CN117737227A - 基于cfDNA筛查胎儿ACH的基因检测试剂盒及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于cfDNA筛查胎儿ACH的基因检测试剂盒及系统。基因检测试剂盒包括4条引物，其中第一引物依次包括上游接头引物、UMI和ACH特异性上游引物，第二引物依次包括下游接头引物和ACH特异性下游引物，第三引物为平台上游通用序列，第四引物依次包括测序接头3’端通用引物、Index序列、下游接头5’端通用引物。本发明的基因检测试剂盒适用于cfDNA模板，对起始模板量要求较低，可以通过对孕妇采集外周血进行检测，对孕妇以及胎儿的伤害更小；在每一条原始模板核酸引入UMI，最大程度降低测序系统误差和PCR过程引入的错误碱基对测序结果判定的影响，实现从含有大量母体背景的孕妇外周血中准确地进行胎儿软骨发育不全的无创产前筛查。
Description
技术领域
本发明属于生物与新医药技术领域，具体涉及高通量测序技术检测孕妇外周血浆筛查胎儿遗传病，特别涉及基于cfDNA筛查胎儿ACH的基因检测试剂盒及系统。
背景技术
单基因病是指由一对等位基因控制的疾病或临床病理表现，根据致病基因所在的染色体可将其分为常染色体遗传病、性染色体遗传病和线粒体遗传病，目前已明确发病机制的单基因病有近5000多种，大多数单基因病无法治愈或治疗成本高。当前每年出生缺陷儿数量不断增加，单基因病是导致新生儿出现缺陷的主要原因之一，进行产前检测是预防患基因病或提前进行临床干预最有效的方法。目前检测单基因病最常用的方法是通过绒毛膜取样和羊膜腔穿刺获取细胞进行检测，但两种方法均为有创检测，存在流产风险，随着孕妇外周血中胎儿游离DNA的发现，基于无创产前检测单基因病已成为主要趋势。
软骨发育不全(achondroplasia，ACH)(OMIM#100800)是导致非匀称性身材矮小的罕见疾病，此病于1878年首次报道，活产婴儿发病率为1∶17 000～1∶28 000，主要表现为四肢长骨近端短缩、大头畸形以及特殊面容(前额突出、面中部发育不良呈现后凹和鼻梁塌陷)。ACH属于常染色体显性遗传性疾病，成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growthfactor receptor 3，FGFR3)基因(OMIM#134934)是其主要致病基因。大约80％的患儿由新发变异所引起，其发生与父亲年龄较大有关，另外约20％是由家族遗传所致。FGFR3基因常见的致病性变异为c.1138G>A(p.Gly380Arg)和c.1138G>C(p.Gly380Arg)，约98％的ACH患儿出现c.1138G>A基因改变，少数为c.1138G>C变异。
目前基于高通量测序技术对单基因病进行无创产前检测的技术手段主要有扩增子测序和液相杂交捕获测序，扩增子测序是一种高特异性的靶向测序方法，通常采用多重PCR的方式进行富集，能够针对基因特定区域的点突变、插入缺失、结构变异进行检测，相较于液相杂交捕获测序方法，扩增子测序优势在于对起始模板量要求低，特异性强，检验操作难度低、时间短，数据量要求低可降低成本等。
扩增子测序虽有上述所提到的优点，但其本身也存在无法避免的技术缺点，采用多重PCR扩增的方法进行靶向富集可能会出现扩增偏好性，同时PCR过程中可能会出现碱基错配、非特异性扩增以及测序系统引入的误差，影响低频突变结果的准确性。此外，当前扩增子测序主流技术需要2步PCR建库，甚至是PCR后再进行常规的NGS文库构建，操作繁琐、检测周期长、成本高且容易引入实验室污染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种基于cfDNA筛查胎儿ACH的基因检测试剂盒及系统。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种筛查胎儿ACH的基因检测试剂盒，包括反应体系，其引物组如下：
第一引物，依次包括测序平台上游接头引物部分引物序列、唯一分子标记和捕获软骨发育不全基因突变的靶标特异性上游引物序列，所述靶标特异性上游引物序列的核苷酸序列为：CCACCACCAGGATGAACAGG；
第二引物，依次包括测序平台下游接头引物部分引物序列反向互补序列和捕获软骨发育不全基因突变的靶标特异性下游引物序列，所述靶标特异性下游引物序列的核苷酸序列为：CATGTCTTTGCAGCCGAGGAGG；
第三引物，为测序平台上游通用序列；
