CN116159071B

CN116159071B - miR-543在制备治疗神经损伤的药物中的应用

Info

Publication number: CN116159071B
Application number: CN202310457596.7A
Authority: CN
Inventors: 桑璇; 刘胜; 赵亮
Original assignee: Third Affiliated Hospital Of Southern Medical University (academy Of Orthopaedics Guangdong Province); Zhongshan Ophthalmic Center
Current assignee: Third Affiliated Hospital Of Southern Medical University (academy Of Orthopaedics Guangdong Province); Zhongshan Ophthalmic Center
Priority date: 2023-04-26
Filing date: 2023-04-26
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2043-04-26
Also published as: CN116159071A

Abstract

本发明涉及miR‑543在视神经损伤中的应用。本发明发现miR‑543能够显著增加视网膜神经节细胞存活的数量，并且带有神经突的RGC数量明显增加，显著提高了视神经损伤后RGC的存活率，促进轴突再生，同时能有效改善视功能水平。而将miR‑543装载于外泌体后对于RGC细胞存活率、轴突再生数量以及视功能恢复的水平提升具有更为显著的效果。同时，本发明还发现，miR‑543以及miR‑543‑Exo均可作用于RGC，激活mTORC1信号通路，并促进轴突再生，这将有助于以miR‑543‑Exo和miR‑543作为活性成分进行各种药物制剂的开发。此外，间充质干细胞外泌体相比于其它载体成分，更加安全高效。

Description

miR-543在制备治疗神经损伤的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及miR-543在制备治疗神经损伤的药物中的应用。

背景技术

视神经损伤是世界范围内不可逆盲的首位病因，包括外伤性视神经病变和青光眼性疾病，均最终导致视神经不可逆性的损害。主要表现为视网膜神经节细胞（Retinalganglion cells，RGCs）以及轴突损伤以后不可再生，这是导致视力丧失的关键因素。尽管各种医学干预，包括急性期视神经鞘减压术、大剂量激素冲击和视神经保护药物的应用，但都疗效甚微。如何有效的促进RGC的存活和轴突再生是治疗视神经损伤的关键。

近年来，间充质干细胞（MSC）移植在中枢神经系统（CNS）疾病中取得了令人鼓舞的治疗效果。在创伤性中枢神经系统损伤的动物模型中，人脐带间充质干细胞（HuMSCs）已被证明具有修复损伤和改善神经功能的作用。并且，与其他来源的间充质干细胞相比，HuMSCs具有组织来源丰富、无伦理争议问题、免疫原性低、更新速度快等优点。然而，MSCs的治疗仍存在诸多问题，如细胞生物学活性难以维持、细胞表型丢失、费用昂贵等问题。相比细胞治疗，细胞来源的外泌体（Exosomes，Exo）拥有更低的免疫原性和致瘤性，安全性更高，并且生产和储存程序更简单，质量控制更容易。因此，采用Exo治疗能避免细胞治疗存在的诸多问题。并且，Exo可携带母体细胞的蛋白质、mRNA、miRNA等多种活性物质融合进入受体细胞，从而成为供体到受体靶细胞的最佳分子生物传递体。其中，所含有的miRNA是一类由内源性基因编码的单链小分子RNA，能够参与调节生物体中多种重要的生物学功能。

现有技术中已经开始应用间充质干细胞外泌体对视神经损伤进行治疗，并取得了一定的疗效，但是未经改造的外泌体仅仅只能在一定程度上促进节细胞存活，都难以实现轴突的再生修复，达到恢复视功能损伤的目的。因此，迫切需要一种更加有效且益于向临床转化的新疗法。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供了miR-543在制备治疗神经损伤的药物中的应用，以解决临床上视神经损伤后轴突不可再生和视功能不能恢复的难题。本发明通过利用体外实验和体内ONC模型，证实经miR-543改造后的间充质干细胞外泌体和miR-543可以提高RGC的存活率，轴突得以再生修复，视功能发生明显改善。并且，改造后的间充质干细胞外泌体与单独应用miR-543相比，疗效更为显著。

