KR20160037137A - 패혈증 바이오마커 및 이의 사용 - Google Patents

Abstract

패혈증의 전세계 발생률이 빠른 고령화로 인한 노인 환자의 증가와 함께 상승하고 있다. 패혈증의 진단 및/또는 예후를 위한 효과적인 바이오마커에 대한 필요성이 있다. 본 발명은 패혈증의 검출 및/또는 예측을 위한 진단 및/또는 예후 바이오마커에 관한 것이다. 본 발명은, 패혈증 연속체의 상태 또는 조건을 포함하는, 피실험자의 패혈증의 검출 및/또는 예후를 위한 바이오마커인 미리 정해진 유전자 패널을 개시한다.

Description

패혈증 바이오마커 및 이의 사용 {SEPSIS BIOMARKERS AND USES THEREOF}

본 발명은 패혈증의 검출 및/또는 예측을 위한 진단 및/또는 예후 바이오마커에 관한 것이다.

본 발명의 배경인 다음 논의는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위한 것이다. 그렇지만 상기 논의는 언급된 임의의 물질이 본 출원의 우선일에 어느 관할에서 공표되거나 알려지거나 보통의 일반적인 지식의 일부라는 점의 인정 또는 시인은 아닌 것으로 이해해야 한다.

패혈증은 박테리아 또는 바이러스, 진균 및 기생충과 같은 다른 감염원에 의해 기인된 감염에 대한 숙주 반응에서 발생한다. 이러한 반응은 전신염증반응증후군(Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS)이라고 한다. 패혈증의 결과는, 장기 및 조직의 부수적 손상을 초래하며 과다형성(over-exuberant)될 수 있는 병원균 침해 및 숙주 반응의 독성에 의해 결정된다. 일반적으로 패혈증이 발생한 경우, 숙주의 몸은 염증이 생긴 혈관 내벽에 형성되는 혈전을 용해할 수 없고, 장기로 흐르는 혈액을 제한하고, 결과적으로 장기부전 또는 괴저로 이어진다.

패혈증은 일반적으로 감염과 함께 시작하여, SIRS로 이어지고, 그런 다음 패혈증, 뒤이어 중증 패혈증 그리고 최종적으로 다장기 기능장애 및 사망에 이르는 패혈증성 쇼크로 이어지는 이질성 질병 과정의 연속체이다. 패혈증의 전세계 발생률은 빠른 고령화로 인한 노인 환자의 관심 증가와 함께 상승하고 있다. 대략 중증 패혈증 환자의 1/3 내지 1/2이 사망했다. 패혈증으로의 진행 이전에 감염이 의심되는 환자의 조기 분류 및 시기적절한 개입은, 패혈증이 종종 너무 늦은 단계에서 진단되기 때문에, 전세계 의사들에게 중요한 임상 도전으로 남아있다.

패혈증의 조기 진단은, 패혈증에서 SIRS 임상 증상이 생화학적이고 면역학적인 반응에 의해 선행되기 때문에 도전적이다. 게다가 SIRS 기준은 매우 포괄적이어서 경계선 결과가 진단 불명확을 초래한다. 게다가 감염은 단지 SIRS에 이를 수 있는 변화무쌍한 조건 중의 하나이며, 나머지는 무균성(sterile) 염증이다. 백혈구, 젖산, 혈당 및 혈소판 수와 같은 현재 이용 가능한 패혈증의 표준 실험실 징후는 비특이성이다. 패혈증 환자의 약 1/3에서, 원인균이 발견되지 않으며, 게다가 항균제 치료의 조기 시작 또는 더 나쁘게는 항균계에 대한 저항을 영구화하는 광범위 항생제의 자유로운 사용을 방해한다.

사이토카인, 케모카인, 급성기단백질, 가용성 수용체 및 세포 표면 마커와 같은 패혈증 바이오마커를 찾기 위한 이전의 연구는

염증의 감염성 원인과 비감염성 원인을 확실하게 구별하지 않았다.

SIRS 및 감염의 숙주 반응이 다양한 경로에 의해 조절되어 정확한 바이오마커를 얻기 위한 활동을 복잡하게 만들기 때문에,

패혈증의 진단을 위한 정확한 바이오마커를 얻는 것은 어렵다.

게다가 유용한 이용 가능한 예후의 바이오마커의 수 또한 매우 적다.

따라서 앞서 언급된 문제점들을 극복, 또는 적어도 완화하는, 패혈증 및 패혈증 연속체 상태의 진단 및/또는 예후를 위한 강력하고 효과적인 바이오마커에 대한 필요성이 있다.

본 발명은 어려움 일부를 개선하기 위한 대상체에서의 패혈증 및 패혈증 연속체 상태의 검출 및/또는 예후를 위한 새로운 방법과 패혈증 검출 및/또는 예측에 대한 현재 방법의 보완을 제공하는 것이다. 본 발명은 게다가 대상체에서 패혈증 및 패혈증 연속체 상태의 검출 및/또는 예후를 위한 키트(kits)를 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 패혈증에 대해 양성 반응을 보인 대상체에서 패혈증의 중증도(severity)를 평가 및/또는 예측하는 새로운 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는 상기 방법은 대상체가 감염, 경증 패혈증 및 중증 패혈증으로부터 선택된 복수의 조건 중 하나 및/또는 패혈증 연속체 상태에서 선택된 복수의 조건 중 하나를 갖는 지 여부를 평가하기 위한 것이다. 게다가 본 발명은 패혈증에 양성 반응을 보인 대상체에서 패혈증의 중증도 평가 및/또는 예측을 위한 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 환자의 혈액 샘플에서 분리된 백혈구의 유전자 발현 프로파일링으로부터 수득된 진단 바이오마커로서 다중유전자 시그너쳐에 기초하며, 이는 현존하는 방법보다 상당히 정확하고 예기적인 진단을 제공한다. 유전자 세트를 포함하는 상기 진단 바이오마커는 염증 반응, 호르몬 신호법, 내피세포 장애(endothelial dysfunction), 혈액 응고, 장기 부상 등의 광범위하고 집중적인 효과를 선택적으로 반영한다.

본 발명은 qPCR 분석에 의해 입증된 마이크로어레이 전장 유전체(genome wide) 발현 프로파일에서 수득된 유전자 세트에 관한 것이다. 놀랍게도 마이크로어레이 유전자 발현 프로파일링 결과의 계층적 클러스터링이 패혈증 연속체, 즉 조절, 감염, 비감염 전신염증반응증후군(SIRS) 또는 패혈증, 중증 패혈증, 이해하기 어려운(cryptic) 쇼크 및 패혈성 쇼크 환자 백혈구의 유전자 발현 패턴에서 큰 차이를 입증했다. 패혈증 동안에 다르게 발현된 유전자는 마이크로어레이 유전자 프로파일에서 수득되었고, 유전자 패널은 초기 33,000개로부터 최종 선정되었다. 게다가 놀랍게도, qPCR을 사용한 분석 확인은 이러한 유전자 패널 또는 바이오마커는, 패혈증 연속체에서 상향 또는 하향 조절과 같이 점진적으로 조절되지 않으며, 이는 마이크로어레이 결과와 상관관계가 있다. 백혈구의 유전자 발현 변화가 분명하게 관찰되고 패혈증 및 패혈증 연속체의 상태의 진단 및/또는 예후를 위해 이용될 수 있다.

게다가 놀랍게도, 소정의 많은 유전자 패널 또는 바이오마커가 임의의 조합으로 패혈증 및 패혈증 연속체의 상태의 진단 및/또는 예후를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 제 1 양태에 따르면, 대상체에서 패혈증을 검출하고 예측하는 방법이 제공되며, 상기 방법은

1) 대상체에서 분리된 제 1 샘플에서 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계,

2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 측정 레벨을 비교하는 단계

를 포함하고,

적어도 하나의 바이오마커는

(a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는(encode) 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체(complement)

로 이루어진 군에서 선택되고,

제 1 샘플에서 측정된 레벨과 기준 레벨 사이의 차이는 제 1 샘플에 존재하는 패혈증을 나타낸다.

바람직하게는, 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 비교해서, 제 1 샘플에서 측정된 적어도 하나의 바이오마커의 레벨 증가를 대상체에서 검출함으로서 패혈증의 존재가 결정되고, 적어도 하나의 바이오마커는

(a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체

로 이루어진 군에서 선택된다.

바람직하게는, 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 비교해서, 제 1 샘플에서 측정된 적어도 하나의 바이오마커의 레벨 감소를 대상체에서 검출함으로써 패혈증의 존재가 결정되고, 적어도 하나의 바이오마커는

(a) SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체

로 이루어진 군에서 선택된다.

바람직하게는, 상기 기준 레벨은 패혈증이 아닌 적어도 하나의 대상체에서 분리된 제 2 샘플에 있는 상응하는 바이오마커의 레벨이다.

바람직하게는, 상기 비교 단계는 대상체에서 패혈증의 유무를 결정하거나 예측하기 위한 결정 룰의 적용 단계를 포함한다.

본 발명의 제 2 양태에 따르면, 대조, 감염, 비감염 전신염증반응증후군(SIRS), 경증 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크 및 애매한(cryptic) 쇼크로 구성된 군에서 선택된 복수의 조건 중 하나가 대상체에게 있는지 여부를 검출하거나 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

1) 대상체에서 분리된 제 1 샘플의 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계; 및

2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 측정 레벨을 비교하는 단계

를 포함하고, 적어도 하나의 바이오마커는

(a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는(encode) 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체(complement)

로 이루어진 군에서 선택되고,

제 1 샘플에서 측정된 레벨은 기준 레벨과 통계학적으로 실질적으로 유사하고 대상체가 조건 중 하나를 가지고 있는지 여부를 나타낸다.

바람직하게는, 상기 기준 레벨은, 통제 대상체, 감염 양성 대상체, 비감염 SIRS 양성 대상체, 경증 패혈증 양성 대상체, 중증 패혈증 양성 대상체 및 애매한 쇼크 양성 대상체로 구성된 군으로 선택된 적어도 하나의 대상체에서 분리된 제 2 샘플의 상응하는 바이오마커의 레벨이다.

바람직하게는, 상기 비교 단계는 대상체가 조건 중 하나가 있는지 여부를 결정하거나 예측하기 위한 결정 룰을 적용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 제 3 양태에 따르면, 제 1 양태의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는

1) 대상체의 제 1 샘플의 바이오마커의 레벨을 정량하기 위한 적어도 하나의 바이오마커에 특별히 결합할 수 있는 적어도 하나의 시약; 및

2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨을 나타내는 표준품(reference standard)

으로 구성된다.

바람직하게는, 상기 적어도 하나의 시약은 적어도 하나의 바이오마커에 특별히 결합할 수 있는 적어도 하나의 항체를 포함한다.

바람직하게는, 상기 키트는 게다가 제 1 샘플의 적어도 하나의 추가적인 바이오마커에 특별히 결합할 수 있는 적어도 하나의 추가적인 시약, 및 상응하는 적어도 하나의 추가적인 바이오마커의 기준 레벨을 나타내는 표준품을 추가로 포함한다.

본 발명의 제 4 양태에 따르면, 제 2 양태의 방법을 수행하는 키트를 제공하며, 상기 키트는

1) 대상체의 제 1 샘플의 바이오마커의 레벨을 정량하기 위한 적어도 하나의 바이오마커에 특별히 결합할 수 있는 적어도 하나의 시약; 및

2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨을 나타내는 표준품

으로 구성된다.

바람직하게는, 상기 적어도 하나의 시약이 적어도 하나의 바이오마커에 특별히 결합할 수 있는 적어도 하나의 항체를 포함한다.

바람직하게는, 상기 키트는 게다가 제 1 샘플의 적어도 하나의 추가적인 바이오마커에 특별히 결합할 수 있는 적어도 하나의 추가적인 시약, 및 상응하는 적어도 하나의 추가적인 바이오마커의 기준 레벨을 나타내는 표준품을 포함한다.

본 발명의 제 5 양태에 따르면, 대상체에서 패혈증을 검출하고 예측하는 키트를 제공하고, 상기 키트는 대상체로부터 분리된 제 1 샘플의 적어도 하나의 바이오마커에 선택적으로 결합할 수 있는 항체, 및 항체와 적어도 하나의 바이오마커의 보체 성분 사이에 형성된 복합체의 검출을 위한 시약, 및 상응하는 바이오마커의 기준 레벨을 나타내는 표준폼을 포함하고, 상기 적어도 하나의 바이오마커는

(a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는(encode) 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체(complement)

로 이루어진 군에서 선택되고,

제 1 샘플에서 측정된 적어도 하나의 바이오마커의 레벨과 기준 레벨의 차이는 제 1 샘플에 존재하는 패혈증을 나타낸다.

바람직하게는, 상기 기준 레벨은 패혈증이 아닌 적어도 하나의 대상체로부터 분리된 제 2 샘플의 상응하는 바이오마커의 레벨이다.

본 발명의 제 6 양태에 따르면, 대조, 감염, 비감염 전신염증반응증후군(SIRS), 경증 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크 및 애매한 쇼크로 구성된 군에서 선택된 복수의 조건 중 하나를 대상체가 가지고 있는지 여부를 검출하거나 예측하는 키트를 제공하며, 상기 키트는 대상체로부터 분리된 제 1 샘플의 적어도 하나의 바이오마커에 선택적으로 결합할 수 있는 항체, 및 항체와 적어도 하나의 바이오마커의 보체 성분 사이에 형성된 복합체를 검출하는 시약, 및 상응하는 바이오마커의 기준 레벨을 나타내는 표준품을 포함하고, 상기 적어도 하나의 바이오마커는

(a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는(encode) 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체(complement)

로 구성된 군에서 선택되고,

제 1 샘플에서 측정된 적어도 하나의 바이오마커의 레벨이 기준 레벨과 통계적으로 실질적으로 유사하고 대상체가 상기 조건 중 하나를 갖는지 여부를 나타낸다.

바람직하게는, 상기 기준 레벨은, 통제 대상, 감염 양성 대상체, 비감염 SIRS 양성 대상체, 경증 패혈증 양성 대상체, 중증 패혈증 양성 대상체 및 애매한 쇼크 양성 대상체로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 대상체로부터 분리된 제 2 샘플의 상응하는 바이오마커의 레벨이다.

본 발명의 제 7 양태에 따르면, 대상체에서 패혈증을 검출하거나 예측하는 방법을 제공하고, 상기 방법은

1) 대상체로부터 분리된 제 1 샘플의 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계; 및

2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 측정 레벨을 비교하는 단계

를 포함하고, 상기 적어도 하나의 바이오마커는

(a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 하나 이상의 그리고 임의의 모든 조합에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함히고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는(encode) 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 하나 이상의 서열에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체(complement)

로 구성된 군에서 선택되고,

제 1 샘플의 측정 레벨과 기준 레벨의 차이는 제 1 샘플에 존재하는 패혈증을 나타낸다.

