CN104531842A - 一种无创产前检测胎儿21、18和13三体综合征的阳性质控品及其制备方法 - Google Patents

一种无创产前检测胎儿21、18和13三体综合征的阳性质控品及其制备方法 Download PDF

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雷孝锋
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Abstract

本发明提供了一种无创产前检测胎儿21、18和13三体综合征的阳性质控品及其制备方法，属于胎儿染色体非整倍体的无创产前检测范畴。本发明的制备步骤包括：将患有21、18、13三体综合征胎儿流产组织的DNA均打断成长度为160～200bp的DNA片段；按比例分别将打断后回收的流产组织DNA片段加入到混合血浆中；最后提取血浆游离总DNA，超纯水稀释后制备成不同浓度的阳性质控品。本发明为一种白色透明DNA溶液，具有稳定、易保存、便捷、无毒等优点，且能够有效的避免同一批次其它样本的检测结果的偏差，增加21、18和13三体综合征无创产前检测的准确性和可靠性。

Description

一种无创产前检测胎儿21、18和13三体综合征的阳性质控品及其制备方法
所属领域
本发明属于生物制品技术领域，属于胎儿染色体非整倍体的无创产前检测范畴，涉及21、18、13三体综合征检测的阳性质控品及其制备方法。
发明背景
染色体非整倍体是指相对于人的正常的46条染色体而言，细胞中的某一条或几条染色体数目增加或减少，与婴幼儿期显著的发病率和死亡率有着密切关系。该类疾病的发病率随着孕妇年龄的增高而增高。据文献报道我国每年出生染色体异常的新生儿约10万人，在活婴儿中染色体异常者占0.3％，而其中21三体、18三体、13三体综合征是临床最常见和最易出现的染色体异常疾病。新生儿中染色体异常的发病率为1/160，其中21三体综合征(唐氏综合征，DS)、18三体综合征(爱德华氏综合征)和13三体综合征(帕陶氏综合征)是三种最主要常染色体非整倍体疾病，在新生儿中发病率分别为1/800～1/600、1/7000～1/3500和1/6000～1/5000。目前对21三体、18三体、13三体综合征的治疗缺乏有效方法，因此普及染色体疾病的产前筛查和产前诊断，对降低出生缺陷的发生有着非常重要的意义。这有利于提高人口质量，实现优生优育，尤其对高龄孕妇(大于35岁)的胎儿进行产前筛查，以防止染色体异常患儿的出生。
在现有染色体异常检测方法中，染色体核型分析技术是检测染色体异常的“金标准”，但核型分析在很大程度上又要依赖于细胞样品的质量。如果样本细胞量小或被污染，则很难或不能检测出结果。目前，国内外广泛采用孕妇血清标记物来大面积筛查DS胎儿。由于DS胎儿的孕妇血清甲胎蛋白(AFP)和雌三醇(uE3)低于平均水平，而绒毛膜促性腺激素(HCG)高于平均水平，因此，利用“三联筛查”方法对妊娠期(孕15～21周)孕妇进行这三项指标的检测。该方法检出率为48％～83％，假阳性率约为5％。这些检测偏差的结果将会给染色体异常新生儿家庭带来痛苦，增加社会的负担。因此，开发一种准确性、灵敏度和可靠性都很高的染色体疾病的产前筛查和产前诊断的方法就会显得尤为重要和迫在眉睫。
那么，利用高通量测序技术对胎儿染色体非整倍体进行检测的方法相比传统方法具有明显优势。该方法只需抽取母体外周血进行检测，可避免传统的侵入性方法可能给孕妇和胎儿带来的危害；另外直接检测母亲和胎儿的DNA序列，相比于检测血清蛋白标志物和超声波检测，准确性、灵敏度及可靠性都大大提高。因此，通过深度测序，能够对孕妇血浆微量胎儿游离DNA进行准确检测，可以克服传统检测方法因胎儿游离DNA含量过低而导致检测结果假阴性过高的缺点。