第四引物，依次包括测序接头3’端通用引物、Index序列、测序平台下游接头5’端通用引物序列。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第一引物的测序平台上游接头引物部分的序列为：GAACGACATGGCTACGATCCGACTT。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第二引物测序平台下游接头引物部分的序列为：GACCGCTTGGCCTCCGACTT。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第二引物的序列为：GACCGCTTGGCCTCCGACTTCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGG。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第一引物的序列为：GAACGACATGGCTACGATCCGACTTNNNNNNNNCCACCACCAGGATGAACAGG，其中NNNNNNNN为唯一分子标记。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第三引物的核苷酸序列为：GAACGACATGGCTACGATCCGACTT。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第四引物的测序接头3’端通用引物的核苷酸序列为：TGTGAGCCAAGGAGTTG，所述第四引物的测序平台下游接头5’端通用引物序列为：TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述唯一分子标识的长度为6～10nt，优选8nt。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述Index序列的长度为6～12nt，优选10nt。
在一些基因检测试剂盒的实例中，第三引物的5’端被磷酸化修饰。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述反应体系包括：扩增缓冲液、DNA聚合酶、纯化磁珠。
在一些基因检测试剂盒的实例中，其检测的样本为孕妇外周血。
本发明的第二个方面，提供：
一种筛查胎儿ACH的基因检测系统，包括：
cfDNA提取装置，用于从孕妇外周血中提取cfDNA；
PCR扩增装置，用于扩增提取得到的cfDNA，其使用的引物如本发明第一个方面所述；
文库构建装置，用于纯化PCR扩增装置的扩增产物并构建测序文库；
高通量测序装置，对测序文库进行高通量测序；
分析装置，基于高通量测序装置得到的测序数据，确定胎儿是否存在ACH基因突变。
在一些基因检测系统的实例中，PCR扩增时，采用第一引物和第二引物对孕妇外周血血浆中的游离DNA模板进行第一轮2个循环的PCR扩增，完成2个循环扩增后，第三引物和第四引物会对所述第一轮扩增产物继续进行第3～35个循环的PCR扩增。
本发明的有益效果是：
本发明检测孕妇外周血浆筛查胎儿软骨发育不全的基因检测试剂盒，适用于血浆游离DNA(cfDNA)模板，对起始模板量要求较低，可以通过对孕妇采集外周血进行检测，相较于传统的穿刺采集羊水或组织，对孕妇以及胎儿的伤害更小。
本发明所述的基因检测试剂盒，引入了唯一分子标记，使每一条原始模板核酸对应一个UMI，最大程度降低测序系统误差和PCR过程引入的错误碱基对测序结果判定的影响，实现从含有大量母体背景的孕妇外周血中准确地进行胎儿软骨发育不全的无创产前筛查。
附图说明
图1是引物对F1/R1扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2是引物对F3/R3扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
一种筛查胎儿ACH的基因检测试剂盒，包括反应体系，其引物组如下：
第一引物，依次包括测序平台上游接头引物部分引物序列、唯一分子标记和捕获软骨发育不全基因突变的靶标特异性上游引物序列，所述靶标特异性上游引物序列的核苷酸序列为：CCACCACCAGGATGAACAGG(SEQ ID NO.：7)；
第二引物，依次包括测序平台下游接头引物部分引物序列反向互补序列和捕获软骨发育不全基因突变的靶标特异性下游引物序列，所述靶标特异性下游引物序列的核苷酸序列为：CATGTCTTTGCAGCCGAGGAGG(SEQ ID NO.：8)；
第三引物，为测序平台上游通用序列；
第四引物，依次包括测序接头3’端通用引物、Index序列、测序平台下游接头5’端通用引物序列。
