KR102537109B1 - 차세대 염기서열 분석 기술 기반 covid-19 진단 및 변이체 판정 시스템 - Google Patents

차세대 염기서열 분석 기술 기반 covid-19 진단 및 변이체 판정 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR102537109B1
KR102537109B1 KR1020210154442A KR20210154442A KR102537109B1 KR 102537109 B1 KR102537109 B1 KR 102537109B1 KR 1020210154442 A KR1020210154442 A KR 1020210154442A KR 20210154442 A KR20210154442 A KR 20210154442A KR 102537109 B1 KR102537109 B1 KR 102537109B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
dna
primer
artificial sequence
forawrd
Prior art date
Application number
KR1020210154442A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20230073365A (ko
Inventor
황태순
백순명
김해숙
임은택
Original Assignee
주식회사 테라젠바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 테라젠바이오 filed Critical 주식회사 테라젠바이오
Priority to KR1020210154442A priority Critical patent/KR102537109B1/ko
Publication of KR20230073365A publication Critical patent/KR20230073365A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102537109B1 publication Critical patent/KR102537109B1/ko

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • GPHYSICS
    • G16INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16BBIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10Sequence alignment; Homology search
    • GPHYSICS
    • G16INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16HHEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H15/00ICT specially adapted for medical reports, e.g. generation or transmission thereof
    • GPHYSICS
    • G16INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16HHEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/80ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics, e.g. flu
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Primary Health Care (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 다양한 SARS-CoV-2 변이체를 동시에 진단할 수 있는 COVID-19 진단 및 변이체 판정 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 시스템을 이용하면 높은 특이도 및 민감도로 다양한 COVID-19 변이체 감염 판정이 가능하므로, 보건 및 의료 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Description

차세대 염기서열 분석 기술 기반 COVID-19 진단 및 변이체 판정 시스템{COVID-19 diagnosis and variant determination system based on next-generation sequencing analysis}
본 발명은 차세대 염기서열 분석 기술 기반 COVID-19 진단 및 변이체 판정 시스템에 관한 것이다.
코로나바이러스는 현대 문명에서 치명적인 감염병을 일으키는 대표적인 바이러스로 2003년 4월에는 중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome; SARS), 일명 사스가 유행해 사망률 9.6%를 기록하며 많은 사람이 사망했으며, 2015년에는 중동 호흡기 증후군(Middle East Respiratory Syndrome; MERS), 일명 메르스가 중동에서 전 세계로 퍼지면서 사망률 약 36%로써 사망자가 다수 발생한 바 있다. 그리고 2019년 12월 처음 발생한 새로운 유형의 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2) 감염 질환인 코로나바이러스감염증-19(Coronavirus disease 19; COVID-19)는 약 2년이 지난 지금까지도 치료제 개발이 미비하여 인류의 건강을 위협하고 있다.
SARS-CoV-2에 감염되면 고열, 심한 기침, 미각 또는 후각 상실, 인후통, 두통, 극심한 피로감 등의 증상이 나타나고, 특히 고령이나 기저질환이 있는 환자의 경우 사망률이 높은 특징이 있다. 2021년 3월 대한민국 건강보험심사평가원이 공개한 통계에 따르면, COVID-19로 인한 사망자 중 68.7%가 평소 고혈압을 앓고 있었으며, 47.6%는 당뇨, 36.6%는 만성 폐질환을 기저질환으로 가지고 있었다. 명확한 치료제가 개발되지 못하고 있는 상황에서 COVID-19에 의한 중증 후유증, 또는 사망률을 최소화하기 위해 빠르고 정확한 진단의 필요성이 대두되고 있으나, COVID-19는 다양한 돌연변이를 일으키며 지속적으로 변이체가 파생되고 있는 실정이다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 다양한 SARS-CoV-2 변이체를 동시에 진단할 수 있는 COVID-19 진단 및 변이체 판정 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 시스템을 이용하면 높은 특이도 및 민감도로 다양한 COVID-19 변이체 감염 판정이 가능하므로, 보건 및 의료 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
본 발명의 일 목적은 코로나바이러스의 계통군 또는 변이체 판정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 코로나 바이러스의 계통군 또는 변이체 판정용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 코로나 바이러스의 계통군 또는 변이체 판정용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 코로나바이러스의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 코로나 바이러스의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 코로나 바이러스의 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 코로나바이러스 감염증의 진단에 관한 정보 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 코로나바이러스의 감염증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 코로나바이러스의 감염증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. “한 가지 구현예” 또는 “구현예”에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 “한 가지 구현예” 또는 “구현예”의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서 내에 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명에서 코로나 바이러스(Coronavirus)란 RNA 바이러스의 일종이다. 코로나비리대(Coronaviridae)의 코로나바이러스아과(Coronavirinae)에 4개의 속(알파, 베타, 감마, 델타)이 있으며, 유전자 크기 27 내지 32kb의 RNA 바이러스로 사람과 동물의 호흡기와 소화기계 감염을 유발하는 것으로 알려져 있다. 주로 점막 전염, 비말 전파로 쉽게 감염되며, 사람은 일반적으로 경미한 호흡기 감염을 일으키지만 드물게 치명적인 감염을 일으키기도 하며, 소와 돼지는 설사, 닭은 호흡기 질환이 발생하기도 한다. 코로나바이러스 중에서 사람을 숙주로 하는 코로나바이러스는 하기 표 1의 분류로 나뉜다(질병관리본부, 2020). 4개의 속 중에서 알파와 베타는 사람과 동물에게 감염이 되며, 감마와 델타는 동물에게만 감염되는 것으로 보고되고 있다.
속(genus) 사람-코로나바이러스 사람 외 감염 코로나바이러스
알파 코로나바이러스 229, NL63 돼지 유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus; PEDV), (돼지)전염성 위장염 바이러스 (transmissible gastroenteritis virus; TGEV), 개코로나바이러스(canine coronavirus; CcoV), 고양이 코로나바이러스 (feline coronavirus;FcoV), Miniopterus bat(박쥐) coronavirus1, Miniopterus bat(박쥐) coronavirus HKU8, Rhinolophus bat(박쥐) coronavirus HKU2, Scotophilus bat(박쥐) coronavirus 512
베타 코로나바이러스 OC43, HKU1, SARS-CoV, SARS-CoV2, MERS-CoV 돼지 혈구 응집성뇌척수염 바이러스(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus; PHEV), 우코로나바이러스(bovine coronavirus; BcoV), 말코로나바이러스(equine coronavirus; EqCoV), 쥐코로나바이러스(murine coronavirus; MuCoV), Tylonycteris bat(박쥐) coronavirus HKU4, Pipistrellus bat(박쥐) coronavirus HKU5, Rousettus bat(박쥐) coronavirus HKU9
감마 코로나바이러스 - 새코로나바이러스(Avian coronavirus), 흰색 돌고래(Beluga whale)-코로나바이러스 SW1
델타 코로나바이러스 - 제주직박구리(Bulbul)-코로나바이러스 HKU11, 개똥지빠귀(Thrush)-코로나바이러스 HKU12, 킨바라(Munia)-코로나바이러스 HKU13
특히, 현재 사람에 감염력이 있는 코로나바이러스로는 하기 표 2의 7종이 존재하며, 감기를 일으키는 유형(229E, OC43, NL63, HKU1)과 중증 폐렴을 일으키는 유형(SARS-CoV, SARS-CoV2, MERS-CoV)으로 나뉜다.
바이러스명 속(Genus) 숙주(host) 증상
HcoV-229E Alpha Human 가벼운 호흡기 증상
HcoV-NL63 Alpha Human 가벼운 호흡기 증상
SARS-CoV Beta Human 심각한 호흡기 증상
MERS-CoV Beta Human 심각한 호흡기 증상
HcoV-OC43 Beta Human 가벼운 호흡기 증상
HcoV-HKU1 Beta Human 폐렴 증상
SARS-CoV-2 Beta Human 호흡기 증상 심한 경우 호흡곤란 유발
상기의 SARS-CoV-2는 코로나바이러스감염증-19(Coronavirus disease 19; COVID-19)의 원인 바이러스로서, 코로나비리대 패밀리에 속하는 외피로 둘러싸인, 양성-극성 외가닥 RNA 베타 코로나바이러스에 해당한다. 보통 코로나바이러스의 게놈 사이즈는 약 26,000~32,000 bp 정도로 사람에 비하면 10만 분의 1로 너무 작은 유전체 사이즈이지만 바이러스 입장에서는 비교적 큰 사이즈의 유전체를 가지고 있다. SARS-CoV-2 유전체는 29.8kb 염기서열(NC_045512.2)로 구성되어 있는데, 이를 구체적으로 분석하면 27개의 단백질을 코딩하는 14개의 오픈 리딩 프레임(open-reading frames; ORFs)를 가지고 있고, 바이러스 게놈의 3‘말단에서 13개의 ORF는 9개의 예측되는 서브-게놈 RNA로부터 발현되며, 이들은 4개의 구조 단백질인, 스파이크(spike; S), 외피(envelope; E), 막(membrane; M) 및 뉴클레오캡시드(nucleocapsid; N)와, 9개의 추정적 부가 요소로부터 발현된다. 여기서, 상기 뉴클레오캡시드 단백질은 N1, N2 및 N3 절편을 포함한다. 상기 코로나바이러스-19의 유전 정보는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/와 같은 기 공개된 데이터베이스로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 상기 코로나 바이러스는 자연적으로 또는 인공적으로 돌연변이가 발생한 변이체를 포함하고, 상기 코로나바이러스에 의한 감염 질환은 코로나바이러스성 장염, 코로나바이러스성 설사, 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome coronavirus; SARS), 중동 호흡기 증후군(Middle East respiratory syndrome; MERS), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2), 상기 바이러스 감염에 기인한 호흡기 질환, 간염, 위장염 또는 뇌염일 수 있고, 바람직하게는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2) 감염 질환인 코로나바이러스감염증-19(Coronavirus disease 19; COVID-19)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 프라이머란, 짧은 서열의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로서 목적하는 DNA 또는 RNA의 반대편 가닥의 상보적 위치에 특이적으로 부착되어 유전자의 증폭(amplification)을 개시하는 역할을 하는 올리고뉴클레오티드이다. 타깃으로 하는 특이적 항원 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드로서, 바람직하게는 서열번호 48 내지 141로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 서열번호 48 내지 94로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나, 및 서열번호 95 내지 141로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 염기쌍일 수 있다. 또는 상기 서열번호 48 내지 141로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나와 염기서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 유사한 서열일 수 있다.
본 발명에서 상기 키트란, 코로나 바이러스를 검출하거나, 코로나 바이러스 감염증을 진단하거나, 또는 코로나 바이러스의 계통군 또는 변이체를 판정하기 위한 시험체 세트를 의미하며, 생물학적 시료로부터 특정 유전자의 존재 여부를 확인할 수 있는 것으로, 바람직하게는 본 발명의 표적 유전자에 대한 프라이머를 포함하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 키트는 유전체 증폭용 키트일 수 있다.
상기 유전체 증폭은 기초 PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR(Reverse transcriptase PCR), 네스티드 PCR(nested PCR), RQ-PCR(real time quantitative PCR), AS-PCR(allele specific PCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 디지털 PCR(disital PCR), multiplex PCR, RT-multiplex PCR, NGS(Next Generation Sequencing)등 기본적으로 유전자의 증폭을 이용한 것이라면 제한없이 이용 가능하다.
본 발명의 상기 키트는 개체로부터 분리된 생체 시료를 대상으로 적용되는 것일 수 있다. 상기 개체로부터 분리된 생체 시료는 혈액, 타액, 조직, 세포, 객담, 기관지 세포세척액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 혹은 그 이상의 것일 수 있다.
