CN109825575A - 辅助诊断结核病的miRNA标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了辅助诊断结核病的miRNA标志物及其应用。本发明要求保护用于检测血清外泌体中的miRNA的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为诊断或辅助诊断结核病患者或者所述产品的用途为诊断或辅助诊断活动性肺结核患者。所述miRNA为如下5种miRNA的任意一种或任意组合：miR‑28‑3p、miR‑193b‑5p、miR‑370‑3p、miR‑1246和miR‑2110。本发明还要求保护用于检测血清外泌体miRNA的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为诊断或辅助诊断结核潜伏感染者。所述miRNA为如下3种miRNA的任意一种或任意组合：let‑7e‑5p、let‑7d‑5p和miR‑140‑5p。本发明将为进一步建立结核病早期快速诊断技术和方法奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及辅助诊断结核病的miRNA标志物及其应用，具体涉及血清外泌体中辅助诊断结核病的miRNA标志物及其应用。
背景技术
目前结核病诊断的金标准是细菌学痰涂片镜检和痰培养。细菌学检测灵敏度低，耗时长，不利于各期结核病诊断与治疗。结核病易感人群(如儿童)往往因无法配合咳痰，痰标本采集困难。细菌学检测局限性更加明显。寻找除了痰之外其他的诊断标本非常必要，比如容易采集的血液。但血清和血浆成分复杂，而真正的特异性分子标识可能是微量的，这导致从血清或血浆中筛选结核病特异性分子标识的效果并不理想。
外泌体是细胞主动分泌的、大小为30-120nm的双层膜囊泡样小体，能够选择性包裹蛋白质、核酸和脂类，参与细胞之间物质运输及信号传递。它们广泛存在于生物体各种体液中，包括血液、尿液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、支气管肺泡灌洗液等。
发明内容
本发明的目的是提供辅助诊断结核病的miRNA标志物及其应用。
本发明要求保护用于检测血清外泌体中的miRNA的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为诊断或辅助诊断结核病患者。所述miRNA为如下5种miRNA的任意一种或任意组合：miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-370-3p、miR-1246和miR-2110。
本发明还要求保护用于检测血清外泌体中的miRNA的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为诊断或辅助诊断活动性肺结核患者。所述miRNA为如下5种miRNA的任意一种或任意组合：miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-370-3p、miR-1246和miR-2110。
本发明还要求保护用于检测血清外泌体miRNA的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为诊断或辅助诊断结核潜伏感染者。所述miRNA为如下3种miRNA的任意一种或任意组合：let-7e-5p、let-7d-5p和miR-140-5p。
本发明还保护特异miRNA或特异miRNA组合作为诊断标志物的应用；所述特异miRNA为如下5种miRNA的任意一种：miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-370-3p、miR-1246和miR-2110；所述特异miRNA组合为如下5种miRNA的任意组合：miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-370-3p、miR-1246和miR-2110；所述诊断标志物为结核病患者的诊断标志物或活动性肺结核患者的诊断标志物。所述特异miRNA为血清外泌体中的特异miRNA。所述特异miRNA组合为血清外泌体中的特异miRNA组合。
本发明还保护特异miRNA或特异miRNA组合作为诊断标志物的应用；所述特异miRNA为如下3种miRNA的任意一种：let-7e-5p、let-7d-5p和miR-140-5p；所述特异miRNA组合为如下3种miRNA的任意组合：let-7e-5p、let-7d-5p和miR-140-5p；所述诊断标志物为结核潜伏感染者的诊断标志物。所述特异miRNA为血清外泌体中的特异miRNA。所述特异miRNA组合为血清外泌体中的特异miRNA组合。
本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测血清外泌体中特异miRNA的物质或用于检测血清外泌体中特异miRNA组合的物质；所述特异miRNA为如下5种miRNA的任意一种：miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-370-3p、miR-1246和miR-2110；所述特异miRNA组合为如下5种miRNA的任意组合：miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-370-3p、miR-1246和miR-2110；所述试剂盒的用途为诊断或辅助诊断结核病患者或者所述试剂盒的用途为诊断或辅助诊断活动性肺结核患者。