为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。

本发明第一方面提供了miR-543在制备用于治疗视神经损伤和/或改善与视神经损伤有关的生理指标的药物中的应用。

作为优选地，所述与视神经损伤有关的生理指标选自视神经损伤后RGC存活率、轴突再生数量、视神经损伤后的视功能水平中的一种或多种。

本发明第二方面提供了一种装载有miR-543的外泌体在制备用于治疗视神经损伤和/或改善与视神经损伤有关的生理指标的药物中的应用。

作为优选地，所述外泌体选自间充质干细胞来源的外泌体；最优选地，所述外泌体选自脐带间充质干细胞来源的外泌体。

作为优选地，所述装载有miR-543的外泌体通过如下方法制备得到：

（1）收集间充质干细胞上清，2000×g离心后取上清，随后10000×g离心后取上清，再以100000×g离心后弃上清，保留沉淀；

（2）对步骤（1）获得的沉淀进行洗涤后，100000×g离心后弃上清，保留沉淀，得到外泌体（Exo）；

（3）将miR-543转染至步骤（2）获得的外泌体中，即得装载有miR-543的外泌体（miR-543-Exo）。

本发明第三方面提供了miR-543和/或装载有miR-543的外泌体在制备促进mTORC1信号通路激活的产品中的应用。

本发明第四方面提供了一种用于治疗视神经损伤和/或改善与视神经损伤有关的生理指标的药物组合物，包括miR-543和/或装载有miR-543的外泌体，以及药学上可接受的辅料。

作为优选地，所述药学上可接受的辅料选自溶剂、增溶剂、润湿剂、抗氧剂、抑菌剂、螯合剂、表面活性剂中的一种或多种。

应理解的是，在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列举的miR-543等为本领域已知的microRNA类型，本领域技术人员有能力从常规的数据库中获取与miR-543等相关的分子生物学信息，例如序列等，其中本发明所采用的miR-543的Gene ID为100126335。同时，为了便于体内外实验的开展，本发明选择本领域常用的分子生物学工具miR-543mimics来模拟生物体内源的miR-543，以增强内源性miR-543的功能。所述miR-543 mimic可根据实验需求自行通过市售途径购买，也可以基于miR-543的序列自行设计和合成。本发明中所采用的miR-543 mimics（miR10004954-1-5 micrON，广州锐博生物技术有限公司）、阴性对照miRNA mimics NC均市售获得（miR1N0000001-1-5，广州锐博生物技术有限公司），并按照产品说明书进行使用。

本发明相对于现有技术具有如下有益效果：

（1）本发明通过大量研究证实了miR-543在视神经损伤修复中发挥重要作用。miR-543能够显著增加RGC存活的数量，并且带有神经突的RGC数量明显增加，显著提高视神经损伤后RGC的存活率，促进轴突再生，同时能有效改善视功能水平。而将miR-543装载于来源于间充质干细胞的外泌体以组成miR-543-Exo，其相较于单纯应用miR-543治疗来说，对于RGC细胞存活率、轴突再生数量以及视功能恢复的水平提升具有更为显著的效果。有效解决了现有技术中应用间充质干细胞外泌体治疗视神经损伤时只能在一定程度上促进节细胞存活、难以实现轴突的再生修复的技术难题，真正达到恢复视功能损伤的目的。

（2）本发明对于miR-543的作用机制进行进一步研究发现，miR-543以及miR-543-Exo均作用于RGC，激活mTORC1信号通路，并促进轴突再生，这将有助于以miR-543-Exo和miR-543作为活性成分进行各种药物制剂的开发，有效解决了常规细胞治疗过程中细胞生物学活性难以维持、细胞表型丢失、费用昂贵等问题。此外，脐带间充质干细胞外泌体相比于其它载体，更加安全高效，并且生产和储存程序更简单，质量控制更容易，有利于新药的临床转化过程。

附图说明

图1为利用qRT-PCR 检测各组miR-543的表达水平结果示意图。

图2为各组RGC数量及神经突生长情况的免疫荧光结果示意图。

图3为各组RGC的数量和带有神经突的RGC数量的定量分析结果示意图。数据以均数±SEM表示，*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001，NC：阴性对照组。图4为miR-543-Exo递送miRNA活性成分进入RGC中。