상기 생체 시료는, 건조된 형태의 액상 또는 조직시료, 또는 액체에 담겨 있는 시료가 이용될 수 있다. 이러한 생체 시료는 검출을 수행하기 전에, 바이러스 검출이 필요한 통상의 시료 수득방법에 의해 대상체로부터 직접 수득된 것이거나, 종전에 미리 분리되어 보관된 것일 수 있다. 혹은, 바이러스 검출이 필요한 대상으로부터 수득된 조직이나 세포 또는 in vitro 세포 배양물이 사용될 수도 있으나, 이에 제한되는 바는 아니다. 다른 예로, 상기 생체 시료는 상술한 세포 또는 조직 시료로부터 분리된 핵산이 시료로서 사용될 수 있다. 이 때, 분리하는 과정에서 다양한 순도로 분리되는 당업계에서 사용되는 생물학적인 분리방법이 동원될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 코로나바이러스 유전체 중 서열번호 1 내지 47로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유전자 증폭하는 단계; 및, 유전자 변이 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 코로나바이러스의 계통군 또는 변이체 판정 방법을 제공하고, 상기 계통군은 L형, S형, V형, G형, GH형, GV형, GR형, GRY형, 또는 GK형인 것인 코로나바이러스의 계통군 또는 변이체 판정 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 변이체는 알파변이, 베타변이, 감마변이, 델타변이, 오미크론변이, 람다변이, 또는 뮤변이일 수 있고, 상기 코로나바이러스는 HcoV-229E, HcoV-NL63, SARS-CoV, MERS-CoV, HcoV-OC43, HcoV-HKU1, 및 SARS-CoV-2로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명에 있어서 상기 변이체 판정은, 코로나바이러스 유전체 중 N 말단으로부터 174번, 210번, 241번, 913번, 3037번, 3267번, 3701번, 4181번, 5184번, 5230번, 5388번, 5986번, 6319번, 6402번, 6954번, 7124번, 8782번, 8964번, 9052번, 9891번, 10028번, 11083번, 11201번, 11288 내지 11296번, 11418번, 11514번, 13843번, 13860번, 14408번, 20936번, 21765 내지 21770번, 21991 내지 21993번, 22028 내지 22036번, 22227번, 22355번, 22812번, 22813번, 22916번, 23012번, 23063번, 23271번, 23403번, 23525번, 23604번, 23709번, 24410번, 24506번, 24775번, 24914번, 25469번, 25563번, 26144T번, 26767번, 27874번, 27972번, 28048번, 28111번, 28144번, 28167번, 28248 내지 28253 번, 28269 내지 28273번, 28280번, 28461번, 28512번, 28877번, 28881번, 28887번, 28916번, 28977번, 29402번, 및 29742번째 아미노산으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이 여부를 확인하는 것일 수 있다. 상기 본 발명의 유전자 증폭은 서열번호 48 내지 94로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나, 및 서열번호 95 내지 141로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 프라이머 염기쌍으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 개체로부터 분리된 생체 시료를 대상으로 코로나바이러스 유전체 중 서열번호 1 내지 47로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유전자 증폭하는 단계;를 포함하는 코로나바이러스 감염증 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 개체로부터 분리된 생체 시료는 혈액, 타액, 조직, 세포, 객담, 기관지 세포세척액 및 소변으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 상기 코로나 바이러스, 및 유전자 증폭에 관한 구체적 사항은 상기 코로나바이러스의 계통군 또는 변이체 판정 방법에서 기재한 바와 중복되어, 이하 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 48 내지 94로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나, 및 서열번호 95 내지 141로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 코로나 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 코로나 바이러스에 관한 구체적 사항은 상기 코로나바이러스의 계통군 또는 변이체 판정 방법에서 기재한 바와 중복되어, 이하 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 48 내지 94로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나, 및 서열번호 95 내지 141로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 코로나 바이러스 검출용 프라이머 세트를 포함하는 코로나 바이러스 검출용 키트를 제공한다. 상기 코로나 바이러스에 관한 구체적 사항은 상기 코로나바이러스의 계통군 또는 변이체 판정 방법에서 기재한 바와 중복되어, 이하 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 48 내지 94로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나, 및 서열번호 95 내지 141로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 코로나 바이러스 변이 판정용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 코로나 바이러스에 관한 구체적 사항은 상기 코로나바이러스의 계통군 또는 변이체 판정 방법에서 기재한 바와 중복되어, 이하 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 48 내지 94로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나, 및 서열번호 95 내지 141로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 코로나 바이러스 변이 판정용 프라이머 세트를 포함하는 코로나 바이러스 변이 판정용 키트를 제공한다. 상기 코로나 바이러스에 관한 구체적 사항은 상기 코로나바이러스의 계통군 또는 변이체 판정 방법에서 기재한 바와 중복되어, 이하 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
이하 상기 본 발명을 실시예에 입각하여 상세히 설명한다.
본 발명은 차세대 염기서열 분석 기술 기반 COVID-19 진단 및 변이체 판정 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 시스템을 이용하면 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2) 감염 질환인 코로나바이러스감염증-19(Coronavirus disease 19; COVID-19)의 변이체 감염 여부를 높은 특이도 및 민감도로 빠르고 정확하게 진단 및 선별검사 할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명의 차세대 염기서열 분석 기술 기반 COVID-19 진단 및 변이체 판정 시스템의 흐름을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명의 차세대 염기서열 분석 기술 기반 COVID-19 진단 및 변이체 판정 시스템 중 NGS 패널 디자인 단계의 흐름을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명의 차세대 염기서열 분석 기술 기반 COVID-19 진단 및 변이체 판정 시스템 중 데이터 분석 단계의 흐름을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 프라이머 패널 디자인을 위해 수집한 SARS-CoV-2 계통군 및 변이체 위치 정보 예시이다. WHO 및 CDC 분류 체계에 따라서 VOC(Variants of Concern, 위)와 VOI(Variants of interest, 아래)의 2종류의 변이체에 대하여 위치 정보를 수집하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명의 디자인 패널인 제조예 패널(좌)과 대조군 패널(우)을 이용하여 SARS-CoV-2 표준물질을 시퀀싱한 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, (a) MN908947.3(기본 서열), (b) EPI_ISL_601443(알파변이), (c) EPI_ISL_678597(베타변이), 및 (d) EPI_ISL_792683(감마변이)을 참조서열로 제작된 표준물질에 대한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 임상 샘플 전장 유전체 시퀀싱 결과에서 본 발명의 디자인 패널인 제조예 패널 영역의 앰플리콘 생성 여부를 확인한 결과이다. 각각은 저품질 임상 샘플에서 앰플리콘 생성 여부(좌측), 및 고품질 임상 샘플에서 앰플리콘 생성 여부(우측)를 나타낸 것으로 노란 영역은 디자인한 프라이머 패널이 타겟으로 하는 영역을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 차세대염기서열분석 기술 기반 COVID-19 진단 및 변이체 판정 시스템 개발
SARS-CoV-2의 변이체(variant) 정보를 수집하고, 해당 정보를 기반으로 차세대 염기서열 분석 방법(Next generation sequencing; NGS)의 타겟 시퀀싱(Target gene sequencing; TGS)을 위한 프라이머(primer) 패널(panel)을 디자인하였다. 이후, 해당 패널을 이용하여 검체의 TGS를 수행하였다. 본 발명의 상기 시스템은 시퀀싱 결과로부터 COVID-19 감염 여부 진단 및 SARS-CoV-2 변이체(variant)를 파악하고, 결과를 전달할 수 있는 시스템이다. 상기 본 발명의 시스템 모식도를 도 1에 나타내었다.
이를 보다 구체적으로 설명하면, 상기 시스템의 1단계는 NGS 패널 디자인 단계이다. 당업계에서 이용 가능한 데이터베이스로부터 SARS-CoV-2의 계통군(clade) 및 변이체를 구분하는 염기서열 위치 정보를 수집한다. 그 후 TGS 프라이머 패널 제작을 위한 타겟 위치를 선택하여 NGS 수행을 위한 타겟 프라이머(primer) 패널을 제작하는 프라이머 패널 디자인을 수행한다. 이 때 패널 디자인 조건으로는 디자인 패널의 비용, 패널에 포함된 프라이머 사이에 간섭 효과(interference) 발생 여부 확인, SARS-CoV-2 변이체의 전염성 및 중증도 등을 통한 변이체의 중요도 등을 고려한다. 상기 NGS 패널 디자인 단계 흐름의 모식도를 도 2에 나타내었다.
제 2 단계는 NGS 수행 단계이다. COVID-19 의심환자 혹은 검사 의뢰자가 검사 기관에서 검체를 채취하면, 해당 검체로부터 RNA를 추출하고, 추출된 RNA에 대하여 상보적 DNA(complemen tary DNA; cDNA)를 합성하고, 합성된 전체 cDNA에서 상기 제작한 프라이머 패널을 이용하여 각 타겟 영역의 앰플리콘(amplicon)을 증폭한 뒤 어댑터(adapter) 서열을 부착하는 과정을 통해 NGS 라이브러리(library)를 제작하고, 제작된 라이브러리에 대해 TGS를 수행한다.
제 3 단계는 데이터 분석 단계이다. 제 2 단계에서 시퀀싱 과정의 결과로 생성된 FASTQ 포맷 데이터로부터 라이브러리 제작 시 사용된 어댑터 서열을 제거(trimming)하여 어댑터가 제거된 샘플의 서열을 얻은 뒤, SARS-CoV-2 참조서열(reference sequence, NC_045512.2)에 정렬(align)한다. 정렬 과정에서 타겟 영역의 개별 염기 위치마다 해당 위치에 유전자 서열이 존재한다면 매핑 리드(read)가 생성되므로, 각 염기서열 위치에 1개 이상의 리드가 생성이 되면 해당 위치에 염기서열이 존재하는 것으로 추정한다. 추정 결과 개별 앰플리콘 영역의 90% 이상의 염기서열이 존재하면 해당 앰플리콘이 생성된 것으로 판정한다. 앰플리콘이 3개 이상 생성이 된다면 NGS를 수행한 검체에 SARS-CoV-2 유전자가 존재하는 것으로 판정하여 COVID-19 양성으로 진단하고, 그렇지 않은 경우는 음성으로 진단한다. 양성으로 진단된 경우 개별 앰플리콘의 정렬 결과를 분석하여 각 타겟 영역에서 발생한 돌연변이(mutation) 정보를 종합하고, 해당 샘플에 포함된 SARS-CoV-2의 계통군 및 변이체를 판정한다. 본 단계에서는 NGS 결과 정렬과정과 COVID-19 감염 여부 진단과정, 및 변이체 판정과정에서 도출된 결과를 평가하는 분석결과 평가 과정이 추가로 수행되고, 해당 과정을 만족하지 못하는 경우에는 NGS 시퀀싱 수행 단계 혹은 데이터 분석 단계를 재 수행하게 되며, 평가 결과 기준을 만족한 경우 분석 결과에 대한 최종 보고서를 생성하고, 이를 의심환자 또는 의뢰자에게 전달한다. 상기 시퀀싱 결과로부터 데이터 분석하는 단계 흐름의 모식도를 도 3에 나타내었다.
