison，NJ)获得完整肺样品。合格病例和对照具有来自肺组织活检体的可用于测定的足够RNA；超过其它IIP诊断来优先选择IPF病例。国立犹太健康中心对照也具有可用的全基因组SNP数据。
DNA制备、储存和质量控制
在AutopureLS(Qiagen)或Qiacube(Qiagen)自动化平台上分别自全血与活检肺组织两者分离基因组DNA。在使用DNAeasy试剂盒于Qiacube上提取之前，首先使用溶解基质D管和FastPrep-24台式均质器(MPBiomedicals)使纤维化肺组织均质化。在分离之后，在NanoDropND-1000分光光度计上测定所有DNA的浓度和纯度。如果DNA＜50ng/μl或具有超出1.7-2.0范围的A260/A280比率，那么排除样品。
在提交至CNG之前，所有样品都使用Quant-iTPicoGreendsDNA测定试剂盒(Invitrogen)再定量，用1×TE标准化，并且等分至被个别地条码化的螺旋帽管中。由于用液体处理机器人的体积限制，用于提交至CNG的绝对最小量是在50ng/ul下30ul。如果样品不满足这个最小量，那么进行替代性提取，或自研究扣留样品。
在收到重复样品后，它们被转移至96孔机器人可相容板中，用PicoGreen定量，并且用1×TE标准化。根据BMGC提交指导方针，提交GWAS和重复群组的各成员的400ngDNA。致力于使由批次影响所致的混乱最小，使用TecanEvo200液体处理机器人跨越所有群组以随机化方式将样品等分至96孔板中，其中每个板具有两个重复。
全基因组基因型分析
条码化DNA样品连同样品信息一起于标准管中被接收，并且经受严格质量控制(QC)。测定浓度、片段化和对PCR的应答。将来自病例和对照的样品随机分布在96孔板上。在配备有8个Tecan液体处理机器人、6个IlluminaBeadArray读取器和2个IlluminaiScans的完全自动化IlluminaBeadLab中，在完全LIMS控制下进行处理。使用IlluminaHuman610四阵列进行基因型分析。重复基因型分析
我们分析1027个独立病例和2000个COPD基因对照中P值小于0.0001(参见统计分析)的198个SNP的基因型。我们也分析不在Illumina660四珠粒芯片上的MUC5B启动子SNPrs35705950的基因型以允许调整rs35705950的染色体11p15重复SNP。此外，为允许在针对关于研究外对照不可用的共变量加以调整下进行追踪联合统计检验(使用来自GWAS病例和重复病例与对照两者的原始基因型)，我们也分析一子组GWAS病例的基因型。以下描述验证测定的细节。在基因型分析质量控制之后，我们在重复分析中包括876个病例和1890个对照，并且在联合分析中包括859个GWAS病例。
在基因型分析之前，所有样品都通过实时Q-PCR定量(“QC1”)和使用Taqman进行的单路基因型分析(“QC2”)来加以质量控制。QC1或QC2不合格的样品尽管向前完成基因型分析，但稍后自分析移除。
用多路(SequenomiPLEX)和单路(Taqman)测定的组合达成验证基因型分析。首先，使用基于网络的软件工具(AssayDesigner套件，可在网站sequenom.com获得)和桌面软件工具(AssayDesigner)(Sequenom，SanDiego)的组合对一组输入的198个SNP(表3)进行用于多路SequenomiPLEX基因型分析的测定设计。在198个输入SNP中，193被高效放置至一组具有以下丛度的6个测定中：35、35、35、35、31和22个SNP。SequenomiPLEX基因型分析是基于多路基因座特异性PCR扩增、自基因座特异性扩增子进行多路单碱基延伸(SBE)和使用基质辅助激光解吸/离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱测定法对SBE产物进行多路分辨碱基识别。
自IDT(Coralville，Iowa)购买用于Sequenom测定的引物，并且iPLEX程序的所有步骤都使用来自Sequenom(SanDiego，CA)的试剂和方法，根据制造商说明书来进行。在384孔板中进行反应，并且使用SequenomMassARRAY分析器4系统，用iPLEXGold试剂和SpectroCHIP阵列进行分析。使用用于数据管理的商业软件(Typer4，Sequenom)和定制工具的组合分析结果。在呈6个多路形式的193个测定中，179个成功产生可用基因型分析数据。
使用商业Taqman测定(LifeTechnologies，SanDiego，CA)分析其余未成功包括在原始SequenomiPLEX设计中的5个SNP(rs2736100、rs35705950、rs13225346、rs10822856、rs10139381、rs10751635)以及在较早研究中公开的第六个SNP(rs35705950)的基因型。这些SNP的dbSNPrs号以及所用测定的商业产品ID显示于表3中。在384孔板中进行反应，并且使用AppliedBiosystemsABI7900HT序列检测系统(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)读出荧光。
基因表达
使用AmbionmirVana试剂盒(LifeTechnologies)自约30mg快速冷冻或RNA-later保存的肺组织分离总RNA。通过NanodropND-1000(ThermoScientific)来测定RNA浓度，并且使用2100生物分析仪(Agilent)测定RNA完整性。使用SuperscriptIII第一链合成系统(Invitrogen)进行cDNA单链转化，并且使用预先设计的在Viia7实时PCR仪器(LifeTechnologies)上操作的Taqman测定进行表达分析。(DPP9：Hs00373589；DSP：Hs00189422，并且DSP变体1测定是Hs00950584；FAM13A：Hs00208453；IVD：Hs01064832；MUC5B：Hs00861588；MUC2：Hs00149374；OBFC1：Hs00998588；WNT3：Hs00902257；WNT9B：Hs00916642；GAPDH：4333764F)。所有测定都一式三份操作，其中GAPDH用作内源性对照。作为另一对照，一式两份操作来自cDNA转化步骤的每个板一个样品。
统计分析
用于GWAS发现的研究外对照的选择。使用EIGENSTRAT3.0软件进行世系分析。参照欧洲人的HapMap数据和样品用作对欧洲、西非和东亚群体的代表以推断被投射于病例和对照样品上的世系信息性主要组成部分。推定性非欧洲样品被标记为离群物，并且自随后分析消除。我们获得与来自欧洲人的匿名基因型的大型数据库的病例具有紧密遗传匹配的对照。自这个数据库，我们选择一子组对照基因型数据以便通过使用基于用支持向量机(R程序包“e1071”)进行群集，随后应用成对匹配算法(R程序包“optmatch”)的方法获得每个病例三个匹配对照。在这个选择下，基因组膨胀因子(用GEMMA软件在针对群体结构加以调整下评估)是0.99。
移除第一支系亲属。我们基于估计亲缘关系系数≥0.45仅包括第一支系亲属之中的一个个体。对于估计通过GWASSNP说明的对隐蔽关联敏感的疾病风险的变化百分比，我们进一步仅移除估计亲缘关系系数＞0.025的那些个体之中的一个个体。
