CN107267628A - 胚胎植入前染色体异常检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胚胎植入前染色体异常检测试剂盒,其特征在于,本试剂盒由单细胞扩增试剂、片段化试剂、文库构建试剂、DNA纯化试剂和阴阳性质控品组成。本发明还公开了前述试剂盒的检测方法。与现有技术相比,本发明建立了一种利用胚胎囊胚期细胞进行植入前染色体检测的方法,采用了创新型的单细胞扩增技术,提高了单细胞扩增均一性(≥97%)和覆盖度(≥92%),具有检测快速、覆盖度广、分辨率高、精准度高和通量适中的优势。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体涉及一种胚胎植入前染色体异常检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
随着我国环境污染以及生育年龄推迟,不孕不育率越来越高。据统计,国内平均每8对育龄夫妇中就有1对不能正常受孕,因此越来越多的人选择辅助生殖技术,目前以试管婴儿为代表的体外授精技术已经成为不孕不育治疗的主流选择。美国疾病控制与预防中心(CDC)统计了2004年到2013年间进行辅助生殖助孕的周期数,到2013年,美国辅助生殖年周期数接近16万,其中进行试管婴儿的周期占其中的99%。但目前为止,即使是技术最好的辅助生殖中心,活产率也只有30%左右。其主要原因是由于胚胎染色体异常而导致反复植入失败,而通过对胚胎染色体进行植入前遗传学筛查,选择正常的胚胎进行移植,可以显著地提高辅助生殖的成活率。
在试管婴儿实施过程中,关键的一步是挑选出优质的胚胎进行植入,传统的方法主要是胚胎形态学观察,但是形态学观察的结果易受观察者主观影响,且各医疗机构评分系统标准不统一,通过植入前遗传学筛查可大大提高试管婴儿的妊娠率和活产率。目前,临床上进行植入前遗传学筛查的方法主要包括Fish,Array CGH等,然而这两种技术都存在一定的局限:FISH技术目前存在的问题在于通量低,一次只能检测几条染色体,且操作繁琐,受到荧光信号的影响,分辨率低;ArrayCGH的缺点在于只能检测已知的染色体异常,且在检测过程中需要加入对照样本,通过与对照样本的信号对比进行结果的分析,这种方法极大的受限于杂交信号的影响。而利用半导体高通量测序法进行植入前遗传学筛查,一次可以检测全部23对染色体,通过构建正常样本数据库进行样本分析,不需要每次检测都加入正常对照,检测的通量可达到25个样本以上一个反应且检测染色体异常的分辨率达到4M。该技术既弥补了FISH在准确度和检测通量方面的缺陷,又降低了单个样本的检测成本,同时提高了检测准确度,已经成为未来PGS检测的发展方向。
不同检测技术对比表
发明内容
本发明公开了一种胚胎植入前染色体异常检测试剂盒,以解决现有技术存在的操作繁琐,效率低下等问题。
本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种检测胚胎植入前染色体异常检测试剂盒,该试剂盒包括:单细胞扩增试剂、片段化试剂、文库构建试剂、DNA纯化试剂和阴阳性质控品;
其中,
所述的单细胞扩增试剂包括:细胞提取缓冲液310μl、细胞裂解缓冲液310μl、细胞裂解酶20μl、预扩增缓冲液300μl、预扩增酶20μl、扩增缓冲液1.5ml和扩增酶60μl;
所述的片段化试剂包括:片段化缓冲液120μl、片段化酶120μl和终止反应缓冲液300μl;
所述的文库构建试剂包括:末端修复缓冲液550μl、末端修复酶27μl、连接缓冲液275μl、DNA连接酶55μl、PCR酶混合液2.6ml、PCR引物混合液137μl、P1接头60μl、无核酸酶水3.8ml和特异性接头1~25各8μl;
单细胞扩增试剂、片段化试剂、文库构建试剂的主要组分如下表所示:
其中,
所述的DNA纯化试剂包括:DNA纯化磁珠20ml和DNA洗脱液7.8ml;
所述的阴阳性质控品包括:核型为21号染色体三体的阳性质控品1、核型为XO染色体异常的阳性质控品2和染色体正常的阴性质控品。