실시예 2. 차세대염기서열분석 기술 기반 COVID-19 진단 및 변이체 판정 시스템 검증
실시예 2-1. 변이체 정보를 통한 시퀀싱 패널 타겟 사이트 선정
SARS-CoV-2 계통군(clade) 및 변이체(variant) 분류가 가능한 시퀀싱 패널 디자인을 위하여 계통군과 변이체 정보를 수집하였다. SARS-CoV-2의 계통군은 L형, S형, V형, G형, GH형, GV형, GR형, GRY형, GK형이 해당된다. 변이체의 경우 크게 VOC(Variants of concern, 주요 변이 바이러스)와 VOI(Variants of interest, 기타 변이 바이러스)의 두 종류로 분류되는데, VOC에는 알파변이, 베타변이, 감마변이, 델타변이, 및 오미크론변이가 포함되고, VOI에는 람다변이, 및 뮤변이가 포함된다. 계통군과 변이체의 정보를 수집하고, 분류에 사용되는 유전자 위치 정보를 정리하여, 이를 도 4에 나타내었다. 이후 계통군 또는 변이체 유행의 정도, 중증도 변화, 전파 속도 차이 등의 임상적 영향과 프라이머 제작 시 프라이머 사이의 간섭 효과(inference) 발생 여부, 제작 비용 등을 고려하여 타겟 위치를 선정하였고, 표 3과 같이 패널을 디자인하였다. 표 3에서 “START”는 SARS-CoV-2 유전체는 29.8kb 염기서열(NC_045512.2) 중 프라이머 타겟의 시작 위치, “END”는 프라이머 타겟의 종결 위치, 프라이머 타겟의 서열, “Target Mutation Base”는 변이 검출을 위한 타겟 염기이다.
START END Target Sequence Amplicon Name Target Mutation Base
136 262 서열번호 1 Amp_01 174T,210T,241T
847 979 서열번호 2 Amp_02 913T
2957 3078 서열번호 3 Amp_03 3037T
3180 3306 서열번호 4 Amp_04 3267T
3639 3767 서열번호 5 Amp_05 3701A
4133 4255 서열번호 6 Amp_06 4181T
5156 5282 서열번호 7 Amp_07 5184T,5230T
5347 5469 서열번호 8 Amp_08 5388T
5904 6024 서열번호 9 Amp_09 5986T
6301 6422 서열번호 10 Amp_10 6319G,6402T
6904 7027 서열번호 11 Amp_11 6954C
7106 7229 서열번호 12 Amp_12 7124T
8713 8840 서열번호 13 Amp_13 8782T
8951 9071 서열번호 14 Amp_14 8964T,9052C
9825 9952 서열번호 15 Amp_15 9891T
9988 10115 서열번호 16 Amp_16 10028T
11007 11130 서열번호 17 Amp_17 11083T
11187 11309 서열번호 18 Amp_18 11201G,11288~11296_del
11401 11524 서열번호 19 Amp_19 11418C,11514T
13796 13919 서열번호 20 Amp_20 13843T,13860T
14345 14471 서열번호 21 Amp_21 14408T
20877 20995 서열번호 22 Amp_22 20936T
21705 21826 서열번호 23 Amp_23 21765-21770_del&21770T
21955 22075 서열번호 24 Amp_24 21991-21993_del,22028~22036_del
22202 22288 서열번호 25 Amp_25 22227T
22334 22459 서열번호 26 Amp_26 22355T
22714 22838 서열번호 27 Amp_27 22812C,22813T
22880 22969 서열번호 28 Amp_28 22916AA
23002 23126 서열번호 29 Amp_29 23012M,23063T
23207 23307 서열번호 30 Amp_30 23271A
23350 23457 서열번호 31 Amp_31 23403G
23507 23634 서열번호 32 Amp_32 23525T,23604R
23676 23802 서열번호 33 Amp_33 23709T
24389 24517 서열번호 34 Amp_34 24410A,24506G
24684 24806 서열번호 35 Amp_35 24775Y
24851 24977 서열번호 36 Amp_36 24914C
25455 25576 서열번호 37 Amp_37 25469T,25563T
26079 26209 서열번호 38 Amp_38 26144T
26702 26835 서열번호 39 Amp_39 26767S
27807 27915 서열번호 40 Amp_40 27874T
27960 28058 서열번호 41 Amp_41 27972T,28048T
28100 28177 서열번호 42 Amp_42 28111G,28144C,28167A
28223 28344 서열번호 43 Amp_43 28248~28253_del&28253T,28269~28273_INS&28271_del,28280CTA
28424 28552 서열번호 44 Amp_44 28461G,28512G
28863 28990 서열번호 45 Amp_45 28877TC,28881WAC,28887T,28916T,28977T
29353 29473 서열번호 46 Amp_46 29402T
29646 29770 서열번호 47 Amp_47 29742T
실시예 2-2. 제조예 패널 프라이머 및 비교예 1 내지 12 프라이머를 이용한 in silico PCR 수행
제조예 패널 프라이머의 검출성능을 확인하고 CDC, WHO 등에서 권장하는 SARS-CoV-2 프라이머와 선행 연구들에서 사용된 프라이머들과 비교하기 위해서 2021년 8월 6일까지 GISAID에 공개되어 있던 SARS-CoV-2 공개 서열 2,578,764개에 대하여 in silico PCR을 실시하였다. 전체 서열 중 제조예 패널 프라이머를 이용한 in silico PCR 결과로 생성된 개별 앰플리콘 비율을 하기 표 4에 나타내었다.
Seqeunce Coverage (%) Seqeunce Coverage (%) Seqeunce Coverage (%)
Amp_01 98.37% Amp_17 99.99% Amp_33 99.99%
Amp_02 99.98% Amp_18 99.99% Amp_34 99.98%
Amp_03 99.98% Amp_19 99.99% Amp_35 99.99%
Amp_04 99.98% Amp_20 100.00% Amp_36 99.99%
Amp_05 99.98% Amp_21 99.99% Amp_37 99.92%
Amp_06 100.00% Amp_22 99.99% Amp_38 99.98%
Amp_07 99.99% Amp_23 99.97% Amp_39 99.99%
Amp_08 99.99% Amp_24 99.99% Amp_40 99.77%
Amp_09 99.99% Amp_25 99.78% Amp_41 99.87%
Amp_10 99.94% Amp_26 99.85% Amp_42 99.74%
Amp_11 99.98% Amp_27 99.99% Amp_43 99.95%
Amp_12 99.99% Amp_28 99.99% Amp_44 99.99%
Amp_13 99.99% Amp_29 99.98% Amp_45 99.95%
Amp_14 99.99% Amp_30 99.99% Amp_46 99.85%
Amp_15 99.99% Amp_31 100.00% Amp_47 90.25%
Amp_16 99.99% Amp_32 99.99%
상기 표 4의 결과에서 확인되는 바와 같이, 앰플리콘 1번과 47번을 제외하는 다른 앰플리콘들은 전체 서열의 99.5% 이상의 앰플리콘이 생성되었다. 생성 비율이 낮은 앰플리콘 1번과 47번의 경우 타겟 위치가 시퀀싱 결과로 제공되는 GISIAD 서열 데이터에서 쉽게 누락되는 SARS-CoV-2 서열 양 끝의 250 bp 정도의 유전자를 타겟으로 하여 앰플리콘이 적게 생성되는 것으로 확인되었다.
다음으로 제조예 패널 프라이머와 기존 RT-PCR 프라이머들(비교예 1 내지 12)의 평균 앰플리콘 생성 비율과 각 프라이머를 이용한 SARS-CoV-2 검출률을 확인하여 하기 표 5에 나타내었다.
Group Forward Primer Reverse Primer Average coverage Detection rate
제조예 서열번호 48
내지
서열번호 94
서열번호 95
내지
서열번호 141
97.427% 100.000%
비교예 1 서열번호 142내지
서열번호 144
서열번호 145
내지
서열번호 147
99.160% 99.916%
비교예 2 서열번호 148
내지
서열번호 152
서열번호 153
내지
서열번호 159
98.909% 99.924%
비교예 3 서열번호 160 서열번호 161 99.092% 99.092%
비교예 4 서열번호 162내지
서열번호 166
서열번호 167
내지
서열번호 171
98.916% 99.962%
비교예 5 서열번호 172내지
서열번호 179
서열번호 180
내지
서열번호 187
97.461% 99.981%
비교예 6 서열번호 188내지
서열번호 193
서열번호 194
내지
서열번호 199
97.784% 99.963%
비교예 7 서열번호 200내지
서열번호 203
서열번호 204
내지
서열번호 207
89.632% 99.989%
비교예 8 서열번호 208내지
서열번호 209
서열번호 210
내지
서열번호 211
99.253% 99.876%
비교예 9 서열번호 212내지
서열번호 217
서열번호 218
내지
서열번호 221
99.110% 99.885%
비교예 10 서열번호 222 서열번호 223 97.770% 99.223%
비교예 11 서열번호 224 서열번호 225 98.940% 98.940%
비교예 12 서열번호 226 서열번호 227 99.223% 99.876%
상기 표로 확인되는 바와 같이, 제조예 프라이머 패널에 포함된 47개 프라이머 세트의 평균 PCR 결과물 생성 비율은 97.427%에 불과했지만, SARS-CoV-2 서열 검출률은 100%를 달성한 것을 확인할 수 있었다. 반면 비교예 1 내지 12의 real-time RT-PCR 프라이머들은 비교예 7 프라이머를 제외하고 본 발명의 제조예 프라이머 패널보다 많은 PCR 결과물 생성 비율을 보였지만, SARS-CoV-2 서열을 100% 검출한 비교예 프라이머는 존재하지 않았다.
실시예 2-3. in silico PCR을 통한 제조예 패널 프라이머 및 비교예 1 내지 12 프라이머의 특이도 확인
SARS-CoV-2에 대한 특이반응을 확인하기 위하여 공개 데이터베이스에서 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 코로나바이러스 10종(HCoV-OC43, 229E, NL63, HKU1, SARS, MERS, BCoV-ENT, Bat coronavirus RaTG13, hCoV-19/pangolin/Guangdong/1/2019, hCoV-19/mink/Netherlands/1/2020)과 기타 호흡기 질환 바이러스를 포함한 총 29종의 바이러스의 52개 염기서열 정보를 수집한 뒤, in silico PCR을 통해 제조예 패널 프라이머와 비교예 1 내지 12 프라이머의 PCR 결과물을 생성한 비율을 하기 표 6에 나타내었다.