用于发现GWAS的个体排除和SNP优先化。除由实验室排除的个体之外，我们排除以下个体：1)基于成对根据状态同一性(IBS)估计值，具有是遗传离群者的证据，其中第5密切邻近值与跨越所有对的平均成对IBS估计值有＞4个标准偏差，2)临床数据与基因组数据之间具有未分辨的性别混合匹配，3)SNP之间的杂合性与跨越所有个体的平均杂合性有大于或小于4个标准偏差，以及4)基因型识别小于98％的通过实验室质量控制的SNP。基于这个质量控制，我们排除298个病例和165个对照。除实验室质量控制措施之外，我们基于其它准则优先考虑供追踪的关联信号。我们通过对病例与对照之间的遗漏的比例的卡方检验(chi-squaredtest)来检验差异性遗漏，并且通过1-df拟合优度检验来检验与HWE的偏离。我们优先考虑以下SNP：1)MAF＞.05，2)单独评估的病例和对照中的HWEp值＞0.0001，3)如果小于2％遗漏，那么病例与对照之间的差异性遗漏的p值＞0.001，并且如果在2％与5％之间遗漏，那么病例与对照之间的差异性遗漏的p值＞0.05。
GWAS关联检验。我们使用用以解释在我们的病例和对照之间的微妙关联与群体分层两者的精确混合模型方法检验各SNP与IIP之间的关联，所述方法是在全基因组高效混合模型关联(GEMMA)软件包中执行。我们根据我们的主要分析的累加模型检验关联，并且如果假定样品之间独立性的线性回归与所述累加模型存在显著缺乏拟合(p＜.05)(所述检验当前不可在GEMMA软件中执行)，那么随后采用隐性和显性模型p值的最小值。我们在所有模型中都针对性别加以调整。我们比较根据累加模型获得的p值的分布与在跨越基因组无关联的无效假设下预期的p值的分布，并且报道分位数-分位数(Q-Q图)和基因组膨胀因子(λ)以验证不存在由于实验性或其它混乱因素(如群体分层)的系统偏差。我们选择p值＜0.0001的所有SNP供在重复群体中追踪，并且目视检查所有198个所选SNP的基因型谱以保证基因型识别质量。因为GEMMA中的线性模型使用恒等关联而非对数-几率关联函数，所以我们由假定在病例和对照之间独立性的针对性别加以调整的逻辑回归模型计算几率比率和95％置信区间(CI)。因此，CI可略微窄于基于完全混合模型的CI。
重复关联。我们使用可免费获得的SNPGWA软件(参见URL)检验重复病例和对照中各重复SNP与IIP之间的关联。我们根据来自GWAS的给出最小p值的遗传模型(143个根据累加模型，24个根据显性模型，并且31个根据隐性模型)检验关联。对于20个全基因组显著GWASSNP，p值＜.0025被视为统计显著重复。其它178个SNP的p值用于GWAS和重复群组的元分析中。
元分析。为获得重复组中181个成功进行基因型分析的SNP中的每一个与IIP之间的关联的联合量度，我们对GWAS和重复结果进行元分析。我们使用加权逆正态方法。让Zi(i＝GWAS或重复)是第i个研究中由关联检验获得的检验统计量，并且让vi(i＝GWAS或重复)是相应权重。此处，我们将权重采用为第i个研究中总样本大小的平方根，因为来自GWAS和重复的作用估计值不在相同尺度上。应注意这个方法明确虑及关联的方向性。因此，具有冲突方向的高度显著关联不展现强烈统计关联。我们使用METAL(可在网站sph.umich.edu/csg/abecasis/metal/获得)来进行我们的元分析。P联合＜5×10-8的SNP被视为全基因组统计显著。我们产生在元分析中全基因组显著的所有基因座的发现GWAS结果的基因座特异性图。
多SNP模型。为评估来自元分析的全基因组显著SNP的作用的独立性，我们使用组合的病例组(GWAS和重复)和重复对照，在各基因座内使用逻辑回归模型。具体来说，在具有全基因组显著的SNP的各基因座内，在调整那个基因座中的最显著相关的SNP(在染色体11p15上，我们调整rs35705950)之后，我们检验IIP与那个基因座内的其它验证组SNP中的每一个之间的关联。为评估除性别之外，各SNP与年龄影响的关联的稳固性，我们检验IIP与各SNP之间针对年龄和性别加以调整的关联。
表达分析。我们使用双样本t检验来检验100个病例与94个对照之间在肺中的差异性基因表达。除非某一基因型组中存在＜5个个体，否则我们也使用组合的病例和对照组通过ANOVA跨越三个基因型组检验根据基因型的差异性表达；在那个情况下，我们将罕见纯合子和杂合子组分组。p值＜.05被视为统计显著。
结果
全基因组发现
我们在Illumina660四珠粒芯片上分析1914个自我报道的非西班牙裔白种人纤维化IIP病例的基因型。在这些中，14、126、8和150分别基于是遗传离群者、具有是另一病例的第一支系亲属的证据、高杂合性、或跨越所有SNP遗漏＞2％的基因型而被排除(参见统计方法)；1616个病例被包括在分析中。在也在Illumina660四珠粒芯片上分析基因型的15,352个研究外对照之中，我们基于全基因组根据状态同一性比较，使用在遗传上最类似于我们的病例的4683个对照。
我们在439,828个以下SNP处比较IIP病例和对照：1)MAF＞.05，2)单独评估的病例和对照中的HWEP值＞0.0001，以及3)如果小于2％遗漏，那么病例与对照之间的差异性遗漏的p值＞0.001，并且如果在2％与5％之间遗漏，那么病例与对照之间的差异性遗漏的p值＞0.05。p值的QQ图(图5)和估计基因组膨胀因子0.99均不表明任何系统偏差，如与群体分层相关的那些。根据用于各SNP处的次要等位基因的累加模型，我们鉴定代表7个染色体位置的具有全基因组显著(P＜5×10-8)关联的19个SNP(图1和表1)。我们根据隐性模型鉴定代表独特基因座的另一全基因组显著SNP(rs1379326)(表1)。
重复和元分析
我们选择20个全基因组显著SNP和具有5×10-8＜P值＜.0001的额外178个SNP(图1中顶部线与底部线之间的SNP；参见表3和4(对于SNP位置、基因型和HWE信息)以及表5(对于所有198个SNP的关联信息))来分析1027个IIP病例的重复群组和2138个对照中的基因型。在基因型质量控制之后，我们包括关于181个SNP成功分析基因型的876个病例和1890个对照。在重复群组中，对应于20个检验的保守邦弗伦尼(Bonferroni)校正，20个全基因组显著的SNP中的13个在P＜0.0025下与IIP相关(表1，中间列)。20个全基因组显著的SNP中来自GWAS的代表7个基因座的18个(图2)在元分析中是全基因组显著的(表1，末列)。代表9个染色体位置(与GWAS基因座重叠的5个以及4个额外基因座(图3))的额外25个SNP在元分析中是全基因组显著的(表1)。
GWAS发现中最高度相关的SNPrs868903(PGWAS＝1.3×10-22；PMeta＝9.2×10-26)在染色体11p15处的MUC5B基因的启动子中，我们已报道所述SNP与IPF和FIP相关，并且已在其它研究中确认。MUC5B区域中的10个额外SNP(包括MUC2和TOLLIP基因中的SNP)在联合分析中也是全基因组显著的，并且不与rs868903有强烈LD(图2d)。在染色体5p15处的SNPrs2736100(PMeta＝1.7×10-19)和rs2853676(PMeta＝3.3×10-8)在TERT基因中(图2a)，并且rs1881984(PMeta＝4.5×10-8)接近TERC基因(图3a)；已报道TERT和TERC中的罕见突变与FIP和IPF相关，并且先前已报道rs2736100在TERT基因中。其余8个全基因组显著的基因座是新型IIP基因座(图6)。染色体4q22、6p24、10q24、13q34和19p13上的5个关联信号似乎定位于单一基因。SNPrs2609255(PMeta＝2.2×10-11)在染色体4q22处的FAM13A基因(具有序列类似性的家族13，成员A)中(图3b)。SNPrs10484326(PMeta＝5.5×10-9)和rs2076295(PMeta＝1.1×10-19)在染色体6p24处的DSP基因(桥粒斑蛋白)中(图2b)。SNPrs10748858(PMeta＝2.7×10-8)、rs2067832(PMeta＝3.7×10-8)和rs11191865(PMeta＝2.4×10-8)在染色体10q24处的OBFC1基因(含有寡核苷酸结合折叠的1)中(图3c)。SNPrs1278769(PMeta＝6.7×10-9)在染色体13q34处的ATP11A基因(ATP酶，VI类，11A型)中(图3d)。SNPrs12610495(PMeta＝1.7×10-12)和rs2109069(PMeta＝2.4×10-11)在染色体19p13处的DPP9基因(二肽基-肽酶9)中(图2g)。其它三个染色体区域(7q22、15q14-15和17q21)在任何基因中都不具有显著SNP或在多个基因中不具有具有显著关联的SNP(表1和图2c、2e、2f)。对所有全基因组显著的SNP估计的几率比率(OR)在～1.1至～1.6的范围内(表1；MAF的小于1的OR对应于主要等位基因的在相同范围内的OR)。