其中,所述的核型为21号染色体三体的阳性质控品由如下方法制备得到:
从核型为21号染色体三体的阳性细胞系样本中取3~5个细胞,在-80℃下密封保存备用。
其中,所述的核型为21号染色体三体的阳性细胞系样本由21三体核型细胞通过常规细胞培养方法进行复苏和传代培养所得。
其中,所述的核型为XO染色体异常的阳性质控品由如下方法制备得到:
从核型为XO染色体异常的阳性细胞系样本中取3~5个细胞,在-80℃下密封保存备用。
其中,所述的核型为XO染色体异常的阳性细胞系样本由XO核型细胞通过常规细胞培养方法进行复苏和传代培养所得。
其中,所述的染色体正常的阴性质控品由如下方法制备得到:
向1mLPBS缓冲液中加入被取样人的口腔细胞,200×g的离心力下离心5min后,弃上清,加入1mL PBS缓冲液,再在200×g的离心力下离心5min后,再次弃去上清,所得细胞重悬于PBS缓冲液中;从前述的细胞重悬液中吸取3个细胞,在-85~-75℃下密封保存备用;其中,所述的PBS缓冲液的浓度为10mmol/L。
其中,所述的被取样人为经体检不存在细胞染色体非整倍体异常的正常人。
其中,可用如下方法取得口腔细胞:
取样前,被取样人首先用清水漱口,然后用干净牙签刮取口腔细胞,即可得到。
上述试剂盒的检测方法,它包括如下步骤:
(1)单细胞全基因组扩增:包括依次进行的细胞裂解、预扩增、指数扩增和扩增产物纯化四步;
(2)单细胞扩增产物定量:使用Qubit荧光计和DNA浓度检测试剂盒检测步骤(1)中单细胞全基因组扩增后所得产物的浓度;
(3)基因组DNA片段化:取步骤(1)中所得产物300ng、片段化缓冲液2μl、片段化酶2μl和无核酸酶水,混合后离心,再于37℃下反应25min,反应结束后再加入5μl终止反应缓冲液,所得混合体系经DNA纯化磁珠和DNA洗脱液纯化后,得到片段化DNA样本;
其中,步骤(1)中所得产物和无核酸酶水的总体积为16μl;
(4)文库构建:包括依次进行的末端修复、DNA片段末端加接头、PCR扩增DNA片段和文库定量四步,各步的具体操作为:
末端修复:取步骤(3)中制备得到的片段化DNA样本30μl、末端修复缓冲液10μl、末端修复酶0.5μl和无核酸酶水9.5μl,混匀后离心,室温下反应30min;反应结束后所得产物经DNA纯化磁珠和DNA洗脱液纯化后得到平末端DNA;
DNA片段末端加接头:向平末端DNA样本中加入无核酸酶水10μl、连接缓冲液5μl、DNA连接酶1μl、P1接头1μl和特异性接头1μl;反应体系混匀后,室温下反应20min;反应结束后所得产物经磁珠法纯化后得到连接接头的DNA;
PCR扩增DNA片段:向连接接头的DNA样品中加入PCR酶混合液47.5μl和PCR引物混合液2.5μl,混合后进行PCR扩增,PCR扩增完成后经DNA纯化磁珠和DNA洗脱液纯化后于4℃下保存,得到文库样品;
文库定量:使用分光光度法或荧光定量PCR法检测各组文库样品浓度;
(5)测序:选择25个特异性接头各不相同的文库样本,吸取样本稀释到100pM,稀释倍数=Qubit浓度*107/660/300;从各组稀释后的文库样品中取5μl,混合后得到混合文库样本;混合文库样本利用市售的高通量测序通用试剂进行上机测序后,利用胚胎染色体非整倍体检测数据分析系统进行数据分析,得到每个测序样本每条染色体的拷贝数数值;若某条染色体的拷贝数数值大于等于0.37或者小于等于-0.51,则步骤(1)中的待检测的单细胞样本的该条染色体存在非整数倍体异常。
步骤(1)中,所述的细胞裂解的具体操作为:10μl反应体系:待检测的单细胞样本Xμl、细胞提取缓冲液5-Xμl、细胞裂解缓冲液4.8μl和细胞裂解酶0.2μl;其中,X不大于2.5;PCR反应条件:75℃10min,95℃4min,25℃保存,1个循环。
步骤(1)中,所述的预扩增的具体操作为:15μl反应体系:细胞裂解后样本10μl、预扩增缓冲液4.8μl和预扩增酶0.2μ;PCR反应条件:95℃2min,1个循环;95℃15s,15℃50s,25℃40s,35℃30s,65℃40s,75℃40s,12个循环;4℃保存,1个循环。