测序平台上、下游接头引物可以根据测序平台推荐的序列确定。在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第一引物的测序平台上游接头引物部分的序列为：GAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO.：9)，所述第二引物测序平台下游接头引物部分的序列为：GACCGCTTGGCCTCCGACTT(SEQ ID NO.：10)。其为华大MGI测序平台推荐的上游接头引物序列。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第二引物的序列为：GACCGCTTGGCCTCCGACTTCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGG(SEQ ID NO.：5)。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第一引物的序列为：GAACGACATGGCTACGATCCGACTTNNNNNNNNCCACCACCAGGATGAACAGG(SEQ ID NO.：6)，其中NNNNNNNN为唯一分子标记。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第三引物的核苷酸序列为：GAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO.：9)。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第四引物的测序接头3’端通用引物的核苷酸序列为：TGTGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO.：11)，所述第四引物的测序平台下游接头5’端通用引物序列为：TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT(SEQ ID NO.：12)。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第四引物的核苷酸序列为：TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT(SEQ ID NO.：13)。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述唯一分子标识(UMI)的长度为6～10nt，优选8nt。具体的长度可以根据样本的量等情况进行相应的调整，以可以准确区分每个样本的来源即可。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述Index序列的长度为6～12nt，优选10nt。具体的长度可以根据测序平台的要求进行相应的调整。
在一些基因检测试剂盒的实例中，第三引物的5’端被磷酸化修饰。5’端被磷酸化修饰，便于在测序前对单链进行环化，方便高通量测序。
在一些基因检测试剂盒的实例中，所述反应体系包括：扩增缓冲液、DNA聚合酶、纯化磁珠。
在一些基因检测试剂盒的实例中，其检测的样本为孕妇外周血。孕妇外周血易于获得，对胎儿是无害的。
为了更好的理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
以下实施例中所使用的试剂若无特殊说明，均为市售商品，或通过现有已知的方法获得，部分试剂的来源如表1所示。
表1、部分试剂的来源
实施例1
一、制备FGFR3基因c.1138G>A突变企业参考品
企业参考品制备原料为杂合50％突变频率的FGFR3基因c.1138G>A基因组DNA和正常女性血浆，将基因组DNA酶切成片段长度为160bp±10bp的小片段，用于模拟胎儿游离DNA，按比例投入正常女性血浆混合成企业参考品。
所述酶切步骤为：
1)取适量基因组DNA用NF水补足至50μL，加入110μL VAHTSDNA Clean Beads，混匀后室温静置5min；转移至磁力架上，静置3min待磁珠完全吸附，吸弃上清；使用200μL新鲜配制的80％乙醇洗涤2次；室温干燥后加入37μL NF水洗脱。
2)酶切反应体系为：
| 组分 | 体积 |
| FEA Buffer | 5μL |
| 基因组DNA | 35μL |
| 总体积 | 40μL |
按所述酶切反应体系配制完成后，混匀，加入10μL FEA Enzyme Mix，混匀后进行酶切反应。
3)所述酶切反应程序为：
| 温度 | 时间 |
| 热盖105℃ | On |
| 37℃ | 25min |
| 4℃ | Hold |