本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测血清外泌体中特异miRNA的物质或用于检测血清外泌体中特异miRNA组合的物质；所述特异miRNA为如下3种miRNA的任意一种：let-7e-5p、let-7d-5p和miR-140-5p；所述特异miRNA组合为如下3种miRNA的任意组合：let-7e-5p、let-7d-5p和miR-140-5p；所述试剂盒的用途为诊断或辅助诊断结核潜伏感染者。
用于检测血清外泌体中的miRNA的物质具体为检测血清外泌体中的miRNA基因的相对表达水平的物质。所述相对表达水平为以U6基因为内参基因的相对表达水平。
let-7e-5p如序列表的序列1所示。
let-7d-5p如序列表的序列2所示。
miR-140-5p如序列表的序列3所示。
miR-1246如序列表的序列4所示。
miR-2110如序列表的序列5所示。
miR-370-3p如序列表的序列6所示。
miR-28-3p如序列表的序列7所示。
miR-193b-5p如序列表的序列8所示。
判断标准Ⅰ：将let-7e-5p诊断结核潜伏感染者的阈值设定为1.25，血清外泌体中该miRNA基因的相对表达水平大于等于阈值判断为结核潜伏感染者。
判断标准Ⅱ：将let-7d-5p诊断结核潜伏感染者的阈值设定为8.73，血清外泌体中该miRNA基因的相对表达水平大于等于阈值判断为结核潜伏感染者。
判断标准Ⅲ：将miR-140-5p诊断结核潜伏感染者的阈值设定为1.02，血清外泌体中该miRNA基因的相对表达水平大于等于阈值判断为结核潜伏感染者。
判断标准Ⅳ：将miR-28-3p诊断活动性肺结核患者的阈值设定为1.40，血清外泌体中该miRNA基因的相对表达水平大于等于阈值判断为活动性肺结核患者。
判断标准Ⅴ：将miR-193b-5p诊断活动性肺结核患者的阈值设定为2.30，血清外泌体中该miRNA基因的相对表达水平大于等于阈值判断为活动性肺结核患者。
判断标准Ⅵ：将miR-370-3p诊断活动性肺结核患者的阈值设定为1.14，血清外泌体中该miRNA基因的相对表达水平大于等于阈值判断为活动性肺结核患者)。
判断标准Ⅶ：将miR-1246诊断活动性肺结核患者的阈值设定为1.40，血清外泌体中该miRNA基因的相对表达水平大于等于阈值判断为活动性肺结核患者。
判断标准Ⅷ：将miR-2110诊断活动性肺结核患者的阈值设定为1.02，血清外泌体中该miRNA基因的相对表达水平大于等于阈值判断为活动性肺结核患者。
以上任一所述试剂盒还包括记载有以上任一所述判断标准的载体。
以上任一所述试剂盒还包括记载有以上判断标准Ⅰ、判断标准Ⅱ和判断标准Ⅲ的载体。
以上任一所述试剂盒还包括记载有以上判断标准Ⅳ、判断标准Ⅴ、判断标准Ⅵ、判断标准Ⅶ和判断标准Ⅷ的载体。
用于检测let-7e-5p基因的物质包括基因上游引物、5×miScript HiSpecBuffer、10×miScript Nucleics Mix、miScript Reverse Transcriptase Mix、2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和10×miScript Universal Primer。用于检测let-7e-5p基因的物质还包括U6基因上游引物。基因上游引物具体如序列表的序列9所示。U6基因上游引物具体如序列表的序列17所示。
用于检测let-7d-5p基因的物质包括基因上游引物、5×miScript HiSpecBuffer、10×miScript Nucleics Mix、miScript Reverse Transcriptase Mix、2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和10×miScript Universal Primer。用于检测let-7e-5p基因的物质还包括U6基因上游引物。基因上游引物具体如序列表的序列10所示。U6基因上游引物具体如序列表的序列17所示。
用于检测miR-140-5p基因的物质包括基因上游引物、5×miScript HiSpecBuffer、10×miScript Nucleics Mix、miScript Reverse Transcriptase Mix、2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和10×miScript Universal Primer。用于检测let-7e-5p基因的物质还包括U6基因上游引物。基因上游引物具体如序列表的序列11所示。U6基因上游引物具体如序列表的序列17所示。
用于检测miR-1246基因的物质包括基因上游引物、5×miScript HiSpec Buffer、10×miScript Nucleics Mix、miScript Reverse Transcriptase Mix、2×QuantiTectSYBR Green PCR Master Mix和10×miScript Universal Primer。用于检测let-7e-5p基因的物质还包括U6基因上游引物。基因上游引物具体如序列表的序列12所示。U6基因上游引物具体如序列表的序列17所示。
