CN110205378B - 一组脊柱结核血浆miRNA联合诊断标记物及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开一组脊柱结核血浆miRNA联合诊断标记物，所述联合诊断标记物包括以下组分中的至少一种：hsa‑miR‑543、hsa‑miR‑506‑3p和hsa‑miR‑195‑5p，其中，hsa‑miR‑543的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，hsa‑miR‑506‑3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，hsa‑miR‑195‑5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述联合诊断标记物联合能够用作筛查脊柱结核的标志物，联合血浆中所述联合诊断标记物能够准确标记感染脊柱结核的血浆。

Description

一组脊柱结核血浆miRNA联合诊断标记物及其应用

技术领域

本申请属于分子生物学领域，特别涉及一种用于脊柱结核联合标记物及其应用。

背景技术

近年来随着流动人口的增多、耐药结核杆菌的出现以及获得性自身免疫缺陷病的流行，结核病的发病率逐年上升，2014年全球新发结核病960万例，中国新发结核病93万例，位居全球第三位。研究表明90％以上的骨关节结核来源于肺结核，脊柱结核约占所有结核病的5％。

目前，脊柱结核的诊断主要依靠临床表现和影像学改变，再辅以各种肺结核病的实验室检查。然而，这些诊疗策略存在着诸多不足，例如，近年的许多研究指出，仅凭临床表现、影像学检查资料的诊断作用很有限，难于将结核与化脓性感染、真菌性感染或者骨肿瘤相鉴别；并且，由于约占脊柱结核11.5％的“非典型性脊柱结核”以及约占骨关节结核14.29％的非结核分枝杆菌病的存在，使脊柱结核的诊断更为困难。目前仍缺乏对脊柱结核特异性的实验室诊断方法。结核病诊断的“金标准”为细菌培养，但其培养阳性率仅为48％，且需要耗时6～8周，同时存在术前培养标本难获取的问题。组织病理学对脊柱结核的诊断率约为68％，干酪样物质与郎罕氏细胞亦可出现在非结核分枝杆菌病，从而导致误诊。诊断肺结核常用的实验室检测方法，例如，结核菌素实验、抗结核抗体检测、结核杆菌PCR检测以及γ-干扰素释放实验等均存在着假阳性、假阴性的结果。综上所述，目前尚缺乏能够准确、特异性诊断脊柱结核的技术手段。开发一种脊柱结核特异性生物标记物具有重要的科学意义与社会意义。

血浆miRNA具备高度的生物稳定性、组织特异性、时空特异性、易于检测等特点，具备作为疾病诊断标记物的先天条件。近年来随着对微小RNA(microRNA，miRNA)研究的不断深入，研究者通过核酸组学(Omics)研究证实miRNA可作为用于诊断肺结核及其它许多疾病的生物标记物，并且，一部分miRNA正在被开发为商品。因此，期待以miRNA为突破口，寻找可用于脊柱结核诊断的特异性生物诊断标记物。

发明内容

本申请对入选的脊柱结核患者分别进行血浆miRNA的基因芯片检测、RT-qPCR大样本临床验证，从而最终获得一组脊柱结核特异性血浆miRNA联合诊断标记物以及包括所述联合诊断标记物的试剂盒，所述联合诊断标记物包括以下组分：hsa-miR-543、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-195-5p，其中，hsa-miR-543的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，hsa-miR-506-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，hsa-miR-195-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本申请的目的在于提供以下几个方面：

第一方面，本申请提供一组脊柱结核血浆miRNA联合诊断标记物，所述联合诊断标记物包括以下组分中的至少一种：hsa-miR-543、miRNA-506-3p和hsa-miR-195-5p，其中，hsa-miR-543的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，miRNA-506-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，hsa-miR-195-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

通过后续实验，发明人发现hsa-miR-543的靶蛋白为RANKL，该基因能够通过OPG/RANKL/RANK信号通路调节破骨细胞的活化与增值。并且，本发明研究发现，在血液样本中，相对健康人群，hsa-miR-543在脊柱结核患者血液中显著下降，其灵敏度可达68.7％，特异性可达83.1％。因此，所述hsa-miR-543可用于脊柱结核筛查。

