WO2021230673A1 - 전장유전체 증폭을 위한 인간 베타코로나바이러스 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트 - Google Patents

전장유전체 증폭을 위한 인간 베타코로나바이러스 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트 Download PDF

Info

Publication number
WO2021230673A1
WO2021230673A1 PCT/KR2021/006000 KR2021006000W WO2021230673A1 WO 2021230673 A1 WO2021230673 A1 WO 2021230673A1 KR 2021006000 W KR2021006000 W KR 2021006000W WO 2021230673 A1 WO2021230673 A1 WO 2021230673A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
coronavirus
beta
primer set
primer
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/006000
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김세일
Original Assignee
한국표준과학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국표준과학연구원 filed Critical 한국표준과학연구원
Publication of WO2021230673A1 publication Critical patent/WO2021230673A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/107—RNA dependent DNA polymerase,(i.e. reverse transcriptase)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a technique for obtaining full genome information by amplifying the viral genome in a trace amount of a sample using a primer set capable of amplifying the full genome of human beta coronavirus and analyzing the nucleotide sequence.
  • Coronavirus belongs to the coronaviridae (Coronaviridae) and is a single-stranded positive RNA virus with a size of about 100 to 120 nm having a spherical outer membrane, the outermost spike (S) protein, hemagglutinin-S It consists of five structural proteins: hemagglutinin-esterase (HE) protein, transmembrane (M) protein, small membrane (E) protein and nucleocapsid (N) protein.
  • Coronavirus (Coronavirus) has a positive-sense single-stranded RNA genome of 30 kb, which is the largest among RNA viruses.
  • coronavirus was first discovered in chickens in 1937, then in animals such as bats, cats, cattle, mice, dogs, pigs, and birds, and then in humans in 1965.
  • HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63 and HCoV-HKU1 are known as common human coronaviruses that infect humans.
  • coronavirus has been recognized as a pathogen that rarely infects humans and mainly infects animals such as dogs, pigs, and cattle. There were only cases where it caused intestinal diseases, such as diarrhea, which were not very dangerous for people.
  • Severe Acute Respiratory Syndrome SARS
  • SARS Severe Acute Respiratory Syndrome
  • SARS Severe Acute Respiratory Syndrome
  • MERS Middle East Respiratory Syndrome
  • Coronaviruses have four main subgroups known as alpha, beta, gamma, and delta.
  • alpha corona viruses there are two human-infectious species, 229E and NL63, and beta-coronaviruses are OC43, HKU1, and Middle East Respiratory (MERS-CoV).
  • Syndrom coronavirus and SARS-CoV (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus) are known, and are zoonotic viruses that can cause colds or severe pneumonia.
  • HCV-OC43 Human betacoronavirus OC43
  • HCV-OC43 Human betacoronavirus OC43
  • Infectious coronaviruses are enveloped positive-sense single-stranded RNA viruses that enter host cells by binding to the N-acetyl-9-O-acetyl neuraminic acid receptor.
  • Korean Patent No. 1857685 discloses primers and probes for simultaneously detecting subtypes of the genus coronavirus and a method for detecting coronavirus using the same, and Korean Patent No. 625325 encodes a leader sequence or N protein of SARS virus. It discloses a probe composition derived from a nucleotide sequence and a primer and a method for detecting a coronavirus using the same.
  • the present invention has been derived from the above needs, and the present inventors utilize a universal primer set that can be amplified in human beta coronavirus to quickly and conveniently sequencing the genome amplified through PCR, etc. from a trace amount of genome.
  • the present invention was completed by confirming that the whole genome sequence could be secured.
  • the present invention provides a method for confirming the whole genome sequence of beta-coronavirus in an isolated sample comprising the following steps.
  • the sequencing method comprises the steps of (a) preparing one or more forward and reverse primer sets complementary to the whole genome of beta coronavirus;
  • the primer set is SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO:7 and SEQ ID NO:8; SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32; and the primer sets of SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34.
  • the present invention provides a beta-coronavirus diagnostic kit comprising one or more forward and reverse primer sets complementary to the full-length beta-coronavirus genome,
  • the primer set includes SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO:7 and SEQ ID NO:8; SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32; And it provides a beta-coronavirus diagnostic kit comprising a primer set of SEQ ID NO: 33
  • the present invention provides a composition for diagnosing beta-coronavirus-induced diseases comprising one or more forward and reverse primer sets complementary to the full-length beta-coronavirus genome,
  • the primer set includes SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO:7 and SEQ ID NO:8; SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32; And it provides a composition for diagnosing a beta-coronavirus-induced disease comprising a primer set
  • the present invention relates to a method for obtaining a sequence of the human beta coronavirus full-length genome and to a use thereof.
  • the methods, kits and compositions of the present invention use a set of forward and reverse primers capable of amplifying the whole genome of human beta coronavirus, and through genome amplification, a trace amount of virus samples and uncultured clinical samples of human beta coronavirus. It is easy and quick to check the presence or absence of a variant.
  • the methods, kits and compositions of the present invention enable the accurate and rapid acquisition of the whole genome sequence of human beta-coronavirus, which can be effectively applied to the diagnosis of diseases caused by human beta-coronavirus.
  • Figure 2 shows the results of the genome amplification of HCoV-OC43 using the primer set for beta corona virus of Table 2 or Table 3 according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows the assembly result of beta corona virus whole genome Sanger sequencing according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 shows a conceptual diagram of an exemplary flow of an optimal diagnostic protocol for beta-coronavirus in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 shows the quality analysis results for Miseq and Pacbio analysis of beta corona virus according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5a Pacbio amplicons
  • Figure 5b Miseq amplicons
  • Figure 5c Pacbio Library
  • Figure 5d Miseq Library
  • Figure 5e Pacbio (RSII) and Miseq results table.
  • 6 shows the quality analysis result of the NGS basic result according to an embodiment of the present invention.
  • 6a-6b Miseq
  • 6c-6d Pacbio.
  • Figure 8 shows the Nanopore minION real-time sequencing process for the beta-coronavirus genome according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 shows a bioinformatic pipeline for whole genome analysis according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10 shows the Nanopore minION real-time sequencing process for the beta-coronavirus genome according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 shows the depth coverage of reference mapping according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11a Miseq
  • 11b Pacbio
  • 11C MinION.
  • the present invention provides a method for confirming the whole genome sequence of beta coronavirus in an isolated sample comprising the following steps.
  • the sequencing method comprises the steps of (a) preparing one or more forward and reverse primer sets complementary to the whole genome of beta coronavirus; (b) isolating RNA from the sample; (c) performing a reverse transcription reaction using the isolated RNA; (d) performing a polymerase chain reaction by adding a primer set to the sample on which the reverse transcription reaction has been performed; and (e) analyzing the sequence of the amplified product.
  • the primer set is SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO:7 and SEQ ID NO:8; SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32; and the primer sets of SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34.
  • the concentrations of the primers are 0.1 to 1.0 pM, 0.1 to 0.8 pM, 0.1 to 0.6 pM, 0.2 to 1.0 pM, 0.2 to 0.8 pM, 0.2 to 0.6 pM, 0.3 to 1.0 pM, 0.3 to 0.8 pM, 0.3 to 0.6 pM, respectively.
  • 0.4 to 1.0 pM or 0.4 to 0.8 pM for example, may be 0.4 to 0.6 pM, but is not limited thereto.
  • the step of performing the polymerase chain reaction is 30 to 50 cycles, 30 to 46 cycles, 30 to 44 cycles, 33 to 50 cycles, 33 to 46 cycles, 33 to 44 cycles, 36 to 50 cycles, 36 to 46 cycles, 36 to 44 cycles, 38 to 50 cycles or 38 to 46 cycles, for example, may be performed under 38 to 44 cycle conditions, but is not limited thereto.