Sequence 제조예 Coverage 비교예 1 내지 12
Coverage
Influenza A virus (H5N1) PB2 gene 0.00% 0.00%
Influenza A virus H5N1 PB1 and PB1-F2 genes 0.00% 0.00%
Influenza A virus H5N1 PA and PA-X genes 0.00% 0.00%
Influenza A virus H5N1 HA gene 0.00% 0.00%
Influenza A virus H5N1 NP gene 0.00% 0.00%
Influenza A virus H5N1 NA gene 0.00% 0.00%
Influenza A virus H5N1 segment 7 0.00% 0.00%
Influenza A virus H5N1 segment 8 0.00% 0.00%
Human adenovirus type 1 0.00% 0.00%
Human adenovirus type 1 subgroup C 0.00% 0.00%
Human parainfluenza virus 3 0.00% 0.00%
Human respiratory syncytial virus strain ATCC VR-26 0.00% 0.00%
Human Respiratory syncytial virus 9320 0.00% 0.00%
Enterovirus D68 0.00% 0.00%
Human enterovirus 71 0.00% 0.00%
Human rhinovirus 14 0.00% 0.00%
Human coxsackievirus A6 strain Gdula 0.00% 0.00%
Echovirus 5 0.00% 0.00%
Influenza A virus (H3N2) HA gene 0.00% 0.00%
Influenza A virus (H1N1) segment 1 0.00% 0.00%
Influenza A virus (H1N1) segment 2 0.00% 0.00%
Influenza A virus (H1N1) segment 3 0.00% 0.00%
Influenza A virus (H1N1) segment 4 0.00% 0.00%
Influenza A virus (H1N1) segment 5 0.00% 0.00%
Influenza A virus (H1N1) segment 6 0.00% 0.00%
Influenza A virus (H1N1) segment 7 0.00% 0.00%
Influenza A virus (H1N1) segment 8 0.00% 0.00%
Influenza B virus 0.00% 0.00%
Influenza B virus segment 2 0.00% 0.00%
Influenza B virus segment 3 0.00% 0.00%
Influenza B virus segment 4 0.00% 0.00%
Influenza B virus segment 5 0.00% 0.00%
Influenza B virus segment 6 0.00% 0.00%
Influenza B virus segment 7 0.00% 0.00%
Influenza B virus segment 8 0.00% 0.00%
HPIV-1 strain Washington/1964 0.00% 0.00%
Human rubulavirus 2 0.00% 0.00%
Streptococcus pneumoniae ATCC 700669 0.00% 0.00%
Haemophilus influenzae Rd KW20 0.00% 0.00%
Mycoplasma pneumoniae M129-B7 0.00% 0.00%
Legionella pneumophila 0.00% 0.00%
Human coronavirus OC43 0.00% 0.00%
MERS England 1 0.00% 0.00%
Human coronavirus 229E 0.00% 0.00%
Human coronavirus NL63 0.00% 0.00%
Human coronavirus HKU1 genotype A 0.00% 0.00%
SARS 6.38% 69.57%
MERS 0.00% 0.00%
Bat coronavirus RaTG13 78.72% 86.96%
hCoV-19/pangolin/Guangdong/1/2019 53.19% 60.87%
hCoV-19/mink/Netherlands/1/2020 100.00% 100.00%
Total 4.58% 6.10%
그 결과, SARS-CoV-2의 근연종에 해당하는 SARS-CoV, Bat coronavirus RaTG13, hCoV-19/pangolin/Guangdong/1/2019와 사람에서 밍크로 동물 전파의 결과로 발생한 hCoV-19/mink/Netherlands/1/2020을 제외한 다른 바이러스들에 대해서는 두 종류의 프라이머 모두 PCR 결과물을 생성하지 않았다. PCR 결과물을 생성한 4가지 서열 중 SARS-CoV-2에 해당하는 hCoV-19/mink/Netherlands/1/2020의 경우 모든 프라이머가 PCR 결과물을 생성하였다. 반면에, 근연종에 해당하는 다른 3가지 서열의 경우 제조예 패널 프라이머가 비교예 1 내지 12 프라이머에 비해 더 적은 PCR 결과물을 생성하는 것을 확인하였는데, 특히 SARS-CoV의 경우 큰 차이를 보였다. 이를 통하여 타겟을 선택하여 제작한 제조예 패널 프라이머가 기존 real-time RT-PCR인 비교예 1 내지 12 프라이머에 비해 SARS-CoV-2에 더 특이적으로 반응한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2-4. 제조예 패널 프라이머 및 비교예 1 내지 12 프라이머를 이용한 임상 샘플 in silico PCR
2020년 3월~5월 사이에 대한민국 대구 지역 COVID-19 확진자에서 추출한 임상 검체 샘플에 대한 전장 유전체 시퀀싱(Whole genome sequencing; WGS)을 수행하였다. WGS 결과, 고품질 결과(95%<= read coverage, n=27)와, 저품질 결과(95%> read coverage, n=37)가 생성되었으며, 저품질 결과를 나타낸 샘플 중에는 partial gene을 가지는 것으로 나타난 샘플도 존재하였다. 각각의 샘플에 대한 WGS 결과를 통하여 공통서열(consensus sequence)를 생성하고, 해당 서열들에 대해 제조예 패널 프라이머 및 비교예 1 내지 12 프라이머를 이용하여 in silico PCR을 수행하였다. 공통서열들에 대해 각 프라이머로 검출한 서열들의 비율을 하기 표 7에 나타내었다.
Primer Low quality High quality
제조예 100.00% 100.00%
비교예 1 86.49% 100.00%
비교예 2 72.97% 100.00%
비교예 3 81.08% 100.00%
비교예 4 97.30% 100.00%
비교예 5 94.59% 100.00%
비교예 6 75.68% 100.00%
비교예 7 91.89% 100.00%
비교예 8 81.08% 100.00%
비교예 9 78.38% 100.00%
비교예 10 40.54% 100.00%
비교예 11 48.65% 100.00%
비교예 12 91.89% 100.00%
그 결과, 고품질 샘플에 대해서는 제조예 패널 프라이머와 비교예 1내지 12의 RT-PCR 프라이머 모두 100% 서열 검출이 되는 것을 확인할 수 있었다. 저품질 샘플에 대해서는 비교예 프라이머들의 경우 40~97% 정도의 서열만 검출이 가능했던 반면, 제조예 패널 프라이머의 경우에는 모든 샘플에 대해 서열 검출이 가능한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2-5. SARS-CoV-2 표준물질을 이용한 전장 유전체 시퀀싱 패널과 제조예 패널 비교
SARS-CoV-2의 기본 서열과 알파변이, 베타변이, 감마변이에 대한 표준물질(standard RNA)에 대하여 전장 유전체 시퀀싱 패널인 대조군 SARS-CoV-2 패널(ThermoFisher사의 NGS 패널)과 본 발명의 제조예 패널 프라이머를 이용해 TGS를 수행하고 결과를 비교하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 시퀀싱 결과 대조군 SARS-CoV-2 패널의 경우 기본 서열에 대한 시퀀싱 결과는 나타나지 않았다(도면 5(a) 우측). 변이체에 대한 표준물질의 경우에 대조군 SARS-CoV-2 패널의 타겟에 대한 리드 비율은 타겟 시퀀싱에 비해 적게 나타났으나, 이는 타겟 영역이 대조군 SARS-CoV-2 패널이 타겟으로 하는 영역의 일부에 불과하기 때문에 나타나는 것으로 보인다(도면 5(b) 내지 5(d) 우측). 또한 대조군 SARS-CoV-2 패널의 알파변이에 대한 결과에서는 음성 대조군인 Human Rpp30에 대한 일부 결과가 생성되기도 하였다(도면 5(b) 우측). 그 외에도 전체 시퀀싱 리드 생성 수는 대조군 SARS-CoV-2 패널이 본 발명의 제조예 패널보다 더 높게 나타났지만 각 염기서열에 대한 평균 커버리지 깊이(Average base coverage depth)는 본 발명의 제조예 패널이 더 높게 생성되어 타겟 영역에 대한 시퀀싱 생성물은 더 많이 생성했다고 볼 수 있으며, uniformity of base coverage(리드 깊이(read depth)가 평균 커버리지 깊이x0.2보다 높은 위치 비율)의 경우에도 본 발명의 제조예 패널이 대조군 패널 보다 더 높게 나타났다. 또한, 알파변이에 대한 시퀀싱 결과를 참조서열에 정렬하여 돌연변이 여부를 파악한 결과, 하기 표 8과 같이 본 발명의 제조예 패널의 경우 대조군 패널이 SARS-CoV-2 패널에서 검출하지 못한 두 위치에 대한 돌연변이도 검출하는 것을 확인하였다.
Position Alternate allele 제조예 패널 프라이머 대조군 패널 프라이머
C241 T C241T x
C3037 T C3037T C3037T
C14408 T C14408T C14408T
21765-21770 DELETION 21765~21770 DEL 21765~21770 DEL
21991-21993 DELETION 21991~21993 DEL 21991~21993 DEL
A23063 T A23063T A23063T
C23271 A C23271A C23271A
A23403 G A23403G A23403G
C23604 A C23604A C23604A
C23709 T C23709T C23709T
T24506 G T24506G T24506G
28271 DELETION 28271 DEL x
A28111 G A28111G A28111G
G28280 C G28280C G28280C
G28881 A G28881A G28881A
이러한 결과를 종합하여, 디자인 패널이 실제 SARS-CoV-2에 대하여 고품질의 시퀀싱 결과를 보고할 수 있고, 특히 변이에 대해서는 기존의 SARS-CoV-2 전체 genome을 커버하는 패널보다 더 정확한 시퀀싱 결과를 제공한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2-6. 임상 샘플 전장 유전체 시퀀싱 결과에 대한 앰플리콘 형성 여부 분석
WGS 결과로 생성한 공통서열에 대하여 디자인 패널 영역의 리드 및 앰플리콘 생성 여부를 확인하였다. 상기 결과를 도 6에 나타내었다. 해당 결과 고품질 결과의 경우 제조예 패널의 모든 앰플리콘 영역의 앰플리콘이 생성되었으며, 저품질 결과 중 partial gene을 가지는 결과에서도 최소 3개의 앰플리콘이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 상기 in silico PCR을 통한 특이도 판정과 해당 결과를 통해 COVID-19 감염 여부 진단을 위한 최소 앰플리콘 생성 수를 3개 이상으로 설정하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열정보
하기 표 9는 본 발명의 타겟 서열을 나타내고,
표 10은 본 발명의 NGS 패널 프라이머 서열(제조예)을 나타내며,
표 11은 비교예 프라이머 서열을 나타낸다.