发明人通过生物信息学预测，发明人发现hsa-miR-195-5p可靶向调控FGF2的表达以调节破骨细胞的分化以及骨吸收功能，本发明研究发现，在血液样本中，相对健康人群，miRNA-506-3p在脊柱结核患者血液中显著下降，其灵敏度可达81.3％，特异性可达66.7％。因此，所述miRNA-506-3p可用于脊柱结核筛查。

同样地，通过生物信息学预测，发明人发现miRNA-506-3p可靶向调控OSBPL3的表达，该蛋白能够促进成骨细胞的分化和骨生成。并且，本发明研究发现，在血液样本中，相对健康人群，hsa-miR-195-5p在脊柱结核患者血液中显著升高，故miRNA-506-3p的升高会促使OSBPL3蛋白表达减少，导致骨破坏增加。本研究表明其灵敏度可达73.3％，特异性可达72.0％。因此，所述hsa-miR-195-5p可用于脊柱结核筛查。

本申请人发现，使用三种组分联合标记，其灵敏度可达80.5％，特异性可达80.0％。

第二方面，本申请还提供第一方面所述脊柱结核血浆联合诊断标记物用作筛查脊柱结核的标志物的用途。

本申请人发现，所述脊柱结核血浆联合诊断标记物中每种组分对脊柱结核杆均具有一定的诊断效率，但是单独使用任意一种组分用于诊断脊柱结核，其敏感度和特异度均不十分理想，但是联合三种组分则能够达到理想的诊断效率。

在本申请中，所述脊柱结核血浆联合诊断标记物可以使用包括以下步骤的方法诊断脊柱结核：

步骤1，抽取静脉血；

步骤2，分离血浆并对血浆中的miRNA进行分离；

步骤3，使用qRT-PCR技术检测步骤2所分离得到的hsa-miR-543、miRNA-506-3p和hsa-miR-195-5pmiRNA的相对表达量。

在本申请中，步骤2中分离血浆的方法为：使用EDTA负压抽血管抽取静脉血后置于4℃冰箱静止30分钟后2500rmp离心5分钟，血浆成功分离。步骤2中分离miRNA的方法为：采用天根公司的miRcute plasma miRNA isolation kit试剂盒来分离血浆中miRNA。

在本申请中，步骤3检测hsa-miR-543、miRNA-506-3p和hsa-miR-195-5pmiRNA的相对表达量的方法可以采用现有技术中任意一种用于检测血浆中miRNA的方法，所用试剂可以使用现有技术中任意一种检测相应基因的试剂。

附图说明

图1a示出hsa-let-7b-5p在各组中的表达量；

图1b示出hsa-miR-195-5p在各组中的表达量；

图1c示出hsa-miR-hsa-miR-215-5p在各组中的表达量；

图1d示出hsa-miR-543在各组中的表达量；

图1e示出hsa-miR-506-3p在各组中的表达量；

图2a示出hsa-miR-506-3p的ROC曲线图；

图2b示出hsa-let-7b-5p的ROC曲线图；

图2c示出hsa-miR-543的ROC曲线图；

图2d示出hsa-miR-195-5p的ROC曲线图；

图2e示出hsa-miR-215-5p的ROC曲线图；

图3a示出hsa-let-7b-5p的表达情况；

图3b示出hsa-miR-195-5p的表达情况；

图3c示出hsa-miR-215-5p的表达情况；

图3d示出hsa-miR-506-3p的表达情况；

图3e示出hsa-miR-543的表达情况；

图4a示出各组中hsa-miR-195-5p的表达情况；

图4b示出各组中hsa-miR-215-5p的表达情况；

图4c示出各组中hsa-miR-506-3p的表达情况；

图4d示出各组中hsa-miR-543的表达情况；

图5a示出hsa-miR-195-5p在两组中的表达情况；

图5b示出hsa-miR-506-3p在两组中的表达情况；

图5c示出hsa-miR-543在两组中的表达情况；

图6示出三种miRNA联合模型在大样本验证队列中的ROC曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例