目前，市场上基于高通量基因测序法检测21、18和13三体综合征的诊断产品非常少，且基本没有提供配套的阳性质控品，这严重影响染色体疾病的产前筛查和诊断的准确性和可靠性。本发明以高通量测序技术用于孕妇血浆游离胎儿DNA的染色体非整倍体(T21、T18和T13)国家标准品为溯源，然后将患有21三体、18三体、13三体综合征胎儿流产组织的DNA都打断成长度为160～200bp的DNA片段，按照特定比例将上述打断的DNA片段加入到正常未孕女性血浆中并混匀，最后提取混匀血浆游离DNA，制备阳性质控品。
发明内容
本发明目的是提供一种无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的阳性质控品及其制备方法。为了实现本发明目的，发明了一种基于高通量测序无创产前检测胎儿染色体非整倍体21、18和13三体综合征的阳性质控品。
本发明的阳性质控品制备方法如下：
(1)取5～10例正常未孕女性血浆混合，抽提血浆游离DNA后测定DNA浓度；
(2)分别提取21、18和13三体综合征胎儿流产组织DNA，超声波打断成片段后E-gel电泳回收160～200bp的片段并测DNA浓度；
(3)将各回收的流产组织DNA片段分别按下列公式加入混合血浆中；
(其中：DNAT21、DNAT18、DNAT13分别为21、18、13三体综合征胎儿流产组织DNA打断回收后加入混合血浆的DNA量，DNAMix为正常未孕女性混合血浆中游离的DNA量)。
(4)提取(3)中血浆游离总DNA，溶解入超纯水后制备成不同浓度的阳性质控品。
本发明中正常未孕女性血浆为年龄介于20～40周岁，且染色体结构正常的未孕女性外周静脉血浆。
本发明是将打断回收的各流产组织DNA片段加入到正常未孕女性血浆里并混匀，提取总血浆游离DNA后，超纯水稀释为不同浓度后并进行检测。
本发明为一种白色透明DNA溶液，具有稳定、易保存、便捷、无毒等优点，且能有效避免同一批次其它样本的检测结果的偏差，增加21、18和13三体综合征产前检测的准确性和可靠性。
附图说明
图1显示21三体综合症胎儿流产组织DNA打断回收后的片段经Agilent 2100 bioanalyzer检测的片段分布。
图2显示18三体综合症胎儿流产组织DNA打断回收后的片段经Agilent 2100 bioanalyzer检测的片段分布。
图3显示13三体综合症胎儿流产组织DNA打断回收后的片段经Agilent 2100 bioanalyzer检测的片段分布。
图4显示阳性质控品溶液经胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)检测结果图。
图5显示阳性质控品溶液与第一组孕妇血浆样本DNA经胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)检测结果图。
图6显示阳性质控品溶液与第二组孕妇血浆样本DNA经胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)检测结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明。
实施例中所用的技术手段若为特殊指明，均为常规方法；试剂与耗材若无特殊说明均可从商业途径获取。
实施例1：阳性质控品的制备
1.混合血浆：取5个正常未孕女性血浆各40mL进行混合，得到混合血浆200mL。
2.提取血浆游离DNA及浓度测定：取600μL混合血浆进行DNA提取，设置3个重复，使用Qubit进行定量，计算血浆中游离DNA的浓度，结果见表1。
表1血浆游离DNA浓度
3.21三体、18三体、13三体综合征胎儿流产组织DNA提取及浓度测定：用Qiagen 69504DNeasy Blood&Tissue Kit提取各流产组织DNA，用Qubit 2.0和dsDNA HS Assay Kit测定浓度和Nanodrop200C测定OD260/OD280，结果见表2。
表2组织DNA提取测定结果