步骤(1)中,所述的指数扩增的具体操作为:75μl反应体系:预扩增后样本15μl、扩增缓冲液25μl、扩增酶0.8μl和无核酸酶水34.2μl;PCR反应条件:95℃2min,1个循环;95℃15s,65℃1min,75℃1min,14个循环;4℃保存,1个循环。
步骤(1)中,所述的扩增产物纯化的具体操作为:利用DNA纯化磁珠和DNA洗脱液将指数扩增后产物纯化。
本试剂盒和检测方法的质控标准如下:
1、阳性质控品1:以PGS阳性质控品1作为待检品,按照试剂盒说明书进行检测,检测结果应为21三体样本;
2、阳性质控品2:以PGS阳性质控品2作为待检品,按照试剂盒说明书进行检测,检测结果应为XO样本;
3、阴性质控品:以PGS阴性质控品作为待检品,按照试剂盒说明书进行检测,检测结果应为阴性。
以上三条必须同时满足,否则需要重新检测。
说明:阴/阳性质控品经过全基因组扩增后,取300ng扩增产物进行DNA片段化,剩余质控品可于-20℃保存6个月,全基因组扩增后的质控品DNA可用于多次质控。
本发明可用于35岁及以上的试管婴儿患者;3次及以上的试管婴儿植入失败者;3次及以上的自然流产患者;夫妻双方或一方存在染色体异常的患者;生育过染色体异常患儿的夫妇;希望提高试管婴儿成功率的夫妇等。本试剂盒可一次性检测样本的所有染色体非整倍体异常(包括单体、单体、微缺失微重复)。
检测结果仅供参考,不单独作为确诊的依据。
有益效果:
与现有技术相比,本发明具有如下优势:
(1)本发明建立了一种利用胚胎囊胚期细胞进行植入前染色体检测的方法,采用了创新型的单细胞扩增技术(Strand Displacement Whole Genome Amplification,SDWGA),提高了单细胞扩增均一性(≥97%)和覆盖度(≥92%),达到国际领先水平。
(2)本发明创新型的胚胎染色体非整倍体检测数据分析模型EDCBS(EuclideanDistance and Circular Binary Segmentation),降低了由扩增偏倚导致样本之间的分析偏差,使结果的准确达到了99%以上。
(3)本发明建立了科学的数据质控体系,通过构建最佳样本量的参考数据库,减少了由于单细胞扩增引起的偏倚误差,降低了检测结果的假阳性及假阴性率。对数据分析中GC校正、测序深度和CNV判断标准等质控指标进行深入研究,严格控制数据的质量,以此保证检测结果的可靠性。
(4)本发明检测快速,构建了全新的胚胎植入前检测流程,将检测周期从一周时间降低到一天,改变了传统检测模式。
(5)本发明应用面覆盖度广,一次性检测胚胎细胞全部23对染色体的非整倍体和微缺失微重复。
(6)本发明分辨率高,能够检测出大于4M新发的染色体微缺失/微重复和大于1M已知的染色体微缺失/微重复。
(7)本发明精准度高,染色体非整倍体检出率、特异性大于99%
(8)本发明通量适中,单次上机样本量灵活,非常适合医院的临床应用。
具体实施方式
实施例1胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒的制备及其使用
1、制备包括下列组成成分的试剂盒
1.1单细胞扩增试剂:细胞提取缓冲液(310μl/管)1管、细胞裂解缓冲液(310μl/管)1管、细胞裂解酶(20μl/管)1管、预扩增缓冲液(300μl/管)1管、预扩增酶(20μl/管)1管、扩增缓冲液(1.5ml/管)1管、扩增酶(60μl/管)1管。
1.2片段化试剂:片段化缓冲液(120μl/管)1管、片段化酶(120μl/管)1管、终止反应缓冲液(300μl/管)1管。
1.3文库构建试剂:末端修复缓冲液(550μl/管)1管、末端修复酶(27μl/管)1管、连接缓冲液(275μl/管)1管、DNA连接酶(55μl/管)1管、PCR酶混合液(1.3ml/管)2管、PCR引物混合液(137μl/管)1管、P1接头(60μl/管)1管及特异性接头1-25(8μl/管)各1管、无核酸酶水(1.9ml/管)2管。