在本申请实施例中，所用材料如下表1所示：

本申请实施例临床样品：来源于2016年9月～2018年12月在宁夏医科大学总医院、浙江省中西医结合医院、深圳市第三人民医院、沈阳市第十人民医院、新乡医学院第一附属医院、银川市第四人民医院门诊和住院治疗的脊柱结核患者、肺结核患者、布氏杆菌性脊柱炎患者、脊柱肿瘤患者、化脓性脊柱炎患者，以及其当地体检中心的正常人。

实施例1基因芯片高通量筛选

本实施例选用天根公司的血浆总RNA提取试剂盒对脊柱结核以及健康成人的血浆总RNA进行提取。质检合格后，选用Exqin MICRORNA芯片对12例脊柱结核以及8例健康成人的血浆miRNA的进行高通量筛选。

其中，在脊柱结核患者血浆中筛选出84个具有差异表达的miRNAs，其中有7个miRNAs表达上调、77个miRNAs表达下调。随后从84个具有差异表达的miRNAs中随机选取2个表达上调和8个表达下调的基因进行实时定量PCR验证，结果显示这10个miRNAs表达量变化趋势与芯片筛选中表现的结果一致，表明芯片结果可靠。

实施例2 RT-qPCR验证

参照已完成的芯片结果，脊柱结核血浆中共有84种miRNA表达改变<0.5倍或>2倍。根据改变差异倍数，选择上调或下调最为显著且丰量较大的miRNA，共13种进行下一步分析。

所选择的miRNA分别为：

(1)表达上调的miRNA：hsa-miR-3617-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-506-3p；

(2)表达下调的miRNA：hsa-let-7b-5p、hsa-miR-181c-3p、hsa-miR-4528、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-543、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-215-5p、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-488-5p、hsa-miR-378c。

首先，对上述13种芯片差异表达的基因首先进行小样本验证。

(一)小样本训练队列1(30vs 30)

本训练队列1对30例脊柱结核患者和30例健康成人的血液标本进行RT-qPCR检测。

由于血浆中尚缺乏稳定表达的内参，因此，选取人工合成的cel-miR-39作为本实验中RT-qPCR反应的外参。

小样本训练队列1的部分结果如图1a至图1e所示，其中，

图1a示出hsa-let-7b-5p在各组中的表达量；

图1b示出hsa-miR-195-5p在各组中的表达量；

图1c示出hsa-miR-215-5p在各组中的表达量；

图1d示出hsa-miR-543在各组中的表达量；

图1e示出hsa-miR-506-3p在各组中的表达量。

由于hsa-miR-3617-5p的变化趋势与芯片结果不符，即，在小样本训练队列1中hsa-miR-3617-5p表现表达下降；miR-199b-5p、hsa-miR-4528的表达峰值较低，CT值(循环次数)大于30，所以予以剔除；而hsa-miR-378c、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-181c-3p、hsa-miR-488-5p差异无统计学意义。

由图1a至图1e可知hsa-miR-506-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-543、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-215-5p在两组间的表达差异具有统计学意义，因此，选择hsa-miR-506-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-543、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-215-5p纳入大样本验证。

而后，使用ROC曲线对血浆hsa-miR-506-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-543、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-215-5p对脊柱结核的诊断性能进行初步分析，结果如图2a至图2e所示，其中，

图2a示出hsa-miR-506-3p的ROC曲线图；

图2b示出hsa-let-7b-5p的ROC曲线图；

图2c示出hsa-miR-543的ROC曲线图；

图2d示出hsa-miR-195-5p的ROC曲线图；

图2e示出hsa-miR-215-5p的ROC曲线图。

在本小样本训练队列1中，hsa-miR-506-3p的AUC＝0.698，灵敏度＝90％，特异度＝30％；hsa-let-7b-5p的AUC＝0.691，灵敏度＝73.3％；hsa-miR-543的AUC＝0.847，灵敏度＝90.1％，特异度＝76.7％，特异度＝74.1％；hsa-miR-195-5p的AUC＝0.704，灵敏度＝73.3％，特异度＝66.6％；hsa-miR-215-5p的AUC＝0.699，灵敏度＝66.7％，特异度＝63.3％；其中，AUC表示线下面积。