图5为利用qRT-PCR 检测各组miR-543的表达水平结果示意图。

图6为利用视网膜铺片荧光染色检测各组的RGC存活率。

图7为各组RGC存活率定量分析结果示意图。

图8为利用视神经荧光染色检测各组轴突再生情况结果示意图。

图9为各组视神经的轴突再生数量定量分析结果示意图。

图10为利用P-ERG分析各组的视功能变化情况结果示意图。

图11为利用TargetScan、miRDB、miRTarBase和miRWalk预测miR-543的靶基因。

图12为利用细胞荧光染色检测各组RGC的mTORC1信号的活性、RGC的数量及神经突的生长情况。

图13为对各组pS6蛋白的表达水平、RGC的数量和带有神经突的RGC的数量的定量分析结果示意图。

图14为利用视网膜组织荧光染色检测各组节细胞层中RGC内的mTORC1信号活性结果示意图。

图15为对各组节细胞层中RGC内的pS6蛋白表达水平定量分析结果示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列出的包括HuMSCs、RGCs、HEK293T等原代细胞和细胞系均根据常规方法进行培养，其中HuMSCs由广东省脐带血干细胞库提供。所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心（武汉）的短串联重复分析鉴定，并使用PCR检测试剂盒（上海Biothrive Sci）验证是否存在支原体污染，同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用的试剂中，均通过市售获得。本发明所使用的实验方法，例如细胞培养、核酸提取、基因组测序、引物设计、PCR、细胞转染、荧光染色、动物实验、生物信息学分析等均为本领域的常规方法和技术。对于动物实验的开展，实验方案均经过中山大学中山眼科中心动物实验伦理委员会批准并遵循其准则。

生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有实验至少重复三次。数据采用GraphPad Prism5.0或SPSS 22.0软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。

实施例1

首先研究miR-543对视网膜神经节细胞（RGCs）的影响，具体步骤如下：

（1）将成年C57BL/6J小鼠安乐死后无菌条件下取出眼球，浸泡在EBSS 缓冲液中并分离出视网膜组织，加入木瓜蛋白酶溶液（15U/ml酶解成单细胞悬液。将视网膜单细胞细胞悬液接种到Neurobasal A神经干培养基中培养补充以神经生长因子，按一定密度进行接种，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，得到RGC细胞。

（2）采用转染试剂盒（锐博产品）分别将miR-543 mimics、阴性对照miRNA mimicsNC转染至RGC中，空白对照组vehicle的RGC不做任何处理，于37℃、5% CO₂细胞培养箱中孵育24h。

（3）24h后更换新鲜培养基继续培养24h，收获细胞得到转染后的细胞样本。

（4）采用RT-qPCR对三组细胞的转染效率进行检测。

（5）对各组RGC的爬片按照常规方法处理后进行免疫荧光染色，检测各组RGC中神经特异性βIII微管蛋白表达情况，以评估各组RGC的平均存活数量以及带有神经突的RGC的平均数量。

对各组细胞转染效率的检测结果如图1所示。结果显示，与阴性对照组miRNAmimics NC和空白对照组vehicle相比，miR-543 mimics组RGC中的miR-543表达量明显升高。各组细胞免疫荧光染色结果如图2-3所示。结果显示，相较于阴性对照组miRNA mimicsNC和空白对照组vehicle，miR-543 mimics组RGC存活的数量显著增加，并且带有神经突的RGC数量明显增加，由此证明miR-543能够显著提高视神经损伤后RGC的存活率，同时促进神经突再生。

随后将miR-543装载至外泌体，研究其对RGCs的影响，具体步骤如下：

（1）将脐带消毒、清洗、剪成小段，放入离心管中，加入培养基，将其剪成碎块，再加入培养基，混匀后放入培养瓶中；将培养瓶放入培养箱中培养，定时更换新鲜培养基，当超过半数培养瓶中的细胞达到80%密度时，细胞进行传代；

（2）当细胞培养至P4代后，收集HuMSCs培养上清300mL；2000×g离心10min取上清（去除死细胞）；10000×g离心30min取上清（去除细胞碎片）；100000×g离心70min后弃上清（沉淀主要为外泌体和杂蛋白），保留沉淀。