用于检测miR-2110基因的物质包括基因上游引物、5×miScript HiSpec Buffer、10×miScript Nucleics Mix、miScript Reverse Transcriptase Mix、2×QuantiTectSYBR Green PCR Master Mix和10×miScript Universal Primer。用于检测let-7e-5p基因的物质还包括U6基因上游引物。基因上游引物具体如序列表的序列13所示。U6基因上游引物具体如序列表的序列17所示。
用于检测miR-370-3p基因的物质包括基因上游引物、5×miScript HiSpecBuffer、10×miScript Nucleics Mix、miScript Reverse Transcriptase Mix、2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和10×miScript Universal Primer。用于检测let-7e-5p基因的物质还包括U6基因上游引物。基因上游引物具体如序列表的序列14所示。U6基因上游引物具体如序列表的序列17所示。
用于检测miR-28-3p基因的物质包括基因上游引物、5×miScript HiSpecBuffer、10×miScript Nucleics Mix、miScript Reverse Transcriptase Mix、2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和10×miScript Universal Primer。用于检测let-7e-5p基因的物质还包括U6基因上游引物。基因上游引物具体如序列表的序列15所示。U6基因上游引物具体如序列表的序列17所示。
用于检测miR-193b-5p基因的物质包括基因上游引物、5×miScript HiSpecBuffer、10×miScript Nucleics Mix、miScript Reverse Transcriptase Mix、2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和10×miScript Universal Primer。用于检测let-7e-5p基因的物质还包括U6基因上游引物。基因上游引物具体如序列表的序列16所示。U6基因上游引物具体如序列表的序列17所示。
外泌体内成分简单，携带着细胞在当时生理条件下的特殊信息，保护核酸不被降解，是理想的分子标识载体。本发明的发明人采用高通量RNA-seq技术，描绘了健康人、结核潜伏感染人群及活动性结核病患者血清外泌体miRNA表达谱，发现健康人、结核潜伏感染人群及活动性结核病患者血清外泌体miRNA表达谱显著不同，具有可区分的表达谱差异。进一步的，本发明的发明人分析了三组样本间的差异表达miRNA并分别筛选出结核潜伏感染人群(LTBI)及活动性结核病患者(TB)血清外泌体特异性表达miRNA。本发明为进一步建立结核病早期快速诊断技术和方法奠定了基础。
附图说明
图1为外泌体在透射电子显微镜下的照片。
图2为外泌体标志物胶体金免疫电镜照片。
图3为对三组样本血清外泌体miRNA数据进行两两比对分析(差异倍数≥2，q值<0.05)并绘制热图的结果。
图4为对特异性表达miRNA的分析结果。
图5为let-7e-5p的结果。
图6为let-7d-5p的结果。
图7为miR-140-5p的结果。
图8为miR-28-3p的结果。
图9为miR-193b-5p的结果。
图10为miR-370-3p的结果。
图11为miR-1246的结果。
图12为miR-2110的结果。
图13为miR-450a-5p的结果。
图14为miR-30c-2-3p的结果。
图15为miR-30a-3p的结果。
图16为miR-31-3p的结果。
图17为miR-143-5p的结果。
图18为miR-3928-3p的结果。
图19为miR-3150a-5p的结果。
图20为miR-3150b-3p的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
遵循赫尔辛基宣言(Helsinki Declaration)的道德标准，符合医学伦理学规范，通过了首都医科大学附属北京胸科医院伦理委员会审查，所有受试者均签署了知情同意书。健康者同时满足如下四个条件：①结核菌素皮试(TST)硬结直径<5mm；②γ干扰素释放试验(IGRA)检测阴性；③无活动性结核和其他疾病病史；④胸片检查无异常。结核潜伏感染者同时满足如下四个条件：①结核菌素皮试(TST)硬结直径>10mm；②γ干扰素释放试验(IGRA)检测阳性；③无活动性结核和其他疾病病史；④胸片检查无异常。活动性肺结核患者同时满足如下三个条件：①具有肺结核临床症状；②胸部X线有结核病变；③痰集菌连续至少两次(+)和痰结核分枝杆菌培养阳性。
实施例1、可作为诊断标志物的miRNA的发现
健康人群组(HC)由60例健康者组成。结核潜伏感染人群组(LTBI)由60例结核潜伏感染者组成。活动性肺结核人群组(ATB)由60例活动性肺结核患者组成。
一、制备样品池
分别采集健康人群组60例健康者的血清，将血清混合(1ml/每例)，得到健康人群组样品池。分别采集结核潜伏感染人群组60例结核潜伏感染者的血清，将血清混合(1ml/每例)，得到结核潜伏感染人群组样品池。分别采集活动性肺结核人群组60例活动性肺结核患者的血清，将血清混合(1ml/每例)，得到活动性肺结核人群组样品池。