본 발명의 제 8 양태에 따르면, 통제, 감염, 비감염 전신염증반응증후군(SIRS), 경증 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크 및 애매한 쇼크로 구성된 군에서 선택된 복수의 조건 중 하나를 대상체가 가지고 있는지 여부를 검출하거나 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

1) 대상체로부터 분리된 제 1 샘플의 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계; 및

2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 측정 레벨을 비교하는 단계

를 포함하고, 적어도 하나의 바이오마커는

(a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 하나 이상의 그리고 임의의 모든 조합에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는(encode) 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 하나 이상의 서열에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체(complement)

로 구성된 군에서 선택되고,

제 1 샘플의 측정 레벨은 기준 레벨과 통계학적으로 실질적으로 유사하고 대사에가 상기 조건 중 하나를 갖는지 여부를 나타낸다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 대상체의 패혈증 진단을 위해 소정의 유전자 패널로부터 선택된 적어도 하나의 유전자가 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태는 대상체의 패혈증 예후를 위해 미리 정해진 유전자 패널로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 대상체의 패혈증을 검출하거나 예측하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 대상체로부터 수득된 적합한 유체 샘플의 소정의 유전자 패널로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 적어도 하나의 패혈증 연속체 마커 발현 산물의 레벨을 측정하는 단계와, 적어도 하나의 통제 대상(control subject)의 상응하는 패혈증 연속체 마커 발현 산물의 레벨과 측정 레벨을 비교하는 방법을 포함하고, 적어도 하나의 패혈증 연속체 마커 발현 산물의 레벨과 상응하는 패혈증 연속체 마커 발현 산물의 레벨의 차이는 대상체에 존재하는 패혈증을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 양태는 감염, 경증 패혈증 및 중증 패혈증으로부터 선택된 복수의 조건 중 하나가 대상체에 있는지 여부를 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 대상체로부터 수득된 적합한 유체 샘플의 소정의 유전자 패널로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 적어도 하나의 패혈증 연속체 마커 발현 산물의 레벨을 측정하는 단계, 및 복수의 통제 대상의 상응하는 패혈증 연속체 마커 발현 산물의 레벨과 측정 레벨을 비교하는 단계를 포함하고, 상기 통제 대상은 적어도 하나의 감염 양성 대상체, 적어도 하나의 경증 패혈증 양성 대상체 및 적어도 하나의 중증 패혈증 양성 대상체이며, 적어도 하나의 발현 산물의 레벨이 통제 대상 중 어느 하나의 상응하는 패혈증 연속체 마커 발현 산물의 레벨과 통계적으로 실질적으로 유사할 때, 대상체가 상기 조건 중 하나를 갖는지 여부를 나타낸다.

본 발명의 또 다른 양태는 대상체에서 패혈증의 검출 및/또는 예후를 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 대상체로부터 수득된 적합한 유체 샘플의 소정의 유전자 패널로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 적어도 하나의 패혈증 연속체 마커 발현 산물에 선택적으로 결합할 수 있는 항체, 및 항체와 적어도 하나의 발현 산물의 보체 성분 사이에 형성된 복합체의 검출을 위한 시약을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 대상체에서 패혈증의 중증도를 평가하고/평가하거나 예측하는 키트를 제공하고, 상기 키트는 대상체로부터 수득된 적합한 유체 샘플의 소정의 유전자 패널로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 적어도 하나의 패혈증 연속체 마커 발현 산물에 선택적으로 결합할 수 있는 항체, 및 항체와 적어도 하나의 발현 산물의 보체 성분 사이에 형성된 복합체의 검출을 위한 시약을 포함한다.

바람직하게는, 상기 키트는 대상체가 감염, 경증 패혈증 및 중증 패혈증으로부터 선택된 복수의 조건 중 하나를 갖는지 또는 걸릴 위험성이 있는지 여부를 평가하기 위한 것이다.

바람직하게는, 상기 적어도 하나의 유전자는 하기의 군으로 이루어진 소정의 유전자 패널로부터 선택된다 : 호모 사피엔스 아실-CoA 합성효소 긴사슬 패밀리 멤버 1 (ACSL1) 유전자, 호모 사피엔스 아넥신 A3 (ANXA3) 유전자, 호모 사피엔스 시스테인-풍부 막투과(transmembrane) 모듈 함유 1 (CYSTM1) 유전자, 호모 사피엔스 염색체 19 오픈 리딩 프레임 59 (C19orf59) 유전자, 호모 사피엔스 콜로니 자극 인자 2 수용체, 베타, 낮은-친화성 (과립구-대식세포)(CSF2RB) 유전자, 호모 사피엔스 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box 폴리펩티드 60-like (DDX60L) 유전자, 호모 사피엔스 Fc fragment of lgG, 높은 친화성 lb, 수용체 (CD64)(FCGR1B) 유전자, 호모 사피엔스 유리 지방산 수용체 2 (FFAR2) 유전자, 호모 사피엔스 포르밀 펩티드 수용체 2 (FPR2) 유전자, 호모 사피엔스 열 쇼크 70kDa 단백질 1B (HSPA1B) 유전자, 호모 사피엔스 인터페론 유도형 막투과 단백질 1 (IFITM1) 유전자, 호모 사피엔스 인터페론 유도형 막투과 단백질 3 (IFITM3) 유전자, 호모 사피엔스 인터류킨 1, 베타 (IL1B) 유전자, 호모 사피엔스 인터류킨 1 수용체 길항제 (IL1RN) 유전자, 호모 사피엔스 백혈구 면역글로불린-유사 수용체, 서브패밀리 A (TM 도메인 포함), 멤버 5 (LILRA5) 유전자, 호모 사피엔스 류신-풍부 알파-2-글리코단백질 1 (LRG1) 유전자, 호모 사피엔스 골수 세포 백혈병 서열 1 (BCL2-관련) (MCL1) 유전자, 호모 사피엔스 NLR 패밀리, 아포토시스 방해 단백질 (NAIP) 유전자, 호모 사피엔스 핵 인자 인터류킨 3 제어 (NFIL3) 유전자, 호모 사피엔스 5‘-뉴클레오티드분해효소, 시토졸 Ⅲ (NT5C3) 유전자, 호모 사피엔스 6-포스포프룩토-2-키나아제/프룩토스-2,6-비포스파타제 3 (PFKFB) 유전자, 호모 사피엔스 포스포리피드 scramblase 1 (PLSCR1) 유전자, 호모 사피엔스 프로키네티신 2 (PROK2) 유전자, 호모 사피엔스 RAB24, 멤버 RAS 발암유전자 패밀리 (RAB24) 유전자, 호모 사피엔스 S100 칼슘 결합 단백질 A12 (S100A12) 유전자, 호모 사피엔스 셀렉틴 L (SELL) 유전자, 호모 사피엔스 용질 운송체 패밀리 22 (유기 양이온/에르고티오네인 수송체), 멤버 4 (SLC22A4) 유전자, 호모 사피엔스 수퍼옥시드 디스뮤타아제 2, 미토콘드리아 (SOD2) 유전자, 호모 사피엔스 SP100 핵 항원 (SP100) 유전자, 호모 사피엔스 톨-유사 수용체 4 (TLR4) 유전자, 호모 사피엔스 케모카인 (C-C 모티브) 리간드 5 (CCL5) 유전자, 호모 사피엔스 CD3d 분자, 델타 (CD3-TCR 복합체)(CD3D) 유전자, 호모 사피엔스 CD6 분자

바람직하게는, 상기 소정의 유전자 패널로부터 선택된 적어도 하나의 유전자는 패혈증이 있는 대상체에서 상향 조절되거나 하향 조절된다.

바람직하게는, 상기 소정의 유전자 패널로부터 선택된 적어도 하나의 유전자는 대조 및 감염이 없는 SIRS로부터 SIRS 없는 감염, 경증 패혈증, 중증 패혈증까지 점진적으로 상향 조절되거나 하향 조절된다.

바람직하게는, 상기 소정의 유전자 패널 중 임의의 수는 패혈증의 진단 및/또는 예후를 위해 임의의 결합으로 선택되거나 사용될 수 있다.

바람직하게는, 상기 소정이 유전자 패널 중 임의의 수는 패혈증에 대해 양성 반응인 대상체의 패혈증 중증도를 평가하고/평가하거나 예측하기 위해 임의의 결합으로 선택되거나 사용될 수 있다.

바람직하게는, 적어도 하나의 패혈증 연속체 마커 전사체는 하기의 군으로 부터 선택된다 : (a) 목록 1에 기재된 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (b) 목록 1에 기재된 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.

바람직하게는, 본 발명은 패혈증이 없는 환자와 패혈증이 있는 환자를 구별하기 위해 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 패혈증이 있는 환자와 중증 패혈증이 있는 환자를 구별하기 위해 사용될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명은 패혈증의 조기 검출 및 진단, 또한 치료 개선을 위한 환자의 모니터링 및 그러한 환자의 결과를 위해 사용될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명은 패혈증 치료를 위한 후보로서 대상체 또는 환자를 확인하고/확인하거나 분류하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태 및 특징은 첨부된 도면과 함께 본 발명의 특정 실시예에 대한 다음의 설명을 검토함으로써 당업자에게 명백하게 될 것이다.

도면은 본 발명의 실시예를 단지 예시적인 방법으로 도시하며 다음과 같다.
도 1은 qPCR에 의한 대조에 비해 감염(SIRS 없는), 경증 및 중증 패혈증의 상대 평균 배 변화. (A) 30 상향 조절된 유전자; 및 (B) 10 하향 조절된 유전자
도 2는 네 가지 다른 유전자 분류 방법으로 확인된 중첩유전자
도 3은 패혈증 연속체의 상향 또는 하향 조절된 발현 레벨을 가진 유전자의 자율 계층적 클러스터링 히트맵
도 4는 패혈증/비패혈증 환자의 계층화를 허용하는 6 모델 (A-F)에 기초한 상자 그림. 각각 수평선으로 나타낸, 패혈증/비패혈증 사이의 소정의 컷오프가 달성 가능한 최고치의 완전한 정확도를 위한 결정 룰을 기반으로 한다. 각각의 모델에서 100개 샘플에 기반한 트레이닝 세트가 생성되었고(좌측) 60개 샘플의 블라인드 테스트는 모델을 입증하기 위해 사용되었다(우측). 상기 모델은
(A) 40 유전자 및 표준화 하우스키핑 유전자로서 HPRT1 사용
(B) 8 유전자 및 표준화 하우스키핑 유전자로서 HPRT1 사용
(C) 40 유전자 및 표준화 하우스키핑 유전자로서 GAPDH 사용
(D) 8 유전자 및 표준화 하우스키핑 유전자로서 GAPDH 사용
(E) 40 유전자 및 표준화 하우스키핑 유전자로서 HPRT1과 GAPDH 모두 사용
(F) 11 유전자 및 표준화 하우스키핑 유전자로서 HPRT1과 GAPDH 모두 사용
도 5는 37 유전자(A) 또는 14 유전자(B) 중에 하나를 기반으로 하는 85명의 패혈증 환자를 나타내는 상자 그림. 경증 패혈증으로부터 중증 패혈증의 분리를 허용하는 두 가지 모델을 사용하여 무게 스코어 시스템이 실행되었다.
도 6은 대조, 감염, 경증 패혈증 및 경증 패혈증/패혈성 쇼크로 구성된 군에서 선택된 환자의 평균 혈장 단백질 농도(S100A12)로, 패혈증의 중증도와 단백질 농도 간의 상관 관계를 보여준다.

본 발명은 대상체의 혈액 샘플에서 분리된 백혈구의 유전자 발현 프로파일으로부터 수득된 진단 바이오마커로서 다중유전자 시그너쳐를 사용하며, 이는 현존하는 방법보다 상당히 더 정확하고 빠른 진단을 제공한다. 바람직하게는, 유전자 발현 프로파일이, 유전자의 상향 또는 하향 조절이 염증-전 단백질과 같은 기능적인 유전자 산물의 합성 전에 발생하기 때문에 패혈증 진단이 지연되는 문제점을 극복하거나 적어도 완화시킨다. 바람직하게는, 본 발명은 패혈증이 있는 개인을 확실하고 정확하게 분류하거나 증후군의 진행에 대한 예후 단서를 제공하여, 보다 효과적인 치료적 개입을 허용한다.

코호트 연구가 수행되었다. 패혈증이 있는 응급실 환자의 연구에 관한 코호트 연구의 목적은 하기를 포함한다. (1) 패혈증의 조기 진단을 향상시키기 위해 패혈증이 있는 환자와 없는 환자의 백혈구에서 다르게 발현된 유전자 발현 패널을 유도하고 검증하는 것; 및 (2) 발병 당시 패혈증의 중증도를 예측함으로써 패혈증의 치료를 안내하기 위해 유전자 발현 패널의 예후 값을 조사하는 것

바람직하게는, 대상체에서 패혈증을 검출하고 예측하는 방법이 제공되며, 상기 방법은

1) 대상체에서 분리된 제 1 샘플의 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계; 및

2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 측정 레벨을 비교하는 단계

를 포함하고, 상기 적어도 하나의 바이오마커는

(a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는(encode) 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체(complement)

로 구성된 군에서 선택되고,

제 1 샘플의 측정 레벨과 기준 레벨의 차이는 제 1 샘플에 존재하는 패혈증을 나타낸다.

바람직하게는, 대조, 감염, 비감염 전신염증반응증후군(SIRS), 경증 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크 및 애매한(cryptic) 쇼크로 구성된 군에서 선택된 복수의 조건 중 하나가 대상체에 있는지 여부를 검출하거나 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

1) 대상체에서 분리된 제 1 샘플의 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계; 및

2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 측정 레벨을 비교하는 단계

를 포함하고, 적어도 하나의 바이오마커는

(a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는(encode) 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체(complement)

로 이루어진 군에서 선택되고,

제 1 샘플에서 측정된 레벨은 기준 레벨과 통계학적으로 실질적으로 유사하고 대상체가 조건 중 하나를 가지고 있는지 여부를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는다면 복수 지시 대상을 포함한다.

"또는", "/"의 사용은, 다르게 지시하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 게다가 "포함하는" 및 "갖는" 용어 및 이의 다른 형태도 마찬가지로 또한 제한하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 "샘플", "테스트 샘플", "종", "대상체로부터 사용된 샘플" 및 "환자 샘플"은 복수의 대상을 포함하여 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 혈액의 샘플, 조직, 소변, 혈청, 혈장, 양수, 뇌척수액, 태반 세포 또는 조직, 혈관 내피 세포, 백혈구, 또는 단핵구일 수 있다. 샘플은 환자 또는 대상체로부터 얻어지는 대로 직접 사용되거나, 본 명세서에 논의되거나 당업계에 알려진 바와 같이 몇몇 방식으로 샘플의 특성을 수정하기 위해, 여과, 증류, 추출, 농축, 원심분리, 방해 성분의 불활성화, 시약 추가 등과 같이 전처리될 수 있다.

임의의 세포 유형, 조직, 또는 체액은 샘플을 얻기 위해 이용될 수 있다. 그러한 세포 유형, 조직, 및 유체는 생검 및 부검 샘플, 조직학적 목적을 위해 얻은 동결절편, 혈액(전혈 등), 혈장, 혈청, 가래, 대변, 눈물, 점액, 타액, broncholveolar lavage(BAL) 유체, 머리카락, 피부, 적혈구, 혈소판, 간질액, 안구 렌즈액, 뇌척수액, 땀, 비강액, 활액, 월경, 양수, 정액 등과 같은 조직의 섹션을 포함한다. 세포 유형 및 조직은 또한 림프액, 금욕 유체, 부인과 유체, 소변, 복강액, 뇌척수액, 질 헹굼에서 수집된 유체, 질 플러싱에서 수집된 유체를 포함할 수 있다. 조직 또는 세포 유형은 동물로부터 세포 샘플을 제거하여 제공될 수 있지만 또한 미리 분리된 세포(예를 들어, 다른 사람에 의해 분리된, 다른 시간에, 및/또는 다른 목적으로)를 사용하여 수행될 수 있다. 또한 처리 또는 결과 기록을 가진 보관 조직이 사용될 수 있다. 단백질 또는 뉴클레오티드 분리 및/또는 정제는 필요하거나 필요하지 않을 수 있다.

핵산 또는 이의 단편은 다른 핵산에 "실질적으로 상동성이 있는"("또는 실질적으로 유사한"), 만약 다른 핵산(또는 이의 상호 보완적인 가닥)과 최적으로 정렬되는 경우, 뉴클레오티드 염기의 적어도 약 60%, 일반적으로 적어도 약 70%, 보다 일반적으로 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 95 내지 98%에서 뉴클레오티드 서열 유사성이 있다.