（3）采用预冷无菌PBS对沉淀进行洗涤，100000×g离心70min后弃上清，保留沉淀，得到HuMSCs来源的外泌体（HuMSC-Exo）；用1mL预冷无菌PBS吹散沉淀。

（4）采用转染试剂盒（SBI产品）分别将miR-543 mimics、阴性对照miRNA mimicsNC转染至HuMSC-Exo中，得到miR-543-Exo，mimics NC-Exo。

（5）将转染后的各组HuMSC-Exo与RGC细胞于37℃，5% CO₂细胞培养箱中共同孵育24h，其中空白对照组vehicle的RGC细胞予以PBS处理，并于相同条件下进行培养。

（6）24h后更换新鲜培养基继续培养24h，收获细胞得到转染后的细胞样本。实验结果如图4所示，结果显示转染了miRNA的HuMSC-Exo可以递送miRNA进入RGC细胞中，带有Cy3荧光标记的miRNA转染了绝大部分的RGC细胞。

（7）采用RT-qPCR对三组细胞的转染效率进行检测。

实验结果如图5所示。PCR结果显示，miR-543-Exo处理组的miR-543的表达水平明显高于阴性对照组miRNA mimics NC-Exo和空白对照组vehicle。以上结果表明，装载了miR-543的HuMSC-Exo的转染效率高，可以高效地将miR-543递送进入RGC中从而发挥生物学功能。

实施例2

前述实施例中，在体外证实了miR-543能有效增加RGC的存活数量，促进神经突的再生。对此，进一步通过体内实验对miR-543的生物学功能进行深入研究，具体步骤如下：

首先进行小鼠视神经损伤模型（ONC）的构建，具体步骤如下：

（1）将6-8周雄性C57BL/6小鼠右眼结膜切开后，移开眶肌，小心暴露视神经，避免损伤血管，使用自闭钳在距离筛板2mm处将视神经挤压，持续5s。术中和术后应用丙美卡因作为局麻药。

（2）将完成ONC模型构建的小鼠随机分为3组，每组10只，记为组1-组3，其中组1小鼠于右眼玻璃体腔内注射3μL包含3×10⁹颗粒数的miR-543-Exo，组2小鼠于右眼玻璃体腔内注射3μL 50mM AgomiR-543注射液（miR-543 mimics），组3小鼠于右眼玻璃体腔内注射3μL PBS作为空白对照组。注射时间为ONC前1天，ONC后第7天和第14天，所有注射均在对小鼠实施麻醉状态下完成。另取10只小鼠作为正常对照组组4，不进行模型构建和给药处理。

（3）实验结束后将各组小鼠予以安乐死，并在手术后第7、14以及21天分别采用无菌生理盐水和4%多聚甲醛经心灌注。将眼球和视神经在4℃下固定1小时。

随后利用上述方法获得的小鼠ONC后的眼球样本，将视网膜与眼球分离，并在每个象限做放射性切口，进行全视网膜铺片后采用Rbpms抗体对视网膜铺片中的RGC进行染色。在LSM 880共聚焦显微镜下拍照200倍图像，以量化每个视网膜RGC的平均数量。

检测结果如图6-7所示。结果显示，在术后第21天， miR-543-Exo和AgomiR-543治疗组均可显著增加节细胞层（GCL）中幸存RGC的数量。并且，miR-543-Exo促进RGC存活的治疗作用要显著优于AgomiR-543。

为了量化轴突再生的数量，利用上述方法获得的小鼠ONC后的视神经样本，将视神经于30%葡萄糖溶液中脱水过夜，随后冰冻进行切片（于组织OCT液（Thermo Fisher）中切片），视神经的厚度为12μm。所有组织标本采用GAP-43抗体进一步进行免疫荧光染色。

实验结果如图8-9所示。结果显示，在术后第21天，在距离挤压部位250、500、1000、1500μm处，与PBS对照组相比，miR-543-Exo和 AgomiR-543均能显著增加GAP-43阳性轴突再生的数量。并且，miR-543-Exo促进轴突再生的作用要显著优于AgomiR-543组。