二、提取外泌体
每个样品池分别提取外泌体。
1、取样品池，1000g离心15min，收集上清液。
2、取步骤1得到的上清液，4℃、16500g离心30min，收集上清液。
3、取步骤2得到的上清液，用0.22μm孔径的滤膜过滤，收集滤液。
4、取步骤3得到的滤液，4℃、120000g离心3h，弃除上清，将离心管倒扣在吸水纸上沥干管壁上的液体，附着于离心管底部的沉淀即为外泌体沉淀。
采用透射电子显微镜对外泌体进行形态观察。采用NanoSight NS300颗粒跟踪分析仪对外泌体进行形态及粒径分布检测。在透射电子显微镜下的照片见图1。外泌体呈圆形囊泡结构，大小均一，直径约100nm，HC、LTBI和ATB的外泌体的粒径峰值依次为95nm、105nm和117nm。
采用胶体金标记的抗体(均为市售)检测外泌体标志物，照片见图2。
三、提取RNA
取步骤二得到的外泌体沉淀，提取RNA。
通过1％琼脂糖凝胶电泳分析RNA纯度及完整性，通过Agilent 2100精确定量并检测RNA长度分布情况。符合质检要求的RNA满足如下标准：插入片段大小合格，峰型单一，无杂峰，无接头和无引物二聚体，qPCR检测浓度≥2nM。
四、RNA测序及数据分析
1、符合质检要求的RNA通过RNA文库构建试剂盒构建用于二代测序的cDNA文库。
RNA文库构建试剂盒:Library Preparation-NEBNext Multiplex Small RNASample Prep Set for Illumina,NEB，货号E7580。网址：https://international.neb.com/protocols/2013/06/04/library-preparation-e7580。
2、使用测序仪Illumina HiseqTM 2500-SE50进行RNA-seq测序，获得原始数据。
3、数据分析
原始数据进行如下处理：去除低质量reads(质量值sQ≤5的碱基数占整个read的50％以上的reads)；去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10％的reads；去除有5’接头污染的reads；去除没有3’接头序列和插入片段的reads；trim掉3’接头序列；去除polyA/T/G/C的reads(大部分连续的polyA/T/G/C，可能来源于测序错误，且信息熵低，可以不做分析)。最终得到clean reads。
使用软件Bowtie(Langmead et al.,2009)将不同样本过滤后的clean reads定位到hg38基因组上。匹配上的small RNA标签通过miRBase20.0数据库搜索miRNA(包括现有数据库中的miRNA以及自行发掘的miRNA)，对可能的miRNA进行预测和二级结构分析。RepeatMasker软件进一步对small RNA标签进行非编码序列(repeat sequences,rRNA,tRNA,snRNA,and snoRNA)的去除。通过将测序数据比对到人的参考基因组(hg38)。得到了三组人群血清外泌体的small RNA表达谱，健康人群组、结核潜伏感染人群组及活动性结核病患者人群组中分别鉴定出9584942个、778169个和10581000个small RNA序列标签，其中分别有688个、612个和1198个是miRNA序列。
miRNA的表达量用TPM(transcript per million)值计量。TPM值＝匹配reads数/总reads数*1000000。通过DEGseq(2010)R软件包比较不同样本之间差异表达的miRNA，以q值<0.05和|log2(foldchange)|>1作为显著差异表达基因的筛选标准。对三组样本血清外泌体miRNA数据进行两两比对分析(差异倍数≥2，q值<0.05)并绘制热图，见图3。健康人群组、结核潜伏感染人群组及活动性结核病患者人群组血清外泌体中共有250个差异表达miRNA。其中，对特异性表达miRNA的分析显示(见图4)：健康人群组样本中有45个特异性表达的miRNA，结核潜伏感染人群组样本中有18个特异性表达的miRNA，活动性结核病患者人群组样本中有67个特异性表达的miRNA。
结核潜伏感染人群组(LTBI)血清外泌体前十位特异性表达的miRNA如下：let-7e-5p、let-7d-5p、miR-450a-5p、miR-30c-2-3p、miR-140-5p、miR-378a-5p、miR-30a-3p、let-7d-3p、miR-31-3p、miR-143-5p。
活动性结核病患者人群组(TB)血清外泌体前十位特异性表达的miRNA如下：miR-1246、miR-2110、miR-370-3p、novel_47、novel_114、miR-3928-3p、miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-3150a-5p、miR-3150b-3p。
20种miRNA的序列以及TPM值见表1。
表1
实施例2、从20种miRNA中进一步筛选可以作为诊断标志物的miRNA
受试者：10例健康者、10例结核潜伏感染者、10例活动性肺结核患者。
一、提取外泌体
每个受试者分别提取血清外泌体。
1、取受试者的血清，1000g离心15min，收集上清液。
2、取步骤1得到的上清液，4℃、16500g离心30min，收集上清液。