探究用于全基因组显著的SNP的调整的模型
为针对先前发现的MUC5B启动子SNP(rs35705950；不在Illumina660四珠粒芯片上)加以调整，我们在相同平台上分析一子组GWAS发现病例的基因型，并且同时作为表1中的SNP的重复病例。我们组合来自这些病例(n＝859)的原始基因型与重复病例和对照来进行联合分析。
为评估各区域内多个独立关联信号的证据，在针对基于元分析是给定区域中最显著的SNP加以调整之后，我们检验与那个区域中的各SNP的关联。对于染色体11p15区域，鉴于我们的先前研究结果和我们在我们的当前研究群体中观察的rs35705950与IIP之间的关联强度(OR[95％CI]：4.51[3.91，5.21]，PJoint＝7.21×10-95)，我们针对rs35705950加以调整。在针对rs35705950加以调整之后，在11p15处仅一个SNP(rs4077759)保持名义上与IIP相关(P＝.03；表2)，而rs35705950在所有模型中都保持高度显著，从而表明我们观察的与其它SNP的关联是由于与rs35705950有微弱LD(对于SNP之间的LD，参见图6)。在针对顶尖SNP加以调整之后，其它区域中的SNP的显著性降低与SNP之间的LD(表6)一致，并且不提供多个关联信号的证据。值得注意的是在针对LRRC34基因中的SNPrs6793295加以调整之后，接近TERC基因的SNPrs1881984不再是显著的。
最后，对于所有全基因组显著的SNP，除性别之外，我们也针对年龄加以调整；除染色体11上的rs7942850之外(调整的P年龄＝0.06)，所有SNP在调整之后都保持显著(表6)。
肺组织中关键基因的表达
我们使用定量PCR和验证的Taqman基因型分析测定(AppliedBiosystems，Foster，City，CA)测量来自100个IPF病例和94个对照的肺组织中的DPP9、DSP、FAM13A、IVD、MUC5B、MUC2、DISP2、OBFC1、WNT3和WNT9B的表达以检验病例与对照之间的差异，以及检验在各基因中最高度相关的SNP处的基因型与那个基因的表达之间的关联。我们确认我们的来自较小研究的结果，即相较于对照，MUC5B在病例的肺组织中更高度表达(P＝5.6×10-11)，但与我们的在IPF病例之中对于rs35705950的先前研究结果一致，rs868903不与MUC5B的表达相关。相较于对照，DSP在病例中更高度表达(P＝0.0002)，并且就在rs2076295处的基因型来说，表达有差异(P＝0.002)；DSP的相对表达随推定性风险中等位基因的拷贝数而增加(图4)。存在通过选择性剪接产生的两种桥粒斑蛋白亚型。rs2076295含于转录因子PU.1的结合位点中，其已牵涉于靶标基因的选择性剪接中；然而，我们未观察到rs2076295基因型对主要亚型的表达相较于选择性亚型有差异性影响的证据。存在相较于对照，DPP9在病例中的表达较高的名义上的证据(P＝0.03)，但rs12610495(P＝0.46)和rs2109069(P＝0.72)均不与DPP9表达相关。在病例与对照之间，或就基因型来说，FAM13A、IVD和OBFC1在表达方面都无差异(全都P＞0.12)；MUC2、DISP2、WNT3和WNT9B显示在这些肺样品中少许表达或不表达。
通过GWASSNP说明的疾病风险的变化百分比
我们使用方差分量模型跨越一定范围的IIP发病率估计值(每100,000中50至每100,000中100)来估计通过被检验关联的所有439,828个GWASSNP说明的疾病风险的百分比。我们发现GWASSNP解释IIP风险的估计30％(标准误差2％)至33％(标准误差3％)。因为我们在这个分析中未包括MUC5B启动子SNP(rs35705950)，所以这是对常见SNP对IIP风险的作用的保守估计。
讨论
这些研究结果提供以下令人信服的证据：常见遗传变异是如IIP的间质性肺病的重要促进因素。我们已鉴定8个新型遗传风险基因座(4q22、6p24、7q22、10q24、13q34、15q14-15、17q21和19p13)，并且确认三个先前报道的基因/基因座(TERC[3q26]、TERT[5p15]和MUC5B[11p15])中的风险变体在IIP中的作用。在这个报道之前，仅有的两个具有可重现IIP相关常见变体的基因是TERT和MUC5B。总的来说，与IIP相关的常见风险变体表明这个疾病主要由宿主防御、细胞-细胞粘着和早期细胞衰老方面的缺陷介导。此外，这些研究结果可用于在这个复杂疾病中指导干预试验。
远端小气道中的分泌粘蛋白(MUC5B)似乎在IIP的显现中起作用。在虑及我们先前已鉴定为IIP的关键风险因素的MUC5B启动子SNPrs35705950的影响之后，数据未表明11p15区域中的其它基因(MUC2或TOLLIP)中的SNP有强烈影响。MUC5B基因的启动子中的是GWAS、重复和元分析中的一个最强烈相关的SNP的rs868903SNP不与rs35705950有强烈LD(r2＝0.13)，并且比rs35705950更靠近MUC5B的转录起始位点(分别是3kb对1.5kb)。尽管来自IIP患者的肺组织比对照具有更高MUC5B浓度，但这些MUC5B启动子变体似乎都不完全负责增加IIP患者中的MUC5B的表达，从而表明其它基因变体或环境毒素在这个疾病中起作用。肺粘蛋白调控异常可能通过一种以下机理来引发或加剧纤维增生：1)改变粘膜宿主防御；2)干扰肺泡修复；或3)直接细胞毒性(内质网应激或凋亡)刺激由过量产生肺粘蛋白引发的纤维增生应答。
维持端粒的长度的基因似乎在IIP的显现中起作用。在这个报道之前，肺纤维化与TERT和TERC之间的关联涉及TERT和TERC的罕见变体以及TERT的常见变体。这些基因中的突变与肺泡上皮细胞中的端粒缩短相关，从而表明这些基因变体可通过增强肺泡上皮的凋亡或坏死来增加肺纤维化的风险。此外，先天性角化不良(一种类似于过早衰老，并且常涉及肺纤维化的先天性病症)与TERT和TERC中的突变相关。这个GWAS鉴定TERT中和接近TERC以及影响端粒长度另一基因OBFC1中的常见变体(Pmeta＝2.4×10-08)。OBFC1中的常见变体已在于一般群体中进行的人白细胞端粒长度的两个GWAS研究中与端粒长度相关联。似乎与这些基因相关的风险不限于罕见变体，而是代表常见风险变异。总的来说，这些研究结果强调端粒长度和早期细胞衰老在肺纤维化的发病机理中的重要性。