4)酶切完成后，所得PCR产物转移至新的装有30μL磁珠的PCR管中，混匀后室温静置5min；转移至磁力架上，静置3min待磁珠完全吸附，将上清转移至新的装有40μL磁珠的PCR管中，混匀后室温静置5min；转移至磁力架上，静置3min待磁珠完全吸附，吸弃上清；使用200μL新鲜配制的80％乙醇洗涤2次；室温干燥后加入32μL NF水洗脱，所得上清即为酶切好的片段化FGFR3基因c.1138G>A突变DNA。
所述酶切反应所使用的试剂均为市面上常见的建库酶切试剂,上海翌圣生物的Hieff
Smearase(货号12907)。
按比例配制1.75％和2.5％突变频率的FGFR3基因c.1138G>A企业参考品，企业参考品设置如表2所示。
表2企业参考品设置
二、FGFR3 1138位点特异性引物筛选
FGFR3基因1138位点附近序列存在大量的GC，基于该基因突变位点进行特异性引物设计往往难以获得较高的特异性，针对该位点设计3对特异性引物，具体序列如下所述：
测序平台上游接头引物部分引物序列、唯一分子标记(UMI)和FGFR3基因特异性上游引物组合成第一引物(R1～R3)，测序平台下游接头引物部分引物序列反向互补序列和FGFR3基因特异性下游引物组合成第二引物(F1～F3)，具体序列如下表所示。
各提取3例阴性血浆样本，采用上述3组引物对模板核酸进行35个循环PCR扩增，所述PCR扩增程序为：
取扩增所得产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，如图1和图2所示。
引物对F1/R1及F3/R3均于150bp-200bp范围内出现条带，对所述两对引物进一步测试，
各提取3例阴性血浆样本，分别使用引物对F1/R1、F3/R3，与第三引物、第四引物进行PCR扩增，扩增完成后，将扩增产物纯化，所构建的测序文库经过测序和数据分析，对比两组文库下机数据的比对率。
| 样本名称 | 比对序列数 | 总序列数 | 比对率 |
| F1/R1-1 | 23575 | 86381 | 27.3％ |
| F1/R1-2 | 44059 | 130686 | 33.7％ |
| F1/R1-3 | 69751 | 124697 | 55.9％ |
| F3/R3-1 | 109517 | 112023 | 97.8％ |
| F3/R3-2 | 102854 | 108456 | 94.8％ |
| F3/R3-3 | 94809 | 103284 | 91.8％ |
结果分析：
数据表明，引物对F3/R3具有非常优秀的特异性，比对率远高于引物对F1/R1，对靶标的富集能力更强，极大减少非靶标序列，使突变结果更为准确。
综上所述，本发明的检测方法及试剂盒采用引物F3作为第一引物，引物R3作为第二引物。
三、高通量测序检测FGFR3基因c.1138G>A突变企业参考品
S1)各提取3例阴性血浆样本，3.5％和5％模拟胎儿cfDNA浓度企业参考品，采用第一引物和第二引物对模板核酸进行第一轮2个循环的PCR扩增，对目标区域进行靶向富集，同时所获得的扩增子均添加上唯一分子标识符；
S2)完成第一轮2个循环的PCR扩增后，第三引物(GAACGACATGGCTACGATCCGACTT)和第四引物(TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT，其中的“NNNNNNNNNN”为测序平台官方推荐的10bp index序列的反向互补序列)会对所述第一轮扩增产物继续进行第3-35个循环的PCR扩增，将第四引物上的接头分子标签添加到目标产物上；
S3)扩增完成后，将扩增产物纯化，即为所构建的测序文库，经过测序和数据分析，得到样本中FGFR3基因c.1138G>A的突变频率，判断胎儿是否存在患软骨发育不全疾病的风险。
所述的PCR扩增体系为：
所述的PCR扩增程序为：
所述的文库纯化方法为：
扩增完成后，加入50μL纯化磁珠，吹打或振荡混匀，瞬时离心后室温放置5min；转移至磁力架上，静置3～5min待磁珠完全吸附，吸弃上清，使用200μL新鲜配制的80％乙醇洗涤2次；室温干燥后加入32μL NF水洗脱，所得上清即为构建好的测序文库。
所述数据分析方法为：
对文库进行测序，获取测序后的每个样本对应的原始数据。将数据比对到人类参考基因组，实施例中我们采用bwa比对软件和hg19人类参考基因组。判断比对到FGFR3基因1138位点的碱基情况，统计出每个碱基的深度Depb(b＝A,T,C,G)，根据比对结果能够直接得出。统计出每个碱基的单分子标签(UMI)数UMIb(b＝A,T,C,G)，根据比对结果聚类能够得出，如果UMI序列一致则为一类，默认来源于同一个原始模板，计数为1。计算突变碱基的UMI比例，R2m＝UMIm/∑UMIb,(b＝A,T,C,G),m代表突变碱基，计算结果即为突变的频率。