3、取步骤2得到的上清液，用0.22μm孔径的滤膜过滤，收集滤液。
4、取步骤3得到的滤液，4℃、120000g离心3h，弃除上清，将离心管倒扣在吸水纸上沥干管壁上的液体，附着于离心管底部的沉淀即为外泌体沉淀。
二、检测外泌体中miRNA的水平
1、取步骤一得到的外泌体沉淀，提取RNA，反转录得到cDNA。
反转录的反应体系(20μL)：含4μL 5×miScript HiSpec Buffer、2μL 10×miScript Nucleics Mix、2μL miScript Reverse Transcriptase Mix、1μg总RNA，用RNase-free water补足体积。5×miScript HiSpec Buffer、10×miScript Nucleics Mix和miScript Reverse Transcriptase Mix均为miScript Ⅱ RT Kit(QIAGEN公司，货号218161)中的组件。反转录体系中具有商品化的引物，在完成反转录的同时给反转录产物增加了通用标签。
反转录的反应条件：37℃60min；95℃5min。
完成反应后，向反应体系中加入200μL ddH2O，混匀，即为产物，4℃保存。
2、以cDNA为模板，通过荧光定量PCR分别检测20种miRNA基因。
采用U6基因为内参基因。用于检测U6基因的上游引物为T6-F。T6-F(序列表的序列17)：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。
用于检测miRNA基因上游引物为每种miRNA对应的DNA。检测let-7e-5p基因采用的上游引物为TGAGGTAGGAGGTTGTATAGTT(序列9，即将序列1中的U替换为T)。检测let-7d-5p基因采用的上游引物为AGAGGTAGTAGGTTGCATAGTT(序列10，即将序列2中的U替换为T)。检测miR-140-5p基因采用的上游引物为CAGTGGTTTTACCCTATGGTAG(序列11，即将序列3中的U替换为T)。检测miR-1246基因采用的上游引物为AATGGATTTTTGGAGCAGG(序列12，即将序列4中的U替换为T)。检测miR-2110基因采用的上游引物为TTGGGGAAACGGCCGCTGAGTG(序列13，即将序列5中的U替换为T)。检测miR-370-3p基因采用的上游引物为GCCTGCTGGGGTGGAACCTGGT(序列14，即将序列6中的U替换为T)。检测miR-28-3p基因采用的上游引物为CACTAGATTGTGAGCTCCTGGA(序列15，即将序列7中的U替换为T)。检测miR-193b-5p基因采用的上游引物为CGGGGTTTTGAGGGCGAGATGA(序列16，即将序列8中的U替换为T)。检测其他miRNA基因的上游引物规则同上。
荧光定量PCR的反应体系(25μL)：12.5μL 2×QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix、2.5μL 10×miScript Universal Primer、2.5μL上游引物溶液、2.5μL步骤1的产物(模板)，5μL RNase-free water。2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和10×miScript Universal Primer均为miScript SYBR Green PCR Kit(QIAGEN公司，货号218076)的组件。反应体系中，上游引物的浓度为1μM。设置不加入模板的阴性对照。10×miScript Universal Primer提供与通用标签对应的通用下游引物。
荧光定量PCR的反应条件：95℃预变性15min；94℃变性15s、55℃退火30s、70℃扩增30s，40个循环。荧光定量PCR采用ABI7500实时荧光定量PCR仪。
用ABI7500software v2.0.6对实时荧光定量PCR的结果进行分析，以U6基因为内参基因，通过2-△Ct的方法计算miRNA的相对丰度(2-△ct×104)。
图5至图20的纵坐标均为相对表达水平。
let-7e-5p的结果见图5和表1。将let-7e-5p诊断结核潜伏感染者的阈值设定为1.25(大于等于阈值判断为结核潜伏感染者)，诊断结核潜伏感染者的假阴性率为30％、从健康者中诊断结核潜伏感染者的假阳性率为30％。
let-7d-5p的结果见图6和表2。将let-7d-5p诊断结核潜伏感染者的阈值设定为8.73(大于等于阈值判断为结核潜伏感染者)，诊断结核潜伏感染者的假阴性率为40％、从健康者中诊断结核潜伏感染者的假阳性率为10％。
miR-140-5p的结果见图7和表3。将miR-140-5p诊断结核潜伏感染者的阈值设定为1.02(大于等于阈值判断为结核潜伏感染者)，诊断结核潜伏感染者的假阴性率为10％、从健康者中诊断结核潜伏感染者的假阳性率为0％。
miR-28-3p的结果见图8和表4。将miR-28-3p诊断活动性肺结核患者的阈值设定为1.40(大于等于阈值判断为活动性肺结核患者)，诊断活动性肺结核患者的假阴性率为0％、从健康者中诊断活动性肺结核患者的假阳性率为0％、从结核潜伏感染者中诊断活动性肺结核患者的假阳性率为0％。
miR-193b-5p的结果见图9和表5。将miR-193b-5p诊断活动性肺结核患者的阈值设定为2.30(大于等于阈值判断为活动性肺结核患者)，诊断活动性肺结核患者的假阴性率为0％、从健康者中诊断活动性肺结核患者的假阳性率为0％、从结核潜伏感染者中诊断活动性肺结核患者的假阳性率为0％。