结果暗示细胞-细胞粘着的改变对IIP显现风险有影响。DSP基因中的变体与IIP以及DSP在IIP患者的肺组织中的表达强烈相关。DSP基因编码蛋白质桥粒斑蛋白(桥粒的组分，粘着性细胞间分子)，其使邻近细胞紧密连接，并且与使细胞骨架栓系于细胞膜的其它蛋白质(盘状球蛋白和桥粒斑菲素蛋白)形成动态结构。桥粒对于维持经受机械应力的组织(如肺的外周部分)的完整性特别重要，并且存在强力证据表明桥粒的扰动会破坏上皮体内平衡。DSP中的突变已与致心律失常性右心室发育不良、角皮病和脱发相关联，从而直接将疾病中的桥粒斑蛋白与组织完整性的损失相牵连。更具体来说，基于在小鼠心脏组织中过度表达，DSP中的突变已与心脏间质性纤维化相关联。涉及DSP的另一潜在机理是通过wnt/β-连环蛋白信号传导路径中的已在肺纤维化中被一致地观察到的改变来达成。桥粒斑蛋白已显示会通过调控桥粒的另一组分γ-连环蛋白来影响wnt/β-连环蛋白信号传导路径。这些研究以及IIP中DSP的过度表达与rs2076295的变异等位基因相关的研究结果为DSP中的遗传变异促进肺纤维化的作用提供强力生物力学或生物学基本原理。
结果暗示其它细胞粘着分子对IIP显现风险有影响。DPP9基因是相同蛋白质家族作为成纤维细胞活化蛋白的成员，其已显示在IPF中在成纤维细胞灶中而非在邻近健康肺中表达。DPP9在上皮中表达，并且已显示会改变人胚肾细胞中的细胞粘着。此外，连环蛋白钙粘着蛋白相关的蛋白α3(CTNNA3)基因在联合分析中接近显著(Pmeta＝9.8×10-07)，位于10q22处，并且是以物理方式与β-连环蛋白相互作用并介导细胞粘着的细胞粘着分子。总的来说，这些研究结果表明肺纤维化是由细胞-细胞粘着方面的缺陷或细胞骨架不能适应与肺的机械拉伸相关的应激方面的缺陷引起。
FAM13A是对缺氧具有应答性的信号转导基因，并且近来已发现那个基因中的SNP(rs7671167)在慢性阻塞性肺病中具有保护性。其它全基因组显著的基因座未也定位于单一基因，但引起关注的候选者显现。存在与IIP相关的若干标记，其在跨过1.14Mb的染色体17q21处都呈强烈LD。鉴于在IIP中观察到的wnt信号传导的改变，在那些基因之中的一明显候选者是WNT3基因；然而，我们未发现WNT3在肺中表达的证据。17q21是在结构上复杂的遗传区域，具有广大(＞1Mb)倒置多态性和疾病相关的较小拷贝数变体(CNV)。引起关注的是，这个区域中的基因LRRC37A和LRRC37A2与染色体3上的邻近于TERC基因的LRRC34基因在相同家族中，所述TERC基因具有重复样品中的一个最强烈关联信号。在染色体17q21区域与染色体11p15上的复杂粘蛋白区域两者中，有可能的是，深入测序和基于阵列的拷贝数测量继之以对推定性基因/等位基因/CNV进行功能性测试将为进一步表征这些观察的与IIP的关联的遗传组构所必需。尽管已提出肺纤维化由发育路径的活化或异常肺修复所致，但研究结果表明这些机理相对于宿主防御或细胞-细胞粘着方面的主要缺陷是次要的。因为肺上皮的完整性(DSP、DPP9和CTNNA3)和肺粘蛋白(MUC5B)中涉及的基因是遗传风险变体，所以这些机理方面的缺陷可能是显现肺纤维化的主要促进因素。鉴于环境暴露(例如暴露于抽烟、石棉和二氧化硅)在显现其它形式的间质性肺病方面的重要性，合乎逻辑的是常见吸入粒子(如与抽烟或空气污染相关的那些)历经数年导致在肺宿主防御或细胞-细胞粘着方面具有缺陷的个人的放大间质性损伤。端粒缩短以及随后早期细胞衰老可能改变宿主防御，或类似于石棉或抽烟，可增强对肺的‘宿主防御对抗’。因此，通过增强的环境暴露、关键体内恒定机理方面的内源性缺陷、或宿主防御方面的微妙缺陷所致的过度肺损伤可历经数年导致肺纤维化的显现。当考虑这个复杂疾病的可药用靶标时，更多关注应指向宿主防御和细胞-细胞粘着。
本发明研究结果应实质上影响IIP的未来遗传、诊断和药理学研究。此处报道的累积GWASSNP解释约三分之一的IIP显现风险可变性，表明除对罕见变异、表观遗传特征和基因-环境相互作用的研究之外，有理由用更大群组进一步考查常见变异。尽管已充分确定这些疾病的临床表现形式，但变得日益明确的是各类型的IIP是由可能具有不同预后，并且可对药理学干预起差异性应答的多种基因变体引起。因此，在未来治疗试验中分析IIP受试者的基因型可向通过鉴定在选择的患者中有效的药剂进行的药物开发提供信息。实际上，在IIP试验中缺乏对药理遗传学方法的关注可解释为何已发现少数用以改变这些疾病的病程的药剂。此外，IIP的遗传异质性表明表征遗传变体有助于重新定义IIP的类型以使我们可为患者和他们的家族提供更准确的预后信息。
应了解本文所述的实例和实施方案仅出于说明目的，并且根据其的各种修改或变化将向本领域技术人员提议，并将包括在本申请的精神和范围以及随附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利、专利申请、网站和数据库都对于所有目的以引用的方式整体并入本文。
表3：被取入重复组中的所有198个SNP的发现组中的基因型计数以及在病例与对照之间的哈迪-温伯格平衡(Hardy-WeinbergEquilibrium，HWE)P值。
a基于NCBI编译版本36的基因组位置
b首先列出的病例中的次要等位基因。
c次要：次要等位基因受试者的计数
dHet：杂合受试者的计数
e主要：主要等位基因(更频繁等位基因)纯合受试者的计数
fHWE拟合优度检验的P值
表4：在重复中被成功分析基因型的所有SNP的重复组中的基因型计数以及在病例与对照之间的哈迪-温伯格平衡(HWE)P值。
a基于NCBI编译版本36的基因组位置
b首先列出的病例中的次要等位基因。
c次要：次要等位基因受试者的计数
dHet：杂合受试者的计数
e主要：主要等位基因(更频繁等位基因)纯合受试者的计数
fHWE拟合优度检验的P值
表5：选择用于重复的所有198个SNP的关联信息。空白重复和联合列对应于在重复中未被成功分析基因型的SNP
MAF：次要等位基因频率；次要等位基因定义为组合的病例和对照组中的次要等位基因；OR：次要等位基因的几率比率；CI：置信区间
表6：使用来自GWAS病例子组、所有重复病例和所有重复对照的联合基因型，在重复中被成功分析基因型的所有181个SNP的调整的关联信息。
a基于相较于对照，对GWAS和重复病例的联合分析以允许针对不关于GWAS组和年龄的rs35705950加以调整；使用与重复病例和对照相同的平台以及在相同时间针对表1SNP和rs35705950再分析GWAS病例的基因型。
b在也包括在那个基因座处来自元分析的最高度相关的SNP的逻辑回归模型中检验各SNP的关联。例外之处是染色体11p15，其中在也包括rs35705950的逻辑回归模型中检验各SNP的关联。

Claims (64)

1.一种用于确定人受试者是否患有间质性肺病或处于显现间质性肺病的风险中的方法，其包括：在来自所述受试者的生物样品中检测以下至少一个：
a)选自由以下组成的组的遗传变体的存在：rs2736100、rs2076295、rs3778337、rs4727443、rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2034650、rs1992272、rsl981997、rs17563986、rs8070723、rs12610495、rs2109069、rs1379326、rs1881984、rs10936599、rs1997392、rs6793295、rs2609255、rs2853676、rs10484326、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs2301160、rs3829223、rs2857476、rs1278769、rs1007177、rs10518693、rs393152、rs12373139、rs17690703、rs2532274、rs2532269、rs2668692、rs169201、rs199533和rs415430；