进一步地，为了研究miR-543对ONC后视功能的影响，利用图形视网膜电图（Pattern electroretinography，P-ERG）在ONC造模后21天，对小鼠视功能的变化情况进行评估。应用光栅条纹图形刺激模式，包含3个波形：35ms的负波谷（n35），50ms的正波峰（p50）和95ms的最低的负波谷（n95）。并使用内置的软件分析波形的潜伏期和振幅，比较各组参数变化情况，其所产生的电反应是RGC细胞依赖性的。

实验结果如图10所示。结果显示，在术后第21天，与PBS对照组相比，miR-543-Exo和 AgomiR-543均显著增加了RGC的功能。并且，miR-543-Exo改善视功能的作用要显著优于AgomiR-543。

实施例3

通过高通量sRNA测序对HuMSC-Exo中的总miRNAs表达模式进行分析，并以HEK293T-Exo作为对照；同时利用KEGG和GO分析预测miRNA的靶基因和富集相关通路。

分析结果显示，HuMSC-Exo具有特定的miRNA丰度特征，与HEK293T-Exo完全不同。其内含有的miR-543高丰度表达，且差异显著。利用TargetScan、miRDB、miRTarBase和miRWalk预测miR-543的靶基因，显示miR-543的靶基因与mTOR通路密切相关（参见图11）。

既往研究表明pS6可以可靠的评估mTORC1信号活性，因此利用pS6抗体对经过miR-543-Exo、miR-543 mimics以及PBS处理的RGC进行染色，比较各组mTORC1信号的表达水平差异。

实验结果如图12-13所示。结果显示，相较于PBS对照组，miR-543-Exo和miR-543mimics均使得RGC中的pS6蛋白表达水平明显上调，提示mTORC1信号通路被激活。并且，miR-543-Exo使RGC存活的数量和带有神经突的RGC数量明显增加，作用效果优于miR-543mimics。

进一步地，采用实施例2中制备获得的小鼠视神经损伤后的眼球样本，将眼球组织置于30%葡萄糖溶液中脱水过夜，随后冰冻进行切片（于组织OCT液（Thermo Fisher）中切片）。眼球组织的纵向截面厚度为14μm，所有组织标本采用pS6抗体进一步进行免疫荧光染色。

实验结果如图14-15所示。结果显示，miR-543-Exo和 AgomiR-543均能显著增加神经节细胞层（GCL）中pS6阳性RGC的数量。提示视神经损伤后，miR-543-Exo和 AgomiR-543在活体内，亦能使得mTORC1信号通路被激活。

本发明通过大量研究发现，miR-543在视神经损伤修复中发挥重要作用。体内体外实验均证明，miR-543不仅在体外能够显著增加RGC存活的数量，促进RGC神经突的再生，还能在活体内显著提高视神经损伤后RGC的存活率，促进轴突再生，同时能有效改善视功能水平。而将miR-543装载于来源于间充质干细胞的外泌体内以组成miR-543-Exo，其相较于单纯应用miR-543治疗来说，对于RGC细胞存活率、轴突再生数量以及视功能恢复的水平提升具有更为显著的疗效。同时，本发明还发现，miR-543以及miR-543-Exo均可作用于RGC细胞中，激活mTORC1信号通路，并促进轴突再生，这将有助于以miR-543-Exo和miR-543作为活性成分进行各种药物制剂的开发。此外，脐带间充质干细胞外泌体相比于其它载体，更加安全高效，并且生产和储存程序更简单，质量控制更容易，有利于新药的临床转化过程。

以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。

Claims

1. miR-543在制备用于治疗视神经损伤和/或改善与视神经损伤有关的生理指标的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述与视神经损伤有关的生理指标选自视神经损伤后RGC存活率、轴突再生数量、视神经损伤后的视功能水平中的一种或多种。

3.装载有miR-543的外泌体在制备用于治疗视神经损伤和/或改善与视神经损伤有关的生理指标的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述外泌体选自间充质干细胞来源的外泌体。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述与视神经损伤有关的生理指标选自视神经损伤后RGC存活率、轴突再生数量、视神经损伤后的视功能水平中的一种或多种。