miR-370-3p的结果见图10和表6。将miR-370-3p诊断活动性肺结核患者的阈值设定为1.14(大于等于阈值判断为活动性肺结核患者)，诊断活动性肺结核患者的假阴性率为0％、从健康者中诊断活动性肺结核患者的假阳性率为0％、从结核潜伏感染者中诊断活动性肺结核患者的假阳性率为0％。
miR-1246的结果见图11和表7。将miR-1246诊断活动性肺结核患者的阈值设定为1.40(大于等于阈值判断为活动性肺结核患者)，诊断活动性肺结核患者的假阴性率为0％、从健康者中诊断活动性肺结核患者的假阳性率为0％、从结核潜伏感染者中诊断活动性肺结核患者的假阳性率为0％。
miR-2110的结果见图12和表8。将miR-2110诊断活动性肺结核患者的阈值设定为1.02(大于等于阈值判断为活动性肺结核患者)，诊断活动性肺结核患者的假阴性率为10％、从健康者中诊断活动性肺结核患者的假阳性率为0％、从结核潜伏感染者中诊断活动性肺结核患者的假阳性率为0％。
miR-450a-5p、miR-30c-2-3p、miR-378a-5p、miR-30a-3p、let-7d-3p、miR-31-3p、miR-143-5p，均无法有效诊断结核潜伏感染者。miR-450a-5p的结果见图13。miR-30c-2-3p的结果见图14。miR-30a-3p的结果见图15。miR-31-3p的结果见图16。miR-143-5p的结果见图17。
novel_47、novel_114、miR-3928-3p、miR-3150a-5p、miR-3150b-3p，均无法有效诊断活动性结核病患者。miR-3928-3p的结果见图18。miR-3150a-5p的结果见图19。miR-3150b-3p的结果见图20。
表1 let-7e-5p在血清外泌体中的相对丰度
| 健康者 | 结核潜伏感染者 | 活动性肺结核患者 |
| 0.9410619 | 2.105075 | 1.708003 |
| 0.5258543 | 5.687541 | 0.0579034 |
| 2.676468 | 2.901864 | 0.6324502 |
| 0.302305 | 2.903952 | 0.000000 |
| 0.8373953 | 3.457224 | 0.6786264 |
| 2.322879 | 0.6707156 | 0.3439453 |
| 0.8209958 | 1.744439 | 0.1001918 |
| 0.1601821 | 1.439664 | 1.247123 |
| 0.7510501 | 0.4203193 | 0.8170727 |
| 1.513278 | 0.7819517 | 0.000000 |
表2 let-7d-5p在血清外泌体中的相对丰度
| 健康者 | 结核潜伏感染者 | 活动性肺结核患者 |
| 6.343293 | 10.107080 | 7.297814 |
| 1.907013 | 31.589830 | 0.4140489 |
| 15.711650 | 18.448960 | 1.935005 |
| 1.409408 | 27.984440 | 0.000000 |
| 3.028903 | 18.188660 | 2.712995 |
| 8.725217 | 4.635482 | 2.561687 |
| 8.127826 | 12.730670 | 1.014315 |
| 1.976903 | 3.214354 | 6.696028 |
| 4.038034 | 1.857294 | 4.290594 |
| 6.736473 | 2.946103 | 0.000000 |
表3 miR-140-5p在血清外泌体中的相对丰度
| 健康者 | 结核潜伏感染者 | 活动性肺结核患者 |
| 0.3458147 | 2.162691 | 1.011208 |
| 0.4466698 | 5.746572 | 0.02499247 |
| 0.9442623 | 5.119142 | 0.1951876 |
| 0.08345439 | 6.892261 | 0.000000 |
| 0.3889703 | 5.937011 | 0.1127444 |
| 0.7657406 | 1.802819 | 0.3788507 |
| 0.847291 | 3.224266 | 0.007877136 |
| 0.09178424 | 2.223135 | 0.7321143 |
| 0.7192042 | 0.7746133 | 0.4343818 |
| 0.428146 | 1.026747 | 0.000000 |
表4 miR-28-3p在血清外泌体中的相对丰度
| 健康者 | 结核潜伏感染者 | 活动性肺结核患者 |
| 0.7951865 | 0.5024081 | 3.981208 |
| 0.1850314 | 0.000000 | 4.479003 |
| 0.7559223 | 0.2520717 | 5.463334 |
| 0.04615394 | 0.000000 | 6.430764 |
| 0.2785765 | 0.4315141 | 6.316029 |
| 0.8658076 | 0.000000 | 1.914584 |
| 0.4877219 | 0.07342342 | 1.928942 |