  • the sample may be isolated from blood, serum, sputum, urine, or living tissue, but is not limited thereto.
  • the beta coronavirus may include one or more selected from the group consisting of OC43 and HKU1, but is not limited thereto.
  • the primer set may additionally include one or more primers selected from SEQ ID NOs: 35 to 199 or a reverse complementary primer sequence thereof.
  • any sequencing method known in the art can be used regardless of the type, and preferably Sanger method or next generation sequencing (NGS) can be used, but limited thereto it's not going to be
  • chromosomal abnormalities including DNA copy number mutations (CNVs), which appear due to a deficiency or overlap of a part of a chromosome
  • CNVs DNA copy number mutations
  • various tests such as karyotyping, fluorescence isosynthesis, chromosome microarray, and NGS-based screening are being performed ( Capalbo A, et al. 2017, Hum Reprod. Vol. 32(3), pp. 492-498).
  • the karyotyping analysis has a lower resolution of about 5 Mb compared to other tests, and it is impossible to detect chromosomal deletions/duplications smaller than that.
  • microdeletions/duplications Chromosomal deletions and duplications with a size of less than 5 Mb are called microdeletions/duplications, and the ratio of microdeletions/duplications among single-gene diseases corresponds to 15% of all mutations (Vissers LE, et al. 2005, Hum). Mol Genet. Vol. 15;14 Spec No. 2:R215-23.).
  • Fluorescence in situ hybridization is a test method that confirms the presence of a specific nucleotide sequence in a chromosome by attaching a fluorescent label to a probe complementary to the nucleotide sequence to be identified. Because it shows a resolution of 100kb-1Mb, it is possible to detect microdeletions/duplications, but since only the parts complementary to the probe sequence can be identified, there is a disadvantage that only known mutations can be detected.
  • microarray-based comparative genomic hybridization (aCGH) is being used as the most common test method to check chromosomal microdeletion/duplication (Russo CD, et al. 2014, Cancer Discov. Vol. 4(1), pp. 19-21).
  • the size of the CNV detectable through the microarray is determined by the density of the probe, and it is possible to detect CNVs with a size of approximately 50 kb. (Watson CT, et al. 2014)
  • chromosomal abnormalities caused by chromosomal rearrangements such as translocation or inversion cannot be detected.
  • the technology for determining the nucleotide sequence sequence of genes constituting living organisms is divided into the first-generation Sanger method and the next-generation sequencing method, NGS (Next Generation Sequencing).
  • the first-generation method called Sanger sequencing developed around 1977, is a chain-stop in which ddNTPs (di-deoxynucleotide triphosphates) stop the synthesis of DNA strands during the Polymerase Chain Reaction (PCR) process. It is a method to collect amplified DNA fragments by applying the chain-termination principle to confirm the nucleotide sequence. Although this method has high accuracy, it takes a long time to determine the nucleotide sequence and has problems in that high cost occurs.
  • ddNTPs di-deoxynucleotide triphosphates
  • NGS Next-generation sequencing
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • INDELs indels
  • NGS is capable of detecting chromosomal abnormalities due to chromosomal rearrangements that cannot be detected in probe-based microarrays and previously unknown new CNVs (Talkowski ME, et al. 2011, Am J Hum Genet. Vol. 88). (4), pp. 469-81).
  • it has the advantage of having higher coverage and resolution than microarrays and detecting breakpoints where chromosomal abnormalities start due to the characteristic of fragmenting the chromosome into small pieces and analyzing the nucleotide sequence (Zhao M, et al. 2013, BMC). Bioinformatics. Vol. 14, Suppl 11:S1).
  • the present invention provides a beta-coronavirus diagnostic kit comprising one or more forward and reverse primer sets complementary to the full-length beta-coronavirus genome,
  • the primer set includes SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO:7 and SEQ ID NO:8; SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO:23 and SEQ ID NO:24; SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32; And it provides a beta-coronavirus diagnostic kit comprising a primer set of SEQ ID NO: 33
  • the present invention is a composition for diagnosing beta-coronavirus-induced disease comprising one or more forward and reverse primer sets complementary to the full-length beta-coronavirus genome,
  • the primer set includes SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO:7 and SEQ ID NO:8; SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO:23 and SEQ ID NO:24; SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32; And it provides a composition for diagnosing a beta-coronavirus-induced disease comprising a primer set
  • the beta-coronavirus-induced disease may be a respiratory disease
  • the respiratory disease may include, but is not limited to, flu, cold, sore throat, bronchitis or pneumonia.
  • Example One beta coronavirus universal primer set selection
  • RNA of HCoV-OC43 a beta-coronavirus
  • concentration of RNA was 7.6 ng/ ⁇ l in one tube, and A260/A280 was 8.98.
  • a screening target primer was prepared by referring to the primer selection criteria among a total of 160 candidates for beta-coronavirus universal primers designed by the Korea Research Institute of Chemical Technology.
  • First strand cDNA synthesis was performed using the random hexamer method. Invitrogen's Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Cat No. 18080-400) was used for first strand cDNA synthesis, and the method was performed according to the kit's manual. In this case, the RNA concentration was 7.6ng/ul.
  • PCR was performed using a primer candidate using cDNA as a template. PCR mixture was prepared by putting 2 ⁇ l first strand cDNA, 1 ⁇ l forward primer, 1 ⁇ l reverse primer, 10 ⁇ l KAPA hotstart ready mix, and 6 ⁇ l sterile distilled water into 0.2 ⁇ l PCR tube and mixing.
  • the amplification efficiency using the beta-coronavirus primer set was judged to be good, and the PCR conditions were changed as follows to shorten the construction time of the genome library. Through this, the PCR time could be reduced from 150 minutes to 80 minutes.
  • the primers in Table 1 below were preferentially selected as a set for beta corona.
  • Betacoronavirus primer set complementation experiments were performed. Based on the primers first selected in the third year, candidate primers that can be replaced and supplemented in the 10th and 12th amplicon regions were selected and PCR was performed in the same manner. A primer with more certain amplification efficiency of the 10th part was selected, and a new primer was selected and supplemented to increase the coverage efficiency of the 12th and 13th parts (Fig. 2, Table 2). In addition, the primer sets of regions 2, 10, and 14 were selected as 2x coverage to prepare for the number of different cases. It was decided to confirm the sequence using the replaced and supplemented primers. After that, after confirmation and complete 1x coverage, it was decided to conduct whole genome analysis using various next-generation sequencing methods (NGS).
  • NGS next-generation sequencing methods
  • Example 3 Verification of universal primer set for beta-coronavirus After reverse transcription, PCR amplification was performed with 14 finally selected primer sets, and the amplification efficiency was confirmed through electrophoresis (FIG. 2). In addition, the effectiveness of the primers was confirmed by the Sanger sequencing primer walking method for 14 amplification products of beta coronavirus. To confirm the accuracy of the single band of the amplification product of the selected primer, PCR purification was performed and the sequence of all genome parts was confirmed. In Sanger sequencing, as a result of combining 59 primer walking sequences, the entire genome of beta coronavirus was covered, and most of the nucleotide sequences were consistent (Fig. 3).
  • the beta-coronavirus optimal diagnostic protocol was developed, and using the final beta-coronavirus primer set in Table 2 previously selected, several steps of preprocessing for whole genome analysis were performed as shown in FIG. 4 and established. Confirmation of the possibility of NGS sequencing for whole genome analysis of beta-coronavirus through preprocessing as shown in FIG. 4 was performed in three different ways using Illumina Miseq, Pacific Bioscience RSII, and OxfordNanopore MinIon. The amplification products produced using the final selected universal primer were mixed at the same concentration and sequenced according to the quality and quantity of each sequencing method. An optimal preprocessing and data analysis workflow for each NGS sequencing method was developed, and sequencing analysis and sequencing method were performed using this.