1.4 DNA纯化试剂:DNA纯化磁珠(20ml/瓶)1瓶、DNA洗脱液(1.9ml/管)4管。
2、制备试剂盒质控品
制备以下核型的试剂盒阴阳性质控品:1管核型为21号染色体三体的阳性质控品1、1管核型为XO染色体异常的阳性质控品2以及1管染色体核型正常的阴性质控品。
2.1阳性质控品1和阳性质控品2的制备
1)收集培养的细胞系样本,将细胞密度调整为2~5×102个/ml。
2)吸取2ml上述细胞悬液于35mm培养皿中,置于倒置显微镜载物台上,调整焦距观察细胞。
3)取出特制的毛细玻璃管,与移卵器的一端相连,移卵器的另一端连上1ml滤芯枪头,以便通过嘴吸气和吹气控制毛细玻璃管移取液体的体积。
4)在倒置显微镜下,左手移动培养皿,右手持固定特制的毛细玻璃管的接头,轻轻晃动毛细玻管接头,以便在显微镜视野中找到毛细玻璃管的针口,然后将毛细玻璃管的针口对准要选取的细胞,嘴吸气和吹气控制毛细玻璃管移取液体的体积,轻轻吸取。在显微镜视野中可以观察到细胞被一个一个吸入毛细玻璃管中,依次吸取3~5个细胞,移取液体体积不超过2μl。若移取液体体积过大,将毛细玻璃管中的细胞重新吹出来,使所需移取的细胞聚在一起,而后通过毛细玻璃管再次逐个吸取3~5个细胞。
5)打开0.2ml进口EP管,将上步显微操作取得的细胞移至EP管底部,然后将EP管瞬时离心,使含有3~5个细胞的细胞悬液置于EP管底部。
6)将EP管用封口膜将管口封两圈(防止管口开裂),放置于2ml冻存管内,贴签。
7)制备好的质控品﹣20℃或﹣80℃长期保存。
2.2阴性质控品的制备
1)取样。在1.5mLEP管内预先加入1mL PBS缓冲液,取样前,被取样人首先用清水漱口,然后用干净牙签刮取口腔细胞,移至1.5mLEP管,将口腔细胞悬于PBS缓冲液中。以200×g的离心力离心5min,弃上清。再次加入1mL PBS缓冲液重悬细胞,以200×g的离心力离心5min,弃上清。
2)重悬。用PBS缓冲液重悬细胞,细胞计数,将细胞密度调整为2~5×102个/mL。
3)分装。吸取1mL细胞悬液于35mm培养皿中,置于倒置显微镜,调整焦距,观察细胞。取出特制的毛细玻璃管,与移卵器的一端相连,移卵器的另一端连上1mL枪头,以便控制毛细玻璃管移取液体的体积。在倒置显微镜下,左手移动培养皿,右手持固定特制的毛细玻璃管的接头,轻轻晃动毛细玻璃管接头,以便在显微镜视野中找到毛细玻璃管的针口,然后将毛细玻璃管的针口对准要选取的细胞,嘴控制毛细玻璃管移取液体的体积,轻轻吸取。在显微镜视野中可以观察到细胞一个一个被吸入毛细玻璃管中,逐次吸取3个细胞。
4)打开0.2mL进口EP管,将细胞液移至EP管底部,然后将EP管短暂离心,使含有3个细胞的细胞悬液置于EP管底部。用封口膜将管口封两圈(防止管口开裂),放置于2ml冻存管内,贴签。
5)制备好的质控品﹣20℃或﹣80℃长期保存。
3、检测方法
3.1试剂准备
准备试剂盒,每次配制反应液前取出相应的试剂置于冰盒上溶解后混匀备用。另外配制70%的酒精、准备DNA浓度检测试剂、测序通用试剂盒备用。
3.2单细胞全基因组扩增
3.2.1细胞裂解
1)将装有细胞样本的0.2mL PCR管短暂离心后,按照下表配制反应体系,混匀后离心,使液体处于管底。
组分 | 反应体积(μL) |
单细胞样本 | X(X≤2.5) |
细胞提取缓冲液 | 5-X |
细胞裂解缓冲液 | 4.8 |
细胞裂解酶 | 0.2 |
反应体系总量 | 10 |
2)设置PCR仪反应程序,按照如下条件进行孵育:
3.2.2预扩增
1)从PCR仪中取出反应结束的样本,按照下表配制反应体系,混匀后离心,使液体处于管底。
组分 | 反应体积(μL) |
裂解后的样本 | 10 |
预扩增缓冲液 | 4.8 |
预扩增酶 | 0.2 |
反应体系总量 | 15 |
2)设置PCR仪反应程序,按照如下条件进行孵育:
3.2.3指数扩增
1)从PCR仪中取出反应结束的样本,放置于冰上,按照下表配制反应体系,混匀后