| 0.6398699 | 0.5045367 | 2.398396 |
| 0.5260894 | 0.4300618 | 1.412792 |
| 0.5981809 | 0.000000 | 2.411378 |
表5 miR-193b-5p在血清外泌体中的相对丰度
| 健康者 | 结核潜伏感染者 | 活动性肺结核患者 |
| 1.348128 | 1.221510 | 2.830096 |
| 0.2376548 | 0.08123808 | 10.450290 |
| 1.231885 | 0.5516616 | 7.559833 |
| 0.1809933 | 0.000000 | 9.330427 |
| 0.5341123 | 0.6460146 | 5.399077 |
| 1.059063 | 0.6576812 | 3.404531 |
| 1.191686 | 0.1560114 | 3.494621 |
| 0.1584256 | 1.229990 | 3.505606 |
| 1.001085 | 0.548095 | 3.241221 |
| 1.551629 | 0.000000 | 2.330689 |
表6 miR-370-3p在血清外泌体中的相对丰度
表7 miR-1246在血清外泌体中的相对丰度
| 健康者 | 结核潜伏感染者 | 活动性肺结核患者 |
| 0.2246684 | 0.594228 | 3.836896 |
| 0.06689401 | 0.05594233 | 2.912880 |
| 0.8979955 | 0.2208801 | 4.803646 |
| 0.06858411 | 0.003235086 | 2.460342 |
| 0.1423701 | 0.1298135 | 4.272040 |
| 0.5789711 | 0.1943623 | 2.417625 |
| 0.3459181 | 0.1021396 | 3.388250 |
| 0.147022 | 1.077374 | 6.544519 |
| 0.2516907 | 1.359462 | 3.242991 |
| 0.6479151 | 0.000000 | 3.569066 |
表8 miR-2110在血清外泌体中的相对丰度
| 健康者 | 结核潜伏感染者 | 活动性肺结核患者 |
| 0.3458147 | 1.011208 | 2.162691 |
| 0.4466698 | 0.02499247 | 5.746572 |
| 0.9442623 | 0.1951876 | 5.119142 |
| 0.08345439 | 0.000000 | 6.892261 |
| 0.3889703 | 0.1127444 | 5.937011 |
| 0.7657406 | 0.3788507 | 1.802819 |
| 0.847291 | 0.007877136 | 3.224266 |
| 0.09178424 | 0.7321143 | 2.223135 |
| 0.7192042 | 0.4343818 | 0.7746133 |
| 0.428146 | 0.000000 | 1.026747 |
以上验证发现：可作为LTBI诊断标志物的miRNA有let-7e-5p、let-7d-5p、miR-140-5p；可作为TB诊断标志物的miRNA有miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-370-3p、miR-1246、miR-2110。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京胸科医院
<120> 辅助诊断结核病的miRNA标志物及其应用
<130> GNCYX190526
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ugagguagga gguuguauag uu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
agagguagua gguugcauag uu 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cagugguuuu acccuauggu ag 22
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
aauggauuuu uggagcagg 19
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
uuggggaaac ggccgcugag ug 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
gccugcuggg guggaaccug gu 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
cacuagauug ugagcuccug ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
cgggguuuug agggcgagau ga 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