서열번호 서열
서열번호 1 ATAACTAATTACTGTCGTTGACAGGACACGAGTAACTCGTCTATCTTCTGCAGGCTGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCAGCCGATCATCAGCACATCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGT
서열번호 2 TGGCTACCCTCTTGAGTGCATTAAAGACCTTCTAGCACGTGCTGGTAAAGCTTCATGCACTTTGTCCGAACAACTGGACTTTATTGACACTAAGAGGGGTGTATACTGCTGCCGTGAACATGAGCATGAAATT
서열번호 3 GATGAGTGGAGTATGGCTACATACTACTTATTTGATGAGTCTGGTGAGTTTAAATTGGCTTCACATATGTATTGTTCTTTCTACCCTCCAGATGAGGATGAAGAAGAAGGTGATTGTGAAGA
서열번호 4 AAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGAT
서열번호 5 GTGAAGACATTCAACTTCTTAAGAGTGCTTATGAAAATTTTAATCAGCACGAAGTTCTACTTGCACCATTATTATCAGCTGGTATTTTTGGTGCTGACCCTATACATTCTTTAAGAGTTTGTGTAGATA
서열번호 6 GTTGTTCAAGAGGGTGTTTTAACTGCTGTGGTTATACCTACTAAAAAGGCTGGTGGCACTACTGAAATGCTAGCGAAAGCTTTGAGAAAAGTGCCAACAGACAATTATATAACCACTTACCCG
서열번호 7 GCTTTTGAGTACTACCACACAACTGATCCTAGTTTTCTGGGTAGGTACATGTCAGCATTAAATCACACTAAAAAGTGGAAATACCCACAAGTTAATGGTTTAACTTCTATTAAATGGGCAGATAACA
서열번호 8 TCTACAAGATGCTTATTACAGAGCAAGGGCTGGTGAAGCTGCTAACTTTTGTGCACTTATCTTAGCCTACTGTAATAAGACAGTAGGTGAGTTAGGTGATGTTAGAGAAACAATGAGTTACTT
서열번호 9 TTACTTATAAATTGGATGGTGTTGTTTGTACAGAAATTGACCCTAAGTTGGACAATTATTATAAGAAAGACAATTCTTATTTCACAGAGCAACCAATTGATCTTGTACCAAACCAACCATA
서열번호 10 TCTTTGGAGCACAAAACCAGTTGAAACATCAAATTCGTTTGATGTACTGAAGTCAGAGGACGCGCAGGGAATGGATAATCTTGCCTGCGAAGATCTAAAACCAGTCTCTGAAGAAGTAGTGG
서열번호 11 TTCATTTAATTATTTGAAGTCACCTAATTTTTCTAAACTGATAAATATTATAATTTGGTTTTTACTATTAAGTGTTTGCCTAGGTTCTTTAATCTACTCAACCGCTGCTTTAGGTGTTTTAATG
서열번호 12 TACTGTACTGGTTCTATACCTTGTAGTGTTTGTCTTAGTGGTTTAGATTCTTTAGACACCTATCCTTCTTTAGAAACTATACAAATTACCATTTCATCTTTTAAATGGGATTTAACTGCTTTTG
서열번호 13 CACTCGTGACATAGCATCTACAGATACTTGTTTTGCTAACAAACATGCTGATTTTGACACATGGTTTAGCCAGCGTGGTGGTAGTTATACTAATGACAAAGCTTGCCCATTGATTGCTGCAGTCATAA
서열번호 14 TGTTACACACCATCAAAACTTATAGAGTACACTGACTTTGCAACATCAGCTTGTGTTTTGGCTGCTGAATGTACAATTTTTAAAGATGCTTCTGGTAAGCCAGTACCATATTGTTATGATA
서열번호 15 AAGAAATGTATCTAAAGTTGCGTAGTGATGTGCTATTACCTCTTACGCAATATAATAGATACTTAGCTCTTTATAATAAGTACAAGTATTTTAGTGGAGCAATGGATACAACTAGCTACAGAGAAGCT
서열번호 16 CAGTAACTCAGGTTCTGATGTTCTTTACCAACCACCACAAACCTCTATCACCTCAGCTGTTTTGCAGAGTGGTTTTAGAAAAATGGCATTCCCATCTGGTAAAGTTGAGGGTTGTATGGTACAAGTAA
서열번호 17 ACTGGTTGTTACTCACAATTTTGACTTCACTTTTAGTTTTAGTCCAGAGTACTCAATGGTCTTTGTTCTTTTTTTTGTATGAAAATGCCTTTTTACCTTTTGCTATGGGTATTATTGCTATGTC
서열번호 18 TACCTTCTCTTGCCACTGTAGCTTATTTTAATATGGTCTATATGCCTGCTAGTTGGGTGATGCGTATTATGACATGGTTGGATATGGTTGATACTAGTTTGTCTGGTTTTAAGCTAAAAGACT
서열번호 19 GAATGTCTTGACACTCGTTTATAAAGTTTATTATGGTAATGCTTTAGATCAAGCCATTTCCATGTGGGCTCTTATAATCTCTGTTACTTCTAACTACTCAGGTGTAGTTACAACTGTCATGTTT
서열번호 20 TTACTAAATACACAATGGCAGACCTCGTCTATGCTTTAAGGCATTTTGATGAAGGTAATTGTGACACATTAAAAGAAATACTTGTCACATACAATTGTTGTGATGATGATTATTTCAATAAAAA
서열번호 21 TGGATGACAGATGCATTCTGCATTGTGCAAACTTTAATGTTTTATTCTCTACAGTGTTCCCACCTACAAGTTTTGGACCACTAGTGAGAAAAATATTTGTTGATGGTGTTCCATTTGTAGTTTCAAC
서열번호 22 TTCTGATAAAGGAGTTGCACCAGGTACAGCTGTTTTAAGACAGTGGTTGCCTACGGGTACGCTGCTTGTCGATTCAGATCTTAATGACTTTGTCTCTGATGCAGATTCAACTTTGATTG
서열번호 23 TACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGAT
서열번호 24 TGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTC
서열번호 25 CGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTT
서열번호 26 TGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACA
서열번호 27 TACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTAC
서열번호 28 AATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCA
서열번호 29 TAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAG
서열번호 30 ACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACT
서열번호 31 TGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTAC
서열번호 32 TGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATC
서열번호 33 TTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAAC
서열번호 34 AGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGAC
서열번호 35 ATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTT
서열번호 36 TCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATG
서열번호 37 GGATGCTACTCCTTCAGATTTTGTTCGCGCTACTGCAACGATACCGATACAAGCCTCACTCCCTTTCGGATGGCTTATTGTTGGCGTTGCACTTCTTGCTGTTTTTCAGAGCGCTTCCAAAA
서열번호 38 CTTCTTCATCTACAATAAAATTGTTGATGAGCCTGAAGAACATGTCCAAATTCACACAATCGACGGTTCATCCGGAGTTGTTAATCCAGTAATGGAACCAATTTATGATGAACCGACGACGACTACTAGCG
서열번호 39 AACTTTAGCTTGTTTTGTGCTTGCTGCTGTTTACAGAATAAATTGGATCACCGGTGGAATTGCTATCGCAATGGCTTGTCTTGTAGGCTTGATGTGGCTCAGCTACTTCATTGCTTCTTTCAGACTGTTTGCGC
서열번호 40 CTATTCCTTGTTTTAATTATGCTTATTATCTTTTGGTTCTCACTTGAACTGCAAGATCATAATGAAACTTGTCACGCCTAAACGAACATGAAATTTCTTGTTTTCTTAG
서열번호 41 CAGTCATGTACTCAACATCAACCATATGTAGTTGATGACCCGTGTCCTATTCACTTCTATTCTAAATGGTATATTAGAGTAGGAGCTAGAAAATCAGCA
서열번호 42 ACCCATTCAGTACATCGATATCGGTAATTATACAGTTTCCTGTTTACCTTTTACAATTAATTGCCAGGAACCTAAATT
서열번호 43 GTATCATGACGTTCGTGTTGTTTTAGATTTCATCTAAACGAACAAACTAAAATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAAC
서열번호 44 TCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGA
서열번호 45 CAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAA
서열번호 46 CAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTG
서열번호 47 TAGATGTAGTTAACTTTAATCTCACATAGCAATCTTTAATCAGTGTGTAACATTAGGGAGGACTTGAAAGAGCCACCACATTTTCACCGAGGCCACGCGGAGTACGATCGAGTGTACAGTGAACA
서열번호 서열 비고
서열번호 48 CACTCACGCAGTATAATTAA Forawrd primer_ Amp_01
서열번호 49 ACAACTTCTGTGGCCCTGAT Forawrd primer_ Amp_02
서열번호 50 ACCACTGGGCATTGATTTAG Forawrd primer_ Amp_03
서열번호 51 TCTGCTGCTCTTCAACCTGA Forawrd primer_ Amp_04
서열번호 52 GGCCCAAATGTTAACAAAGG Forawrd primer_ Amp_05
서열번호 53 TCCATATATAGTGGGTGATG Forawrd primer_ Amp_06
서열번호 54 TGACACTCTACGTGTTGAGG Forawrd primer_ Amp_07
서열번호 55 TGAAGTTTAATCCACCTGCT Forawrd primer_ Amp_08
서열번호 56 ACAACAACCATAAAACCAGT Forawrd primer_ Amp_09
서열번호 57 ATACCTGGTGTATACGTTGT Forawrd primer_ Amp_10
서열번호 58 GTAAATTTTGTCTAGAGGCT Forawrd primer_ Amp_11
서열번호 59 TAATGTCACTATTGCAACCT Forawrd primer_ Amp_12
서열번호 60 AGGCTATTGATGGTGGTGTC Forawrd primer_ Amp_13
서열번호 61 TAGTGCAGTTGGTAACATCT Forawrd primer_ Amp_14
서열번호 62 TGCACCTTTTTGTTAAATAA Forawrd primer_ Amp_15
서열번호 63 CAAAGGCTCTCAATGACTTC Forawrd primer_ Amp_16
서열번호 64 ACAATCAAGGGTACACACCA Forawrd primer_ Amp_17
서열번호 65 TTTCTCTGTTTGTTTTTGTT Forawrd primer_ Amp_18
서열번호 66 GGAGAGTGTGGACACTTATG Forawrd primer_ Amp_19
서열번호 67 CATATATCACGTCAACGTCT Forawrd primer_ Amp_20
서열번호 68 CCAAATTGTGTTAACTGTTT Forawrd primer_ Amp_21
서열번호 69 TTATACATTTTGGTGCTGGT Forawrd primer_ Amp_22
서열번호 70 GTTTTCAGATCCTCAGTTTT Forawrd primer_ Amp_23
서열번호 71 ATGTTGTTATTAAAGTCTGT Forawrd primer_ Amp_24
서열번호 72 CACGCCTATTAATTTAGTGC Forawrd primer_ Amp_25
서열번호 73 TGGTGATTCTTCTTCAGGTT Forawrd primer_ Amp_26
서열번호 74 AGTGTTATGGAGTGTCTCCT Forawrd primer_ Amp_27
서열번호 75 TATAGCTTGGAATTCTAACA Forawrd primer_ Amp_28
서열번호 76 AGGCCGGTAGCACACCTTGT Forawrd primer_ Amp_29
서열번호 77 CTTCAATGGTTTAACAGGCA Forawrd primer_ Amp_30
서열번호 78 GTTCTTTTGGTGGTGTCAGT Forawrd primer_ Amp_31
서열번호 79 TTTTCAAACACGTGCAGGCT Forawrd primer_ Amp_32
서열번호 80 CTTGGTGCAGAAAATTCAGT Forawrd primer_ Amp_33
서열번호 81 CTCACTTTCTTCCACAGCAA Forawrd primer_ Amp_34
서열번호 82 GGACAATCAAAAAGAGTTGA Forawrd primer_ Amp_35
서열번호 83 TCGTGAAGGTGTCTTTGTTT Forawrd primer_ Amp_36
서열번호 84 TGAAGCAAGGTGAAATCAAG Forawrd primer_ Amp_37
서열번호 85 CTGGTGTTGAACATGTTACC Forawrd primer_ Amp_38
서열번호 86 TCTGGCTGTTATGGCCAGTA Forawrd primer_ Amp_39
서열번호 87 GTGCTTTTTAGCCTTTCTGC Forawrd primer_ Amp_40
서열번호 88 TCACCAAGAATGTAGTTTAC Forawrd primer_ Amp_41
서열번호 89 ATGAGGCTGGTTCTAAATCA Forawrd primer_ Amp_42
서열번호 90 TCTATGAAGACTTTTTAGAG Forawrd primer_ Amp_43
서열번호 91 TTTACCCAATAATACTGCGT Forawrd primer_ Amp_44
서열번호 92 CGCAACAGTTCAAGAAATTC Forawrd primer_ Amp_45
서열번호 93 ATAAGCATATTGACGCATAC Forawrd primer_ Amp_46
서열번호 94 CGTAACTACATAGCACAAGT Forawrd primer_ Amp_47
서열번호 95 GGGACAAGGCTCTCCATCTT Reverse primer_ Amp_01
서열번호 96 GAACGTTCCGTGTACCAAGC Reverse primer_ Amp_02
서열번호 97 TTGATGGCTCAAACTCTTCT Reverse primer_ Amp_03
서열번호 98 GAACAACTGGTGTAAGTTCC Reverse primer_ Amp_04
서열번호 99 GTAGACATTTGTGCGAACAG Reverse primer_ Amp_05
서열번호 100 TAACCATTTAAACCCTGACC Reverse primer_ Amp_06
서열번호 101 TGCAGTGGCAAGATAACAGT Reverse primer_ Amp_07
서열번호 102 CTAAATTGGCATGTTGAAAC Reverse primer_ Amp_08
서열번호 103 TATCGAAGCTTGCGTTTGGA Reverse primer_ Amp_09
서열번호 104 TTTCTGTATGGTAGGATTTT Reverse primer_ Amp_10
서열번호 105 GAAGGCATGCCTAAATTAGA Reverse primer_ Amp_11
서열번호 106 AAACCACTCTGCAACTAAGC Reverse primer_ Amp_12
서열번호 107 GACAAAACCCACTTCTCTTG Reverse primer_ Amp_13
서열번호 108 AGAACCTTCTAGTACATTGG Reverse primer_ Amp_14
서열번호 109 TTTGCGAGATGACAACAAGC Reverse primer_ Amp_15
서열번호 110 AAGTGTAGTTGTACCACAAG Reverse primer_ Amp_16
서열번호 111 CAAACATCATTGCAAAAGCA Reverse primer_ Amp_17
서열번호 112 AGCTGATGCATACATAACAC Reverse primer_ Amp_18
서열번호 113 AAAACAATACCTCTGGCCAA Reverse primer_ Amp_19
서열번호 114 CTACAAAATCATACCAGTCC Reverse primer_ Amp_20
서열번호 115 GCTCTCTGAAGTGGTATCCA Reverse primer_ Amp_21
서열번호 116 ATGTACAGTTGCACAATCAC Reverse primer_ Amp_22
서열번호 117 GTGGAAGCAAAATAAACACC Reverse primer_ Amp_23
서열번호 118 TCCATAAGAAAAGGCTGAGA Reverse primer_ Amp_24
서열번호 119 AAATAACTTCTATGTAAAGC Reverse primer_ Amp_25
서열번호 120 AAGGATTTCAACGTACACTT Reverse primer_ Amp_26
서열번호 121 GCAGCCTGTAAAATCATCTG Reverse primer_ Amp_27
서열번호 122 CCGGCCTGATAGATTTCAGT Reverse primer_ Amp_28
서열번호 123 TTTAGGTCCACAAACAGTTG Reverse primer_ Amp_29
서열번호 124 GTGTAATGTCAAGAATCTCA Reverse primer_ Amp_30
서열번호 125 CTGTAGAATAAACACGCCAA Reverse primer_ Amp_31
서열번호 126 ACATAGTGTAGGCAATGATG Reverse primer_ Amp_32
서열번호 127 ACAAAAGATTGCTGCATTCA Reverse primer_ Amp_33
서열번호 128 TGCACTTCAGCCTCAACTTT Reverse primer_ Amp_34
서열번호 129 GTGTGCTTTTCCATCATGAC Reverse primer_ Amp_35
서열번호 130 TAATTCAGGTTGCAAAGGAT Reverse primer_ Amp_36
서열번호 131 TCTCTTTTTGAGGGTTATGA Reverse primer_ Amp_37
서열번호 132 AGCTTGTGCTTACAAAGGCA Reverse primer_ Amp_38
서열번호 133 TGACCACATGGAACGCGTAC Reverse primer_ Amp_39
서열번호 134 AGCTACAGTTGTGATGATTC Reverse primer_ Amp_40
서열번호 135 ACGCACAATTCAATTAAAGG Reverse primer_ Amp_41
서열번호 136 AACGCACTACAAGACTACCC Reverse primer_ Amp_42
서열번호 137 CTCCATTCTGGTTACTGCCA Reverse primer_ Amp_43
서열번호 138 TTACCGTCACCACCACGAAT Reverse primer_ Amp_44
서열번호 139 ACAGTTTGGCCTTGTTGTTG Reverse primer_ Amp_45
서열번호 140 AATTGTTTGGAGAAATCATC Reverse primer_ Amp_46
서열번호 141 TAGGCAGCTCTCCCTAGCAT Reverse primer_ Amp_47
서열번호 서열
서열번호 142 GACCCCAAAATCAGCGAAAT
서열번호 143 TTACAAACATTGGCCGCAAA
서열번호 144 GGGAGCCTTGAATACACCAAAA
서열번호 145 TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
서열번호 146 GCGCGACATTCCGAAGAA
서열번호 147 TGTAGCACGATTGCAGCATTG
서열번호 148 GTGARATGGTCATGTGTGGCGG
서열번호 149 GTGAAATGGTCATGTGTGGCGG
서열번호 150 GTGAGATGGTCATGTGTGGCGG
서열번호 151 ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT
서열번호 152 CACATTGGCACCCGCAATC
서열번호 153 CARATGTTAAASACACTATTAGCATA
서열번호 154 CAAATGTTAAACACACTATTAGCATA
서열번호 155 CAAATGTTAAAGACACTATTAGCATA