  • PacBio RS II sequencing The necessary conditions for the PacBio RS II 10kb Amplicon Target sequencing method were concentration (ng/ul) > 150, Total Amount (ug): 10, A260/280 Ratio >1.8. However, in order to proceed with the amplicon method, the total amount of 5.46ug was sufficient for library preparation, and the sample was prepared in the corresponding amount (FIG. 5).
  • Figure 5a is Pacbio amplicons
  • Figure 5c is the Pacbio Library quality analysis results.
  • Nanopore sequencing using 1D ligation method resulted in sequencing for about 21 hours, resulting in 44.1Gb of raw data in fast5 format. After converting this to fastq format using Guppy basecaller V.2.3.1, quality check control was performed. As a result, data of 2.96 Gb was generated.
  • V3.2.2 OxfordNanopore's EPI2ME - Fastq control experiment
  • the average Q-score was 9.01, but the target length confirmed by the fastqc program.
  • the Q-score value of was increased to about 14 on average (Fig. 7).
  • Illumina Miseq sequencing A total of 1 Gb of Illumina Miseq raw data sequenced with 301 Paired-End was QC and trimmed using CLC genomic workbench, and then merged. Two types of long contigs were obtained by mapping and de novo assembly to the reference genome using the merged and extended data.
  • a consensus sequence was created using these two methods and compared with the reference.
  • the depth coverage of the reference mapping was different for each sequencing method as shown in FIG. 11 .
  • Consensus and reference confirmed that about 66 nts were inconsistent. However, when compared with the consensus sequence for each final contig sequence according to the sequencing method, about 9 or less sequences were mismatched. This means that there is a variation in the level of microevolution in the experimental strain compared to the reference strain.
  • MinIon has 3, Pacbio 5, Miseq 4, and Sanger 4 sequences inconsistent.
  • the error rate is PacBio, and as a result of reference mapping, Miseq sequencing has high coverage and low error rate.

Abstract

본 발명은 베타 코로나바이러스 감염 여부를 판별하기 위한 전장 유전체 서열 획득 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 방법, 키트, 조성물은 베타 코로나바이러스의 유전체 서열을 증폭할 수 있는 범용 프라이머 세트를 포함하고, 이에 따라 시료 내 목적 베타 코로나바이러스의 존재 유무 및 관련 질환을 간편하고 빠르게 확인할 수 있다. 또한 전장 유전체 분석을 통해 신종 베타 코로나바이러스의 변이여부를 판별하여 신규 베타 코로나바이러스 동정에도 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

전장유전체 증폭을 위한 인간 베타코로나바이러스 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트
본 발명은 인간 베타코로나바이러스의 전장유전체를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 활용하여 미량의 시료에서 바이러스 유전체를 증폭하고 염기서열을 분석하여 전장 유전체 정보를 얻어내는 기술에 관한 것이다.
코로나바이러스(coronavirus)는 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하며 구형의 외막을 가지는 약 100 내지 120 nm 크기의 단일가닥 양성 RNA 바이러스로, 가장 외각에 있는 스파이크(spike; S) 단백질, 헤마글루티닌-에스테라제(hemagglutinin-esterase; HE) 단백질, 막관통(transmembrane; M) 단백질, 작은 막(small membrane; E) 단백질 및 뉴클레오캡시드(nucleocapsid; N) 단백질과 같은 5개의 구조 단백질로 이루어져 있다. 코로나바이러스(Coronavirus)는 30kb의 positive-sense singlestranded RNA genome을 갖고 있고 있으며 이는 RNA virus 중 가장 크다.
코로나바이러스는 1937년 닭에서 처음 발견된 뒤 박쥐, 고양이, 소, 쥐, 개, 돼지, 조류 등의 동물을 거쳐 1965년에는 사람에게서도 발견되었다. 사람에게 감염되는 일반적인 사람 코로나바이러스로 HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63 및 HCoV-HKU1가 알려져 있다. 지금까지 코로나바이러스는 사람에게는 거의 감염되지 않고 주로 개, 돼지, 소 등의 동물에 감염되는 병원균으로 인식되어 왔으며, 사람에게 감염될 때에도 호흡기 증상을 유발하는 여러 바이러스 가운데 하나로서 단순한 감기를 유발하거나 어린이에게 위험성이 그리 높지 않은 설사 등의 장질환을 일으키는 경우가 있을 뿐이었다. 그러나, 2003년 3월 중순에 처음으로 발생하여 세계적으로 100명이 넘는 사망자와 3,000여 명의 환자를 발생시킨 중증급성호흡기증후군(SARS) 및 2012년 9월에 사우디아라비아에서 처음으로 발생하여 세계적으로 600명이 넘는 사망자와 1,980여 명의 환자를 발생시킨 중동호흡기증후군(MERS)의 원인균이 신종(변종) 코로나 바이러스인 것으로 알려지면서 점차 주목받기 시작하였다.
코로나바이러스는 알파, 베타, 감마, 델타라고 알려진 4가지 주요 하위 그룹이 있고, 알파코로나 중 인체 감염 종으로는 229E와 NL63 두 종이 있고, 베타코로나바이러스는 OC43, HKU1, MERS-CoV(Middle east respiratory syndrom coronavirus), SARS-CoV(Severe acute respiratory syndrome coronavirus)가 알려져 있으며, 감기 또는 중증폐렴을 일으킬 수 있는 인수공통 감염 바이러스이다.
인간 베타코로나바이러스 OC43 (HCoV-OC43)은 인간과 소를 감염시키는 베타코로나바이러스이다. 감염 코로나 바이러스는 엔벌로프된 포지티브 센스 단일 가닥 RNA 바이러스로, N-아세틸-9-O-아세틸 뉴라민산 수용체에 결합하여 숙주 세포에 들어간다.
인간 코로나바이러스의 발견은 일찍이 되었지만, 의학적 중요성이 낮고 분리 및 동정의 어려움으로 관심을 받지 못하였다가 2003년 SARS로 진단의 중요성이 커졌다. 그러나 모든 종류의 인간 코로나바이러스를 검출할 수 있는 민감하고 신속한 검출법은 존재하지 않고, 단클론 항체를 이용하거나 PCR법을 이용하여 진단해오고 있다.
한국등록특허 제1857685호는 코로나바이러스속의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법에 관해 개시하고 있고, 한국등록특허 제625325호는 SARS 바이러스의 리더서열 또는 N 단백질으르 코딩하는 염기서열 유래의 프로브 조성물과 프라이머 및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법에 관해 개시하고 있다.
하지만, 본 발명의 인간 베타코로나바이러스의 전장유전체 검출을 위한 범용 프라이머 세트에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 인간 베타코로나바이러스에서 증폭이 가능한 범용 프라이머 세트를 활용하여 미량의 유전체로부터 PCR 등을 통하여 증폭된 유전체를 염기서열분석법으로 빠르고 간편하게 바이러스의 전장유전체 염기서열을 확보할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 분리된 시료 내 베타코로나바이러스의 전장 유전체 서열 확인 방법을 제공한다.
상기 서열 확인 방법은 (a) 베타 코로나 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 제조하는 단계;
(b) 시료에서 RNA를 분리하는 단계;
(c) 분리된 RNA를 사용하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
(d) 역전사 반응이 수행된 시료에 프라이머 세트를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계; 및
(e) 증폭된 산물의 서열을 분석하는 단계를 포함한다.