tgaggtagga ggttgtatag tt 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
agaggtagta ggttgcatag tt 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
cagtggtttt accctatggt ag 22
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
aatggatttt tggagcagg 19
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
ttggggaaac ggccgctgag tg 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
gcctgctggg gtggaacctg gt 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
cactagattg tgagctcctg ga 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
cggggttttg agggcgagat ga 22
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
ctcgcttcgg cagcaca 17
Claims (10)
1.用于检测血清外泌体中的miRNA的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为诊断或辅助诊断结核病患者。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述miRNA为如下5种miRNA的任意一种或任意组合：miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-370-3p、miR-1246和miR-2110。
3.用于检测血清外泌体中的miRNA的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为诊断或辅助诊断活动性肺结核患者。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述miRNA为如下5种miRNA的任意一种或任意组合：miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-370-3p、miR-1246和miR-2110。
5.用于检测血清外泌体miRNA的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为诊断或辅助诊断结核潜伏感染者。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述miRNA为如下3种miRNA的任意一种或任意组合：let-7e-5p、let-7d-5p和miR-140-5p。
7.特异miRNA或特异miRNA组合作为诊断标志物的应用；所述特异miRNA为如下5种miRNA的任意一种：miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-370-3p、miR-1246和miR-2110；所述特异miRNA组合为如下5种miRNA的任意组合：miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-370-3p、miR-1246和miR-2110；所述诊断标志物为结核病患者的诊断标志物或活动性肺结核患者的诊断标志物。
8.特异miRNA或特异miRNA组合作为诊断标志物的应用；所述特异miRNA为如下3种miRNA的任意一种：let-7e-5p、let-7d-5p和miR-140-5p；所述特异miRNA组合为如下3种miRNA的任意组合：let-7e-5p、let-7d-5p和miR-140-5p；所述诊断标志物为结核潜伏感染者的诊断标志物。
9.一种试剂盒，包括用于检测血清外泌体中特异miRNA的物质或用于检测血清外泌体中特异miRNA组合的物质；所述特异miRNA为如下5种miRNA的任意一种：miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-370-3p、miR-1246和miR-2110；所述特异miRNA组合为如下5种miRNA的任意组合：miR-28-3p、miR-193b-5p、miR-370-3p、miR-1246和miR-2110；所述试剂盒的用途为诊断或辅助诊断结核病患者或者所述试剂盒的用途为诊断或辅助诊断活动性肺结核患者。
10.一种试剂盒，包括用于检测血清外泌体中特异miRNA的物质或用于检测血清外泌体中特异miRNA组合的物质；所述特异miRNA为如下3种miRNA的任意一种：let-7e-5p、let-7d-5p和miR-140-5p；所述特异miRNA组合为如下3种miRNA的任意组合：let-7e-5p、let-7d-5p和miR-140-5p；所述试剂盒的用途为诊断或辅助诊断结核潜伏感染者。
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