대안적으로, 실질적인 상동성 또는 (유사성)은, 선택적인 하이브리드화 조건 하에서 핵산 또는 이의 단편이 다른 핵산(또는 이의 대응 가닥)에, 또는 가닥에, 또는 이의 보체에 하이브리드화될 때, 존재한다. 하이브리드화의 선택성은 특이성의 전무보다 실질적으로 선택적인 하이브리드화가 발생할 때 존재한다. 일반적으로 선택적 하이브리드화는 적어도 약 14개 뉴클레오티드의 가닥에 대해 적어도 약 55%의의 유사성, 바람직하게는 적어도 약 65%, 보다 바람직하게는 적어도 약 75%, 가장 바람직하게는 적어도 약 90%의 유사성이 발생할 것이다. 상동성 비교를 위한 길이는, 기재된 바와 같이, 더 길게 뻗은 범위에 걸쳐 있을 수 있으며, 특정 실시예에서는 적어도 약 9개 뉴클레오티드의 연속체에 대해, 일반적으로 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 보다 일반적으로 적어도 약 24개 뉴클레오티드, 일반적으로 적어도 약 28개 뉴클레오티드, 보다 일반적으로 적어도 약 32개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 약 36개 이상의 뉴클레오티드의 연속체일 것이다.

따라서 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 목록 1에 나타낸 서열 또는 본원에 기재된 서열과 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%의 상동성을 가진다. 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 98%의 상동성이 있다. 뉴클레오티드 상동성 비교는 폴리펩티드에 대해 하기된 바와 같이 수행될 수 있다. 바람직한 서열 비교 프로그램은 하기된 GCG Wisconsin Best fit 프로그램이다. 디폴트 채점 매트릭스는 각각의 동일한 뉴클레오티드에 대해 10 그리고 각각의 불일치에 대해 -9의 매칭 값을 가진다. 각각의 뉴클레오티드에 대한 디폴트 갭 생성 패널티는 -50이고 디폴트 갭 확장 패널티는 -3이다.

본 발명의 문맥에서, 상동성 또는 상동성 서열은, 하기 서열 목록 또는 목록1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 적어도 20, 50, 100, 200, 300, 500 또는 1000개의 뉴클레오티드에 대해 아미노산 레벨에서 적어도 60, 70, 80 또는 90% 유사성, 바람직하게는 적어도 95 또는 98% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 여겨진다. 특히, 상동성은 일반적으로, 비필수적인 인접한 서열보다는단백질의 기능에 필수인 것으로 알려진 인접한 아미노산 서열을 암호화하는 서열의 해당 영역에 대해 고려되어야 한다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드는, 상기 서열에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상에 50, 60 또는 70% 초과하는 상동성, 보다 바람직하게는 80, 90, 95 또는 97% 초과하는 상동성을 갖는 인접한 서열을 포함한다. 바람직한 폴리뉴클레오티드는 대안적으로 또는 추가로 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 하기 서열 목록 또는 목록1에 기재된 서열과 80, 90, 95 또는 97% 초과하는 상동성을 가진 인접한 서열을 포함할 수 있다.

다른 바람직한 폴리뉴클레오티드는, 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 기재된 서열과 40, 50, 60 또는 70% 초과하는 상동성, 보다 바람직하게는 80, 90, 95 또는 97% 초과하는 상동성을 가진 인접한 서열을 포함한다.

뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 적어도 15 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 적어도 20, 30, 40, 50, 100 또는 200 뉴클레오티드 길이이다.

일반적으로 폴리뉴클레오티드의 길이가 짧을수록, 선택적인 하이브리드화를 위해 요구되는 상동성이 더 크다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 약 30 뉴클레오티드 미만으로 이루어진 경우, % 유사성은 본원 서열 목록 또는 하기 목록 1에 기재된 뉴클레오티드 서열과 비교하여 75% 초과, 바람직하게는 90% 또는 95% 초과인 것이 바람직하다. 반대로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 예를 들어 50 또는 100 초과 뉴클레오티드로 이루어진 경우, 본원 서열 목록 또는 하기 목록1에 기재된 서열과 비교된 % 유사성은 예를 들어 50% 초과, 바람직하게는 60 또는 75% 초과로 더 낮을 수 있다.

본 발명의 "폴리뉴클레오티드" 조성물은 RNA, cDNA, 유전체 DNA(genomic DNA), 합성 형태, 및 혼합 중합체, 보스 센스(both sense) 및 안티센스 가닥을 포함하고, 화학적 또는 생화학적으로 변형되거나, 비-천연 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있으며, 이는 당업자들에게 쉽게 이해될 것이다. 이러한 변형은 예를 들어 라벨, 메틸화, 유사체를 가진 자연적으로 발생한 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 그리고 비하전된(uncharged) 결합(예, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스터, 포스포아미다이트, 카바메이트 등), 하전된 결합(예, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 반족(pendent moieties)(예, 폴리펩티드), 삽입제(예, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이트제, 알킬화제, 및 변형된 결합(예, 알파 아노머 핵산 등)과 같은 핵산 간의 변형을 포함한다. 또한 수소 결합 및 다른 화학적 상호 작용을 통해 정해진 서열에 결합하는 능력이 있는 폴리뉴클레오티드를 모방하는 합성 분자를 포함한다. 이러한 분자는 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 펩티드 결합이 분자의 백본(backbone)에서 인산염 결합을 대신하는 분자를 포함한다.

"폴리펩티드"라는 용어는 아미노산의 중합체 및 이에 상당하는 것을 의미하고, 산물의 특정 길이를 의미하지 않아서, 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질은 폴리펩티드의 정의에 포함된다. 이 용어는 또한 폴리펩티드의 변형체, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 의미하고 않거나 배제시킨다. 정의에 포함된 것으로는 예를 들어 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 천연 아미노산 등) 유사체를 포함하는 폴리펩티드, 당 업계에 알려진 다른 변형 뿐만 아니라 치환된 결합을 가진 폴리펩티드도 있고, 모두 자연적으로 및 비자연적으로 발생한다.

본 발명의 문맥에서, 상동성 서열은, 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하며 상기 서열 목록 또는 하기 목록1에 기재된 서열을 가진 적어도 20, 50, 100, 200, 300 또는 400 아미노산에 대해 아미노산 레벨에서 적어도 60, 70, 80 또는 90% 동일한, 바람직하게는 적어도 95 또는 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것으로 여겨진다. 특히 상동성은 일반적으로 비-필수 인접한 서열보다는 단백질의 기능에 필수적으로 알려진 서열의 구역에 관해 고려되어야 한다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드는, 상응하는 아미노산 중 하나 이상에 50,60 또는 70% 초과하는 상동성, 보다 바람직하게는 80 또는 90% 초과하는 상동성을 가진 인접한 서열을 포함한다.

다른 바람직한 폴리펩티드는, 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하며 상기 서열 목록 또는 하기 목록1에 제시된 서열 중에서, 40, 50, 60 또는 70% 초과하는 상동성을 가진 인접한 서열을 포함한다. 그러나 상동성은 또한 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 가진 아미노산 잔기)에 관해 고려될 수 있고, 본 발명의 문맥 내에서 서열 유사성에 관한 상동성을 표현하는 것이 바람직하다. "실질적인 상동성" 또는 "실질적인 유사성"이라는 용어는, 폴리펩티드를 나타내는 경우, 문제의 폴리펩티드 또는 단백질이 자연 발생 단백질 전체 또는 일부와 적어도 약 70%의 유사성, 일반적으로 적어도 약 80%의 유사성, 바람직하게는 적어도 약 90% 또는 95%의 유사성을 보여줌을 나타낸다.

상동성 비교는 눈, 또는 보다 일반적으로, 쉽게 이용 가능한 서열 비교 프로그램의 도움을 받아 수행될 수 있다. 이러한 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 두 개 이상의 서열 간의 % 상동성을 계산할 수 있다.

백분율(%) 상동성은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있는데, 즉 하나의 서열이 다른 서열과 나란히 위치하고 하나의 서열의 각각의 아미노산이 다른 서열의 상응하는 아미노산과 한 번에 하나의 잔기씩 직접 비교된다. 이것은 "비갭핑(ungapped)" 정렬이라고 한다. 일반적으로 그러한 비갭핑 정렬은 비교적 적은 수의 잔기에 대해서만 수행된다(예를 들어 50 미만의 인접한 아미노산)

비록 매우 단순하고 일관된 방법이나, 서열의 다르게 동일한 쌍에서, 하나의 삽입 또는 삭제는 다음의 아미노산 잔기가 어긋나게 하고 잠재적으로는 글로벌 정렬이 수행될 때 % 상동성에 있어서 큰 감소를 초래한다는 것을 고려하지는 못했다. 그 결과, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 스코어를 과도하게 처벌하지 않고, 가능한 삽입 및 삭제를 고려하는 최적의 정렬을 생산하도록 설계된다. 이것은 국부 상동성을 최대화히기 위해 서열 정렬에 "갭"을 삽입함으로써 달성된다.

그러나 이렇게 보다 복잡한 방법은 정렬에서 발생하는 각각의 갭에 "갭 패널티"를 부과하여, 동일한 아미노산의 동일한 수에 대해, 가능한 적은 갭을 가진 서열 정렬(두 개의 비교 서열 간의 높은 관련성을 반영)이 많은 갭을 가진 서열 정렬보다 더 높은 스코어를 얻을 것이다. "아핀 갭 코스트(Affine gap costs)"는 일반적으로 갭의 존재에 대해 상대적으로 높은 코스트를 주고, 갭에 있는 각각의 후속 잔기에 대해 더 적은 패널티를 부과하는데 사용된다. 이것은 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 패널티는 물론 더 적은 갭을 가진 최적의 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변경되도록 허용한다. 그러나 그러한 소프트웨어를 서열 비교에 사용할 때는 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG Wisconsin Best fit 패키지(하단 참조)를 사용할 때, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭에 대해 -12, 그리고 각각의 확장(extension)에 대해 -4이다.

따라서 최대 % 상동성의 계산은 갭 패널티를 고려하여 최적의 정렬 생산을 우선 요구한다. 그러한 정렬을 수행하기 위한 적절한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Best fit 패키지(미국, 위스콘신 대학교; Devereux 외, 1984, 핵산 연구 12:387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예로는 BLAST 패키지(Ausubel 외, 1999, 챕터 18 참고), FASTA(Atschul 외, 1990, J.Mol.Biol., 403-410) 및 GENEWORKS 비교 측정 방법 세트를 포함하지만 제한되는 것은 아니다. BLAST 및 FASTA는 모두 오프라인 및 온라인 검색이 가능하다(Ausubel 외, 1999, p.7-58 내지 7-60). 그러나 GCG Bestfit 프로그램이 바람직하다.

최종 % 상동성이 유사성에 관해 측정될 수 있지만, 정렬 단계 자체는 일반적으로 전체 또는 무(nothing) 쌍 비교를 기반으로 하지 않는다. 대신에 기준 유사성 스코어 매트릭스는 일반적으로 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기반하여 각각의 쌍 비교에 스코어를 부여하는데 사용된다. 이러한 매트릭스의 예는 일반적으로 BLOSUM62 매트릭스로, 이는 BLAST 세트 프로그램을 위한 디폴트 매트릭스다. GCG 위스콘신 프로그램은 일반적으로 공공의 디폴트 값 또는 관습 기호 비교표를 사용한다(자세한 설명은 사용 설명서 참조). GCG 패키지용으로는 공공의 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하고, 다른 소프트웨어의 경우에는 BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.

소프트웨어가 최적의 정렬을 생성하면, % 상동성, 바람직하게는 % 서열 유사성을 계산하는 것이 가능하다. 상기 소프트웨어는 일반적으로 서열 비교의 일환으로 작업을 수행하고 수치 결과를 생성한다.

폴리펩티드 "단편","일부" 또는 "분절"은 적어도 약 5 내지 7개의 인접한 아미노산, 종종 적어도 약 7 내지 9개의 인접한 아미노산, 일반적으로는 적어도 약 9 내지 13개의 인접한 아미노산, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 20 내지 30개 또는 그 이상의 인접한 아미노산의 아미노산 잔기의 구간이다.

본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 상기 서열 목록 또는 하기 목록1에 제시된 서열과 실질적으로 유사한 기능을 가진다. 본 발명의 바람직한 폴리뉴클레오티드는 상기 서열 목록 또는 하기 목록1에 제시된 서열과 실질적으로 유사한 기능을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. "실질적으로 유사한 기능"은, 상기 서열 목록 또는 하기 목록1에 제시된 서열 또는 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하며 상기 서열 목록 또는 하기 목록1에 제시된 서열에 관하여, 상기 서열 목록 또는 하기 목록1에 제시된 서열의 핵산 또는 폴리펩티드의 동족체, 변이체, 유도체 또는 단편의 기능을 의미한다.

핵산 하이브리드화는 염 농도, 온도, 또는 유기용매와 같은 조건뿐만 아니라 염기 조성물, 상보적인 가닥의 길이, 및 하이브리드화 핵산 간의 뉴클레오티드 염기 부조화에 영향을 받으며, 당업자는 이를 쉽게 이해할 것이다. 엄격한 온도 조건은 일반적으로 섭씨 30도 초과, 일반적으로 섭씨 37도 초과, 바람직하게는 섭씨 45도 초과인 온도를 포함할 것이다. 엄격한 염 농도는 보통 1000mM 미만, 일반적으로 500mM 미만, 바람직하게는 200mM 미만일 것이다. 그러나 파라미터의 조합은 어느 하나의 파라미터의 측정보다 훨씬 더 중요하다. 엄격한 하이브리드화 조건의 예는 65℃ 및 0.1×SSC(1×SSC=0.15M NaCl, 0.015M 시트르산나트륨 pH7.0)이다.

본원에서 사용된 복수의 의미를 포함하는 "대상체","환자" 및 "개인"은 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 임의의 척추 동물을 의미하지만, 포유류에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시예에서, 상기 대상체는 인간이거나 인간이 아닐 수 있다. 대상체 또는 환자는 다른 형태의 치료를 받거나 받지 않을 수 있다.

본원에서 사용된 "대조" 또는 "대조군"은 임의의 감염성 원인에 관련이 없는 임의의 조건을 의미하고; 만성 염증 조건, 자가면역 질병 또는 면역 질환, 예를 들어 천식, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 진성 당뇨병 등의 기초가 되지 않는다.

본원에서 사용된 "감염이 없는 전신염증반응증후군(이하 SIRS)" 또는 "비-감염 SIRS"는 4개의 SIRS 기준(표 2 참조) 중 적어도 2개를 충족하고, 감염의 임상적/방사선학적 증거가 없다.

본원에서 사용되고 상호교환적으로 사용될 수 있는 "SIRS 없는 감염" 및 "감염"은 아래 표 2의 4개의 SIRS 기준 중에서 적어도 2개를 충족하지 못한다. 또한 감염의 임상적/방사선학적 의심 또는 확인이 있다. 이러한 조건을 가진 환자는 상기도 트랙 감염/흉부 감염/폐렴(기침, 콧물, 목의 통증, 흉부 X-선에 침투를 포함), 요로 감염(흐린 소변, 배뇨통, 소변 검사에서 아질산염 양성을 포함), 위장염(설사, 구토, 복통을 포함), 셀룰라이트/농양(발적, 부종, 통증, 피부 홍반을 포함)에 대한 증상 및 흔적이 있을 수 있다.

본원에서 사용된 "경증 패혈증"은 표 2의 SIRS 4개의 기준 중 적어도 2개를 충족하며, 감염의 임상적/방사선학적 의심 또는 확인이 있다. 또한 상기 용어는 감염이 있는 SIRS를 의미한다.

본원에 사용된 "중증 패혈증"은 >2mmol/L 혈청 젖산 또는 >1 장기 부전의 증거를 가진 패혈증을 의미한다(표 3 참조).

본원에 사용된 "애매한(cryptic) 쇼크"는 저혈압이 없는 >4mmol/L 혈청 젖산을 가진 패혈증을 의미한다.

본원에 사용된 "패혈성 쇼크"는 정맥내 결정질 1리터 주입에도 불구하고 저혈압을 가진 패혈증을 의미한다.