4.DNA打断：将21三体、18三体、13三体综合征胎儿流产组织DNA用Covaris S220超声波打断，电泳系统回收160～200bp长度的DNA片段，用Qubit 2.0和dsDNA HS AssayKit测定DNA的浓度，Agilent 2100 Bioanalyzer测定DNA片段长度分布，见表3(对应图1-图3)。
表3回收后DNA质量检测
5.计算比例混入DNA及血浆游离DNA提取：取10mL混合血浆，按照各5％比例将打断后T21、T18、T13流产组织DNA片段加入混合血浆中，再提取血浆游离DNA，共提取10份。
6.阳性质控品的检测：对得到的阳性质控品利用胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)进行检测。
由表4可知，阳性质控品制备瓶间差变异系数较小，说明本发明的稳定性和可靠性，适用于染色体疾病的产前筛查和诊断。
由表5可知，阳性质控品的配套试剂盒检测与实际样本情况的符合率为100％，说明本发明的阳性质控品可以用于该试剂盒检测时的质量控制。
表4瓶间差实验
注：Unique Reads为测到的唯一比对人类基因组(hg19)的DNA序列数，Aligned Reads为测到的比对到人类基因组(hg19)的所有DNA序列数，Z Score-21为该样本21号染色体的Z值，即21号染色体上测到的碱基占该样本所有检测到的碱基的百分比与参考数据库中正常样本21号染色体的碱基数目与所有碱基数目百分比的偏差；Z Score-18和Z Score-13分别为18号染色体和13号染色体的Z值。Z值介于[-3.00，3.00]为正常样本。
表5配套试剂盒检测符合率
实施例2：阳性质控品检测起始量对检测准确性和稳定性的影响
阳性质控品的制备方法同实施例1。
分别取3ng、30ng、300ng的阳性质控品利用胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)进行检测。
由表6可知，3ng、30ng、300ng三个梯度浓度的阳性质控品的检测结果所有Z值均大于3.00，由表7可知，三个梯度浓度的阳性质控品均表现为21、18、13三体阳性，说明三个浓度梯度的检测范围的阳性质控品均可用于胎儿染色体非整倍体21、18、13三体的无创产前检测。
表6瓶间差实验
表7配套试剂盒检测符合率
实施例3：阳性质控品的非整倍染色体无创产前检测方法的准确性
阳性质控品的制备方法同实施例1。
孕妇血浆样本20例分两组分别与阳性质控品进行检测，结果见表8.1和8.2(图5和图6)。
由表8.1和8.2可知，20组样品的实际检测结果与对照结果完全一致，符合率达到100％。这说明本发明的阳性质控品可以用于21三体、18三体和13三体检测试剂盒的质量控制，检测结果和方法均是准确和可靠的。
表8.1阳性质控品与孕妇血浆游离DNA检测结果
表8.2阳性质控品与孕妇血浆游离DNA检测结果
以上实施例1～3的阳性质控品检测使用到的胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)，包括：
1)文库构建试剂盒和接头试剂盒
其中，包括半导体测序过程的文库构建阶段用于DNA片段两端连接的特异性接头试剂和相关反应所必需的DNA连接酶及其他各种酶类以及相应反应的缓冲液。
2)模板制备试剂盒、模板制备溶液盒和模板制备耗材盒。
其中，包括半导体测序过程模板制备阶段所必需的阳性模板载体、PCR酶和相应的缓冲液以及相关耗材。本阶段实质是一种油包水PCR的过程，即阳性模板载体上含有接头序列的引物，在PCR酶的作用下经特定程序将模板DNA扩增到阳性模板载体上，用于测序过程上机测序阶段的顺利进行。
3)测序试剂盒、测序溶液盒和测序耗材盒
其中，包括半导体测序过程的上机测序阶段所必需的四种脱氧核苷酸(dGTP、dCTP、dATP、dTTP)、PCR酶、测序引物、相应的缓冲液和测序仪的各种洗液等。本阶段实质是阳性模板载体DNA在PCR酶的作用下扩增时，每有一个脱氧核苷酸的掺入，微孔中都会释放一个H+。
4)芯片和和芯片预处理液