또한, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20; 서열번호 21 및 서열번호 22; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 27 및 서열번호 28; 서열번호 29 및 서열번호 30; 서열번호 31 및 서열번호 32; 및 서열번호 33 및 서열번호 34의 프라이머 세트를 포함하는 것이다.
본 발명은 베타코로나바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 베타코로나바이러스 진단 키트로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20; 서열번호 21 및 서열번호 22; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 27 및 서열번호 28; 서열번호 29 및 서열번호 30; 서열번호 31 및 서열번호 32; 및 서열번호 33 및 서열번호 34의 프라이머 세트를 포함하는 베타코로나바이러스 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 베타코로나바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 베타코로나바이러스 유발 질환 진단용 조성물로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20; 서열번호 21 및 서열번호 22; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 27 및 서열번호 28; 서열번호 29 및 서열번호 30; 서열번호 31 및 서열번호 32; 및 서열번호 33 및 서열번호 34의 프라이머 세트를 포함하는 것인 베타코로나바이러스 유발 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
본 발명은 인간 베타코로나바이러스 전장 유전체의 서열 획득 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 방법, 키트 및 조성물은 인간 베타코로나바이러스의 전장유전체를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 이용하고, 유전체 증폭을 통하기 때문에 미량의 바이러스 시료 및 미배양 임상시료 등에서 인간 베타코로나바이러스의 존재 유무 및 변종유무를 간편하고 빠르게 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법, 키트 및 조성물은 인간 베타코로나바이러스의 전장유전체 서열을 정확하고 신속하게 얻을 수 있게 해주며, 이를 통해 인간 베타코로나바이러스로 유발된 질환의 진단에 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 표1의 베타코로나바이러스용 프라이머세트를 사용한 HCoV-OC43의 유전체 증폭 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 표2 또는 표3의 베타코로나바이러스용 프라이머 세트를 사용한 HCoV-OC43의 유전체 증폭 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 베타코로나바이러스 전장유전체 Sanger sequencing의 assemble 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 베타코로나바이러스의 최적 진단 프로토콜의 예시적 흐름에 관한 개념도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 베타코로나이러스의 Miseq과 Pacbio 분석을 위한 품질분석 결과를 나타낸 것이다. 도 5a, Pacbio amplicons; 도 5b, Miseq amplicons; 도 5c, Pacbio Library; 도 5d, Miseq Library; 도 5e, Pacbio(RSII) 및 Miseq 결과표.
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 NGS 기초결과의 품질분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6a-6b, Miseq; 도 6c-6d, Pacbio.
도 7은 본 발명의 일 구현 예에 따른 Nanopore minION 서열분석 기초결과의 품질분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 구현 예에 따른 베타코로나바이러스 유전체에 대한 Nanopore minION 실시간 서열분석 과정을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 구현 예에 따른 전장유전체 분석을 위한 Bioinformatic pipeline을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 구현 예에 따른 베타코로나바이러스 유전체에 대한 Nanopore minION 실시간 서열분석 과정을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 구현 예에 따른 reference mapping의 depth coverage를 나타낸 것이다. 도 11a, Miseq; 도 11b, Pacbio; 도 11c, MinION.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 분리된 시료 내 베타코로나바이러스의 전장 유전체 서열 확인 방법을 제공한다.
상기 서열 확인 방법은 (a) 베타 코로나 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 제조하는 단계; (b) 시료에서 RNA를 분리하는 단계; (c) 분리된 RNA를 사용하여 역전사 반응을 수행하는 단계; (d) 역전사 반응이 수행된 시료에 프라이머 세트를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계; 및 (e) 증폭된 산물의 서열을 분석하는 단계를 포함한다.
또한, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20; 서열번호 21 및 서열번호 22; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 27 및 서열번호 28; 서열번호 29 및 서열번호 30; 서열번호 31 및 서열번호 32; 및 서열번호 33 및 서열번호 34의 프라이머 세트를 포함하는 것이다.
상기 프라이머의 농도는 각각 0.1 내지 1.0 pM, 0.1 내지 0.8 pM, 0.1 내지 0.6 pM, 0.2 내지 1.0 pM, 0.2 내지 0.8 pM, 0.2 내지 0.6 pM, 0.3 내지 1.0 pM, 0.3 내지 0.8 pM, 0.3 내지 0.6 pM, 0.4 내지 1.0 pM 또는 0.4 내지 0.8 pM, 예를 들어, 0.4 내지 0.6 pM일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계는 30 내지 50 사이클, 30 내지 46 사이클, 30 내지 44 사이클, 33 내지 50 사이클, 33 내지 46 사이클, 33 내지 44 사이클, 36 내지 50 사이클, 36 내지 46 사이클, 36 내지 44 사이클, 38 내지 50 사이클 또는 38 내지 46 사이클, 예를 들어, 38 내지 44 사이클 조건으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 베타 코로나 바이러스는 OC43 및 HKU1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 35 내지 199에서 선택된 하나 이상의 프라이머 또는 이의 역상보적 프라이머 서열을 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 증폭된 산물의 서열을 분석하는 단계는 이 분야에 알려진 시퀀싱 방법이면 종류에 관계없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 Sanger법 또는 차세대염기서열분석법(NGS; next generation sequencing)을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
염색체의 일부가 결핍 또는 중복되어 나타나는 DNA복제수 변이(CNVs)를 포함한 염색체 이상을 확인하기 위해 핵형분석, 형광동소보합법, 염색체 마이크로어레이, NGS기반의 스크리닝 검사와 같이 다양한 검사가 이루어지고 있다 (Capalbo A, et al. 2017, Hum Reprod. Vol. 32(3), pp. 492-498). 핵형분석은 다른 검사들에 비해 5Mb 정도의 낮은 해상도를 보이며 그보다 작은 크기의 염색체 결실/중복은 검출이 불가능하다. 5Mb 미만의 작은 크기의 염색체 결실 및 중복을 미세결실/중복이라고 하며, 단일유전자에 의한 질환 중 미세결실/중복에 의한 비율이 전체 변이의 15%에 해당한다(Vissers LE, et al. 2005, Hum Mol Genet. Vol. 15;14 Spec No. 2:R215-23.).
이러한 미세결실/중복을 검출해내기 위해서 특정 염기서열에 상보적인 탐침자를 활용한 형광동소보합법(FISH)과 염색체 마이크로어레이 검사가 이루어지고 있다. 형광동소보합법은 확인하려는 염기서열에 상보적인 탐침자에 형광라벨을 붙여 염색체 내에 특정 염기서열의 여부를 확인하는 검사법이다. 100kb-1Mb의 해상도를 보이기 때문에 미세결실/중복의 검출이 가능하지만 탐침자 서열에 상보적인 부분만 확인이 가능하기 때문에 기존에 알려진 변이에 대해서만 검출이 가능하다는 단점이 있다.
현재 염색체 미세결실/중복을 확인하는 가장 일반적인 검사법으로 마이크로어레이를 기반으로 하는 비교유전체 혼성화법(aCGH)이 활용되고 있다(Russo CD, et al. 2014, Cancer Discov. Vol. 4(1), pp. 19-21). 마이크로어레이를 통해 검출 가능한 CNV의 크기는 탐침자의 밀도에 의해 결정되며 대략 50kb 크기의 CNV까지 검출이 가능하다. (Watson CT, et al. 2014) 하지만 전좌 또는 역위와 같이 염색체 재배열에 의한 염색체 이상은 검출이 불가능하다.