본원에 사용된 패혈증 연속체의 "상태" 또는 "조건"은 대조, 감염(SIRS 없는), 감염 없는 SIRS, 경증 패혈증, 중증 패혈증, 애매한 쇼크 및 패혈성 쇼크를 의미한다. 본원에 사용된 "패혈증"은 경증 패혈증, 중증 패혈증, 애매한 쇼크 및 패혈성 쇼크를 포함하는 상태 또는 조건 중 하나 이상을 의미한다. 예를 들어, 대상체가 패혈증을 갖거나 패혈증이 예측된다면, 대상체는 경증 패혈증, 또는 중증 패혈증, 또는 애매한 쇼크 또는 패혈성 쇼크를 겪을 수 있다. 본원에 사용된 "비-패혈증"은 대조, 감염 및 감염 없는 SIRS를 포함하는 상태 또는 조건 중 하나 이상을 의미한다. 예를 들어, 대상체가 비-패혈증이라면, 대상체는 대조, 감염 또는 감염 없는 SIRS일 수 있다.

본원에 사용되고 복수의 대상을 포함하는 "소정의 절단" 또는 "절단"은, 소정의 절단/절단에 대한 평가 결과를 비교하여 진단, 예후, 또는 치료 효능 결과를 평가하기 위해 사용되는 어세이(assay) 절단 값을 의미하며, 상기 소정의 절단/절단은 이미 다양한 임상적 파라미터(예를 들어, 질병/조건의 존재, 질병/조건의 단계, 질병/조건의 중증도/ 진행, 비-진행, 또는 질병/조건의 개선 등)와 관련이 있다. 본 발명은 예시적인 소정의 절단/절단을 제공한다. 그러나 절단값은 분석 특징(예를 들어, 적용된 항체, 반응 조건, 샘플 순도 등)에 따라 달라질 수 있음이 이해될 것이다. 게다가 본 발명은 본원에 기재된 서술에 기초하여 다른 분석에 대한 면역-특이 절단값을 얻기 위한 면역분석과 같은, 다른 분석에 적용될 수 있음이 이해될 것이다. 그러나 소정의 절단/절단의 정확한 값은 분석마다 달라질 수 있고, 본원에 기재된 상관 관계는 일반적으로 적용되어야 한다.

본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 일반적으로 당업자에게 이해되는 의미를 갖는다. 예를 들어, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 생명공학, 통계와 관련된 명명법 및 기술, 및 단백질 및 핵산 및 하이브리드화는 잘 알려져 있고 일반적으로 사용된다. 용어의 의미와 범위는 명백해야한다; 그러나 어떤 잠재적 모호성의 경우, 본원에 제공된 정의는 사전 또는 외부 정의를 통해 전례를 취한다. 게다가 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다.

1. 물질 및 방법

1.1. 환자 코호트

환자의 코호트 연구는, 싱가포르의 국립 대학 병원("NUH"), 등급실("ED")에서 전체 패혈증 연속체와 함께 수행되었다. 입원 환자는 입원 환자 단위로 추적 관찰되었다. 건강한 대조군 및 감염 증거가 없는 SIRS 대상은 조기 진단을 위한 바이오마커의 차이를 입증하기 위해 모집되었다.

모집에 대한 선정 기준을 충족하기 위해 확인된 대상체는 이번 연구에 참여함으로써 접촉되었다. 대상체로부터 사전 동의를 얻은 후에, 12mL의 혈액이 EDTA 튜브로 추출되었고, Acumen 연구소("ARL")로 냉동 상태로 이송되었다. 샘플은 혈액 수집 후 30분 이내에 RNA 분리를 위해 가공되었다. ED로부터 직접 배출된 환자는, 추출된 바이오마커의 샘플의 진단 정확성을 보장하기 위해, 30일 이내에 이들의 질병의 임상적 재발에 대해 추적되었다. 본 연구에 등록된 모든 환자는, 모집의 진단 정확성을 보장하기 위해, 최종 검토를 위해 30일 후에 추적 관찰되었다.

아래의 표 1은 코호트 연구를 위한 대상체 모집을 위한 포함 기준을 보여준다.

표 1 : 패혈증 연속체의 범주로 환자 포함 기준(성인 21세 이상)

환자 범주	기준
대조군	나이 및 성별 일치 임의의 감염성 원인과 관련없는 조건으로 ED에 출석; 만성 염증 조건, 자가면역 질병 또는 면역계 질환(예를 들어, 천식, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, SLE, 진성 당뇨병)에 대한 잠재성 없음
감염 없는 SIRS	4개의 SIRS 기준 중 적어도 2개 충족(표 2 참조) 감염의 임상적/방사선학의 증거 없음
SIRS 없는 감염	4개의 SIRS 기준 중 적어도 2개를 충족하지 않음 감염의 임상적/방사선학적 의심 또는 확인 환자는 상기도 트랙 감염/흉부 감염/폐렴(기침, 콧물, 목의 통증, 흉부 X-선에 침투를 포함), 요로 감염(흐린 소변, 배뇨통, 소변 검사에서 아질산염 양성을 포함), 위장염(설사, 구토, 복통을 포함), 셀룰라이트/농양(발적, 부종, 통증, 피부 홍반을 포함)에 대한 증상 및 흔적이 있을 수 있다.
경증 패혈증	4개의 SIRS 기준 중 적어도 2개 충족 감염의 임상적/방사선학적 의심 또는 확인
중증 패혈증	저혈압이 없는 >2mmol/L 혈청 젖산 또는 >1 장기 부전을 가진 패혈증(표 3 참조)
애매한 쇼크	저혈압이 없는 >4mmol/L 혈청 젖산을 가진 패혈증
패혈성 쇼크	정맥내 결정질 1리터 주입에도 불구하고 저혈압을 가진 패혈증

코호트 연구 대상체 모집을 위한 배제 기준은 다음: 21세 미만의 나이, 알려진 임신, 포로, 인공호흡 상태, 심페소생술 금지, 즉시 수술 필요, 활성 항암화학요법, 혈액학적 악성 종양, 담당 의사가 적극적인 치료가 적합하지 않다고 여김, 정보 동의를 할 수 없거나 연구 요구사항을 준수할 수 없는 사람들을 포함한다.

SIRS의 네 가지 기준은 아래의 표 2에 나타낸다.

장기 부전의 지표는 아래의 표 3에 나타낸다.

1.2. 환자로부터 혈액 샘플 수집

전체 혈액 중 총 12mL가 4개의 EDTA-코팅된 혈관 수집 튜브로 각각의 환자로부터 뽑아졌다. 전체 혈액은 동결 상태로 이송되었고, RNA 분리는 샘플 수집 30분 이내에 수행되었다.

1.3. RNA 샘플 준비

1.3.1. 백혈구로부터 RNA 추출

백혈구 RNA 정제 키트(Norgen Biotek Corporation)가 백혈구 RNA 추출을 위한 제조사의 지시에 따라 사용되었다.

1.3.2. RNA 품질 관리 및 저장

RNA 농도 및 품질은 Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific)을 사용해서 결정되었다. RNA 농도는 260/280 및 260/230 비율이 기록되었다. RNA는 그 후 액체 질소에서 RNase 및 DNAse 동결 튜브에서 보관되었다.

바이오애널라이저(Agilent)는 마이크로어레이 연구에 사용되었던 샘플의 RNA 품질을 체크하기 위해 나노드롭에 추가 사용되었다. 각 RNA 샘플의 RNA 무결성 번호(RIN)가 수득되었고, 각각의 전기 실행 후 바이오애널라이저에 의해 생성된 이미지가 분석되었다.

1.4. 유전자 발현 마이크로어레이의 전-처리 및 분석

전유전체 유전자 발현 마이크로어레이는 Illumia® Human HT-12 v4 BeadChip에서 수행되었다. 각각의 어레이는 47,000 초과하는 전사체, 및 인간 전사체의 알려진 스프라이스(splice) 변형체를 커버한다.

요약하면, 환자의 혈액 샘플로부터 정제된 전체 RNA의 500ng가 증폭되었고, 제조사의 지시에 따라 Illumina TotalPrep RNA 증폭 키트(Ambion)를 사용하여 분류되었다. 그런 다음 분류된 cRNA의 총 750ng는 Illumina Human HT-12 v4 Expression BaedChip에 하이브리드화를 위해 준비되었다. 하이브리드화 이후에, BeadChips은 BeadScan 소프트웨어 v3.2를 사용하여 BeadArray Reader에서 스캔되었고, 데이터는 추가 분석을 위해 GenomeStudio Gene Expression Module 소프트웨어 v1.6으로 업로드되었다.

전-처리 및 후속 생물정보학 분석은 R 소프트웨어를 사용하여 수행되었고, Lumi 패키지는 배경 신호, 분위수 정규화 및 원시 유전자 발현 데이터의 분산-안정화 변환을 조정했다.

생물정보학 분석 이전에, 마이크로어레이의 품질 체크가 수행되었다. 모든 샘플은 좋은 RIN 품질을 갖기 위해 평가되었다. Euclidean 거리 및 평균 결합을 사용하는 자율 계층적 클러스터링은 매우 유사한 생물학적 복제를 드러냈다(표 3 참조). 표 3에 나타낸 바와 같이 잠재적인 특이점(n=5)을 제거한 후에, 마이크로어레이(SAM)의 중요한 분석이 패혈증과 비-패혈증 사이의 상당히 다른 발현을 갖는 유전자를 선택하기 위해 사용된다(배 변화 > 2.0 또는 잘못된 탐색 비율 = 0)

감염, 경증 패혈증 및 중증 패혈증에서 상당히 다르게 발현된 유전자 세트는 생물정보학 및 경로 분석을 통해 확인되었다. 마지막으로, 각 환자 그룹의 유전자 발현 프로파일의 시각화를 허용하기 위해, Java Treeview를 사용하여 히트맵이 생성되었다.

1.5. qPCR에 의한 후보 바이오마커의 분석 검증

1.5.1. cDNA 변환 및 저장

RNA 샘플의 cDNA 변환은 iScript™ cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행되었다.

1.5.2. 프라이머 설계 및 검증

프라이머 쌍은 Primer-BLAST(NCBI,NIH) 및 Oligo 7으로 설계되었다. 모든 프라이머 쌍은 표준 곡선 분석에 대해, 그리고 환자 샘플 중 추가 테스트를 위한 후보가 되기 전의 융해 곡선에 대해 세 가지 다른 RNA 샘플로 qPCR에 의해 입증되었다.

프라이머 쌍은 SYBR Green-based qPCR로 검사되었다. 감염과 경증 패혈증 대상체 사이에 강한 배 변화(배 변화 < 1.5)로 특정된(qPCR 융해 곡선 분석에서 일관된 복제 및 단일 피크) 프라이머 쌍이 선택되었다. 40개 후보 패혈증 바이오마커가 후보가 되었다(30 상향 조절된 유전자, 10 하향 조절된 유전자).

또한 프라이머 쌍은 qPCR 분석의 효율을 결정하기 위해 표준 곡선 방법을 이용해서 테스트되었다(표 14 참조). PCR 효율은 템플릿 연속 희석의 선형 회귀 기울기를 사용하여 결정되었다. 후보 바이오마커는 선형 Ct 범위(r2>0.99)에서 80-120%의 효율을 갖도록 요구되었다. 42개의 프라이머 쌍(후보 패혈증 바이오마커 40개 및 하우스키핑 유전자 2개) 전부는 80%가 넘는 qPCR 효율을 가지며, 이는 데이터 분석을 위한 표준 ddCt 방법이 적용 가능하다는 것을 나타낸다.

1.5.3. qPCR에 의해 환자 샘플의 후보 바이오마커 발현의 분석

바이오마커의 증폭 및 검출은 세 개의 시스템, LightCycler 1.5(Roche), LightCycler 480 Instrument Ⅰ(Roche) 및 LightCycler 480 Instrument Ⅱ(Roche)를 사용하여 수행되었다. LightCycler FastStart DNA MasterPlus SYBR Green ⅠKit(Roche)는 LightCycler 1.5와 같이 사용되었고, LightCycler 480 SYBR Green ⅠMaster Kit(Roche)는 LightCycler 480 Instrument Ⅱ(Roche)와 같이 사용되었다. SYBR Green kit 두개에 대해, 사용된 최종 반응 부피는, 1μM 작업 프라이머 농도 및 4.17㎍ cDNA 템플릿과 함께, 10㎕였다.

모든 반응은 f다음의 사이클 조건으로 수행되었다 : 95℃에서 10분 (초기 변성); 95℃에서 10초, 40-45회 (변성), 60℃에서 5초 (어닐링) 및 72℃에서 25초 (연장) 이후에 용해 곡선 분석 및 냉각

후보 바이오마커의 Ct 값은, 각각의 유전자에 대해 △Ct 값을 생성하기 위해, 하우스키핑 유전자인 히포크산틴 포스포리보실전이효소 1 (HPRT1) 및 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (GAPDH)에 대해 표준화되었다. 패혈증 연속체에서 범주 사이의 상대적인 발현 차이(△△Ct값) 또한 계산되었다. △△Ct값은 이후에 각각의 유전자에 대해 유전자 발현 배 변화를 계산하는데 사용되었다. 사용된 공식은 다음과 같다:

△Ct = Ct 바이오마커 - Ct 하우스키핑 유전자

△△Ct = Ct 패혈증 범주 1 - Ct 패혈증 범주 2

배 변화 = 2^-△△Ct

1.6. 패혈증 진단을 위한 예측 모델의 개발 및 검증

패혈증의 중증도를 실질적으로 예측하는, 건강한 대조군과 패혈증을 가진 환자를 분류할 수 있는 예측 모델이 개발되었다. 이것은, 상당히 다르게 발현된 40개 유전자에 기초한 46개 샘플(대조군 9개, SIRS 14개, 경증 패혈증 14개, 중증 패혈증 9개)의 유전자 발현(qPCR에 의한 △Ct값)을 사용하여 예측 모델을 훈련함으로써 수행되었다. 상기 예측 모델은, 패혈증을 가진 환자를 진단하고 이후에 패혈증 중증도를 예측하는 작업에 각각 전념하는 두 가지 요소, 즉 분류 모델과 회귀 모델로 개발되었다.

10겹 교차 검증는 5개의 분류 모델(랜덤 포레스트, 판단 트리, K-최근접 이웃, 지원 벡터 머신, 로지스틱 회귀)을 구축하고 평가하기 위해 채택되었다. 최대 10겹 교차 검증 정밀도를 갖는 상기 모델이 선택되었다(로지스틱 회귀)(표 4 참조). 유사하게는, 패혈증의 중증도를 예측하기 위해, 10겹 교차 검증이 다른 회귀 모델(선형 회귀, 지원 벡터 회귀, 다층 퍼셉트론, 올가미 회귀, 탄성 그물 회귀)을 훈련하고 평가하기 위해 사용되었다. 이처럼 10겹 교차 검증에 관하여 가장 성취도가 높은 회귀 모델이 선택되었다(지원 벡터 회귀)(표 5 참조).

표 4는 5개의 데이터 마이밍 모델의 10겹 교차 검증을 보여준다.

아래의 표 5는 5개의 회귀 모델의 10겹 교차 검증을 보여준다.

예측 모델은 블라인드 검층 과정을 받는다. 4개의 블라인드 샘플이 사용되었다. 환자 패혈증 범주의 예측은 설정된 모델을 사용하여 수행되었다. 그 결과는 임상적으로 배정된 범주와 비교를 위해 NUH로 보내졌다.

1.7. 패혈증의 검출을 위한 qPCR 멀티플렉스 분석의 개발 및 검증

1.7.1. 분석 형식

바이오마커의 확장 및 검출은 LightCycler 480 기기 Ⅰ(Roche) 및 LightCycler® 480 기기 Ⅱ(Roche)를 사용하여 수행되었다. Quanfifast RT-PCR 키트(Qiagen) 및 LightCycler 480 Probes Master(Roche)가 사용되었다. 최종 반응 부피는 10㎕였고, 4.17㎕의 RNA 또는 cDNA 템플릿이 사용되었다.