离心,使液体处于管底。
组分 | 反应体积(μL) |
预扩增样本 | 15 |
扩增缓冲液 | 25 |
扩增酶 | 0.8 |
无核酸酶水 | 34.2 |
反应体系总量 | 75 |
2)设置PCR仪反应程序,按照如下条件进行孵育:
3.2.4扩增产物纯化
将扩增产物转移到1.5mL的EP管中,利用磁珠法进行纯化后,用33μL DNA洗脱液洗脱。
3.3单细胞扩增产物定量
使用分光光度法或荧光定量PCR法检测全基因组扩增产物的浓度。
3.4基因组DNA片段化
3.4.1 DNA片段化
1)在1.5mL的EP管中,按照下表配制片段化反应体系,混匀后离心,使液体处于管底。
组分 | 反应体积(μL) |
纯化后的DNA样本 | X(300ng) |
片段化缓冲液 | 2 |
无核酸酶水 | 16-X |
片段化酶 | 2 |
反应体系总量 | 20 |
2)将EP管放置在恒温金属浴中37℃反应25min。反应结束后加入5μL终止反应缓冲液。
3.4.2片段化后的DNA纯化
将片段化反应体系利用磁珠法进行纯化后,用33μL DNA洗脱液洗脱。
3.5文库构建
3.5.1末端修复
1)取出全基因扩增后片段化DNA样本,按照下表配制反应体系,混匀后离心,使液体处于管底,室温反应30分钟。
组分 | 反应体积(μL) |
片段化DNA | 30 |
末端修复缓冲液 | 10 |
末端修复酶 | 0.5 |
无核酸酶水 | 9.5 |
反应体系总量 | 50 |
2)反应结束后,利用磁珠法进行片段选择并纯化后,用33μL DNA洗脱液洗脱。
3.5.2 DNA片段末端加接头
1)根据下表向上步反应得到的平末端DNA中依次加入试剂,混匀,室温反应20分钟。注意:加入特异性接头X时须反复核对;每次只开一个管盖,谨防特异性接头之间交叉污染。
组分 | 反应体积(μL) |
平末端DNA | 32 |
无核酸酶水 | 10 |
连接缓冲液 | 5 |
DNA连接酶 | 1 |
P1接头 | 1 |
特异性接头X | 1 |
反应体系总量 | 50 |
2)反应结束后利用磁珠法进行纯化后,用15μL DNA洗脱液洗脱。
3.5.3 PCR扩增DNA片段
1)根据下表在PCR管中依次加入试剂,混匀后离心数秒,使液体处于管底。
组分 | 反应体积(μL) |
连接接头的DNA | 15 |
PCR酶混合液 | 47.5 |
PCR引物混合液 | 2.5 |
反应体系总量 | 65 |
2)将PCR管放入PCR仪按以下条件进行反应:72℃,20分钟;95℃,5分钟;(95℃15秒,62℃15秒,70℃1分钟)10个循环;70℃,5分钟;4℃保存。
3)根据样本数准备1.5mL EP管,编好相应的编号,PCR结束之后,取出PCR管,离心数秒,将PCR管中样本转移到对应编号的EP管中。
4)按照1:1.5的比例加入97.5μL DNA纯化磁珠,进行纯化后用22μL DNA洗脱液洗脱。
5)将建好的文库样品暂存于4℃冰箱中,等待文库定量。
3.5.4文库定量
使用Qubit荧光计和DNA浓度检测试剂盒对文库浓度。
3.6测序
1)文库稀释:根据Qubit检测结果,将样本进行稀释到100pM,稀释倍数=Qubit浓度*107/660/300
2)文库混合:稀释好的样本按照每个样本5μL等体积混合,注意混合样本的特异性接头不能重复。
3)推荐取8μL的混合文库样本进行上机测序,根据测序反应通用试剂盒(半导体法)操作说明书进行操作。
备注:100pM取8μL的上机量为推荐量,可根据测序仪的具体表现进行微调。3.7质控标准
1)阳性质控品1:以PGS阳性质控品1作为待检品,按照试剂盒说明书进行检测,检测结果应为21三体样本。
2)阳性质控品2:以PGS阳性质控品2作为待检品,按照试剂盒说明书进行检测,检测结果应为XO样本。
3)阴性质控品:以PGS阴性质控品作为待检品,按照试剂盒说明书进行检测,检测结果应为阴性。
以上三条必须同时满足,否则需要重新检测。