생명체를 구성하는 유전자의 염기서열 순서를 확정하는 기술은 1세대 생어(Sanger) 방식과 차세대 염기서열 분석법인 NGS(Next Generation Sequencing)로 나뉜다. 1977년경에 개발된 생어 서열분석(Sanger sequencing)이라 불리는 1세대 방법은 유전자 증폭 반응(Polymerase Chain Reaction; PCR) 과정 중 ddNTPs(di-deoxynucleotidetriphosphates)가 DNA 가닥(strand)의 합성을 중단시키는 연쇄-정지(chain-termination) 원리를 응용하여 증폭된 DNA 절편(fragment)을 모아 염기서열을 확인하는 방법이다. 이 방법은 정확도는 높지만, 염기서열 확정에 시간이 오래 걸리며, 높은 비용이 발생한다는 문제점을 가지고 있다.
이와 같은 문제점을 극복하기 위하여 차세대 염기 서열 분석법이 개발되었다. 수많은 유전체의 유전정보를 분절화한 후, 증폭하여 빅데이타를 얻은 다음 생물정보학을 이용하여 원하는 생물체의 전장 유전체 염기서열(Whole genome sequences; WGS)을 확보하는 것이다. 차세대염기서열분석법(NGS)은 염색체를 작은 조각으로 나누고 각 조각의 유전정보를 병렬적으로 분석하는 염기서열분석법이다. NGS는 유전자분석 기술이 발전하면서 상대적으로 검사의 소요시간과 비용이 적고 단일염기 다형성(SNP), 삽입-결실(INDELs)까지 검출 가능한 높은 해상도 때문에 신생아의 유전성 질환 선별검사로 활용되고 있다. 그러나 염색체를 작게 나누어 분석하는 NGS의 원리적 특성상 큰 규모의 염색체의 구조적 변이나 CNVs을 검출하는데 기술적 한계가 있다(Yohe S, Thyagarajan B. 2017, Arch Pathol Lab Med. Vol. 141(11), pp. 1544-1557).
하지만 NGS는 탐침자를 기반으로 하는 마이크로어레이에서 검출할 수 없는 염색체 재배열에 의한 염색체 이상과 기존에 알려지지 않은 새로운 CNV의 검출이 가능하다(Talkowski ME, et al. 2011, Am J Hum Genet. Vol. 88(4), pp. 469-81). 또한 염색체를 작게 조각 내어 염기서열을 분석하는 특성으로 마이크로어레이 보다 더 높은 coverage와 해상도를 보이고 염색체 이상이 시작되는 구획점(breakpoint) 검출이 가능하다는 장점이 있다(Zhao M, et al. 2013, BMC Bioinformatics. Vol. 14, Suppl 11:S1).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 베타코로나바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 베타코로나바이러스 진단 키트로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20; 서열번호 21 및 서열번호 22; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 27 및 서열번호 28; 서열번호 29 및 서열번호 30; 서열번호 31 및 서열번호 32; 및 서열번호 33 및 서열번호 34의 프라이머 세트를 포함하는 베타코로나바이러스 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 베타코로나바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 베타코로나바이러스 유발 질환 진단용 조성물로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20; 서열번호 21 및 서열번호 22; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 27 및 서열번호 28; 서열번호 29 및 서열번호 30; 서열번호 31 및 서열번호 32; 및 서열번호 33 및 서열번호 34의 프라이머 세트를 포함하는 것인 베타코로나바이러스 유발 질환 진단용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 베타코로나바이러스 유발 질환은 호흡기 질환인 것일 수 있고, 상기 호흡기 질환은 독감, 감기, 인후염, 기관지염 또는 폐렴을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다
[실시예]
실시예 1. 베타코로나바이러스 범용 프라이머 세트 선정
2019년 3월말 한국화학연구원으로부터 베타코로나바이러스인 HCoV-OC43 종의 RNA를 제공받아서 확보하였고, RNA의 농도는 1개의 튜브에 7.6 ng/μl 였으며, A260/A280는 8.98이었다. 한국화학연구원에서 설계한 베타코로나바이러스 범용 프라이머 총 160여개 후보군 가운데 프라이머 선별 기준을 참조하여 스크리닝 대상 프라이머를 제작하였다. 선별 기준은 1) 증폭산물의 길이가 약 3kb 전후이며, 2) dimer를 형성하지 않고, 3) degeneracy가 3개 이하이며, 4) T m = 약 55℃ 프라이머 쌍을 선별하였고, 5) 염기서열 분석 시 서열 누락을 방지하기 위해서 각 증폭산물이 약 100bp이상 중복될 수 있도록 고려하였다.
Random hexamer 방법을 사용하여 first strand cDNA 합성을 진행하였다. First strand cDNA 합성에는 Invitrogen사의 Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Cat No. 18080-400)를 사용하였으며, 방법은 kit의 매뉴얼을 따라 진행하였다. 이때 RNA농도는 7.6ng/ul를 사용하였다. cDNA를 template으로 하여 프라이머 후보를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR mixture는 2μl first strand cDNA, 1μl forward primer, 1μl reverse primer, 10μl KAPA hotstart ready mix, 6μl 멸균증류수를 0.2μl PCR tube에 넣고 혼합하여 준비하였다. 스크리닝 과정 중 베타코로나바이러스 프라이머 세트를 사용한 증폭 효율이 좋은 것으로 판단되어 유전체 라이브러리 구축 시간 단축을 위해 PCR 조건을 다음과 같이 변경하였다. 이를 통해 PCR 시간을 기존 150분에서 80분으로 단축할 수 있었다.
기존 방법 (150분 소요):
① 94℃ 5분, ② [denaturation 94℃ 30초, annealing 55℃ 1분, extension 72℃ 3분] × 30회, ③ final extension 72℃ 10분.
변경 방법 (80분 소요):
① 98℃ 30초, ② [denaturation 98℃ 5초, annealing 55℃ 30초, extension 72℃ 2분] × 30회, ③ final extension 72℃ 2분.
위의 조건으로 후보 프라이머에 대한 스크리닝 결과 하기 표1의 프라이머를 베타코로나용 세트로 우선적으로 선택하였다.
<베타코로나바이러스 전장유전체 증폭을 위한 우선 선별 프라이머 세트>
　 Forward Reverse Size (bp)
1 89F 3039R 2950
2 - 1 1347F 4918R 3571
2 - 2 1354F 4918R 3564
3 4384F 7486R 3102
4 6448F 9698R 3250
5 8886F 11778R 2892
6 11551F 14637R 3086
7 14218F 17217R 2999
8 16674F 19230R 2556
9 18885F 21252R 2367
10 - 1 20419F 24290R 3871
10 - 2 21118F 24290R 3172
11 22461F 25820R 3359
12 24284F 26998R 2714
13 - 1 26998F 30476R 3478
13 - 2 27079F 30476R 3397
표1의 프라이머에 대한 PCR 결과 OC43 유전체의 마지막 부분인 poly A tail 앞까지 합성이 되며 유전체 전체가 커버되는 세트인 것을 확인하였다(도 1). 다만 2번 프라이머가 multiband가 형성되는 것이 확인되어 이를 대체할 다른 후보 프라이머에 대해 전수 스크리닝을 진행하였으나, 2번 후보보다 효율이 좋으면서 특이성이 우수한 프라이머를 찾지 못하였으므로 2번 프라이머를 현재 상태로 사용하기로 하였다. 또한 10번, 13번 프라이머 세트 구간이 다른 구간에 비해 합성효율이 낮다고 판단되어 범용성을 담보하기 위해 이 구간에 대해 각 두 개의 프라이머를 선정하였다.
실시예 2. 베타코로나바이러스 범용 프라이머 세트 보완 및 최종 선정
표1의 프라이머 서열은 각 프라이머 별 염기서열 assembly과정에서 read coverage가 낮거나 불안정한 region을 보완하여 시퀀싱 효율을 높이기 위해 해당 부위의 프라이머 세트를 보완하기로 결정하여 새로운 프라이머를 설계하였다. 설계한 프라이머 세트의 PCR 과정에서 10번 프라이머의 amplicon의 electrophersis 결과에서 증폭 효율에 대한 불안정함이 제기되었다. 또한 12번 amplicon과 13번 amplicon 사이가 충분한 길이로 중첩되지 않아 추후 베타코로나 바이러스의 유전체 분석 시, genome assembly가 제대로 진행되지 않을 가능성이 제기되었으므로, 이와 같은 점들을 보완하기 위하여 하기 표2의 프라이머 세트를 제작하였다.
베타코로나바이러스 프라이머 세트 보완 실험을 수행하였다. 3차년도에 우선 선정한 프라이머를 기반으로 하여 10번과 12번 amplicon region에 대체 및 보완할 수 있는 후보 프라이머를 선별하여 동일한 방법으로 PCR을 진행하였다. 10번 부분의 증폭의 효율이 조금 더 확실함 프라이머를 선별하였으며, 12번과 13번 부분의 coverage의 효율을 높이기 위해 새로운 프라이머를 선별하여 보완하였다(도 2, 표 2). 또한, 2번과 10번, 14번 region의 프라이머 세트를 2x coverage로 선정하여 다른 경우의 수를 대비하였다. 이렇게 교체 및 보완한 프라이머를 이용하여 시퀀스를 확인 하기로 하였다. 그 후 확인이 끝나 전체 1x coverage가 완성되면 다양한 차세대 염기서열 분석법(NGS)을 이용하여 전장유전체 분석을 실시하기로 하였다.
<베타코로나바이러스 전장유전체 증폭을 위한 최종 프라이머 세트>
　 Forward Reverse Size (bp)
1 89F
(서열번호 1)		 3039R
(서열번호 2)		 2950
2 - 1 1347F
(서열번호 3)		 4918R
(서열번호 4)		 3571
2 - 2 1354F
(서열번호 5)		 4918R
(서열번호 6)		 3564
3 4384F
(서열번호 7)		 7486R
(서열번호 8)		 3102
4 6448F
(서열번호 9)		 9698R
(서열번호 10)		 3250
5 8886F
(서열번호 11)		 11778R
(서열번호 12)		 2892
6 11551F
(서열번호 13)		 14637R
(서열번호 14)		 3086
7 14218F
(서열번호 15)		 17217R
(서열번호 16)		 2999
8 16674F
(서열번호 17)		 19230R
(서열번호 18)		 2556
9 18885F
(서열번호 19)		 21252R
(서열번호 20)		 2367
10 - 1 20419F
(서열번호 21)		 24290R
(서열번호 22)		 3871
10 - 3 20419F
(서열번호 23)		 23207R
(서열번호 24)		 2788
11 22461F
(서열번호 25)		 25820R
(서열번호 26)		 3359
12 24290F
(서열번호 27)		 27544R
(서열번호 28)		 3254
13 24284F
(서열번호 29)		 26998R
(서열번호 30)		 2714
14 - 1 26998F
(서열번호 31)		 30476R
(서열번호 32)		 3478
14 - 2 27079F
(서열번호 33)		 30476R
(서열번호 34)		 3397
실시예 3. 베타코로나바이러스 범용 프라이머 세트 검증Reverse transcription한 후 최종 선정한 14개의 프라이머 세트로 PCR증폭을 하여 증폭 효율성을 전기영동을 통해 확인하였다(도 2). 또한, 베타코로나바이러스의 14개의 증폭산물을 Sanger 시퀀싱 primer walking법으로 프라이머의 유효성을 확인하였다. 선정한 프라이머의 증폭산물의 단일 밴드 정확성 확인을 위해 PCR purification을 진행 후 모든 유전체 부분의 시퀀스를 확인하였다. Sanger 시퀀싱은 59개의 primer walking 시퀀스를 조합한 결과 베타코로나바이러스의 전장유전체가 전부 cover되었으며 대부분의 염기서열이 일치하였다(도 3).
실시예 4. 베타코로나바이러스 전장유전체 분석
베타코로나바이러스 최적진단프로토콜 개발을 진행하였으며 앞서 선정한 표2의 최종 베타코로나바이러스 프라이머 세트를 이용하여 전장유전체 분석을 위한 여러 단계의 preprocessing을 도 4와 같이 진행하여 확립하였다. 도 4와 같은 preprocessing을 거처 베타코로나바이러스의 전장유전체 분석을 위한 NGS 시퀀싱 가능여부 확인은 Illumina Miseq, Pacific Bioscience RSII, OxfordNanopore MinIon을 이용한 3가지 다른 방식으로 수행하였다. 최종선별한 범용성 프라이머를 이용하여 생산한 증폭 산물들을 동일 농도로 혼합하여 각 시퀀싱 방법의 quality 및 quantity를 맞춰 시퀀싱 하였다. 각 NGS 시퀀싱 방법의 최적 preprocessing과 data analysis workflow를 개발하였으며 이것을 이용하여 시퀀싱 분석 및 서열결정 방법을 진행하였다.
○ 베타코로나바이러스 전장유전체 시퀀싱
1) NGS 시퀀싱 Library preparation
- Illumina Miseq sequencing : Illumina Miseq sequencing의 Truseq 방식을 진행하기 위해 필요한 조건은 concentration(ng/ul) > 10, Total Amount(ug) : 0.4, A260/280 Ratio >1.8 이였다. 따라서 Library preparation을 위해서 넉넉하게 Total 0.579ug sample을 준비하여 301 Paired-end 방식으로 prep하였다(도 5). 도 5b는 Miseq amplicons, 도 5d는 Miseq Library 품질분석 결과이다.
- PacBio RS II sequencing : PacBio RS II 10kb의 Amplicon Target sequencing 방식을 진행하기 위해 필요한 조건은 concentration(ng/ul) > 150, Total Amount(ug) : 10, A260/280 Ratio >1.8 이였다. 그러나 amplicon 방식으로 진행하기에 Library preparation을 위해서 Total Amount 5.46ug으로 충분하여 sample을 해당 양으로 준비하였다(도 5). 도 5a는 Pacbio amplicons, 도 5c는 Pacbio Library 품질분석 결과이다.
- Nanopore MinION sequencing : Oxford Nanopore MinION sequencing의 FLO-MIN106 flowcell과 1d amplicon/cDNA by Ligation kit를 이용하기 위한 library preparation 조건은 Total Amont(ug) : 1-1.5, A260/280 Ratio >1.8 이였다. 따라서, 베타코로나바이러스의 정제된 증폭산물들을 동일한 농도로 맞춘 후 넉넉하게 Total 약 2ug의 양이 되도록 혼합하여 MinION 시퀀싱 라이브러리 제작에 사용하였으며 표준 프로토콜에 따라 Library를 제작하였다.
2) NGS 시퀀싱 raw data quality check control
- Illumina Miseq sequencing : Illumina Miseq 301 Paired-end 방식으로 sequencing한 raw data는 약 500Mb씩 양쪽 두 개의 파일이 생산되어 total 1Gb의 fastq 포멧의 raw data가 생산되었다. raw data의 Quality check control을 위해 fastqc 프로그램을 사용하여 fastq포멧의 raw data를 분석하였다. 그 결과 대부분의 Q-score가 30이상이므로 quality를 측정할 수 있다(도 6a-6b).
- PacBio RS II sequencing : PacBio RS II Amplicon Target sequencing방식으로 시퀀싱을 진행하였으며 raw data는 약 1Gb를 생산하였다. raw data 결과 2,201,460,493bp가 생산되었다(도 6c-6d).
- Nanopore MinION sequencing : 1D ligation 방법을 이용한 Nanopore sequencing을 약 21시간의 시퀀싱 결과 44.1Gb의 fast5포멧의 raw data를 생산하였다. 이것을 Guppy basecaller V.2.3.1을 사용하여 fastq 포맷으로 변환 후 quality check control을 진행하였다. 그 결과 2.96Gb의 data가 생성되었으며 OxfordNanopore사의 EPI2ME - Fastq control experiment (V3.2.2) 프로그램을 이용하여 전체 base에 대한 quality check를 진행하였을 때, Q-score는 평균 9.01이였으나 fastqc 프로그램으로 확인한 target length의 Q-score값은 평균 약 14로 상향되는 결과를 보였다(도 7).
베타코로나바이러스의 NGS 시퀀싱 실시간 확인은 MinION으로만 가능하기에 실시간 시퀀싱 가능여부 판단을 위해 Oxford Nanopore MinION 시퀀싱 실시간 진행사항을 체크하였다. 총 running time은 약 21h이 소요되었다. Nanopore sequencing running후 총 455.389개의 read (약 44.1GB) raw data가 산출되었으며, throughput read length는 약 3 kb였다 (도 8c-8d). MinION 장비에서 산출된 44.1GB의 fast5 포맷의 rawdata를 OxfordNanopore의 자체 프로그램인 Guppy software을 사용하여 fastq파일로 변환하였다. 이 파일 변환은 basecalling 및 sequence quality를 보정 과정으로 총 10h가 소요되었다.
실시예 5. 베타코로나바이러스 전장유전체 분석 및 염기서열 결정
○ Beta-CoV 전장유전체 시퀀싱 분석 및 서열 결정 방법
- Illumina Miseq sequencing : 301 Paired-End로 sequencing한 총 1Gb의 Illumina Miseq raw data를 CLC genomic workbench를 이용하여 QC와 Trimming를 진행 한 후 merge를 수행하였다. Merge되어 길이가 늘어난 data를 이용하여 reference genome으로 mapping과 de novo assembly 하여 2가지 종류의 long contig를 확보하였다.
- PacBio RS II sequencing : 총 23.8G의 Pacbio rawdata를 bam 파일 포맷으로 변환한 뒤 Pacbio 전용 분석 프로그램인 SMRTlink의 Long Amplicon Anlysis (LAA) 를 이용하여 Consensus sequence를 확보하였다. 확보된 시퀀스들은 Megahit 프로그램을 이용하여 assembly를 수행하여 최종 1개의 long contig를 얻었다. 또한, rawdata에서 생성된 fastq포멧을 CLC genomic workbench 프로그램을 이용한 reference genome으로 mapping하여 consensus 서열을 생성하여 2가지 버전의 최종 contig를 생성하였다.
- Nanopore MinION sequencing : 약 21시간의 시퀀싱 결과, 44.1G의 MinION rawdata(fast5포멧)을 산출하였으며 두 가지 방식으로 raw data를 다뤘다. 먼저, 이를 HMM 방식을 사용하는 Guppy software(V2.3.1)을 이용해 2.96Gb의 fastq 포멧파일로 변환하였다. 이 파일 변환은 basecalling 및 sequence quality 보정 과정으로 fast 옵션 설정으로 약 10h가 소요되었다. fastq로 변환된 파일을 CLC genomic workbench를 이용하여 reference genome에 mapping하여 한 개의 long contig consensus sequence로 된 complete genome sequence를 획득하였다. 다음으로, MinION rawdata를 한 파일로 만든 후, bowtie2 프로그램을 이용하여 trim과 reference mapping을 이용한 alignment를 하였다. 분석된 BAM 파일은 Genome Analysis Tool Kit(GATK)을 이용하여 Variant Discovery을 하여 vcf 파일을 도출하고 이를 FASTA 파일 포맷으로 변환하여 1개의 contig를 얻었다.
- Sanger Sequencing : Primer walking 방법을 사용하여 총 14개 amplicons을 모두 시퀀싱하였다. 확보된 모든 염기서열은 Q20 이상인 base를 chromatogram을 참고하여 quality를 확인하고, ezeditor2 프로그램을 사용하여 trim 하였다. 각 시퀀싱 방법의 정확도 평가를 하기 위하여, Pacbio, MinION, Miseq 시퀀싱으로 도출된 각 contig 함께 Codoncode alinger를 이용하여 hybrid assembly를 수행하였다.
○ 베타코로나바이러스 전장유전체 염기서열 분석 결과 : 4가지의 서로 다른 방법을 이용하여 시퀀싱한 결과 모두 최종 1개의 consensus 서열이 생성됨을 확인할 수 있었다. 이렇게 확보된 각각의 염기서열을 보고된 베타코로나바이러스 전장유전체(GenBank Accession number AY391777.1)와 염기서열을 비교해 보았다(도 10, 표 3, 표 4). 본 연구에서 Miseq, Pacbio, MinIon, Sanger 시퀀싱으로 결과를 바탕으로 각 시퀀싱 분석방법에 따라 1차적으로 reference mapping방식으로 1개의 최종 contig를 확보하여 비교하였다. 또한, 현재까지 보고된 NGS 시퀀싱 방법 중 정확도가 높다고 알려진 Miseq과 PacBio 방법으로 de novo assembly를 진행하였을 때 비슷한 최종 contig를 확보할 수 있었다. 이와 같은 두 가지 방식을 이용하여 consensus 시퀀스를 만들고 이를 reference와 비교하였다. reference mapping의 depth coverage가 각 시퀀싱 방법별로 도 11과 같이 차이가 있었다. consensus와 reference는 약 66개 nt가 불일치함을 확인하였다. 그러나 시퀀싱 방법에 따른 최종 contig 서열별로 consensus 시퀀스와 비교하였을 때 약 9개 이하의 시퀀스가 불일치하였다. 이는 reference 균주에 비해 실험 균주에서 microevolution 수준의 변이가 있음을 의미한다. Consensus 시퀀스와 비교하여 MinIon은 3개, Pacbio는 5개, Miseq은 4개, Sanger는 4개의 시퀀스가 불일치함을 확인하였으며 이러한 결과로 유추해 볼 때, de novo assembly의 결과 중 coverage가 높고 낮은 시퀀싱 에러율은 PacBio으로 보이며 reference mapping의 결과로는 Miseq의 시퀀싱이 coverage가 높고 낮은 에러율이 확인되었다.
<네 가지 시퀀싱 기술의 베타코로나바이러스 유전체 분석 성능 비교>
시퀀싱
기술		 Input RNA Input gDNA Coverage Accuracy Runtime
Sanger 50 - 98.6341 99.9934 -
MinION 50 2.1ug 99.2032 99.8295 8-24h reference mapping
RSII 50 5.46ug 98.9138 99.8356 10h de novo assembly
99.2032 99.8295 reference mapping
MiSeq 50 0.579ug 99.0341 99.8358 48h de novo assembly
99.3951 99.8364 reference mapping
<Miseq, PacBio, MinIon, Sanger 시퀀싱으로 확보된 베타코로나바이러스 전장유전체의 서열 비교>
Position 72 73 90 95 11556 12161 30480 30487 30494
AY391777.1 T T C A A A G C A
Consensus T T C T A A G C C
Sanger - - C T C A - - -
Miseq
(de novo)		 T T T A C A G C -
Miseq
(mapping)		 T T C T A A G C A
Pacbio(LAA) - - C T A A - - -
Pacbio
(mapping)		 G C C T A - G C C
MinION
(mapping)		 G C C T A - G C C

Claims (13)

  1. 하기의 단계를 포함하는 분리된 시료 내 베타코로나바이러스의 전장 유전체 서열 확인 방법
    (a) 베타 코로나 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 제조하는 단계;
    (b) 시료에서 RNA를 분리하는 단계;
    (c) 분리된 RNA를 사용하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
    (d) 역전사 반응이 수행된 시료에 프라이머 세트를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계; 및
    (e) 증폭된 산물의 서열을 분석하는 단계
    상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20; 서열번호 21 및 서열번호 22; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 27 및 서열번호 28; 서열번호 29 및 서열번호 30; 서열번호 31 및 서열번호 32; 및 서열번호 33 및 서열번호 34의 프라이머 세트를 포함하는 것임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것인, 방법
  3. 제1항에 있어서, 상기 베타 코로나 바이러스는 OC43 및 HKU1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 방법
  4. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 35 내지 199에서 선택된 하나 이상의 프라이머 또는 이의 역상보적 프라이머 서열을 추가적으로 포함하는 것인, 방법
  5. 베타코로나바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 베타코로나바이러스 진단 키트로서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20; 서열번호 21 및 서열번호 22; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 27 및 서열번호 28; 서열번호 29 및 서열번호 30; 서열번호 31 및 서열번호 32; 및 서열번호 33 및 서열번호 34의 프라이머 세트를 포함하는 베타코로나바이러스 진단 키트.
  6. 제5항에 있어서, 진단 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것인, 키트
  7. 제5항에 있어서, 상기 베타코로나바이러스는 OC43 및 HKU1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 키트
  8. 제5항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 35 내지 199에서 선택된 하나 이상의 프라이머 또는 이의 역상보적 프라이머 서열을 추가적으로 포함하는 것인, 키트
  9. 베타코로나바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 베타코로나바이러스 유발 질환 진단용 조성물로서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20; 서열번호 21 및 서열번호 22; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 27 및 서열번호 28; 서열번호 29 및 서열번호 30; 서열번호 31 및 서열번호 32; 및 서열번호 33 및 서열번호 34의 프라이머 세트를 포함하는 것인 베타코로나바이러스 유발 질환 진단용 조성물
  10. 제9항에 있어서, 상기 베타코로나바이러스 유발 질환은 호흡기 질환인 것인, 조성물
  11. 제9항에 있어서, 진단 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것인, 조성물
  12. 제9항에 있어서, 상기 베타코로나바이러스는 OC43 및 HKU1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 조성물
  13. 제9항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 35 내지 199에서 선택된 하나 이상의 프라이머 또는 이의 역상보적 프라이머 서열을 추가적으로 포함하는 것인, 조성물
PCT/KR2021/006000 2020-05-14 2021-05-13 전장유전체 증폭을 위한 인간 베타코로나바이러스 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트 WO2021230673A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0057804 2020-05-14
KR1020200057804A KR102295574B1 (ko) 2020-05-14 2020-05-14 전장유전체 증폭을 위한 인간 베타코로나바이러스 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021230673A1 true WO2021230673A1 (ko) 2021-11-18

Family

ID=77489259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/006000 WO2021230673A1 (ko) 2020-05-14 2021-05-13 전장유전체 증폭을 위한 인간 베타코로나바이러스 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102295574B1 (ko)
WO (1) WO2021230673A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006524052A (ja) * 2003-04-21 2006-10-26 ゲノム インスティチュート オブ シンガポール 重症急性呼吸器症候群コロナウイルスを検出する試薬および方法
KR100994568B1 (ko) * 2003-12-12 2010-11-15 삼성전자주식회사 사스 코로나바이러스 검출용 프라이머, 그를 이용한 사스코로나바이러스 검출 방법 및 키트
CN102732638A (zh) * 2011-04-07 2012-10-17 中山大学 人冠状病毒oc43、229e、nl63、hku1和sars一管多重荧光pcr检测方法及其引物、探针和试剂盒
CN104498636A (zh) * 2015-01-09 2015-04-08 江苏国际旅行卫生保健中心无锡分中心 一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列及检测方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100625325B1 (ko) 2004-08-20 2006-09-20 (주)지노믹트리 코로나바이러스 검출용 프로브 조성물, 프라이머 혼합물및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법
KR20180052317A (ko) * 2016-11-10 2018-05-18 충북대학교 산학협력단 메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101857685B1 (ko) 2017-09-22 2018-05-14 주식회사 코젠바이오텍 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006524052A (ja) * 2003-04-21 2006-10-26 ゲノム インスティチュート オブ シンガポール 重症急性呼吸器症候群コロナウイルスを検出する試薬および方法
KR100994568B1 (ko) * 2003-12-12 2010-11-15 삼성전자주식회사 사스 코로나바이러스 검출용 프라이머, 그를 이용한 사스코로나바이러스 검출 방법 및 키트
CN102732638A (zh) * 2011-04-07 2012-10-17 中山大学 人冠状病毒oc43、229e、nl63、hku1和sars一管多重荧光pcr检测方法及其引物、探针和试剂盒
CN104498636A (zh) * 2015-01-09 2015-04-08 江苏国际旅行卫生保健中心无锡分中心 一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列及检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L. VIJGEN, E. KEYAERTS, E. MOES, P. MAES, G. DUSON, M. VAN RANST: "Development of One-Step, Real-Time, Quantitative Reverse Transcriptase PCR Assays for Absolute Quantitation of Human Coronaviruses OC43 and 229E", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 43, no. 11, 1 November 2005 (2005-11-01), US , pages 5452 - 5456, XP055711192, ISSN: 0095-1137, DOI: 10.1128/JCM.43.11.5452-5456.2005 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102295574B1 (ko) 2021-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104531883A (zh) Pkd1基因突变的检测试剂盒及检测方法
AU2014346680A1 (en) Targeted screening for mutations
WO2014023076A1 (zh) 一种地中海贫血的分型方法及其应用
BR112021006402A2 (pt) Ferramenta baseada em sequência-gráfico para determinar a variação em regiões curtas de repetição em tandem
CN105803054A (zh) 试剂盒及其在检测唇腭裂相关基因中的用途
WO2021230673A1 (ko) 전장유전체 증폭을 위한 인간 베타코로나바이러스 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트
JP2023519919A (ja) 病原体を検出するためのアッセイ
WO2022050700A1 (ko) 전장유전체 증폭을 위한 인간 사스-코로나바이러스-2 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트
CN108753934B (zh) 一种检测基因突变的方法、试剂盒及其制备方法
WO2021091211A1 (ko) 메르스 코로나 바이러스 전장 유전체 증폭을 통한 전장 유전체 검출 방법 및 진단 키트
CN116121360A (zh) 一种用于检测dba致病基因集合的试剂盒及检测方法
CN108642173B (zh) 一种无创检测slc26a4基因突变的方法和试剂盒
CN113444784B (zh) 重症先天性中性粒细胞减少症检测引物组合物及应用
CN108949951B (zh) 一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒
AU2012380897B2 (en) Method and system for identifying types of twins
Pausch et al. Exploiting whole genome sequence data for the identification of causal trait variants in cattle
CN108424959B (zh) 一种用于强直性脊柱炎早期诊断的生物标记物及其在试剂盒中应用
KR102537109B1 (ko) 차세대 염기서열 분석 기술 기반 covid-19 진단 및 변이체 판정 시스템
WO2023140596A1 (ko) 전장유전체 증폭을 위한 치쿤군야 바이러스 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트
CN109457019B (zh) Kcnh2基因scd相关snp检测试剂盒及检测方法
CN113265409B (zh) Timm21突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途
KR102111037B1 (ko) 서울바이러스의 감염을 진단하기 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 키트 및 방법
KR20230138279A (ko) 전장유전체 증폭을 위한 리프트밸리열 바이러스 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트
CN117737227A (zh) 基于cfDNA筛查胎儿ACH的基因检测试剂盒及系统
Nakamura et al. Detection and Genetic Analysis of Bovine Rhinitis B Virus in Japan

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21805026

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21805026

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1