Quanfifast RT-PCR 키트에 대해, 다음의 사이클 조건 하에서 반응이 수행되었다 : 20분간 50℃(역전사), 5분간 95℃(초기 변성); 15초간 95℃에서 40-45회(변성), 30초간 60℃(어닐링 및 연장), 이후에 냉각. LightCycler® 480 Probes Master에 대해, 다음의 사이클 조건으로 반응이 수행되었다 : 5분간 95℃(초기 변성); 10초간 95℃에서 40-45회(변성), 30초간 60℃(어닐링 및 연장) 및 1초간 72℃(정량), 이후에 냉각.

1.7.2. Taqman 프로브 설계 및 검증

Taqman 프로브는 Primer3web 웹사이트(www.primer.wi.mit.edu) 및 Oligo 7을 사용하여 설계되었다. Autodimer는 모든 프라이머 및 프로브 조합[1]의 이량체화에 대해 테스트하기 위해 사용되었다. 모든 프라이머-프로브는 표준 곡선 분석으로 검증되었다. 프라이머 적정은 또한, 가능한 일정한 Ct 값을 갖는 가장 낮은 프라이머 농도를 결정하기 위해 수행되었다.

1.7.3. 프라이머-프로브 조합의 검증

프라이머-프로브의 다른 조합은 Quantifast RT-PCR + R 키트를 사용하여 멀티플렉스 분석으로 테스트되었다. 3-플렉스 분석을 위해, 바이오마커에 대해서는 프라이머 0.2μM 및 프로브 0.2μM이 사용되었고, 하우스키핑 유전자에 대해서는 0.4μM 및 프로브 0.2μM이 사용되었다. 21개의 3-플렉스 조합 모두 8명의 환자 샘플로 테스트되었다. 3-플렉스 및 모노플렉스 분석 사이의 Ct값이 비교되었다. 단지 최고의 3-플렉스 조합(모든 구성요소 유전자에 대해 그리고 모든 패혈증 연속체 범주를 거쳐 평균 △Ct 차이 < 1.0)이 추가 검증을 위해 선택되었다

1.7.4. 초기 3-플렉스 프로토타입

최고의 3-플렉스 조합이 Acumen 연구쇼(Acumen Research Laboratories)에서 16명의 환자 샘플로 두 번 검증되었다.

2. 결과

2.1. 환자 코호트

114개 대상체가 본 연구에 포함되었다 : 18명의 건강한 대조군, 감염 없는 SIRS를 가진 대상체 3명, 감염이 있는 대상체 30명, 경증 패혈증을 가진 대상체 45명, 중증 패혈증을 가진 대상체 15명 및 애매한 쇼크 또는 패혈성 쇼크를 가진 대상체 3명. 대상체의 인구 통계 및 임상적 데이터는 표 6에 보여진다. 나이, 성별, 및 인종의 분포는, 감염이 없는 SIRS 및 애매한/패혈성 쇼크 범주를 제외하고 모든 그룹에 걸쳐 유사했다. 모집된 대상체 중 남성 우세가 있었다.

환자의 진행은, 이들의 입원 기간에 걸쳐, 그리고 ED에 재출석 및 병원에 재입원을 모니터링하기 위해 입원 초기 날짜로부터 30일간 추적되었다. 30일 이내에 ED로 돌아간 6명의 환자가 있었다. 2명은 초기 출석 때와 비슷한 감염 상태였다.

아래의 표 6은 패혈증 연속체에 따라 그룹화된 대상체 세부 사항을 보여준다.

2.2. 유전자 발현 프로파일은 패혈증 진단을 위한 잠재적 마커를 보여준다.

건강한 대조군과 감염 및 경증 패혈증을 가진 대상체를 구별할 수 있는 잠재적인 바이오마커를 확인하기 위해, 전유전체 발현 마이크로어레이 실험이 수행되었다(상기 물질 및 방법 참조). 대조군에 대한 유전자 발현 배 변화에 관한 Significant Analysis of Microarray(SAM) 분석은, 초기 ~33,000 유전자로부터 마이크로어레이로 후보를 정하기 위해 수행되었다. 오류발견율=0, 배 변화 2.0 초과 또는 0.5 미만, 패혈증에서 실질적으로 샹향 조절되는 유전자 444개 및 실질적으로 하향 조절되는 유전자 462개의 엄격한 임계값을 사용하는 것이 선택되었다. ILR1N, IL1B, TLR1, TNFAIP6과 같이 확인된 유전자 중 대부분이 염증 반응(p=1.41×10^-5), 면역 반응(p=1.41×10^-5) 및 상처 반응(p=1.41×10^-5)에 관여한다. 이것은 패혈증이 감염에 대한 염증 반응의 결과라는 사실과 일치한다.

2.3. 패혈증 바이오마커로 선택된 40개의 유전자 패널

예측 모델 개발을 위해 임상적으로 실현 가능한 수로 SAM을 통해 확인된 906개 유전자 리스트를 줄이기 위해, 최대 배 변화를 갖는 유전자만 추가 테스트를 위해 선택되었다. 전체에서, 85개 유전자만 테스트되었고, 이중 7개는 하향 조절된 유전자였고, 74개는 상향 조절된 유전자였다. qPCR 검증 이후에, 40개 유전자의 패널이 최종 후보가 되었다. 상기 패널은 30개의 상향 조절된 유전자 및 10개의 하향 조절된 유전자로 구성된다(목록 1 참조).

HRPT1 및 GAPDH는 백혈구[2]에서 안정적인 발현을 위해 하우스키핑 유전자로 선택되었다.

목록 1은 각각 30개의 상향 조절된 유전자 및 10개의 하향 조절된 유전자에 대한 유전자 코딩 서열을 나열한다. 목록 2는 두 개의 하우스키핑 유전자를 나열한다.

목록 1 : 각각 30개의 상향 조절된 유전자 및 10개의 하향 조절된 유전자에 대한 유전자 코딩 서열

30개의 상향 조절된 유전자

1.ACSL1:호모 사피엔스 아실-CoA 합성효소 긴사슬 패밀리 멤버1(ACSL1), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_001995.2(SEQ ID NO:1)

2.ANXA3:호모 사피엔스 아넥신 A3(ANXA3), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_005139.2(SEQ ID NO:2)

3.CYSTM1:호모 사피엔스 시스테인-풍부 막투과 모듈 함유 1(CYSTM1), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_032412.3(SEQ ID NO:3)

4.C19orf59:호모 사피엔스 염색체 19 오픈 리딩 프레임 59(C19orf59), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_174918.2(SEQ ID NO:4)

5.CSF2RB:호모 사피엔스 콜로니 자극 인자 2 수용체, 베타, 낮은 친화성(과립구-대식세포)(CSF2RB), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_000395.2(SEQ ID NO:5)

6.DDX60L:호모 사피엔스 DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp) 박스 폴리펩티드 60-like(DDX60L), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_001012967.1(SEQ ID NO:6)

7.FCGR1B:호모 사피엔스 Fc 단편 of IgG, 높은 친화성 Ib, 수용체(CD64)(FCGR1B),전사체 변형 2, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_001004340.3(SEQ ID NO:7)

8.FFAR2:호모 사피엔스 유리 지방산 수용체 2(FFAR2), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_005306.2(SEQ ID NO:8)

9.FPR2:호모 사피엔스 포르밀 펩티드 수용체 2(FPR2), 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_001462.3(SEQ ID NO:9)

10.HSPA1B:호모 사피엔스 열 쇼크 70kDa 단백질 1B(HSPA1B), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_005346.4(SEQ ID NO:10)

11.IFITM1:호모 사피엔스 인터페론 유도 막투과 단백질 1(IFITM1), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_003641.3(SEQ ID NO:11)

12.IFITM3:호모 사피엔스 인터페론 유도 막투과 단백질 3(IFITM3), 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_021034.2(SEQ ID NO:12)

13.IL1B:호모 사피엔스 인터류킨 1, 베타(IL1B), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_000576.2(SEQ ID NO:13)

14.IL1RN:호모 사피엔스 인터류킨 1 수용체 길항제(IL1RN), 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_173842.2(SEQ ID NO:14)

15.LILRA5:호모 사피엔스 백혈구 면역글로불린-유사 수용체, 서브패밀리 A(TM 도메인 포함), 멤버 5(LILRA5), 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_021250.2(SEQ ID NO:15)

16.LRG1:호모 사피엔스 류신-풍부 알파-2-당단백질 1(LRG1),mRNA. NCBI 참조 서열:NM_052972.2(SEQ ID NO:16)

17.MCL1:호모 사피엔스 골수성 백혈병 세포 서열 1(BCL2-관련)(MCL1), 핵 유전자 코딩 미토콘드리아 단백질, 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_021960.4(SEQ ID NO:17)

18.NAIP:호모 사피엔스 NLR 패밀리,아포토시스 방해 단백질(NAIP), 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_004536.2(SEQ ID NO:18)

19.NFIL3:호모 사피엔스 핵 인자, 인터류킨 3 제어(NFIL3), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_005384.2(SEQ ID NO:19)

20.NT5C3:호모 사피엔스 5'-뉴클레오티드분해효소, 시토졸 Ⅲ (NT5C3), 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_001002010.2(SEQ ID NO:20)

21.PFKFB3:호모 사피엔스 6-포스포프룩토-2-키나아제/프룩토스-2, 6-비포스파타제 3(PFKFB3), 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_004566.3(SEQ ID NO:21)

22.PLSCR1:호모 사피엔스 포스포리피드 scramblase 1 (PLSCR1), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_021105.2(SEQ ID NO:22)

23.PROK2:호모 사피엔스 프로키네티신 2 (PROK2),전사체 변형 2, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_021935.3(SEQ ID NO:23)

24.RAB24:호모 사피엔스 RAB24, 멤버 RAS 발암유전자 패밀리 (RAB24), 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_001031677.2(SEQ ID NO:24)

25.S100A12:호모 사피엔스 S100 칼슘 결합 단백질 A12 (S100A12), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_005621.1(SEQ ID NO:25)

26.SELL:호모 사피엔스 셀렉틴 L (SELL),전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_000655.4(SEQ ID NO:26)

27.SLC22A4:호모 사피엔스 용질 운송체 패밀리 22 (유기 양이온/에르고티오네인 수송체), 멤버 4 (SLC22A4),mRNA. NCBI 참조 서열:NM_003059.2(SEQ ID NO:27)

28.SOD2:호모 사피엔스 수퍼옥시드 디스뮤타아제 2, 미토콘드리아 (SOD2), 핵 유전자 코딩 미토콘드리아 단백질, 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_000636.2(SEQ ID NO:28)

29.SP100:호모 사피엔스 SP100 핵 항원 (SP100), 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_001080391.1(SEQ ID NO:29)

30.TLR4:호모 사피엔스 톨-유사 수용체 4(TLR4), 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_138554.4(SEQ ID NO:30)

10개의 하향 조절된 유전자

1.CCL5:호모 사피엔스 케모카인 (C-C 모티브) 리간드 5 (CCL5), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_002985.2(SEQ ID NO:31)

2.CCR7:호모 사피엔스 케모카인 (C-C 모티브) 수용체 7 (CCR7), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_001838.3(SEQ ID NO:32)

3.CD3D:호모 사피엔스 CD3d 분자, 델타 (CD3-TCR 복합체)(CD3D), 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_000732.4(SEQ ID NO:33)

4.CD6:호모 사피엔스 CD6 분자 (CD6), 전사체 변형 1, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_006725.4(SEQ ID NO:34)

5.FAIM3:호모 사피엔스 Fas 아포토티스 방해 분자 3 (FAIM3), 전사체 변형 1,mRNA. NCBI 참조 서열:NM_005449.4(SEQ ID NO:35)

6.FCER1A:호모 사피엔스 Fc 단편 of IgE, 높은 친화성 I, 수용체; 알파 폴리펩티드 (FCER1A),mRNA. NCBI 참조 서열:NM_002001.3(SEQ ID NO:36)

7.GZMK:호모 사피엔스 그랜자임 K (그랜자임 3; 트립타제 Ⅱ)(GZMK),mRNA. NCBI 참조 서열:NM_002104.2(SEQ ID NO:37)

8.IL7R:호모 사피엔스 인터류킨 7 수용체 (IL7R), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_002185.3(SEQ ID NO:38)

9.KLRB1:호모 사피엔스 킬러 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 B, 멤버 1(KLRB1), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_002258.2(SEQ ID NO:39)

10.MAL:호모 사피엔스 말, T-세포 분화 단백질(MAL), 전이체 변형 d, mRNA. NCBI 참조 서열:NM_022440.2(SEQ ID NO:40)

목록 2 : 두 개의 하우스키핑 유전자 각각에 대한 유전자 코딩 서열

2개의 하우스키핑 유전자("HKG")

1.HPRT1:호모 사피엔스 히포크산틴 포스포리보실기전이효소 1 (HPRT1), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_000194.2(SEQ ID NO:41)

2.GAPDH:호모 사피엔스 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH), mRNA. NCBI 참조 서열:NM_002046.5(SEQ ID NO:42)

2.4. 40개 패혈증 바이오마커 후보자 각각은 패혈증 진단을 위해 높은 민감도 및 특이도를 갖는다.

대조군 샘플과 감염, 경증 패혈증 및 중증 패혈증 샘플의 상대적인 배 변화는 qPCR에 의해 비교되었다. 패혈증 연속체를 따라 유전자 발현의 진보적인 상향 또는 하향 조절이 관찰되었다(도 1 참조). 도 1은 선택된 40개 유전자 패널이 패혈증 연속체를 따라 대상체 샘플을 정확하게 구별하는데 사용하기 위한 잠재력을 가지고 있음을 도시한다.

건강한 대상체(대조군)과 감염(감염,경증 패혈증,중증 패혈증)을 가진 환자를 구별하는 것은 임상학적으로 중요하다. 유전자 패널은 대조군과 감염/경증 패혈증/중증 패혈증; 및 대조군/감염과 경증 패혈증/중증 패혈증을 구별하는 능력을 위해 구체적으로 테스트되었다.

패혈증 연속체에 따른 유전자 발현 배 변화는 1.5 초과이고, 분화에 사용되기에 충분히 컸다(표 15 참조).

각각의 패혈증 바이오마커의 예측 값은, 최종 후보 바이오마커가 패혈증의 초기 분화에 대한 높은 예측 값을 가지는 것을 확인하기 위해, 대조군과 감염/경증 패혈증/중증 패혈증의 구별, 및 대조군/감염과 경증 패혈증/중증 패혈증의 구별을 위해 Receiver Operating Characteristic(ROC)의 곡선하면적(AUC)를 사용하여 계산되었다(표 16 참조). 감염/경증/중증과 대조군을 구별하는 경우 예측 값에 대해, 3개 바이오마커는 > 95%, 18개 바이오마커는 90-95% 그리고 16개 바이오마커는 85-90%였다. 경증/중증과 대조군/감염을 구별하는 경우 예측 값을 보면, 10개 바이오마커는 > 95%, 20개 바이오마커는 90-95% 그리고 10개 바이오마커는 85-90%였다. p-값은 두 가지 구별의 모든 바이오마커에 대해 < 0.01이다.

2.5. 예측 모델은 패혈증 진단에서 89%가 넘는 정확성을 달성했다.

대조군과 감염, 경증 패혈증 및 중증 패혈증을 갖는 대상체를 구별할 수 있는 예측 모델을 구축했다. 상기 모델은 두 개의 구성 요소의 집합체이다. 제 1 구성 요소(분류 모델)는 대조군과 패혈증 환자를 구별한다. 만일 샘플이 감염 또는 패혈증으로 확인된다면, 제 2 구성 요소(회귀 모델)는 패혈증의 중증도를 예측할 것이다.

46개의 샘플(대조군 9, 감염 14, 경증 패혈증 14, 중증 패혈증 9)로부터 조기 확인된 다르게 발현된 40개 유전자의 qPCR 유전자 발현 데이터는, 10겹 교차 검증을 사용하여 예측 모델의 제 1 및 제 2 구성 요소를 훈련하기 위해 사용되었다. 각각의 구성 요소에서, 다른 모델이 테스트되었고, 가장 성과가 좋은 모델은 특정 구성 요소로 선택되었다. 로지스틱 회귀 모델은 테스트된 다른 모델을 능가했기 때문에 선택되었다. 그것은 10겹 교차 검증 평가에서 대조군으로부터 패혈증을 분류하여 89.13%의 높은 전체 정확도를 달성한다(민감도 77.8%, 특이도 91.9%).