(二)小样本训练队列2(45vs 45)

在本训练队列2中，使用训练队列1中初筛得的5种基因对45例脊柱结核患者和45例健康成人的血液标本进行进一步的RT-qPCR检测。

本训练队列2仍选取人工合成的cel-miR-39作为本实验中RT-qPCR反应的外参。

结果如图3a至图3e所示，其中，

图3a示出hsa-let-7b-5p的表达情况；

图3b示出hsa-miR-195-5p的表达情况；

图3c示出hsa-miR-215-5p的表达情况；

图3d示出hsa-miR-506-3p的表达情况；

图3e示出hsa-miR-543的表达情况。

通过本次小样本训练队列验证发现hsa-let-7b-5p在脊柱结核组和健康对照组的表达差异无统计学意义，将其予以剔除；其余各基因脊柱结核与正常人组差异仍具有统计学意义。

(三)鉴别队列(75vs 75vs 30vs 30vs 30vs 23)

将小样本训练队列2(45vs45)和小样本训练队列1(30vs30)进行合并，使用筛选而得的四个基因探针对脊柱感染性疾病和肺结核患者进行进一步的验证，结果图4a至图4d所示，其中，

图4a示出各组中hsa-miR-195-5p的表达情况；

图4b示出各组中hsa-miR-215-5p的表达情况；

图4c示出各组中hsa-miR-506-3p的表达情况；

图4d示出各组中hsa-miR-543的表达情况。

由图4a至图4d可知，hsa-miR-215-5p在脊柱结核组、布氏杆菌脊柱炎组、化脓性脊柱炎组差异无统计学意义，予以剔除。

(四)风险评估模型的建立

将小样本训练队列2(45vs45)和小样本训练队列1(30vs30)进行合并，利用logistic回归，确定每种miRNA在模型中的权重，建立风险评分计算方程如下:

风险评分＝0.443-0.088×miR-543表达量+0.218×mR-506-3p表达量-1.885×miR-195-5p表达量。

(五)大样本验证队列(70vs 82)

本实验使用另一个独立的队列对3种miRNA评分模型进行验证。此队列纳入82例脊柱结核病例和70例健康人对照，结果如图5a至图5c以及图6所示，其中，

图5a示出hsa-miR-195-5p在两组中的表达情况；

图5b示出hsa-miR-506-3p在两组中的表达情况；

图5c示出hsa-miR-543在两组中的表达情况；

图6示出三种miRNA联合模型在大样本验证队列中的ROC曲线图。

由图5a至图5c以及图6可知，AUC＝0.87，敏感性＝80.5％，特异性＝80.0％，此模型的诊断性能依然较好。

在脊柱结核病人血液中hsa-miR-543、hsa-mR-506-3p、hsa-miR-195-5p表达量变化显著，将以上三种基因联合可作为脊柱结核的潜在诊断标记物。其诊断效率较为理想：AUC(曲线下面积)＝0.87，敏感性＝80.5％，特异性＝80.0％。并且与脊柱感染性疾病(布氏杆菌行脊柱炎、化脓性脊柱炎)、脊柱肿瘤和肺结核均具有较为理想的标记识别能力。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

序列表

<110> 宁夏医科大学总医院

<120> 一组脊柱结核血浆miRNA联合诊断标记物及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> hsa-miR-543

<400> 1

aaacauucgc ggugcacuuc uu 22

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> hsa-miR-506-3p

<400> 2

uaaggcaccc uucugaguag a 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> hsa-miR-195-5p

<400> 3

uagcagcaca gaaauauugg c 21

Claims (3)

1.一组脊柱结核血浆miRNA联合诊断标记物，其特征在于，所述联合诊断标记物由以下组分组成：hsa-miR-543、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-195-5p，其中，hsa-miR-543的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，hsa-miR-506-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，hsa-miR-195-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.检测权利要求1所述脊柱结核血浆miRNA联合诊断标记物表达量的试剂在制备筛查脊柱结核的产品中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，分别检测血浆中所述hsa-miR-543、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-195-5p的表达量。

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