b)选自由以下组成的组的一种标记基因或多种标记基因的基因表达的水平：与选自由TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、MUC5B、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体组成的组的序列具有至少95％序列同一性的标记基因；
c)由b)的所述标记基因编码的多肽；
d)c)的多肽的片段；以及
e)完全互补于b)的标记基因的至少一部分的多核苷酸；
其中所述至少一种遗传变体、多肽、片段和/或互补多核苷酸的所述存在，和/或所述标记基因的基因表达增加或降低指示所述受试者患有间质性肺病或处于显现间质性肺病的风险中。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述检测的标记基因与b)中的所述相应标记基因共有100％序列同一性。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中确定所述至少一种遗传变体、多肽、片段和/或互补多核苷酸的所述存在，和/或所述标记基因的基因表达增加或降低，并且与标准水平或参照集进行比较。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述标准水平或参照集是根据用于风险预测的统计程序来确定。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述用于风险预测的统计程序包括使用由比例危险系数加权的所述一种标记或多种标记的所述基因表达的总和。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中遗传变体的所述存在是通过PCR来确定。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述遗传变体的所述存在是通过检测福斯特共振能量转移(FRET)来确定。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述遗传变体的所述存在是通过检测多肽的存在或表达水平来确定。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述方法进一步包括使用特异性结合所述多肽或其片段的试剂检测所述多肽的所述存在。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述试剂选自由抗体、抗原结合性抗体衍生物和抗原结合性抗体片段组成的组。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述遗传变体的所述存在或标记基因的表达水平是通过以下方式来确定：自所述生物样品获得RNA；自所述RNA产生cDNA；扩增所述cDNA；以及由所述扩增的cDNA获得所述生物样品中的所述基因的所述表达水平。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中间质性肺病是纤维化肺病。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述间质性肺病是特发性肺纤维化(IPF)、家族性间质性肺炎(FIP)或特发性间质性肺炎(IIP)。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其进一步包括：
a)将所述生物样品中的所述一种标记基因或多种标记基因的所述表达水平与所述标记基因的选自由以下组成的组的对照水平进行比较：
i)所述标记基因的已与间质性肺病相关联的对照水平；以及
ii)所述标记的尚未与间质性肺病相关联的对照水平；以及
b)如果所述生物样品中的所述标记基因的所述表达水平在统计上类似于或大于(a)(i)的所述对照水平，那么将所述受试者选择为患有间质性肺病或处于显现间质性肺病的风险中，或
c)如果所述生物样品中的所述标记基因的所述水平在统计上小于(a)(ii)的所述对照水平，那么将所述受试者选择为被预测未患有间质性肺病或处于显现间质性肺病的风险中。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其进一步包括：
a)将所述生物样品中的所述遗传变体的所述存在与来自患有间质性肺病的受试者或对照组的一组遗传变体进行比较，以及，
b)如果所述生物样品中存在的所述遗传变体与来自所述受试者或对照组的所述遗传标记相同，那么将个体选择为患有间质性肺病或处于显现间质性肺病的风险中，或
c)如果所述生物样品中存在的所述遗传变体不与来自所述受试者或对照组的所述遗传标记相同，那么将所述个体选择为未患有间质性肺病或处于间质性肺病的风险中。
16.一种用于监测人受试者的间质性肺病的进展的方法，其包括：
i)测量自所述受试者获得的第一生物样品中的多种基因标记的表达水平，其中所述多种标记包括多种选自由以下组成的组的标记：
a)与选自由以下组成的组的序列具有至少95％序列同一性的标记基因：TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、MUC5B、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体；
b)由a)的所述标记基因编码的多肽；
c)b)的多肽的片段；以及
d)完全互补于a)的标记基因的至少一部分的多核苷酸；
ii)测量自所述受试者获得的第二生物样品中的所述多种标记的表达水平；以及
iii)将在所述第一样品中测量的所述标记的所述表达水平与在所述第二样品中测量的所述标记的所述水平进行比较。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述检测的标记基因与a)中的所述相应标记基因共有100％序列同一性。
18.如权利要求16所述的方法，其进一步包括进行选自由以下组成的组的追踪步骤：胸部CT扫描以及对来自所述受试者的肺组织的病理检查。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述来自所述受试者的第一生物样品是在时间t0获得，并且所述来自所述受试者的第二生物样品是在稍后时间t1获得。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其进一步包括测量至少一个额外时间自所述受试者获得的至少一个其它生物样品中的所述多种标记的表达水平，以及将在所述第一样品和所述第二样品中测量的所述标记的所述表达水平与在所述至少一个其它样品中测量的所述标记的所述水平进行比较。
21.如权利要求16-20中任一项所述的方法，其进一步包括当所述第二样品中的所述标记的所述表达水平高于所述第一样品的所述标记的所述表达水平时，推荐针对间质性肺病的治疗。
22.如权利要求16-21中任一项所述的方法，其中所述间质性肺病是特发性肺纤维化(IPF)、家族性间质性肺炎(FIP)或特发性间质性肺炎。
23.一种评估对人受试者的间质性肺病的治疗的功效的方法，所述方法包括：
i)测定在时间t0自所述受试者获得的第一样品中测量的标记的表达水平，其中所述标记选自由以下组成的组：
a)与选自由以下组成的组的序列具有至少95％序列同一性的标记基因：TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、MUC5B、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体；
b)由a)的所述标记基因编码的多肽；
c)b)的多肽的片段；以及
d)完全互补于a)的标记基因的至少一部分的多核苷酸；
ii)测定在稍后时间t1自所述受试者获得的第二样品中的所述标记的表达水平；以及