제 2 구성요소로는, 제 1 구성요소에서 발견된 패혈증의 중증도를 예측하는 지원 벡터 회귀가 선택되었다. 상기 회귀 모델은 샘플에서 패혈증 중증도를 87% 정확하게 예측할 수 있었다.

2.6. 블라인드 검증에서 예측 모델은 패혈증 진단에서 최대 88% 정확도를 달성한다.

우리 모델의 적용 가능성을 추가로 검증하기 위해, 예측 모델을 구축하는데 사용되지 않았던 독립적인 데이터 세트를 사용하여 블라인드 평가를 수행했다. 24-샘플 독립적인 데이터 세트는 감염이 없는 SIRS 대상체 3, 대조군 4, 감염 2, 경증 패혈증 12, 중증 패혈증 2 및 패혈성 쇼크 1을 임상적으로 평가했다. 평가 목적으로, 패혈성 쇼크를 가진 대상체는 중증 패혈성을 가진 대상체와 같이 분류되었다.

예측 모델은 두 개의 목적, 즉 패혈증의 진단 및 패혈증 중증도의 평가를 가진 두 개의 구성요소를 포함한다. 제 1 구성요소는 대조군과 패혈증을 분류했다; 선택된 모델은 패혈증을 가진 대상체 18개 중 16개를 정확하게 진단하고(민감도 94%) 7개의 대조군 중 5개를 정확하게 확인하여(특이도 71%) 88%의 높은 전체 정확도를 가진다. 더 중요한 것은, 감염이 없는 SIRS를 가진 대상체가 대조군으로서 정확하게 분류되었고, 이는 바이오마커 후보가 패혈증과 멸균 SIRS를 구별할 수 있음을 보여준다.

제 2 구성요소는 회귀 모델이다. 감염과 경증 패혈증 사이의 높은 유사성으로 인해 패혈증의 중증도를 예측하기가 어려움에도 불구하고, 상기 모델은 경증 패혈증 또는 중증 패혈증과 감염을 구별함에 있어 82% 정확했다. 상대적으로 낮은 정확도는, 감염성 병인 때문에 질병을 갖는 계층화 환자를 위험하게 하는 임상을 안내하기 위해 사용되는, 패혈증 연속체에서 감염과 경증 패혈증 사이의 묘사에 대한 전체적 임계값을 나타낸다. 감염, 경증 패혈증 및 중증 패혈증은, 상기 모델을 사용한 정확도 예측의 어려움을 더 증가시키며, 정도를 다르게 하여 유사한 염증 반응을 유도한다.

종합적으로, 이러한 결과(표 7 및 8 참조)는 우리의 접근이 실현 가능할 뿐만 아니라 초기 단계에서 패혈증을 진단 정확도가 양호한 것을 보여준다. 이러한 결과는 또한 회귀 모델의 정련이 패혈증 환자의 중증도를 더 잘 예측하기 위해 필요하다는 것을 나타낸다.

표 7은 대조군과 패혈증을 분류하는 바이오마커 패널의 성능을 보여준다.

표 8은 패혈증 스테이징(staging) 중증도를 위한 바이오마커의 성능을 보여준다.

2.7.패혈증 검출을 위한 qPCR의 개발 및 검증

2.7.1.멀티플렉스 분석의 개발

멀티플렉스 개발을 위한 최고의 예측 유전자를 선택하기 위해, 10겹 교차 검증이 수행되었다. 분류 방법의 4개의 다른 10겹 교차 검증으로부터, 8개의 재발/중복 유전자가 확인되었다(도 2 참조). 중복 방법은 다른 가정에 따라 데이터 세트를 분류하는 다른 분류 모델과의 고유 바이어스를 줄이기 때문에 선택되었다. 동시에 또다른 유전자 8개는 ROC 곡선을 사용하여 대조군과 감염/경증 패혈증/중증 패혈증의 비교로부터 예측 값을 사용하여 선택되었다. 선택된 유전자는 아래의 표 19에 나타낸다.

3-플렉스 조합은 최고의 예측 유전자로부터 설계되었다. 3-플렉스의 21개 조합 모두 8명의 다른 환자 샘플의 모노플렉스와 멀티플렉스의 Ct 값을 비교함으로써 선별되었다(표 22 참조). 21개의 조합 중, 5개의 3-플렉스 분석은 유사한 Ct 값(△Ct<1.0)을 갖고, 추가 검증을 위한 후보가 되었다.

2.7.2. 환자 샘플을 사용하는 멀티플렉스 분석의 검증

후보가 된 5개의 3-플렉스 분석은 추가적인 8개의 환자 샘플에서 테스트되었다. 멀티플렉스에서의 구성요소 유전자의 Ct 값과 모노플렉스 분석의 비교는 분석의 유효성을 결정하도록 만들어졌다(표 23 참조). 오직 S100A12/FFAR2/HPRT1은 다른 패혈증 범주로부터 환자 샘플에서 일관된 결과를 주었음이 관찰되었다. MCL1/CYSTM1/HPRT1은 덜 일치했다. 다른 3개의 조합에서, 결과는 대조군 샘플에서 일치하지만 패혈증 샘플에서는 일치하지 않았다. 하우스키핑 유전자인 HPRT1의 △Ct은 패혈증 샘플에서 더 높았다. 이것은 패혈증 매우 표현된 바이오마커에 의한 HPRT1 증폭의 억제 때문이다.

3. 토론

3.1. 백혈구로부터의 바이오마커는 패혈증 진단을 위해 사용될 수 있다.

우리의 마이크로어레이 유전자 발현 프로파일 결과의 계층적 클러스터링은 감염과 패혈증이 있는 환자와 없는 환자 사이의 백혈구의 유전자 발현 패턴에서 상당한 차이를 보여주었다. 패혈증 동안 다르게 발현된 유전자는 마이크로어레이 유전자 프로파일로부터 유래되었고, 패널 유전자 또는 바이오마커가, 이 경우 40개의 유전자로, 초기 33,000으로부터 후보가 정해졌다. 후보가 된 유전자 패널은 qPCR 분석에서 검증되었다. qPCR을 사용하는 분석 검증은, 이러한 후보 바이오마커가 패혈증 연속체에 걸쳐 대상체에서 점진적으로 조절 곤란한 것으로 나타난다. 이러한 결과는 마이크로어레이로부터 얻어진 결과와 상관 관계이다. 백혈구에서 유전자 발현 변화는 분명히 관찰될 수 있고, 패혈증의 진단 및/또는 예후, 및 대상체에서 패혈증의 중증도를 평가 및/또는 예측을 위해 잠재적으로 사용된다.

ROC 곡선의 AUC를 사용하여 수득된 각각의 유전자의 예측 값은, 각각이 유전자에 대해 85% 초과의 스코어로 격려했다. 각각의 유전자의 높은 예측 값은, 선택된 유전자 패널이 조기 진단 마커로서 사용될 수 있음을 제시한다. 이러한 40개 유전자로부터 정보를 완전히 활용하기 위해, 예측 모델은 40개 유전자 모두의 qPCR △△Ct 값을 사용하여 구축했다. 이 예측 모델은 블라인드 샘플 중 88%를 정확하게 진단할 수 있었다. 유도된 유전자 발현 패널은, 임상적 표현형(phenotypes)에 기초한 패혈증 연속체에 걸쳐 대상체의 면역 분리를 허용하기 위해 패혈증 연속체에 걸쳐 충분히 뚜렷한 것으로 보여진다.

3.2. 패혈증 진단을 위한 바이오마커의 개발

33,000개 이상이 유전자가 마이크로어레이 분석을 통해 조사되었다. SAM을 사용하여, 패혈증 연속체에 걸쳐 다르게 표현된 906개 유전자가 확인되었고, 이후 40개 유전자로 감소했다. 모든 대상체에서 이러한 40개 유전자의 발현은 qPCR을 통해 검증되었고, 배 변화 차이는 예측 모델을 구축하여 사용되었다.

상기 모델에 의한 예측은 임상 분류와 비교되었고, 7개의 불일치 예상이 확인되었다. 7개의 불일치 예상 중, 4개는 환자 관리에 차이를 두지 않았다. 감염 대상체 없는 SIRS의 적은 수에도 불구하고, 상기 모델은 블라인드 샘플 조사에서 대상체 둘 다 모두 정확하게 분류할 수 있었다. 그러나 이후 임상 검증 단계를 통한 모델의 추가 정제가 특이도와 민감도를 증가시키기 위해 수행되어야 할 것이다. 유전자 패널은 비용 효율성 및 재현성을 개선하기 위해 정확도를 희생하지 않고 추가로 감소될 수 있다. 예측 모델을 훈련하기 위한 더 큰 데이터 세트의 사용은 이 임무에 중요하다. 비교를 위해 사용된 기준을 보장하기 위해 새로운 하우스키핑 유전자의 사용과 같은 시스템에 대한 다른 개선은 안정적이고, 개인의 나이 및 성별의 차이를 설명할 수 있다.

3.3. 진단 키트의 프로토타이핑

수득된 질적 유전자 발현은, 다른 예측 모델의 사용을 통해, 감염 및 비-감염 환자의 구별, 패혈증 및 비-패혈증의 구별, 및 패혈증의 스테이징(staging) 중증도를 포함하여 여러 응용을 위해 사용될 수 있다. 기존 데이터는 새로운 예측 모델 구축에 사용하기 위한 미래의 연구로부터의 새로운 데이터와 병합될 수 있다. 바람직하게는, 새로운 유전자가 마이크로어레이 데이터로부터 선택될 수 있다. 이것은 환자 질병 진행에 대해 충분한 정보가 얻어지거나 환자 질병 진단을 분류하는데 사용하기 위한 새로운 유전자가 확인되는 경우에 유용할 것이다. 따라서 본 연구로부터 얻은 데이터를 이용하는데 있어 탁월한 유연성이 있다.

현재 백혈구로부터의 RNA는 원형(prototype) 개발을 위한 템플릿(template)으로 사용된다. 그러나 최종 원형에 대한 출발 물질은, 처리에 걸리는 시간 및 복잡성, 분석의 감도 및 안정성, 병원의 이용 가능한 장비, 및 샘플 준비에 걸리는 시간과 같은 다양한 요인에 의해 결정될 수 있다.

3.4. 진단 키트의 임상적 유용성

현재, 패혈증의 진단을 위한 황금 표준은 없다. 대부분의 초기 테스트는 긍정적인 혈액 배양에 의존한다. 최종 결과를 얻기 위해 필요한 긴 시간(24 내지 72 시간), 필요한 혈액의 큰 부피(보통 20 내지 40㎖) 및 위양성율(0.6 내지 10%)을 포함하여 혈액 배양에 의존하는 몇 가지 주요 단점이 있다[3,4]. 몇 가지 병원균-기반 분자 진단 키트는 이러한 문제점을 피하기 위해 상업적으로 이용 가능하도록 만들어졌는데, 예를 들어 FilmArray® 혈액 배양 확인 패널(BioFire Diagostics Inc.)이다. 그러나 이 방법은 단지 숙주 염증성 반응을 선동하는 병원균(및 이의 부산물, 예를 들어 독소)을 확인하고, 표적 향균 치료가 도입되지만 오버 무성 숙주 염증 반응 또는 패혈증의 중증도에 의한 부수적인 손상을 나타내지 않도록 허용한다.

혈액 배양의 제한은 혈액 내의 낮은 박테리아 농도, 배양 병으로 추출된 불충분한 혈액, 까다로운 생물의 존재 또는 샘플 수집 이전에 항생제 사용으로 인한 위음성 결과에 있다. 2007년과 2012년 사이 NUH ED로부터의 데이터는 65세 이상의 환자에 대해 단지 21.4%의 진정한 긍정적인 혈액 배양 속도를 보여줬다.

감염/패혈증으로 인한 유전자 발현 변화의 형태로 숙주 반응에 대한 qPCR 분석을 사용하는 제안된 진단 키트는 앞서 기재된 병원균-기반 분자 기법을 보완한다. 조기 진단을 위한 숙주 반응을 확인하는 기능은 초기에 임상적으로 패혈증을 명시하지 않았지만 이후에 악화될 수 있는 환자의 관리를 보다 신속하고 정확하게 하기 위해 병원균 확인의 이용을 선행한다. 소스 제어, 조기 혈역학 소생물 및 지원, 및 인공 호흡기 지원을 포함하는 패혈증 관리의 기둥은 환자의 결과를 개선하기 위해 조기 제정될 수 있다. 유전자 발현 진단 키트에 필요하다고 추정된 3시간은 병원에서 부상자 분류 및 치료의 오른쪽 부지 선정에 대한 신속한 정보 결정을 하는 응급 의사와 같은 일선 의사일 수 있는 기회를 제공한다.

4. 보충 방법

4.1. 유전자 발현 프로파일

4.1.1.비교 가능한 마이크로어레이 분석을 위한 품질 관리

마이크로어레이 하이브리드화를 위한 품질 관리(QC)가 수행되었다. 사용된 제어 매트릭스는 하이브리드화 절차를 위한 하이브리드화 제어로, 세정 온도에 대해 낮은 엄격성 테스트, Cy3 결합에 대한 높은 엄격성 테스트, 비-특이 하이브리드화에 대한 음성 제어, 샘플의 무결성에 대한 유전자 강도 테스트 및 하이브리드화의 양 및 이상치를 검출하기 위한 최종 신호 분포 해석이다.

4.2. qPCR에 의해 후보 선정된 바이오마커의 분석적 검증

4.2.1. 프라이머 설계 및 검증

생명공학 정보를 위한 국립 센터(NCBI) 뉴클레오티드 데이터베이스는 우리의 선택된 유전자 각각에 대해 코딩 서열을 얻기 위해 사용되었다. 프라이머-BLAST는 각각의 유전자에 대해 20개의 다른 프라이머 쌍을 얻기 위해 실행되었다. 사용된 파라미터는 최고 200bp인 PCR 산물 크기; 반환된 20개 프라이머 쌍; 최소 59℃, 최대 61℃ 및 최대 차이가 2℃인 프라이머 용융 온도이다. 각각의 쌍은 Oligo 7을 사용하여 실리코에서 안정성 및 사용법에 대해 테스트되었다. 700 포인트 초과하는 최고의 두 프라이머는 qPCR에서 사용하기 위해 선택되었다.

실험을 시작하기 전에 각각의 프라이머 쌍은 이들의 품질을 확인하기 위해 테스트되었다. 새로운 프라이머는 qPCR에 의해 3개의 다른 샘플로 테스트되었다. 용융 곡선은 부산물 또는 프라이머 이합체가 없는지 확인하기 위해 점검되었다. 또한 표준 곡선 분석은 프라이머 쌍의 상관계수(r2) 및 효율(E)을 계산하기 위해 수행되었다. 효율 계산을 위해 사용된 공식은 다음과 같다:

E = [ -1 + 10(1/기울기)] × 100%

상기 기울기는 표준 곡선으로부터 계산되었다. 그럼 다음 검증된 프라이머 쌍은 분석 검증을 위해 사용되었다(표 9 참조).

표 9는 사용된 프라이머의 목록을 보여준다.

4.3. 패혈증의 검출을 위한 qPCR 멀티플렉스 분석의 개발 및 검증

4.3.1. Taqman 프로브 설계 및 검증

Taqman 프로브는 다음의 파라미터를 사용하여 Primer3web 웹사이트(www.primer.wi.mit.edu)를 사용하여 설계되었다 : 프로브 크기는 18-27bp; 프로브 용융 온도(Tm) 65-73℃; GC 함량 30-80%. 각각의 프로브는 이후 Oligo 7을 사용하여 실리코에서 안정성 및 사용법에 대해 테스트되었다. Autodimer는 모든 프라이머 및 프로브 조합에 대해 프라이머-프로브 및 프로브-프로브 및 프라이머-프라이머 이합체에 대해 테스트하기 위해 사용되었다[1](표 10 참조).

표 10은 프라이머-프로브 조합의 목록을 보여준다.

프라이머-프로브 혼합은 우선 두 개의 다른 키트에 템플릿 RNA의 연속 희석법을 사용하여 표준 곡선 분석으로 테스트되었다 : QuantiFast® Multiplex RT-PCR 키트(Qiagen) 및 LightCycler® 480 Probes Master (Roche). 세트들은 프로브가 프라이머 쌍과 호환되도록 검증되었다 : 증폭 효율이 80-120% 범위내에 있고 배 변화는 테스트된 Ct 범위에 걸쳐 선형이다.

다음에, 0.05μM 단계에서 0.4-0.05μM 적정 프라이머는, 권장 프라이머 농도인 0.4μM 에서의 Ct 값을 유지하면서 가능한 최저 프라이머 농도를 결정하기 위해 수행되었다.

5. 보조 결과

5.1. RNA 샘플 준비

5.1.1. RNA 질과 양

모든 RNA 샘플에 대해 취득된 RNA 평균 농도 및 260/280 및 260/230의 비율이 발견된다. 취득된 RNA 질 및 양은 농도 > 50ng/uL, 280/260 비율 > 2.0, 및 260/230 비율 > 1.7이고, 좋은 수율은 RNA 추출로부터 획득되었고 사용된 RNA 샘플은 단백질 및 탄수화물에 오염되지 않았다.

5.2. 유전자 발현 프로파일

5.2.1. 마이크로어레이를 위한 RNA 품질 및 농도

RNA 품질 및 무결성은 마이크로어레이 실험에 사용되기 전에 Bioanalyzer로 테스트되었다. 사용된 모든 샘플에 대한 RNA 무결성 번호(RIN)는 7보다 크다. 전기 영동 실행은 RNA의 날카로운 밴드가 존재함을 보여준다. 마이크로어레이에 사용된 RNA 샘플은 높은 무결성을 가지고 분해되지 않는 것을 확인했다.

5.2.2. 마이크로어레이 하이브리드화에 대한 품질 관리

마이크로어레이 하이브리드화에 대한 품질 관리(QC) 또한 수행되었다. 파일럿(표 12 참조) 및 제 2 마이크로어레이(표 13 참조) 둘 다 모든 품질 관리 테스트를 통과했다.

표 12는 파일럿 마이크로어레이에 대한 어레이 품질 관리의 요약을 보여준다.

표 12 : 마이크로어레이의 제 1 배치에 대한 어레이 품질 관리의 요약

제어 메트릭	설명	결과
하이브리드화 대조군	하이브리드화 절차의 품질관리	통과; 하이브리드화 제어 프로브의 신호가 예상 값과 만난다. 높다>중간>낮다
낮은 엄격함	하이브리드화 온도 빛 높은 세정 온도의 품질관리	통과; 불일치 프로브보다 더 높은 신호가 생성된 완벽한 일치 프로브
비오틴 및 높은 엄격함	스트렙타아비딘-Cy의 3 스테이닝의 품질관리	통과; Cy3 스테이닝의 높은 신호가 나타난 비오틴-활용 제어 프로브
음성 대조군	비-특이성 하이브리드화의 품질관리	통과; 배경 신호 및 소음이 낮은 레벨에서 있었다.
유전자 강도	생물학적 샘플의 무결성 및 하이브리드화된 샘플의 양의 변화의 품질관리	허용; 유전자의 신호가 배경보다 높았고, 예상된 하우스키핑>전체 유전자를 만났다;하이브리드화된 샘플의 양에서 약간의 변형
신호 분포 (상자 그림)	이상치를 확인하기 위한 내부-어레이 분석의 시각화	통과; 이상치 없음을 확인했다; 예상대로 관찰된 약간의 변형

표 13은 마이크로어레이의 제 2 배치에 대한 어레이 품질 관리의 요약을 보여준다.

표 13 : 제 2 마이크로어레이에 대한 어레이 품질 관리의 요약

제어 메트릭	설명	결과
하이브리드화 대조군	하이브리드화 절차의 품질관리	통과; 하이브리드화 제어 프로브의 신호가 예상 값과 만난다. 높다>중간>낮다
낮은 엄격함	하이브리드화 온도 빛 높은 세정 온도의 품질관리	통과; 불일치 프로브보다 더 높은 신호가 생성된 완벽한 일치 프로브
비오틴 및 높은 엄격함	스트렙타아비딘-Cy의 3 스테이닝의 품질관리	통과; Cy3 스테이닝의 높은 신호가 나타난 비오틴-활용 제어 프로브
음성 대조군	비-특이성 하이브리드화의 품질관리	통과; 배경 신호 및 소음이 낮은 레벨에서 있었다.
유전자 강도	생물학적 샘플의 무결성 및 하이브리드화된 샘플의 양의 변화의 품질관리	유전자의 신호가 배경보다 높았고, 예상된 하우스키핑>전체 유전자를 만났다;하이브리드화된 샘플의 양에서 약간의 변형
신호 분포 (상자 그림)	이상치를 확인하기 위한 내부-어레이 분석의 시각화	통과; 이상치 없음을 확인했다; 예상대로 관찰된 약간의 변형

5.3.qPCR에 의한 후보 유전자의 분석 검증

5.3.1. 프라이머 테스트 및 검증

프라이머 쌍은 또한 qPCR 분석의 효율을 결정하기 위한 표준 곡선 방법으로 테스트되었다(표 14 참조). PCR 효율은 템플릿 연속 희석의 선형 회귀 기울기를 사용하여 결정되었다. 후보 바이오마커는 선형 Ct 범위(r²>0.99)에서 80-120%의 효율이 요구되었다. 41개의 프라이머 쌍(후보 패혈증 바이오마커 40개 및 하우스키핑 유전자 1개) 중에, qPCR 효율이 80% 미만인 것은 없었다. 그러나 11개의 프라이머 쌍이 120% 초과의 효율을 가졌다. 120%보다 큰 효율을 가짐에도 불구하고, 이러한 프라이머 쌍은 여전히, 용해 곡선에서 어떠한 오류 산물도 검출되지 않기 때문에 패혈증 동안에 유전자 발현 변화를 연구하는데 사용되었다.

표 14는 후보 패혈증 바이오마커의 프라이머 쌍의 효율성 및 선형 Ct 범위 를 나타낸다.

5.3.2. 후보 유전자의 진단 성능

도 1은 qPCR에 의한 대조군에 대한 감염, 경증 및 중증 패혈증 샘플의 상대적 배 변화를 도시한다.(A) 상향 조절된 유전자 30개; 및 (B) 하향 조절된 유전자 10개.

표 15는 대조군 대 감염, 감염 대 경증 패혈증 사이의 변화를 나타낸다. C-대조군, I-감염, M-경증.

표 16은 대조군 대 감염/경증 패혈증/중증 패혈증, 및 대조군/감염 대 경증 패혈증/중증 패혈증에 대한 바이오마커 패널의 예상 값(곡선하면적; AUC), 표준 편차 및 p-값을 나타낸다.

5.3.3. 패혈증 범주의 차별화를 위한 예측 모델의 유도

로지스틱 회귀 인덱스를 생성하기 위해 각각의 유전자에 주어진 무게를 나타냈다(표 17 참조). 임상적 검증 동안에 블라인드 환자 샘플 분류에 사용된 알고리즘은 :

로지스틱 회귀 인덱스 = ∑(dC_t·w) + I

dC_t - 하우스키핑 유전자에 정상화된 유전자 순환 임계치

w - 무게

I - 절편(intercept)

건강한 대조군 샘플에 대해, 로지스틱 회귀 인덱스 ≥0

감염/패혈증 샘플에 대해, 로지스틱 회귀 인덱스 < 0

아래의 표 17은 로지스틱 회귀 모델로부터 각각의 유전자 및 절편에 대한 무게를 나타낸다.

지원 벡터 회귀 인덱스를 생성하기 위해 각각의 유전자에 주어진 무게를 나타냈다(표 18 참조). 임상적 검증 동안 블라인드 환자 샘플 분류를 위해 사용된 알고리즘은 :

지원 벡터 회귀 인덱스 = ∑(dC_t·w) + I

dC_t - 하우스키핑 유전자에 정상화된 유전자 순환 임계치

w - 무게

I - 절편(intercept)

감염 샘플에 대해, 지원 벡터 회귀 인덱스 ≥1.41

경증 패혈증 샘플에 대해, 지원 벡터 회귀 인덱스 1.41≥x<3.52

중증 패혈증 샘플에 대해, 지원 벡터 회귀 인덱스 <3.52

아래의 표 18은 지원 벡터 회귀 모델로부터 각각의 유전자 및 절편에 대한 무게를 나타낸다.

5.4. 패혈증의 검출을 위한 qPCR 멀티플렉스 분석의 개발 및 검증

도 2는 4개의 다른 분류 방법의 중복에서 확인된 최고 예측 유전자를 도시한다.

표 19는 2개의 다른 선택 방법으로 상위 8개의 예측 유전자의 목록을 나타낸다.

프라이머-프로브는, 프라이머-프로브가 증폭 곡선을 생성할 수 있음을 확인하고 qPCR 분석의 효율성을 결정하는 표준 곡선 방법으로 테스트되었다. PCR 효율성은 템플릿 연속 희석의 선형 회귀 기울기를 사용하여 결정되었다. SYBR 녹색 형식을 사용하는 qPCR과 유사하게, 프라이머-프로브는 허용 가능한 효율성(80-120%) 및 선형 Ct 범위(r²>0.99)를 갖는다.

12개의 바이오마커 및 1개의 하우스키핑에 대한 프라이머-프로브가 설계되었다. 두 개의 유전자의 프라이머-프로브는 증폭 곡선을 생성하는데 실패했다. 4개의 하우스키핑 프라이머 프로브 중, 하나는 가장 일관된 결과로 선택되었다. 작업된 모든 프로브는 허용 가능한 효율(80-120%) 및 테스트된 선형 Ct 범위를 가진다(표 20 참조).

표 20은 검사된 패혈증 바이오마커의 프라이머-프로브의 효율성 및 선형 Ct 범위를 나타낸다.

프라이머 적정은 매우 풍부한 유전자에 사용되는 프라이머 농도를 감소시키기 위해 수행되었다(표 21 참조). 감소된 프라이머 농도는 0.4μM의 권장 시작 작업 농도와 비해 Ct 값에 영향을 주지 못한다. 감소하는 프라이머 농도는 qPCR 반응 경쟁 및 파괴를 통해 적게 풍부한 유전자에 매우 풍부한 유전자의 증폭 억제의 효과를 제한한다. 이후, 가능한 최소 최종 프라이머 농도는 0.20 내지 0.05μM 범위에 들고, 0.2μM은 모든 바이오마커에 대해 최종 프라이머 농도로 선택되었다. 적게 풍부한 하우스키핑 유전자에 대한 최종 프라이머 농도는 0.4μM로 유지되었다.

표 21은 검사된 패혈증 바이오마커의 프라이머-프로브의 효율성 및 선형 Ct 범위를 나타낸다.

표 22는 테스트된 3-플렉스 조합을 나타낸다.

표 23은 후보로 선정된 3-플렉스 조합에 대해 멀티플렉스와 모노플렉스 분석 간의 Ct 차이가 1.0보다 큰 샘플의 수를 나타낸다.

도 3은 패혈증 데이터 패널의 자율 계층적 클러스터링 히트 맵을 나타낸다(빨강 = 높은 발현, 초록 = 낮은 발편). 열(row)은 유전자이고, 행은 패혈증/대조군 샘플이다. 강조 샘플은 잠재적인 이상치이다.

6. 추가 예

바이오마커 세트 또는 바이오마커 패널의 이용을 추가로 보여주기 위해, 151개의 환자 샘플의 후속 코호트가 이용되었다. 150개 샘플의 하위 분류는 다음과 같다 : 대조군 36개, 감염 없는 SIRS 6개, SIRS 없는 감염 24개, 경증 패혈증 67개, 중증 패혈증 12개 및 패혈성 쇼크/애매한 쇼크 6개. 다음 단락의 예가 이러한 샘플 세트에 기초한다.

표 24는 대조군 대 패혈증에 대해 목록 1에 제시된 40개의 바이오마커 또는 유전자의 바이오마커 패널의 바이오마커 각각의 예측 값(곡선하면적(AUC))을 나타낸다. 일부 실시예에서, 본원에 기재된 방법 또는 키트 각각은 표 24에 제시된 바이오마커 또는 유전자 중 임의의 하나를 사용한다.

일부 실시예에서, 본원에 기재된 방법 또는 키트 각각은 목록 1에 제시된 40개의 바이오마커 또는 유전자 중 하나 이상, 및 임의의 조합을 사용한다.

표 25는 하우스키핑 유전자로서 HPRT1/GAPDH를 포함하고, 대조군 대 패혈증에 대해 목록 1에 제시된 40개의 바이오마커 또는 유전자의 바이오마커 패널 중 예시적인 2개의 바이오마커 세트의 예측 값(곡선하면적)을 나타낸다.

표 26은 대조군/SIRS 없는 감염/감염 없는 SIRS 대 경증 패혈증/중증 패혈증/패혈성 쇼크에 대해 목록 1에 제시된 40개의 바이오마커 또는 유전자의 바이오마커 패널의 각각의 바이오마커에 주어진 무게를 나타낸다.

표 27은 경증 패혈증 대 중증 패혈증/패혈성 쇼크에 대해 목록 1에 제시된 40개의 바이오마커 또는 유전자의 바이오마커 패널의 각각의 바이오마커에 주어진 무게를 나타낸다.

일부 실시예에서, 본원에 기재된 방법 또는 키트 각각은 목록 1에 기재된 40개의 바이오마커 또는 유전자 중 임의의 5개를 사용한다.

표 28은 하우스키핑 유전자로서 HPRT1/GAPDH를 포함하고, 대조군 대 패혈증에 대해 목록 1에 기재된 40개의 바이오마커 또는 유전자의 바이오마커 패널 중 5개 바이오마커의 예시 세트의 예측 값(곡선하면적(AUC))을 나타낸다.

일부 실시예에서, 본원에 기재된 방법 또는 키트 각각은 목록 1에 기재된 40개의 바이오마커 또는 유전자 중 임의의 10개를 사용한다.

표 29는 하우스키핑 유전자로서 HPRT1/GAPDH를 포함하고, 대조군 대 패혈증에 대해 목록 1에 기재된 40개의 바이오마커 또는 유전자의 바이오마커 패널 중 10개 바이오마커의 예시 세트의 예측 값(곡선하면적(AUC))을 나타낸다.

일부 실시예에서, 본원에 기재된 방법 또는 키트 각각은 목록 1에 기재된 40개의 바이오마커 또는 유전자 중 임의의 20개를 사용한다.

표 30는 하우스키핑 유전자로서 HPRT1/GAPDH를 포함하고, 대조군 대 패혈증에 대해 목록 1에 기재된 40개의 바이오마커 또는 유전자의 바이오마커 패널 중 20개 바이오마커의 예시 세트의 예측 값(곡선하면적(AUC))을 나타낸다.

일부 실시예에서, 본원에 기재된 방법 또는 키트 각각은 목록 1에 기재된 40개의 바이오마커 또는 유전자 중 임의의 30개를 사용한다.

표 31는 하우스키핑 유전자로서 HPRT1/GAPDH를 포함하고, 대조군 대 패혈증에 대해 목록 1에 기재된 40개의 바이오마커 또는 유전자의 바이오마커 패널 중 30개 바이오마커의 예시 세트의 예측 값(곡선하면적(AUC))을 나타낸다.