서열번호 156 CAGATGTTAAACACACTATTAGCATA
서열번호 157 CAGATGTTAAAGACACTATTAGCATA
서열번호 158 ATATTGCAGCAGTACGCACACA
서열번호 159 GAGGAACGAGAAGAGGCTTG
서열번호 160 TGTGACATCAAGGACCTGCC
서열번호 161 CTGAGTCACCTGCTACACGC
서열번호 162 CTAGGACCTCTTTCTGCTCA
서열번호 163 CCCTGTTGCTATTCATGCAG
서열번호 164 GGAAGAGACAGGTACGTTAA
서열번호 165 CCTCTTCTCGTTCCTCATCA
서열번호 166 CATCTCACTTGCTGGTTCCT
서열번호 167 ACACTCTCCTAGCACCATCA
서열번호 168 CCCTATTAAACAGCCTGCAC
서열번호 169 AAGGTTTTACAAGACTCACG
서열번호 170 CCTGGTCCCCAAAATTTCCT
서열번호 171 CCTTAATAGTCCTCACTTCTCTC
서열번호 172 AGAATAGAGCTCGCACCGTA
서열번호 173 TCTGTGATGCCATGCGAAAT
서열번호 174 CTACATGCACCAGCAACTGT
서열번호 175 GCTGGTGCTGCAGCTTATTA
서열번호 176 TTCGGAAGAGACAGGTACGTT
서열번호 177 TTCGGAAGAGACAGGTACGTTA
서열번호 178 CAATGCTGCAATCGTGCTAC
서열번호 179 GCTGCAATCGTGCTACAACT
서열번호 180 CTCCTCTAGTGGCGGCTATT
서열번호 181 ACTACCTGGCGTGGTTTGTA
서열번호 182 CACCTGTGCCTGTTAAACCA
서열번호 183 AGGGTCAAGTGCACAGTCTA
서열번호 184 CACACAATCGATGCGCAGTA
서열번호 185 AGCAGTACGCACACAATCG
서열번호 186 GTTGCGACTACGTGATGAGG
서열번호 187 TGAACTGTTGCGACTACGTG
서열번호 188 GCTCGCAAACATACAACGTG
서열번호 189 TGAAATCAATAGCCGCCACT
서열번호 190 CAGATGCTGGCTTCATCAAA
서열번호 191 ACTGTTTTGCCACCTTTGCT
서열번호 192 AAGGAAATTTTGGGGACCAG
서열번호 193 AAAGGCCAACAACAACAAGG
서열번호 194 CATTAACATTGGCCGTGACA
서열번호 195 TGTTTGCGAGCAAGAACAAG
서열번호 196 GGTTGGCAATCAATTTTTGG
서열번호 197 AGCTTGTGCATTTTGGTTGA
서열번호 198 GAGTCAGCACTGCTCATGGA
서열번호 199 GCTCTGTTGGTGGGAATGTT
서열번호 200 CAAGTGGGGTAAGGCTAGACTTT
서열번호 201 AGAAGATTGGTTAGATGATGATAGT
서열번호 202 TGATGATACTCTCTGACGATGCTGT
서열번호 203 CCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACT
서열번호 204 ACTTAGGATAATCCCAACCCAT
서열번호 205 TTCCATCTCTAATTGAGGTTGAACC
서열번호 206 CTCAGTCCAACATTTTGCTTCAGA
서열번호 207 CAAGCTATAACGCAGCCTGTA
서열번호 208 ATGAGCTTAGTCCTGTTG
서열번호 209 GGTAACTGGTATGATTTCG
서열번호 210 CTCCCTTTGTTGTGTTGT
서열번호 211 CTGGTCAAGGTTAATATAGG
서열번호 212 TGGGGYTTTACRGGTAACCT
서열번호 213 TGGGGCTTTACAGGTAACCT
서열번호 214 TGGGGCTTTACGGGTAACCT
서열번호 215 TGGGGTTTTACAGGTAACCT
서열번호 216 TGGGGTTTTACGGGTAACCT
서열번호 217 TAATCAGACAAGGAACTGATTA
서열번호 218 AACRCGCTTAACAAAGCACTC
서열번호 219 AACACGCTTAACAAAGCACTC
서열번호 220 AACGCGCTTAACAAAGCACTC
서열번호 221 CGAAGGTGTGACTTCCATG
서열번호 222 TAGCACTCTCCAAGGGTGTTC
서열번호 223 GCAAAGCCAAAGCCTCATTA
서열번호 224 AAATTTTGGGGACCAGGAAC
서열번호 225 TGGCAGCTGTGTAGGTCAAC
서열번호 226 CGTTTGGTGGACCCTCAGAT
서열번호 227 CCCCACTGCGTTCTCCATT
<110> Theragen Bio Co., Ltd. <120> COVID-19 diagnosis and variant determination system based on next-generation sequencing analysis <130> PDPB214548 <160> 227 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 1 ataactaatt actgtcgttg acaggacacg agtaactcgt ctatcttctg caggctgctt 60 acggtttcgt ccgtgttgca gccgatcatc agcacatcta ggtttcgtcc gggtgtgacc 120 gaaaggt 127 <210> 2 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 2 tggctaccct cttgagtgca ttaaagacct tctagcacgt gctggtaaag cttcatgcac 60 tttgtccgaa caactggact ttattgacac taagaggggt gtatactgct gccgtgaaca 120 tgagcatgaa att 133 <210> 3 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 3 gatgagtgga gtatggctac atactactta tttgatgagt ctggtgagtt taaattggct 60 tcacatatgt attgttcttt ctaccctcca gatgaggatg aagaagaagg tgattgtgaa 120 ga 122 <210> 4 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 4 aagaagagca agaagaagat tggttagatg atgatagtca acaaactgtt ggtcaacaag 60 acggcagtga ggacaatcag acaactacta ttcaaacaat tgttgaggtt caacctcaat 120 tagagat 127 <210> 5 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 5 gtgaagacat tcaacttctt aagagtgctt atgaaaattt taatcagcac gaagttctac 60 ttgcaccatt attatcagct ggtatttttg gtgctgaccc tatacattct ttaagagttt 120 gtgtagata 129 <210> 6 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 6 gttgttcaag agggtgtttt aactgctgtg gttataccta ctaaaaaggc tggtggcact 60 actgaaatgc tagcgaaagc tttgagaaaa gtgccaacag acaattatat aaccacttac 120 ccg 123 <210> 7 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 7 gcttttgagt actaccacac aactgatcct agttttctgg gtaggtacat gtcagcatta 60 aatcacacta aaaagtggaa atacccacaa gttaatggtt taacttctat taaatgggca 120 gataaca 127 <210> 8 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 8 tctacaagat gcttattaca gagcaagggc tggtgaagct gctaactttt gtgcacttat 60 cttagcctac tgtaataaga cagtaggtga gttaggtgat gttagagaaa caatgagtta 120 ctt 123 <210> 9 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 9 ttacttataa attggatggt gttgtttgta cagaaattga ccctaagttg gacaattatt 60 ataagaaaga caattcttat ttcacagagc aaccaattga tcttgtacca aaccaaccat 120 a 121 <210> 10 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 10 tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 60 cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 120 gg 122 <210> 11 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 11 ttcatttaat tatttgaagt cacctaattt ttctaaactg ataaatatta taatttggtt 60 tttactatta agtgtttgcc taggttcttt aatctactca accgctgctt taggtgtttt 120 aatg 124 <210> 12 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 12 tactgtactg gttctatacc ttgtagtgtt tgtcttagtg gtttagattc tttagacacc 60 tatccttctt tagaaactat acaaattacc atttcatctt ttaaatggga tttaactgct 120 tttg 124 <210> 13 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 13 cactcgtgac atagcatcta cagatacttg ttttgctaac aaacatgctg attttgacac 60 atggtttagc cagcgtggtg gtagttatac taatgacaaa gcttgcccat tgattgctgc 120 agtcataa 128 <210> 14 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 14 tgttacacac catcaaaact tatagagtac actgactttg caacatcagc ttgtgttttg 60 gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata ttgttatgat 120 a 121 <210> 15 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 15 aagaaatgta tctaaagttg cgtagtgatg tgctattacc tcttacgcaa tataatagat 60 acttagctct ttataataag tacaagtatt ttagtggagc aatggataca actagctaca 120 gagaagct 128 <210> 16 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 16 cagtaactca ggttctgatg ttctttacca accaccacaa acctctatca cctcagctgt 60 tttgcagagt ggttttagaa aaatggcatt cccatctggt aaagttgagg gttgtatggt 120 acaagtaa 128 <210> 17 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 17 actggttgtt actcacaatt ttgacttcac ttttagtttt agtccagagt actcaatggt 60 ctttgttctt ttttttgtat gaaaatgcct ttttaccttt tgctatgggt attattgcta 120 tgtc 124 <210> 18 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 18 taccttctct tgccactgta gcttatttta atatggtcta tatgcctgct agttgggtga 60 tgcgtattat gacatggttg gatatggttg atactagttt gtctggtttt aagctaaaag 120 act 123 <210> 19 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 19 gaatgtcttg acactcgttt ataaagttta ttatggtaat gctttagatc aagccatttc 60 catgtgggct cttataatct ctgttacttc taactactca ggtgtagtta caactgtcat 120 gttt 124 <210> 20 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 20 ttactaaata cacaatggca gacctcgtct atgctttaag gcattttgat gaaggtaatt 60 gtgacacatt aaaagaaata cttgtcacat acaattgttg tgatgatgat tatttcaata 120 aaaa 124 <210> 21 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 21 tggatgacag atgcattctg cattgtgcaa actttaatgt tttattctct acagtgttcc 60 cacctacaag ttttggacca ctagtgagaa aaatatttgt tgatggtgtt ccatttgtag 120 tttcaac 127 <210> 22 <211> 119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 22 ttctgataaa ggagttgcac caggtacagc tgttttaaga cagtggttgc ctacgggtac 60 gctgcttgtc gattcagatc ttaatgactt tgtctctgat gcagattcaa ctttgattg 119 <210> 23 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 23 tacattcaac tcaggacttg ttcttacctt tcttttccaa tgttacttgg ttccatgcta 60 tacatgtctc tgggaccaat ggtactaaga ggtttgataa ccctgtccta ccatttaatg 120 at 122 <210> 24 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 24 tgaatttcaa ttttgtaatg atccattttt gggtgtttat taccacaaaa acaacaaaag 60 ttggatggaa agtgagttca gagtttattc tagtgcgaat aattgcactt ttgaatatgt 120 c 121 <210> 25 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 25 cgtgatctcc ctcagggttt ttcggcttta gaaccattgg tagatttgcc aataggtatt 60 aacatcacta ggtttcaaac tttactt 87 <210> 26 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 26 tggacagctg gtgctgcagc ttattatgtg ggttatcttc aacctaggac ttttctatta 60 aaatataatg aaaatggaac cattacagat gctgtagact gtgcacttga ccctctctca 120 gaaaca 126 <210> 27 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 27 tactaaatta aatgatctct gctttactaa tgtctatgca gattcatttg taattagagg 60 tgatgaagtc agacaaatcg ctccagggca aactggaaag attgctgatt ataattataa 120 attac 125 <210> 28 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 28 aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat aattacctgt atagattgtt taggaagtct 60 aatctcaaac cttttgagag agatatttca 90 <210> 29 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 29 taatggtgtt gaaggtttta attgttactt tcctttacaa tcatatggtt tccaacccac 60 taatggtgtt ggttaccaac catacagagt agtagtactt tcttttgaac ttctacatgc 120 accag 125 <210> 30 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 30 acaggtgttc ttactgagtc taacaaaaag tttctgcctt tccaacaatt tggcagagac 60 attgctgaca ctactgatgc tgtccgtgat ccacagacac t 101 <210> 31 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 31 tgttataaca ccaggaacaa atacttctaa ccaggttgct gttctttatc aggatgttaa 60 ctgcacagaa gtccctgttg ctattcatgc agatcaactt actcctac 108 <210> 32 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 32 tgtttaatag gggctgaaca tgtcaacaac tcatatgagt gtgacatacc cattggtgca 60 ggtatatgcg ctagttatca gactcagact aattctcctc ggcgggcacg tagtgtagct 120 agtcaatc 128 <210> 33 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 33 ttgcttactc taataactct attgccatac ccacaaattt tactattagt gttaccacag 60 aaattctacc agtgtctatg accaagacat cagtagattg tacaatgtac atttgtggtg 120 attcaac 127 <210> 34 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 34 agtgcacttg gaaaacttca agatgtggtc aaccaaaatg cacaagcttt aaacacgctt 60 gttaaacaac ttagctccaa ttttggtgca atttcaagtg ttttaaatga tatcctttca 120 cgtcttgac 129 <210> 35 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 35 atttttgtgg aaagggctat catcttatgt ccttccctca gtcagcacct catggtgtag 60 tcttcttgca tgtgacttat gtccctgcac aagaaaagaa cttcacaact gctcctgcca 120 ttt 123 <210> 36 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 36 tcaaatggca cacactggtt tgtaacacaa aggaattttt atgaaccaca aatcattact 60 acagacaaca catttgtgtc tggtaactgt gatgttgtaa taggaattgt caacaacaca 120 gtttatg 127 <210> 37 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 37 ggatgctact ccttcagatt ttgttcgcgc tactgcaacg ataccgatac aagcctcact 60 ccctttcgga tggcttattg ttggcgttgc acttcttgct gtttttcaga gcgcttccaa 120 aa 122 <210> 38 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 38 cttcttcatc tacaataaaa ttgttgatga gcctgaagaa catgtccaaa ttcacacaat 60 cgacggttca tccggagttg ttaatccagt aatggaacca atttatgatg aaccgacgac 120 gactactagc g 131 <210> 39 <211> 134 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 39 aactttagct tgttttgtgc ttgctgctgt