iii)进行追踪步骤，所述追踪步骤选自进行胸部CT扫描以及对来自所述受试者的肺组织进行病理检查；
其中相对于所述第一样品，所述第二样品中的所述标记的所述表达水平的降低指示所述治疗有效治疗所述受试者的间质性肺病。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述检测的标记基因与a)中的所述相应标记基因共有100％序列同一性。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述时间t0在已向所述受试者施用所述治疗之前，而所述时间t1在已向所述受试者施用所述治疗之后。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中间质性肺病是特发性肺纤维化(IPF)、家族性间质性肺炎(FIP)或特发性间质性肺炎(IIP)。
27.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述时间t0在已向所述受试者施用所述治疗之后，而所述时间t1在已向所述受试者施用所述治疗之后迟于时间t0。
28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述治疗是多次施用。
29.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述对自所述受试者获得的生物样品的比较是历经一定时间范围加以重复。
30.一种用于预测对针对人受试者的间质性肺病的疗法的应答的测定系统，其包括用以检测以下至少一个的工具：
a)选自由以下组成的组的遗传变体的存在：rs2736100、rs2076295、rs3778337、rs4727443、rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2034650、rs1992272、rs1981997、rs17563986、rs8070723、rs12610495、rs2109069、rs1379326、rs1881984、rs10936599、rs1997392、rs6793295、rs2609255、rs2853676、rs10484326、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs2301160、rs3829223、rs2857476、rs1278769、rs1007177、rs10518693、rs393152、rs12373139、rs17690703、rs2532274、rs2532269、rs2668692、rs169201、rs199533和rs415430；以及
b)选自由以下组成的组的一种标记基因或多种标记基因的基因表达水平：与选自由TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3、C17orf69或其同源物或变体组成的组的序列具有至少95％序列同一性的标记基因；
c)由b)的所述标记基因编码的多肽；
d)c)的多肽的片段；以及
e)完全互补于b)的标记基因的至少一部分的多核苷酸。
31.如权利要求30所述的测定系统，其中所述用以检测的工具包括包含所述标记多态性或基因的至少10至50个连续核酸或其互补核酸序列的核酸探针。
32.如权利要求30或31所述的测定系统，其中所述用以检测的工具包括与邻近或包含(a)的所述遗传变体的序列杂交的核酸引物或探针。
33.如权利要求32所述的测定系统，其中至少一种所述引物或探针用福斯特共振能量转移(FRET)接受体标记，并且至少一种所述引物或探针用FRET供体标记。
34.如权利要求30所述的测定系统，其中所述用以检测的工具包括特异性检测由所述标记基因编码的多肽的结合配体。
35.如权利要求30所述的测定系统，其中所述检测的基因与b)中的所述相应标记基因共有100％序列同一性。
36.如权利要求30所述的测定系统，其中所述用以检测的工具包括配置在测定表面上的核酸探针和结合配体中的至少一种。
37.如权利要求36所述的测定系统，其中所述测定表面包括芯片、阵列、珠粒、微流体表面或流动卡。
38.如权利要求36所述的测定系统，其中所述探针包含所述标记基因的至少10至50个连续核酸的互补核酸序列。
39.如权利要求36所述的测定系统，其中所述结合配体包括抗体、抗原结合性抗体衍生物或抗原结合性抗体片段。
40.如权利要求30所述的测定系统，其进一步包括：选自含有预定对照水平和一组遗传变体和/或标记基因的已与患有间质性肺病的受试者的诊断、显现、进展或预期寿命相关联的信息的对照。
41.一种用于预测、诊断或预后间质性肺病的试剂盒，其包括用于检测选自由以下组成的组的基因中的遗传变体的核酸探针或引物：TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、MUC5B、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3和C17orf69。
42.如权利要求41所述的试剂盒，其包括扩增所述所选基因中的核酸的PCR引物。
43.如权利要求41或42所述的试剂盒，其中所述探针或引物互补于所述遗传变体的变异核苷酸。
44.如权利要求41-43中任一项所述的试剂盒，其中标记所述探针或引物。
45.如41-44中任一项所述的试剂盒，其包括用福斯特共振能量转移(FRET)接受体标记的探针或引物以及用FRET供体标记的探针或引物。
46.如权利要求41-45中任一项所述的试剂盒，其包括用于检测至少两个选自由以下组成的组的基因中的遗传变体的核酸探针或引物：TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、MUC5B、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3和C17orf69。
47.如权利要求41-46中任一项所述的试剂盒，其中所述核酸探针或引物被包括在阵列、珠粒、微流体表面或芯片上。
48.一种用于预测、诊断或预后间质性肺病的试剂盒，其包括至少一种用于检测选自由以下组成的组的遗传变体的核酸探针或引物：rs2736100、rs2076295、rs3778337、rs4727443、rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2034650、rs1992272、rs1981997、rs17563986、rs8070723、rs12610495、rs2109069、rs1379326、rs1881984、rs10936599、rs1997392、rs6793295、rs2609255、rs2853676、rs10484326、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs2301160、rs3829223、rs2857476、rs1278769、rs1007177、rs10518693、rs393152、rs12373139、rs17690703、rs2532274、rs2532269、rs2668692、rs169201、rs199533和rs415430。
49.如权利要求48所述的试剂盒，其包括扩增跨过所述所选遗传变体的位置的核酸的PCR引物。
50.如权利要求48或49所述的试剂盒，其中所述至少一种探针或引物互补于所述所选遗传变体的变异核苷酸。
51.如权利要求48-50中任一项所述的试剂盒，其包括一种用福斯特共振能量转移(FRET)接受体标记的探针或引物以及一种用FRET供体标记的探针或引物。