도 4는 패혈증/비-패혈증 환자의 계층화를 허용하는 6가지 모델(A-F)를 나타내는 상자그림을 도시한다. 각 수평 라인으로 나타낸 패혈증/비-패혈증 사이에 소정의 차단(cut off)은 가장 높은 전체 정확성에 대한 결정 규칙을 기반으로 한다. 각각의 모델에 대해 100개의 샘플을 기반으로 하는 트레이닝 세트가 생성되고(좌측) 61개의 블라인드 테스트는 모델을 검증하기 위해 사용되었다. 상기 모델은:

(A) 40개 유전자 및 표준화 하우스키핑 유전자로서 HPRT1 사용

(B) 8개 유전자 및 표준화 하우스키핑 유전자로서 HPRT1 사용

(C) 40개 유전자 및 표준화 하우스키핑 유전자로서 GAPDH 사용

(D) 8개 유전자 및 표준화 하우스키핑 유전자로서 GAPDH 사용

(E) 40개 유전자 및 표준화 하우스키핑 유전자로서 HPRT1과 GAPDH 모두 사용

(F) 11개 유전자 및 표준화 하우스키핑 유전자로서 HPRT1과 GAPDH 모두 사용

표 32는 하우스키핑 유전자로서 HPRT1/GAPDH를 포함하고, 유전자(즉 40개 유전자, 8개 유전자, 40개 유전자, 8개 유전자, 40개 유전자, 11개 유전자)의 각각의 수에 대해 상기 기재된 6가지 모델의 예측 값(AUC)을 나타낸다.

도 5는 37개의 유전자(A) 또는 14개의 유전자(B) 중 하나에 기반하는 85명의 패혈증 환자를 나타내는 상자그림을 도시한다. 무게 채점 시스템은 경증 패혈증과 중증 패혈증의 구분을 허용하는 2가지 모델을 사용하여 수행되었다.

도 6은 대조, 감염, 경증 패혈증 및 중증 패혈증/패혈성 쇼크로 이루어진 군으로부터 선택된 환자의 평균 혈장 단백질 농도(S100A12)를 도시하고, 패혈증의 중증도와 단백질 농도 사이의 상관 관계를 나타낸다.

바람직하게는, 기재된 방법, 바이오마커 또는 바이오마커들 및 키트는 패혈증의 조기 검출 및 진단을 위해 사용될 수 있고, 또한 그러한 환자의 치료 및 결과의 개선을 위해 환자의 모니터링을 위해 사용될 수 있다.

바람직하게는, 본원에 기재된 방법, 바이오마커 또는 바이오마커들 및 키트는 패혈증 치료를 위한 후보로서 대상체 또는 환자를 확인하고/확인하거나 분류하기 위해 사용될 수 있다.

진단 키트

검출 키트는 항체, 앱타머, 증폭 시스템, 검출 시약(원체, 형광 물질 등), 희석 완충액, 세정액, 카운터 얼룩 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 키트 구성요소는 이들 방법의 연습이 수동으로, 또는 일부 또는 전체가 자동화되어 패키징될 수 있다. 키트를 포함하는 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 조성물, 및 선택적으로 이들 사용에 대한 지시를 포함하는 키트를 고려한다. 그러한 키트는 예를 들어 환자 집단의 계층화, 진단, 예후, 치료학적 치료 결정을 안내, 및 다른 적용을 포함하여 용도의 다양성을 갖는다.

당업자라면 본 발명에 기재된 발명이 상세하게 기술된 것 외에 변형 및 수정 여지가 있음을 이해할 것이다. 본 발명은 그러한 변형 및 수정을 모두 포함한다. 또한 본 발명은 본 명세서에 언급되거나 표시된 모든 단계, 특징, 제형 및 화합물을 개별적으로 또는 집합적으로 포함한다.

본문에 인용되는 각각의 문서, 참고 도서, 특허 출원 또는 특허는 참고로서 그 전체가 본원에 명확히 포함되며, 이는 텍스트의 일부로서 독자에 의해 읽혀지고 고려되어야 함을 의미한다. 본문에 인용되는 서류, 참고 도서, 특허 출원 또는 특허가 텍스트에서 반복되지 않는 것은 단지 간결의 이유로 인한 것이다.

본원 또는 본원에 참고로서 포함된 임의의 서류에 언급된 임의의 제품에 대하여 임의의 제조업자의 지시, 설명, 제품 사양 및 제품 시트는 참고로서 본원에 포함되고, 본 발명의 실시에 적용될 수 있다.

본 발명은 본원에 기재된 구체적인 실시예에 의해 범위가 제한되지 않는다. 이러한 실시예는 단지 예시의 목적을 위해 의도된다. 기능적으로 동등한 제품, 제제 및 방법은 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 분명하게 있다.

본원에 기재된 본 발명은 하나 이상의 값의 범위를 포함할 수 있다(예를 들어, 크기, 농도 등). 값의 범위는, 범위는 경계를 정의하는 값과 바로 인접한 값과 동일한 또는 실질적으로 동일한 결과를 이끄는 범위에 인접한 값 및 범위를 정의하는 값을 포함하여, 범위 내의 모든 수치를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본원에 사용된 선택된 용어에 대한 다른 정의는 본 발명의 상세한 설명 내에서 찾아 전체에 적용될 수 있다. 만일 다르게 정의되지 않으면, 본원에 사용된 모두 다른 과학적 및 기술적 용어는 본 발명이 속한 당업자에게 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 문맥이 다르게 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 임의의 다른 정수 또는 정수 그룹의 배제가 아니라 언급된 정수 또는 정수 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 또한 본 개시에서 특히 청구항 및/또는 단락에서, "포함하다(comprises)", "포함된", "포함하는" 등과 같은 용어는 미국 특허에서 그것에 속하는 것으로 생각되는 의미를 가질 수 있으며, 예를 들어 "포함하다(includes)", "포함된", "포함하는" 등을 의미하고, "본질적으로 구성되는" 및 "본질적으로 구성하다" 와 같은 용어는 미국 특허에서 그것에 속하는 것으로 생각되는 의미를 가지는데, 예를 들어, 그들은 명쾌하게 나열되는 구성요소가 아니라, 종래 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적 또는 새로운 특성에 영향을 주는 요소를 배제하는 구성요소를 허용하는 것에 주의한다.

앞서 명백히 언급된 본 발명의 다른 특징, 장점 및 이점은 본 설명으로부터 당업자에 의해 이해될 수 있다.

전술한 발명이 예시 및 실시예로서, 하나 이상의 실시예와 관련하여 상세히 기술되었지만, 명확한 이해의 목적을 위해, 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 특정한 변화, 변형 및 수정이 이루어질 수 있는 본 발명의 새로운 교시 및 이점은 그 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백하다.

본 발명이 각 실시예를 포함하지만 논의된 실시예의 조합도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 하나의 실시예에 기재된 특징은 다른 실시예에 기재된 특징와 상호 배탁적인 것은 아니고, 본 발명의 추가 실시예를 형성하기 위해 결합될 수 있다.

참고문헌

1) Vallone,P.M. 및 Butler,J.M. AutoDimer : 프라이머-이합체(dimer) 및 머리핀(hairpin) 구조를 위한 스크리닝 도구. BioTechniques 37, 226-31 (2004).

2) Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A. 및 Speleman F. (2002). 여러 내부 통제 유전자의 기하 평균에 의한 실시간 정량적 RT-PCR 데이터의 정확한 정규화. Genome Biology 3(7): 연구0034-연구0034.11.

3) Kaufmann SH. 면역학의 기초 : 파울 에를리히 및 일리야 메치니코프 노벨상 100주년. Nat Immunol. 2008 Jul;9(7):705-12.

4) Segal AW. 호중구가 미생물을 죽이는 방법. Annu Rev Immunol. 2005;23:197-223.

Claims (20)

1. 대상체의 패혈증을 검출하거나 예측하는 방법으로서,
   1) 대상체에서 분리된 제 1 샘플에서 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계; 및
   2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 측정 레벨을 비교하는 단계
   를 포함하고,
   적어도 하나의 바이오마커는
   (a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는(encode) 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체(complement)
   로 이루어진 군에서 선택되고,
   제 1 샘플에서 측정된 레벨과 기준 레벨 사이의 차이는 제 1 샘플에 존재하는 패혈증을 나타내는 것을 특징으로 하는, 패혈증을 검출하거나 예측하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 패혈증의 존재는, 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 비교해서, 제 1 샘플에서 측정된 적어도 하나의 바이오마커의 레벨 증가를 대상체에서 검출함으로써 결정되고, 적어도 하나의 바이오마커는
   (a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체
   로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 패혈증을 검출하거나 예측하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 패혈증의 존재는, 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 비교해서, 제 1 샘플에서 측정된 적어도 하나의 바이오마커의 레벨 감소를 대상체에서 검출함으로써 결정되고, 적어도 하나의 바이오마커는
   (a) SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체
   로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 패혈증을 검출하거나 예측하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 기준 레벨은 패혈증이 아닌 적어도 하나의 대상체에서 분리된 제 2 샘플에 있는 상응하는 바이오마커의 레벨인 것을 특징으로 하는, 패혈증을 검출하거나 예측하는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 비교 단계는 대상체에서 패혈증의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 결정 규칙을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 패혈증을 검출하거나 예측하는 방법.
6. 대조, 감염, 비감염 전신염증반응증후군(SIRS), 경증 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크 및 애매한(cryptic) 쇼크로 이루어진 군에서 선택된 복수의 조건 중 하나가 대상체에 있는지 여부를 검출하거나 예측하는 방법에 있어서,
   1) 대상체에서 분리된 제 1 샘플의 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계; 및
   2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 측정 레벨을 비교하는 단계
   를 포함하고, 적어도 하나의 바이오마커는
   (a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체
   로 이루어진 군에서 선택되고,
   제 1 샘플에서 측정된 레벨은 기준 레벨과 통계학적으로 실질적으로 유사하고 대상체가 조건 중 하나를 가지고 있는지 여부를 나타내는 것을 특징으로 하는, 복수의 조건 중 하나가 대상체에 있는지 여부를 검출하거나 예측하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 기준 레벨은, 대조군, 감염 양성 대상체, 비감염 SIRS 양성 대상체, 경증 패혈증 양성 대상체, 중증 패혈증 양성 대상체 및 애매한 쇼크 양성 대상체로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 대상체에서 분리된 제 2 샘플에 있는 상응하는 바이오마커의 레벨인 것을 특징으로 하는, 복수의 조건 중 하나가 대상체에 있는지 여부를 검출하거나 예측하는 방법.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 비교 단계는 대상체가 조건 중 하나를 가지고 있는지 여부를 결정하거나 예측하기 위한 결정 규칙을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 복수의 조건 중 하나가 대상체에 있는지 여부를 검출하거나 예측하는 방법.
9. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트로서,
   1) 대상체의 제 1 샘플에 있는 바이오마커의 레벨을 정량하기 위해 적어도 하나의 바이오마커에 특별히 결합할 수 있는 적어도 하나의 시약; 및
   2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨을 나타내는 표준품(reference standard)
   을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
10. 제9항에 있어서, 적어도 하나의 시약은 적어도 하나의 바이오마커에 특별히 결합할 수 있는 적어도 하나의 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 제 1 샘플의 적어도 하나의 추가적인 바이오마커에 특별히 결합할 수 있는 적어도 하나의 추가적인 시약, 및 상응하는 적어도 하나의 추가적인 바이오마커의 기준 레벨을 나타내는 표준품을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
12. 제6항 내지 제8항 중의 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트로서,
    1) 대상체의 제 1 샘플에 있는 바이오마커의 레벨을 정량하기 위해 적어도 하나의 바이오마커에 특별히 결합할 수 있는 적어도 하나의 시약; 및
    2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨을 나타내는 표준품
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
13. 제12항에 있어서, 적어도 하나의 시약은 적어도 하나의 바이오마커에 특별히 결합할 수 있는 적어도 하나의 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 제 1 샘플에 있는 적어도 하나의 추가적인 바이오마커에 특별히 결합할 수 있는 적어도 하나의 추가적인 시약, 및 상응하는 적어도 하나의 추가적인 바이오마커의 기준 레벨을 나타내는 표준품을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
15. 대상체에서 패혈증을 검출하고 예측하기 위한 키트로서,
    대상체로부터 분리된 제 1 샘플의 적어도 하나의 바이오마커에 선택적으로 결합할 수 있는 항체, 및 항체와 적어도 하나의 바이오마커의 보체 성분 사이에 형성된 복합체의 검출을 위한 시약, 및 상응하는 바이오마커의 기준 레벨을 나타내는 표준폼을 포함하는 키트에 있어서,
    상기 적어도 하나의 바이오마커는
    (a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체
    로 이루어진 군에서 선택되고,
    제 1 샘플에서 측정된 적어도 하나의 바이오마커의 레벨과 기준 레벨의 차이는 제 1 샘플에 존재하는 패혈증을 나타내는 것을 특징으로 하는, 대상체에서 패혈증을 검출하고 예측하기 위한 키트.
16. 제15항에 있어서, 기준 레벨은 패혈증이 아닌 적어도 하나의 대상체로부터 분리된 제 2 샘플의 상응하는 바이오마커의 레벨인 것을 특징으로 하는, 대상체에서 패혈증을 검출하고 예측하기 위한 키트.
17. 대조군, 감염, 비감염 전신염증반응증후군(SIRS), 경증 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크 및 애매한 쇼크로 구성된 군에서 선택된 복수의 조건 중 하나를 대상체가 가지고 있는지 여부를 검출하거나 예측하는 키트로서,
    대상체로부터 분리된 제 1 샘플의 적어도 하나의 바이오마커에 선택적으로 결합할 수 있는 항체, 및 항체와 적어도 하나의 바이오마커의 보체 성분 사이에 형성된 복합체를 검출하는 시약, 및 상응하는 바이오마커의 기준 레벨을 나타내는 표준품을 포함하는 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 바이오마커는
    (a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는(encode) 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 서열 중 어느 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체(complement)
    로 구성된 군에서 선택되고,
    제 1 샘플에서 측정된 적어도 하나의 바이오마커의 레벨이 기준 레벨과 통계적으로 실질적으로 유사하고 대상체가 상기 조건 중 하나를 갖는지 여부를 나타내는 것을 특징으로 하는, 키트.
18. 제17항에 있어서, 기준 레벨은, 통제 대상, 감염 양성 대상체, 비감염 SIRS 양성 대상체, 경증 패혈증 양성 대상체, 중증 패혈증 양성 대상체 및 애매한 쇼크 양성 대상체로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 대상체로부터 분리된 제 2 샘플에 있는 상응하는 바이오마커의 레벨인 것을 특징으로 하는, 키트.
19. 대상체에서 패혈증을 검출하거나 예측하는 방법으로서,
    1) 대상체로부터 분리된 제 1 샘플의 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계; 및
    2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 측정 레벨을 비교하는 단계
    를 포함하고, 상기 적어도 하나의 바이오마커는
    (a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 하나 이상의 그리고 임의의 모든 조합에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함히고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 하나 이상의 서열에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체
    로 구성된 군에서 선택되고,
    제 1 샘플의 측정 레벨과 기준 레벨의 차이는 제 1 샘플에 존재하는 패혈증을 나타내는 것을 특징으로 하는, 대상체에서 패혈증을 검출하거나 예측하는 방법.
20. 통제, 감염, 비감염 전신염증반응증후군(SIRS), 경증 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크 및 애매한 쇼크로 구성된 군에서 선택된 복수의 조건 중 하나를 대상체가 가지고 있는지 여부를 검출하거나 예측하는 방법으로서,
    1) 대상체로부터 분리된 제 1 샘플의 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계; 및
    2) 상응하는 바이오마커의 기준 레벨과 측정 레벨을 비교하는 단계
    를 포함하고, 적어도 하나의 바이오마커는
    (a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 동족체, 변이체, 유도체; (b) (a)의 서열 중 하나 이상의 그리고 임의의 모든 조합에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는(encode) 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a),(b)의 하나 이상의 서열에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체(complement)
    로 구성된 군에서 선택되고,
    제 1 샘플의 측정 레벨은 기준 레벨과 통계학적으로 실질적으로 유사하고 대사에가 상기 조건 중 하나를 갖는지 여부를 나타내는 것을 특징으로 하는, 방법.

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