ttacagaata aattggatca ccggtggaat 60 tgctatcgca atggcttgtc ttgtaggctt gatgtggctc agctacttca ttgcttcttt 120 cagactgttt gcgc 134 <210> 40 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 40 ctattccttg ttttaattat gcttattatc ttttggttct cacttgaact gcaagatcat 60 aatgaaactt gtcacgccta aacgaacatg aaatttcttg ttttcttag 109 <210> 41 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 41 cagtcatgta ctcaacatca accatatgta gttgatgacc cgtgtcctat tcacttctat 60 tctaaatggt atattagagt aggagctaga aaatcagca 99 <210> 42 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 42 acccattcag tacatcgata tcggtaatta tacagtttcc tgtttacctt ttacaattaa 60 ttgccaggaa cctaaatt 78 <210> 43 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 43 gtatcatgac gttcgtgttg ttttagattt catctaaacg aacaaactaa aatgtctgat 60 aatggacccc aaaatcagcg aaatgcaccc cgcattacgt ttggtggacc ctcagattca 120 ac 122 <210> 44 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 44 tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa 60 ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct 120 accagacga 129 <210> 45 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 45 caactccagg cagcagtagg ggaacttctc ctgctagaat ggctggcaat ggcggtgatg 60 ctgctcttgc tttgctgctg cttgacagat tgaaccagct tgagagcaaa atgtctggta 120 aaggccaa 128 <210> 46 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 46 caaaacattc ccaccaacag agcctaaaaa ggacaaaaag aagaaggctg atgaaactca 60 agccttaccg cagagacaga agaaacagca aactgtgact cttcttcctg ctgcagattt 120 g 121 <210> 47 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Amplicon cDNA <400> 47 tagatgtagt taactttaat ctcacatagc aatctttaat cagtgtgtaa cattagggag 60 gacttgaaag agccaccaca ttttcaccga ggccacgcgg agtacgatcg agtgtacagt 120 gaaca 125 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 48 cactcacgca gtataattaa 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 49 acaacttctg tggccctgat 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 50 accactgggc attgatttag 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 51 tctgctgctc ttcaacctga 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 52 ggcccaaatg ttaacaaagg 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 53 tccatatata gtgggtgatg 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 54 tgacactcta cgtgttgagg 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 55 tgaagtttaa tccacctgct 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 56 acaacaacca taaaaccagt 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 57 atacctggtg tatacgttgt 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 58 gtaaattttg tctagaggct 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 59 taatgtcact attgcaacct 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 60 aggctattga tggtggtgtc 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 61 tagtgcagtt ggtaacatct 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 62 tgcacctttt tgttaaataa 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 63 caaaggctct caatgacttc 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 64 acaatcaagg gtacacacca 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 65 tttctctgtt tgtttttgtt 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 66 ggagagtgtg gacacttatg 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 67 catatatcac gtcaacgtct 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 68 ccaaattgtg ttaactgttt 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 69 ttatacattt tggtgctggt 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 70 gttttcagat cctcagtttt 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 71 atgttgttat taaagtctgt 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 72 cacgcctatt aatttagtgc 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 73 tggtgattct tcttcaggtt 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 74 agtgttatgg agtgtctcct 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 75 tatagcttgg aattctaaca 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 76 aggccggtag cacaccttgt 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 77 cttcaatggt ttaacaggca 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 78 gttcttttgg tggtgtcagt 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 79 ttttcaaaca cgtgcaggct 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 80 cttggtgcag aaaattcagt 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 81 ctcactttct tccacagcaa 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 82 ggacaatcaa aaagagttga 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 83 tcgtgaaggt gtctttgttt 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 84 tgaagcaagg tgaaatcaag 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 85 ctggtgttga acatgttacc 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 86 tctggctgtt atggccagta 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 87 gtgcttttta gcctttctgc 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 88 tcaccaagaa tgtagtttac 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 89 atgaggctgg ttctaaatca 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 90 tctatgaaga ctttttagag 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 91 tttacccaat aatactgcgt 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 92 cgcaacagtt caagaaattc 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 93 ataagcatat tgacgcatac 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 94 cgtaactaca tagcacaagt 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 95 gggacaaggc tctccatctt 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 96 gaacgttccg tgtaccaagc 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 97 ttgatggctc aaactcttct 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 98 gaacaactgg tgtaagttcc 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 99 gtagacattt gtgcgaacag 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 100 taaccattta aaccctgacc 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 101 tgcagtggca agataacagt 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 102 ctaaattggc atgttgaaac 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 103 tatcgaagct tgcgtttgga 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 104 tttctgtatg gtaggatttt 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 105 gaaggcatgc ctaaattaga 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 106 aaaccactct gcaactaagc 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 107 gacaaaaccc acttctcttg 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 108 agaaccttct agtacattgg 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 109 tttgcgagat gacaacaagc 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 110 aagtgtagtt gtaccacaag 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 111 caaacatcat tgcaaaagca 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 112 agctgatgca tacataacac 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 113 aaaacaatac ctctggccaa 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 114 ctacaaaatc ataccagtcc 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 115 gctctctgaa gtggtatcca 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 116 atgtacagtt gcacaatcac 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 117 gtggaagcaa aataaacacc 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 118 tccataagaa aaggctgaga 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 119 aaataacttc tatgtaaagc 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 120 aaggatttca acgtacactt 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 121 gcagcctgta aaatcatctg 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 122 ccggcctgat agatttcagt 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 123 tttaggtcca caaacagttg 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 124 gtgtaatgtc aagaatctca 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 125 ctgtagaata aacacgccaa 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 126 acatagtgta ggcaatgatg 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 127 acaaaagatt gctgcattca 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 128 tgcacttcag cctcaacttt 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 129 gtgtgctttt ccatcatgac 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 130 taattcaggt tgcaaaggat 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 131 tctctttttg agggttatga 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 132 agcttgtgct tacaaaggca 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 133 tgaccacatg gaacgcgtac 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 134 agctacagtt gtgatgattc 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 135 acgcacaatt caattaaagg 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 136 aacgcactac aagactaccc 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 137 ctccattctg gttactgcca 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 138 ttaccgtcac caccacgaat 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 139 acagtttggc cttgttgttg 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 140 aattgtttgg agaaatcatc 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 141 taggcagctc tccctagcat 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 142 gaccccaaaa tcagcgaaat 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 143 ttacaaacat tggccgcaaa 20 <210> 144 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 144 gggagccttg aatacaccaa aa 22 <210> 145 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 145 tctggttact gccagttgaa tctg 24 <210> 146 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 146 gcgcgacatt ccgaagaa 18 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 147 tgtagcacga ttgcagcatt g 21 <210> 148 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 148 gtgaratggt catgtgtggc gg 22 <210> 149 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 149 gtgaaatggt catgtgtggc gg 22 <210> 150 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 150 gtgagatggt catgtgtggc gg 22 <210> 151 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 151 acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26 <210> 152 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 152 cacattggca cccgcaatc 19 <210> 153 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 153 caratgttaa asacactatt agcata 26 <210> 154 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 154 caaatgttaa acacactatt agcata 26 <210> 155 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 155 