52.如权利要求48-51中任一项所述的试剂盒，其包括至少一种用于检测至少两种选自由以下组成的组的遗传变体的核酸探针或引物：rs2736100、rs2076295、rs3778337、rs4727443、rs868903、rs7934606、rs6421972、rs7480563、rs7942850、rs4077759、rs2334659、rs7122936、rs2034650、rs1992272、rs1981997、rs17563986、rs8070723、rs12610495、rs2109069、rs1379326、rs1881984、rs10936599、rs1997392、rs6793295、rs2609255、rs2853676、rs10484326、rs10748858、rs2067832、rs11191865、rs2301160、rs3829223、rs2857476、rs1278769、rs1007177、rs10518693、rs393152、rs12373139、rs17690703、rs2532274、rs2532269、rs2668692、rs169201、rs199533和rs415430。
53.如权利要求48-52中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种核酸探针或引物被包括在阵列、珠粒、微流体表面或芯片上。
54.如权利要求41-53中任一项所述的试剂盒，其进一步包括来自(i)未患有间质性肺病的一个受试者或多个受试者和/或(ii)患有间质性肺病的一个受试者或多个受试者的对照样品。
55.一种试剂盒，其包括与选自由以下组成的组的基因中的遗传变体杂交的核酸引物或探针：TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、MUC5B、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3和C17orf69。
56.如权利要求55所述的试剂盒，其进一步包括扩增跨过所述遗传变异核苷酸的位置的核酸的PCR引物。
57.如权利要求55或56所述的试剂盒，其中标记所述至少一种探针或引物和/或PCR引物。
58.如权利要求57所述的试剂盒，其包括至少一种用福斯特共振能量转移(FRET)接受体标记的探针或引物以及至少一种用FRET供体标记的探针或引物。
59.如权利要求55-58中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种探针或引物能够与所述所选基因的扩增产物杂交。
60.一种体外复合物，其包含与遗传变异核酸的杂交第一核酸探针，其中所述遗传变异核酸包含遗传变异TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、MUC5B、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3或/和C17orf69基因序列，其中所述遗传变异核酸是自患有或怀疑患有间质性肺病的人受试者提取，或是自患有或怀疑患有间质性肺病的人受试者提取的核酸的扩增产物。
61.如权利要求60所述的体外复合物，其中所述复合物进一步包含与所述遗传变异核酸杂交的第二标记的核酸探针。
62.如权利要求61所述的体外复合物，其中所述第一标记的核酸探针包含第一标记，并且所述第二标记的核酸探针包含第二标记，其中所述第一标记和所述第二标记能够进行福斯特共振能量转移(FRET)。
63.一种体外复合物，其包含结合于遗传变异核酸的热稳定聚合酶，所述遗传变异核酸包含遗传变异TERT、DSP、MUC2、DISP2、MAPT、DPP9、CSMD1、MYNN、LRRC34、FAM13A、OBFC1、TOLLIP、MUC5B、ATP11A、IVD、CRHR1、IMP5、LOC100128977、KIAA1267、NSF、WNT3或C17orf69基因序列，其中所述遗传变异核酸是自患有或怀疑患有间质性肺病的人受试者提取，或是自患有或怀疑患有间质性肺病的人受试者提取的核酸的扩增产物。
64.如权利要求63所述的体外复合物，其中所述复合物进一步包含与所述遗传变异核酸杂交的核酸引物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107677835A (zh) * 2017-09-26 2018-02-09 上海市肺科医院 一种ae‑ipf的蛋白标记物及其应用
CN108660206A (zh) * 2018-08-14 2018-10-16 安徽未名天佳基因科技有限公司 预测或辅助预测肺部辐射后患放射性肺炎风险的遗传生物标记物及其应用
CN110184355A (zh) * 2019-06-06 2019-08-30 四川大学华西第二医院 一种与宫颈鳞癌发生发展相关的生物标志物及其应用

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4039821A3 (en) 2013-02-14 2022-11-02 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods for predicting risk of interstitial pneumonia
WO2015198144A2 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Techflux, Ltd. Method and device for transmitting data unit
WO2017066796A2 (en) * 2015-10-16 2017-04-20 The Children's Medical Center Corporation Modulators of telomere disease
WO2017066712A2 (en) 2015-10-16 2017-04-20 The Children's Medical Center Corporation Modulators of telomere disease
WO2017121769A1 (en) * 2016-01-12 2017-07-20 bioMérieux In vitro method for predicting a risk of developing pneumonia in a subject
CA3068546A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Biomarkers for the diagnosis and treatment of fibrotic lung disease
JP2020526218A (ja) 2017-07-14 2020-08-31 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 移植拒絶リスクを予測する新規の方法
WO2019178143A1 (en) * 2018-03-12 2019-09-19 The Regents Of The University Of California Assessing transplant rejection status by analysis of t-cell receptor subunit repertoire diversity
KR20210022622A (ko) * 2018-06-06 2021-03-03 렉센트 바이오, 인크. 생물학적 샘플의 핑거프린팅 방법
JP7300642B2 (ja) * 2019-06-14 2023-06-30 国立大学法人浜松医科大学 特発性肺線維症の予後予測方法
RU2720713C9 (ru) * 2020-03-27 2020-05-18 Евгений Олегович Рубальский Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления рнк коронавируса
RU2732608C1 (ru) * 2020-04-09 2020-09-21 Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-2019, методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени
RU2727054C1 (ru) * 2020-04-24 2020-07-17 Сергей Феликсович Дрозд Способ выявления кДНК коронавируса SARS-CoV-2 с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции
JP2021197100A (ja) * 2020-06-18 2021-12-27 国立研究開発法人産業技術総合研究所 情報処理システム、情報処理方法、同定方法及びプログラム
DE102020005556B4 (de) 2020-09-02 2023-07-06 Gesellschaft für Individualisierte Medizin mbH Verfahren zur Prognose der Schwere des Verlaufs einer COVID-19-Erkrankung

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020197646A1 (en) * 2001-02-14 2002-12-26 Nogee Lawrence M. Single nucleotide polymorphisms associated with interstitial lung disease
WO2011094345A1 (en) * 2010-01-26 2011-08-04 National Jewish Health Methods and compositions for risk prediction, diagnosis, prognosis, and treatment of pulmonary disorders

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US7235406B1 (en) 1996-04-03 2007-06-26 Applera Corporation Nucleic acid analysis device
US6825047B1 (en) 1996-04-03 2004-11-30 Applera Corporation Device and method for multiple analyte detection
US6272939B1 (en) 1999-10-15 2001-08-14 Applera Corporation System and method for filling a substrate with a liquid sample
US6514750B2 (en) 2001-07-03 2003-02-04 Pe Corporation (Ny) PCR sample handling device
US20120034214A1 (en) * 2010-07-22 2012-02-09 Isis Innovation Limited Methods and kits for determining the prognosis of pulmonary sarcoidosis
EP4039821A3 (en) 2013-02-14 2022-11-02 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods for predicting risk of interstitial pneumonia

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020197646A1 (en) * 2001-02-14 2002-12-26 Nogee Lawrence M. Single nucleotide polymorphisms associated with interstitial lung disease
WO2011094345A1 (en) * 2010-01-26 2011-08-04 National Jewish Health Methods and compositions for risk prediction, diagnosis, prognosis, and treatment of pulmonary disorders

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALESSANDRA等: "Mutation in Human Desmoplakin Domain Binding to Plakoglobin Causes a Dominant Form of Arrthythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy", 《AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS》 *
FINGERLIN等: "Genome-wide association study identifies multiple susceptibility loci pulmonary fibrosis", 《NATURE GENETICS》 *
MARTIN G LARSON等: "Framingham Heart Study 100K project: genome-wide associations for cardiovascular disease outcomes", 《BMC MEDICAL GENETICS》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107677835A (zh) * 2017-09-26 2018-02-09 上海市肺科医院 一种ae‑ipf的蛋白标记物及其应用
CN107677835B (zh) * 2017-09-26 2019-08-09 上海市肺科医院 一种ae-ipf的蛋白标记物及其应用
CN108660206A (zh) * 2018-08-14 2018-10-16 安徽未名天佳基因科技有限公司 预测或辅助预测肺部辐射后患放射性肺炎风险的遗传生物标记物及其应用
CN108660206B (zh) * 2018-08-14 2022-11-22 天佳吉瑞基因科技有限公司 预测或辅助预测肺部辐射后患放射性肺炎风险的遗传生物标记物及其应用
CN110184355A (zh) * 2019-06-06 2019-08-30 四川大学华西第二医院 一种与宫颈鳞癌发生发展相关的生物标志物及其应用

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Publication number Publication date
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