其中，半导体测序过程所用的芯片表面含有165M微孔，经芯片预处理液按照操作说明书处理后每个微孔可以承载一个阳性模板载体，最终测序仪能够将每个微孔中释放出来的H+在芯片的底部转换成电信号，仪器就会同时记录每个孔每条DNA分子加入的碱基排列顺序，实现测序目的。
本发明的阳性质控品为白色透明的DNA溶液，具有稳定、易保存和不危害操作者健康的优点，同时阳性质控品制备瓶间差变异系数较小，这说明本发明的稳定性和可靠性，适用于染色体疾病的产前筛查和诊断。
本发明能够有效的避免同一批次其它样本的检测结果出现偏差，提高了21三体、18三体和13三体无创产前检测的准确性和可靠性。
以上实施例1～3涉及到的血浆游离DNA提取，根据金麦格血浆游离DNA提取试剂盒进行。具体步骤为：
1.取600μL血浆加入30μL Proteinase K、12μL Acryl Carrier、900μL Lysis buffer、60μL磁珠，室温下颠倒混匀10min，使磁珠和核酸充分结合。将反应EP管置于磁力架上4min，待磁珠吸附完全后，吸出液体。
2.Wash Buffer I清洗：加入500μL Wash Buffer I，重悬磁珠，置于磁力架上4min，待磁珠吸附完全后，吸出液体，取下EP管。
3.Wash Buffer II清洗：加入500μLWash Buffer II，重悬磁珠，置于磁力架上4min，待磁珠吸附完全后，吸出液体，EP管仍置于磁力架上，使磁珠继续吸附。
4.Wash Buffer III清洗：轻柔地加入550μL Wash Buffer III，30s后吸出液体，取下EP管。
5.晾干磁珠：将EP管短暂离心。将EP管置于磁力架上，待磁珠吸附完全后，吸出残留溶液，晾干2min使管内的液体挥发干净。
6.洗脱DNA：加33μL EB buffer于EP管内，重悬磁珠，55℃孵育5min。
7.回收DNA样品：将EP管置于磁力架上4min，待磁珠吸附完全后，将上清溶液吸出于新的EP管中(约32μL)。
虽然，上述中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以做一些修改和改进，这对本领域技术而言数显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种无创产前检测胎儿21、18和13三体综合征的阳性质控品及其制备方法，其特征在于阳性质控品由四种DNA和超纯水组成，分别为正常未孕女性血浆游离DNA、21三体综合征胎儿流产组织DNA、18三体综合征胎儿流产组织DNA、13三体综合征胎儿流产组织DNA片段；且阳性质控品的其制备方法为：
(1)取5～10例正常未孕女性血浆混合，抽提血浆游离DNA后测定DNA浓度；
(2)分别提取21、18和13三体综合征胎儿流产组织DNA，超声波打断成片段后E-gel回收160～200bp的片段并测DNA浓度；
(3)将各回收的流产组织DNA片段分别按比例加入混合血浆中；
(4)提取(3)中血浆游离总DNA，溶解入超纯水后制备成不同浓度的阳性质控品。
2.根据权利要求1所述的阳性质控品，其特征还在于所述“正常未孕女性血浆”为20～40周岁的染色体结构正常未孕女性的外周静脉血浆。
3.根据权利要求1所述的阳性质控品，其特征还在于制备方法步骤(3)中所述“混合血浆”为5～10例正常未孕女性血浆混合后的总血浆，步骤(4)中所述“血浆游离总DNA”为分别将21、18、13三体综合征胎儿流产组织DNA片段按比例加入到混合血浆后所得血浆中的所有DNA。
4.根据权利要求1和3所述的阳性质控品，其特征还在于将回收的各流产组织DNA片段分别按下列公式加入混合血浆中：
(其中：DNAT21、DNAT18、DNAT13分别为21、18、13三体综合征胎儿流产组织DNA打断回收后加入混合血浆中的DNA量，DNAMix为正常未孕女性混合血浆中游离的DNA量)。
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