结果分析：
该次各检测3例阴性血浆样本，3.5％和5％模拟胎儿cfDNA浓度c.1138G>A突变企业参考品，实际突变频率与理论值差异不大，符合预期，具体结果如表3所示：
表3企业参考品检测结果
四、临床应用研究
选用一例经产前诊断Sanger测序结果为FGFR3基因突变的真实临床样本，3例产前诊断Sanger测序未出检FGFR3基因突变的临床样本，分别取原始孕妇外周血血浆样本，进行盲测试验，血浆样本经广州精科生物技术有限公司的核酸提取或纯化试剂提取cfDNA，采用所述检测方法进行检测，具体结果如表4所示。
表4临床样本检测结果
| 样本编号 | 本发明检测结果 | 产前诊断 | 一致性 |
| Test001 | 未检出FGFR3 1138G>A突变 | 未检出FGFR3 1138G>A突变 | 一致 |
| Test002 | 检出FGFR3 1138G>A突变 | 检出FGFR3 1138G>A杂合突变 | 一致 |
| Test003 | 未检出FGFR3 1138G>A突变 | 未检出FGFR3 1138G>A突变 | 一致 |
| Test004 | 未检出FGFR3 1138G>A突变 | 未检出FGFR3 1138G>A突变 | 一致 |
结果分析：
采用本发明的检测方法和试剂盒，与产前诊断结果符合率100％，表明本发明适合检测孕妇外周血浆筛查胎儿软骨发育不全。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.查胎儿ACH的基因检测试剂盒，包括反应体系，其特征在于，其引物组如下：
第一引物，依次包括测序平台上游接头引物部分引物序列、唯一分子标记和捕获软骨发育不全基因突变的靶标特异性上游引物序列，所述靶标特异性上游引物序列的核苷酸序列为：CCACCACCAGGATGAACAGG；
第二引物，依次包括测序平台下游接头引物部分引物序列反向互补序列和捕获软骨发育不全基因突变的靶标特异性下游引物序列，所述靶标特异性下游引物序列的核苷酸序列为：CATGTCTTTGCAGCCGAGGAGG；
第三引物，为测序平台上游通用序列；
第四引物，依次包括测序接头3’端通用引物、Index序列、测序平台下游接头5’端通用引物序列。
2.根据权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述第三引物的核苷酸序列为： GAACGACATGGCTACGATCCGACTT；和/或
所述第一引物的测序平台上游接头引物部分的序列为：GAACGACATGGCTACGATCCGACTT。
3.根据权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述第四引物的测序接头3’端通用引物的核苷酸序列为：TGTGAGCCAAGGAGTTG，所述第四引物的测序平台下游接头5’端通用引物序列为：TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT。
4.根据权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述唯一分子标识的长度为6～10 nt。
5.根据权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述Index序列的长度为6～12nt。
6.根据权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述反应体系包括：扩增缓冲液、DNA聚合酶、纯化磁珠。
7.根据权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，第三引物的5’端被磷酸化修饰。
8.根据权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，其检测的样本为孕妇外周血。
9.权利要求1～7任一项所述基因检测试剂盒在制备胎儿ACH筛查试剂中的应用。
10.一种筛查胎儿ACH的基因检测系统，包括：
cfDNA提取装置，用于从孕妇外周血中提取cfDNA；
PCR扩增装置，用于扩增提取得到的cfDNA，其使用的引物如权利要求1～7任一项所述；
文库构建装置，用于纯化PCR扩增装置的扩增产物并构建测序文库；
高通量测序装置，对测序文库进行高通量测序；
分析装置，基于高通量测序装置得到的测序数据，确定胎儿是否存在ACH基因突变。
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