说明:阴/阳性质控品经过全基因组扩增后,取300ng扩增产物进行DNA片段化,剩余质控品可于-20℃保存6个月,全基因组扩增后的质控品DNA可用于多次质控。
3.8结果分析
利用胚胎染色体非整倍体检测数据分析系统进行数据分析,得到每个测序样本每条染色体的拷贝数(Copy Number Variation,简称CNV)数值,根据参考区间的参考范围进行结果判断。
3.9检测结果解释
1)若单细胞扩增失败,可能是在取样过程中没有取到细胞或者细胞丢失,由于无法再次取样,因此对于此类胚胎样本,需要临床医生结合其他指征决定是否植入。
2)若检测样本中的某条染色体的CNV数值≥0.37或者≤-0.51,则提示该样本存在该染色体非整倍体,不宜植入。若胚胎的所有染色体正常,在胚胎其他临床指征都正常的情况下可以植入。
实施例2特异性样本的检测
选取89种胚胎植入前染色体异常检测的企业参考品,包括72种阳性参考品(66个不同染色体CNV大小及三体细胞系样本和6个三体胚胎干细胞样本,共计72个样本),6种30%嵌合参考品,10种阴性参考品,1种数据质量控制参考品,每种类型样本各1例作为待检样本,参照实施例1中的试剂盒使用方法,对所有的样本进行全基因组扩增、片段化、文库构建后上机测序,同时进行阴阳性质控品的检测。
检测结果:阴阳性质控品全部符合,参考品中阳性样本全部检出、阴性样本全部符合、大于4M的嵌合参考品全部检出,所有样本均满足数据质量控制的要求(有效数据量大于1M,基因组覆盖率不低于4%)。具体检测结果如下表。
注:基本每个样本按照形式“序号+异常类型+异常大小”进行标号,如“1-del(3)-4.5M”代表1号样本核型为3号染色体缺失4.5M片段的参考品。
本次试验中89种企业参考品的检测结果与样本的核型完全吻合,说明利用本试剂盒检测胚胎植入前染色体非整倍体异常是可行的。本试剂盒操作简便,检测时间短,可实现高通量检测,加之其价格相对于传统检测方法成本低廉,适合植入前遗传学筛查的临床应用。
Claims (9)
1.一种胚胎植入前染色体异常检测试剂盒,其特征在于,本试剂盒包括单细胞扩增试剂、片段化试剂、文库构建试剂、DNA纯化试剂和阴阳性质控品;
其中,
所述的单细胞扩增试剂包括:细胞提取缓冲液310μl、细胞裂解缓冲液310μl、细胞裂解酶20μl、预扩增缓冲液300μl、预扩增酶20μl、扩增缓冲液1.5ml和扩增酶60μl;
所述的片段化试剂包括:片段化缓冲液120μl、片段化酶120μl和终止反应缓冲液300μl;
所述的文库构建试剂包括:末端修复缓冲液550μl、末端修复酶27μl、连接缓冲液275μl、DNA连接酶55μl、PCR酶混合液2.6ml、PCR引物混合液137μl、P1接头60μl、无核酸酶水3.8ml和特异性接头1~25各8μl;
所述的DNA纯化试剂包括:DNA纯化磁珠20ml和DNA洗脱液7.8ml;
所述的阴阳性质控品包括:核型为21号染色体三体的阳性质控品1、核型为XO染色体异常的阳性质控品2和染色体核型数目正常的阴性质控品。
2.根据权利要求1所述的胚胎植入前染色体异常检测试剂盒,其特征在于,所述的核型为21号染色体三体的阳性质控品由如下方法制备得到:
从核型为21号染色体三体的阳性细胞样本中取3~5个细胞,在-80℃下密封保存备用。
3.根据权利要求1所述的胚胎植入前染色体异常检测试剂盒,其特征在于,所述的核型为XO染色体异常的阳性质控品由如下方法制备得到:
从核型为XO染色体异常的阳性细胞样本中取3~5个细胞,在-80℃下密封保存备用。
4.根据权利要求1所述的胚胎植入前染色体异常检测试剂盒,其特征在于,所述的染色体正常的阴性质控品由如下方法制备得到:
向1mL PBS缓冲液中加入被取样人的口腔上皮细胞,200×g的离心力下离心5min后,弃上清,加入1mL PBS缓冲液,再在200×g的离心力下离心5min后,再次弃去上清,所得细胞重悬于PBS缓冲液中;从前述的细胞重悬液中吸取3个细胞,在-85~-75℃下密封保存备用;其中,所述的PBS缓冲液的浓度为10mmol/L。
5.采用权利要求1所述的试剂盒的检测方法,其特征在于,它包括如下步骤:
(1)单细胞全基因组扩增:包括依次进行的细胞裂解、预扩增、指数扩增和扩增产物纯化四步;
(2)单细胞扩增产物定量:使用Qubit荧光计和DNA浓度检测试剂盒检测步骤(1)中单细胞全基因组扩增后所得产物的浓度;
(3)基因组DNA片段化:取步骤(1)中所得产物300ng、片段化缓冲液2μl、片段化酶2μl和无核酸酶水,混合后离心,再于37℃下反应25min,反应结束后再加入5μl终止反应缓冲液,所得混合体系经DNA纯化磁珠和DNA洗脱液纯化后,得到片段化DNA样本;
其中,步骤(1)中所得产物和无核酸酶水的总体积为16μl;
(4)文库构建:包括依次进行的末端修复、DNA片段末端加接头、PCR扩增DNA片段和文库定量四步,各步的具体操作为:
末端修复:取步骤(3)中制备得到的片段化DNA样本30μl、末端修复缓冲液10μl、末端修复酶0.5μl和无核酸酶水9.5μl,混匀后离心,室温下反应30min;反应结束后所得产物经DNA纯化磁珠和DNA洗脱液纯化后得到平末端DNA;
DNA片段末端加接头:设置25组样品,每组取平末端DNA32μl、无核酸酶水10μl、连接缓冲液5μl、DNA连接酶1μl、P1接头1μl和特异性接头1μl;其中,序号1~25的特异性接头分别加入不同样品组中;每组样品混匀后,室温下反应20min;反应结束后所得产物经DNA纯化磁珠和DNA洗脱液纯化后得到25组连接接头的DNA;
PCR扩增DNA片段:取连接接头的DNA15μl、PCR酶混合液47.5μl和PCR引物混合液2.5μl,混合后进行PCR扩增,PCR扩增完成后经DNA纯化磁珠和DNA洗脱液纯化后于4℃下保存,得到25组文库样品;
文库定量:使用Qubit荧光计和DNA浓度检测试剂盒检测各组文库样品浓度;
(5)测序:选择25个特异性接头各不相同的文库样本,吸取样本稀释到100pM,稀释倍数=Qubit浓度*107/660/300;从各组稀释后的文库样品中取5μl,混合后得到混合文库样本;混合文库样本上机测序后,利用胚胎染色体非整倍体检测数据分析系统进行数据分析,得到每个测序样本每条染色体的拷贝数数值;若某条染色体的拷贝数数值大于等于0.37或者小于等于-0.51,则步骤(1)中的待检测的单细胞样本的该条染色体存在非整数倍体异常。
6.根据权利要求5所述的检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的细胞裂解的具体操作为:10μl反应体系:待检测的单细胞样本Xμl、细胞提取缓冲液5-Xμl、细胞裂解缓冲液4.8μl和细胞裂解酶0.2μl;其中,X不大于2.5;PCR反应条件:75℃10min,95℃4min,25℃保存,1个循环。
7.根据权利要求5所述的检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的预扩增的具体操作为:15μl反应体系:细胞裂解后样本10μl、预扩增缓冲液4.8μl和预扩增酶0.2μ;PCR反应条件:95℃2min,1个循环;95℃15s,15℃50s,25℃40s,35℃30s,65℃40s,75℃40s,12个循环;4℃保存,1个循环。
8.根据权利要求5所述的检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的指数扩增的具体操作为:75μl反应体系:预扩增后样本15μl、扩增缓冲液25μl、扩增酶0.8μl和无核酸酶水34.2μl;PCR反应条件:95℃2min,1个循环;95℃15s,65℃1min,75℃1min,14个循环;4℃保存,1个循环。
9.根据权利要求5所述的检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的扩增产物纯化的具体操作为:利用DNA纯化磁珠和DNA洗脱液将指数扩增后产物纯化。
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