caaatgttaa agacactatt agcata 26 <210> 156 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 156 cagatgttaa acacactatt agcata 26 <210> 157 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 157 cagatgttaa agacactatt agcata 26 <210> 158 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 158 atattgcagc agtacgcaca ca 22 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 159 gaggaacgag aagaggcttg 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 160 tgtgacatca aggacctgcc 20 <210> 161 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 161 ctgagtcacc tgctacacgc 20 <210> 162 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 162 ctaggacctc tttctgctca 20 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 163 ccctgttgct attcatgcag 20 <210> 164 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 164 ggaagagaca ggtacgttaa 20 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 165 cctcttctcg ttcctcatca 20 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 166 catctcactt gctggttcct 20 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 167 acactctcct agcaccatca 20 <210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 168 ccctattaaa cagcctgcac 20 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 169 aaggttttac aagactcacg 20 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 170 cctggtcccc aaaatttcct 20 <210> 171 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 171 ccttaatagt cctcacttct ctc 23 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 172 agaatagagc tcgcaccgta 20 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 173 tctgtgatgc catgcgaaat 20 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 174 ctacatgcac cagcaactgt 20 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 175 gctggtgctg cagcttatta 20 <210> 176 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 176 ttcggaagag acaggtacgt t 21 <210> 177 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 177 ttcggaagag acaggtacgt ta 22 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 178 caatgctgca atcgtgctac 20 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 179 gctgcaatcg tgctacaact 20 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 180 ctcctctagt ggcggctatt 20 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 181 actacctggc gtggtttgta 20 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 182 cacctgtgcc tgttaaacca 20 <210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 183 agggtcaagt gcacagtcta 20 <210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 184 cacacaatcg atgcgcagta 20 <210> 185 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 185 agcagtacgc acacaatcg 19 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 186 gttgcgacta cgtgatgagg 20 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 187 tgaactgttg cgactacgtg 20 <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 188 gctcgcaaac atacaacgtg 20 <210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 189 tgaaatcaat agccgccact 20 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 190 cagatgctgg cttcatcaaa 20 <210> 191 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 191 actgttttgc cacctttgct 20 <210> 192 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 192 aaggaaattt tggggaccag 20 <210> 193 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 193 aaaggccaac aacaacaagg 20 <210> 194 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 194 cattaacatt ggccgtgaca 20 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 195 tgtttgcgag caagaacaag 20 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 196 ggttggcaat caatttttgg 20 <210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 197 agcttgtgca ttttggttga 20 <210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 198 gagtcagcac tgctcatgga 20 <210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 199 gctctgttgg tgggaatgtt 20 <210> 200 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 200 caagtggggt aaggctagac ttt 23 <210> 201 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 201 agaagattgg ttagatgatg atagt 25 <210> 202 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 202 tgatgatact ctctgacgat gctgt 25 <210> 203 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 203 cctactaaat taaatgatct ctgctttact 30 <210> 204 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 204 acttaggata atcccaaccc at 22 <210> 205 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 205 ttccatctct aattgaggtt gaacc 25 <210> 206 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 206 ctcagtccaa cattttgctt caga 24 <210> 207 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 207 caagctataa cgcagcctgt a 21 <210> 208 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 208 atgagcttag tcctgttg 18 <210> 209 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 209 ggtaactggt atgatttcg 19 <210> 210 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 210 ctccctttgt tgtgttgt 18 <210> 211 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 211 ctggtcaagg ttaatatagg 20 <210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 212 tggggyttta crggtaacct 20 <210> 213 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 213 tggggcttta caggtaacct 20 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 214 tggggcttta cgggtaacct 20 <210> 215 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 215 tggggtttta caggtaacct 20 <210> 216 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 216 tggggtttta cgggtaacct 20 <210> 217 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 217 taatcagaca aggaactgat ta 22 <210> 218 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 218 aacrcgctta acaaagcact c 21 <210> 219 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 219 aacacgctta acaaagcact c 21 <210> 220 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 220 aacgcgctta acaaagcact c 21 <210> 221 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 221 cgaaggtgtg acttccatg 19 <210> 222 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 222 tagcactctc caagggtgtt c 21 <210> 223 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 223 gcaaagccaa agcctcatta 20 <210> 224 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 224 aaattttggg gaccaggaac 20 <210> 225 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 225 tggcagctgt gtaggtcaac 20 <210> 226 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forawrd primer <400> 226 cgtttggtgg accctcagat 20 <210> 227 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 227 ccccactgcg ttctccatt 19

Claims (14)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 개체로부터 분리된 생체 시료를 대상으로 프라이머 염기쌍으로 유전자 증폭하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염증 진단에 관한 정보를 제공하는 방법으로서,
    상기 프라이머 염기쌍은 서열번호 48 내지 서열번호 94, 및 서열번호 95 내지 서열번호 141을 포함하는 것인, 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 개체로부터 분리된 생체 시료는 혈액, 타액, 조직, 세포, 객담, 기관지 세포세척액 및 소변으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 방법.
  8. 삭제
  9. 프라이머 염기쌍을 포함하는 SARS-CoV-2 코로나 바이러스 검출용 프라이머 세트로서,
    상기 프라이머 염기쌍은 서열번호 48 내지 서열번호 94, 및 서열번호 95 내지 서열번호 141을 포함하는 것인, 세트.
  10. 삭제
  11. 제 9항의 프라이머 세트를 포함하는, SARS-CoV-2 코로나 바이러스 검출용 키트.
  12. 프라이머 염기쌍을 포함하는 SARS-CoV-2 코로나 바이러스 변이 판정용 프라이머 세트로서,
    상기 변이는 알파변이, 베타변이, 및 감마변이에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이고,
    상기 프라이머 염기쌍은 서열번호 48 내지 서열번호 94, 및 서열번호 95 내지 서열번호 141을 포함하는 것인, 세트.
  13. 삭제
  14. 제 12항의 프라이머 세트를 포함하는, SARS-CoV-2 코로나 바이러스 변이 판정용 키트.
KR1020210154442A 2021-11-11 2021-11-11 차세대 염기서열 분석 기술 기반 covid-19 진단 및 변이체 판정 시스템 KR102537109B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210154442A KR102537109B1 (ko) 2021-11-11 2021-11-11 차세대 염기서열 분석 기술 기반 covid-19 진단 및 변이체 판정 시스템

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210154442A KR102537109B1 (ko) 2021-11-11 2021-11-11 차세대 염기서열 분석 기술 기반 covid-19 진단 및 변이체 판정 시스템

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20230073365A KR20230073365A (ko) 2023-05-25
KR102537109B1 true KR102537109B1 (ko) 2023-05-30

Family

ID=86529723

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210154442A KR102537109B1 (ko) 2021-11-11 2021-11-11 차세대 염기서열 분석 기술 기반 covid-19 진단 및 변이체 판정 시스템

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102537109B1 (ko)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rosa 등, Water, Vol. 13, No. 2503, (2021.09.13.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230073365A (ko) 2023-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111197112B (zh) 一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒
Moës et al. A novel pancoronavirus RT-PCR assay: frequent detection of human coronavirus NL63 in children hospitalized with respiratory tract infections in Belgium
Pyrc et al. Mosaic structure of human coronavirus NL63, one thousand years of evolution
CN111500771B (zh) 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒
WO2022095723A1 (zh) 用于检测SARS-CoV-2的试剂盒及方法
CN111394513B (zh) 新型冠状病毒SARS-CoV-2荧光定量PCR检测方法及其应用
TW202200788A (zh) SARS-CoV-2之偵測的檢驗
JP2023519919A (ja) 病原体を検出するためのアッセイ
CA3176541A1 (en) Single step sample preparation for next generation sequencing
Chong et al. Current diagnostic approaches to detect two important betacoronaviruses: Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)
US7709188B2 (en) Multi-allelic detection of SARS-associated coronavirus
KR102146113B1 (ko) 인간 알파코로나바이러스 전장유전체 증폭을 통한 진단키트 및 전장 유전체 서열 확인 방법
US20230009218A1 (en) Primer, Probe And Controls For Detection And Discrimination Of Covid-19 And Other Coronaviruses
KR102526524B1 (ko) 전장유전체 증폭을 위한 인간 사스-코로나바이러스-2 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트
KR102313941B1 (ko) Covid-19 감염 진단을 위한 rt-lamp용 키트 및 방법
KR102537109B1 (ko) 차세대 염기서열 분석 기술 기반 covid-19 진단 및 변이체 판정 시스템
KR102346881B1 (ko) 코로나 바이러스 및 인플루엔자 바이러스 동시 진단용 키트
CN113215329A (zh) 呼吸道7种亚型流感病毒多重pcr检测的引物、探针和试剂盒
ZA200602353B (en) Multi-allelic molecular detection of SARS-Associated coronavirus
US20220243290A1 (en) Molecular detection of novel coronaviruses
CN114262758B (zh) 检测新型冠状病毒突变株的试剂盒及检测方法
KR102295574B1 (ko) 전장유전체 증폭을 위한 인간 베타코로나바이러스 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트
KR102435209B1 (ko) 인플루엔자 a형 및 b형 바이러스와 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스를 구별하여 동시에 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 검출 방법
KR102395969B1 (ko) 코로나바이러스의 검출을 위한 루프-매개 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102366554B1 (ko) SARS-CoV-2 델타 변이 구별용 RT-LAMP 프라이머 세트 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
AMND Amendment
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant