CN114031672A - 一种多肽及其在制备软骨修复和/或骨关节炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肽领域,尤其是涉及一种多肽及其在制备软骨修复和/或骨关节炎药物中的应用。所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的多肽GQG15可显著促进COL2A1基因、ACAN基因的mRNA表达量增加,促进间充质干细胞向软骨细胞的分化;此外,多肽GQG15还可以促进软骨细胞的增殖和修复,改善骨关节炎症状。
Description
技术领域
本发明涉及肽领域,尤其是涉及一种多肽及其在制备软骨修复和/或骨关节炎药物中的应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种常见的关节疾病,表现为关节疼痛、僵硬,软骨损伤是导致骨关节炎的主要成因。本病在中年以后多发,女性多于男性,40岁人群的患病率为10%-17%,60岁以上为50%,而在75岁以上人群则高达80%。该病有一定的致残率。而随着人口的日益老龄化,骨关节炎将成为影响人们生活质量的重要问题,骨关节炎药物市场需求将不断扩大。
目前临床上对于骨关节炎的治疗药物分为特异性治疗药物与非特异性治疗药物。非特异性治疗药物以镇痛和控制症状为主,但对软骨没有保护作用,如非甾体抗炎药等。特异性治疗药物可保护关节软骨,延缓骨关节炎进展,如氨基葡萄糖、硫酸软骨素、双膦酸盐等,但一般起效较慢,需治疗数周才见效,而且对受损软骨的再生没有作用。因此开发一种安全性好、疗效突出的新型软骨修复和/或骨关节炎药物成为医学界的一大目标。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种多肽及其在制备软骨修复和/或骨关节炎药物中的应用,该多肽可以用于骨形成,促进软骨修复和/或治疗骨关节炎。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
本发明提供了一种多肽,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的多肽含有15个氨基酸,其序列为Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Lys AlaVal Phe Ser Thr Gln,发明人将多肽命名为GQG15,以下多肽均用此命名。
本发明的多肽可以用于软骨修复和/或用于治疗骨关节炎。
作为本发明所述多肽的优选实施方式,所述多肽采用固相合成工艺合成。
本发明的多肽通过常规的固相合成工艺制备,合成的多肽纯度>95%。
作为本发明所述多肽的优选实施方式,所述多肽用于软骨修复,和/或用于治疗骨关节炎。
本发明提供了上述多肽在促进COL2A1基因和ACAN基因表达量中的应用。
本发明的多肽GQG15可显著促进COL2A1基因、ACAN基因的mRNA表达量增加,并表现出明显的量效关系和时效关系,说明多肽GQG15可以诱导进COL2A1基因和ACAN基因的表达,促进间充质干细胞向软骨细胞的分化。
作为本发明所述多肽应用的优选实施方式,所述多肽的浓度为0.1~10μM。
更优选地,所述多肽的浓度为0.1μM、1μM或10μM。
当多肽的浓度为0.1μM、1μM和10μM时,可以显著促进COL2A1基因和ACAN基因表达量增加,使得间充质干细胞向软骨细胞分化,有利于软骨修复。
作为本发明所述多肽应用的优选实施方式,多肽与其他治疗骨关节炎的药物联用来治疗骨关节炎,所述其他治疗骨关节炎的药物包括非甾体抗炎药和/或玻璃酸钠注射液。
本发明提供了上述多肽的药学上可接受的盐,所述盐为醋酸盐、盐酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐中的一种。
本发明还提供了一种药物,所述药物含有治疗有效剂量的如上述的多肽和药学上可接受的载体。
作为本发明所述药物的优选实施方式,所述载体包括生理盐水、磷酸钠缓冲液、玻璃酸钠溶液中的至少一种。
另外,本发明提供了上述多肽在制备软骨修复和/或骨关节炎药物中的应用。
经过实施例3的数据证实,添加不同浓度的多肽可以显著提高OD490,促进被IL-1β损伤的大鼠软骨细胞的增殖;当使用多肽处理体外软骨细胞损伤模型3-7天时,其软骨细胞的增殖与模型对照组有显著差异。
通过实施例4验证,本发明的多肽GQG15还可以修复斑马鱼软骨损伤模型,中剂量(100ng/尾)、高剂量(500ng/尾)的多肽GQG15均表现出明显的软骨修复效果。
当采用BMP-2肽处理斑马鱼软骨损伤模型时,其测定的荧光强度不及本发明的多肽GQG15,说明BMP-2促进受损软骨再生的效果不及多肽GQG15。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种多肽GQG15及其在制备软骨修复和/或骨关节炎药物中的应用,多肽GQG15可显著促进COL2A1基因、ACAN基因的mRNA表达量增加,促进间充质干细胞向软骨细胞的分化;此外,多肽GQG15还可以促进软骨细胞的增殖和修复,改善骨关节炎症状。
附图说明
图1为多肽GQG15的HPLC检测图谱图;
图2为不同浓度的多肽GQG15对间充质干细胞Col2A1基因和Acan基因表达情况图;
图3为不同浓度的多肽GQG15在不同作用时间下对IL-1β损伤的大鼠软骨细胞增殖的影响图;
图4为不同剂量的多肽GQG15修复斑马鱼软骨损伤模型的荧光强度图;
图5为不同剂量的多肽GQG15修复斑马鱼软骨损伤模型结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中,所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、多肽GQG15的固相合成
本发明的多肽GQG15委托合肥国肽生物科技有限公司采用常规固相工艺合成,合成的多肽GQG15纯度>95%,其HPLC检测图谱分别如图1所示,合成500mg。
实施例2、多肽GQG15体外促进间充质干细胞的分化
1、人间充质干细胞的培养和传代:将人骨髓间充质干细胞(BMSCs,购自广州赛业生物科技有限公司)复苏,加入完全培养基,置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。复苏后的第二天,给复苏的细胞换用新鲜的完全培养基,每两天给细胞换新鲜的完全培养基直到细胞达80%-90%的汇合度,然后进行传代培养。
2、成软骨诱导:将多肽GQG15用磷酸缓冲液(PBS)溶解。用含不同浓度的多肽GQG15(0.1μM、1μM和10μM)的完全成软骨培养基重悬细胞,使得BMSCs的浓度为每毫升5.0×105个细胞,并以PBS为阴性对照,1μM人胰岛素生长因子1(IGF-1)为阳性对照。处理的BMSCs置于37℃,5%CO2饱和湿度条件下孵育。每2-3天更换培养基,每管加入0.5mL新鲜完全成软骨培养基。
3、qPCR检测:收集细胞,Trizol法提取总RNA,逆转录得cDNA,反应条件为:30℃保温10分钟;42℃保温60分钟;85℃保温10分钟。以cDNA为模板,利用下列引物(见表1),对II型胶原(Col2A1)和蛋白聚糖(Aggrecan,Acan)进行定量PCR,反应条件为:50℃2分钟;95℃2分钟;95℃15秒,60℃32秒读板,40个循环。
表1
COL2A1-F1 | CAAGAACAGCATTGCCTATC |
COL2A1-R1 | ATAACAGTCTTGCCCCACTT |
ACAN-F1 | TGGGTCTGGAGTAGAAGTATCA |
ACAN-R1 | GTTAGCTTCGTGGAATGCA |
β-actin-F1 | TGGATCAGCAAGCAGGAGTA |
β-actin-R1 | TCGGCCACATTGTGAACTTT |
参考图2,浓度为0.1μM、1μM和10μM的多肽GQG15可显著促进COL2A1基因、ACAN基因的mRNA表达量增加,并表现出明显的量效关系和时效关系(见图2),说明多肽GQG15可以诱导进COL2A1基因和ACAN基因的表达,进一步可促进间充质干细胞向软骨细胞的分化。
当浓度为10μM的多肽GQG15应用于ACAN基因上,其ACAN基因相对表达量与阳性对照组促进ACAN基因相对表达量持平。
实施例3、多肽GQG15对IL-1β损伤的大鼠软骨细胞增殖的影响
原代培养:8周龄SD大鼠处死,取膝关节经75%酒精消毒后,在超净台中以α-MEM培养基洗涤3遍;将大鼠膝关节组织切开,剔除肌肉组织、脂肪组织,暴露膝关节软骨,用α-MEM洗二次,用解剖剪将膝关节软骨锐性切碎;用2倍体积含有4mg/mlⅠ型胶原酶(Gibco,货号:17018029)的α-MEM消化120分钟;消化的细胞悬液经70μm细胞滤网过滤,1500-2000rpm离心6分钟;细胞沉淀用α-MEM离心洗涤2次,用记数板进行细胞计数。细胞最终悬浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中,接种到培养瓶中,于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养,每2-3天换液一次。
药物处理:取对数生长期的软骨细胞,消化后计数,调整细胞浓度为1×105个/ml,接种到96孔板,每孔100ul,即每孔细胞为1×104个。加入终浓度为10ng/mL的IL-1β处理24h,建立体外软骨细胞损伤模型。同时设立阴性对照组,不以IL-1β处理,而以同体积α-MEM培养基处理。IL-1β处理的软骨细胞分别加入不同浓度(0、0.01、0.1、1、10μM)的GQG15处理,并以30ng/ml的胰岛素生长因子1(IGF-1)作为阳性对照。收集各个时间点的细胞(0、1、3、7天)加入cellTiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂(Promega,Cat.No.G3582),孵育4小时后,酶标仪测定OD490。
结果:如图3所示,软骨细胞经10ng/mL的IL-1β处理后1天,细胞活力明显下降,说明体外软骨细胞损伤模型成立。
加入不同浓度的GQG15处理体外软骨细胞损伤模型,处理7天后,其OD490明显升高,表明GQG15促进了软骨细胞的增殖,其中1、10μM剂量组在处理3、7天后,软骨细胞的增殖与模型对照组有显著的统计学意义(P<0.01)。
实施例四、多肽GQG15对斑马鱼软骨损伤模型的修复作用
随机选取受精后2天的转基因软骨荧光斑马鱼于六孔板中,每孔(即每浓度组)30尾斑马鱼,给予地塞米松处理建立斑马鱼软骨损伤模型。模型斑马鱼分别静脉注射给予生理盐水溶解的多肽GQG15,剂量为20、100、500ng/尾,给予浓度为1000μg/mL的硫酸软骨素处理作为阳性对照,同时设置正常对照组(给予生理盐水)、模型对照组(给予生理盐水),每孔容量为3mL,28℃培养箱孵育72小时。实验结束后,每组随机选取10尾斑马鱼在显微镜下观察、拍照并保存图片,用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件,测定斑马鱼软骨荧光强度、斑马鱼角舌骨和Meckel’s软骨的长度和角度。软骨再生作用计算公式如下:
表2多肽GQG15对斑马鱼软骨损伤的治疗作用
正常对照组 | 892147±39372 |
模型对照组 | 592361±52386 |
GQG15低剂量组 | 632587±58436 |
GQG15中剂量组 | 703482±63694<sup>*</sup> |
GQG15高剂量组 | 837452±65673<sup>**</sup> |
阳性对照组 | 886953±66376<sup>**</sup> |
注:*代表与模型对照相比,差异具有统计学意义(P<0.05)**代表与模型对照相比,差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。
结果:与模型对照组相比,中、高剂量(分别为100、500ng/尾)的多肽GQG15处理,均显示出明显的软骨修复作用,表现为多肽GQG15中、高剂量组的斑马鱼的荧光强度明显高于模型对照组(**代表P<0.01),且量效关系明显(见表2、图4),提示多肽GQG15有促进受损软骨再生的作用,各组斑马鱼软骨的荧光成像结果见图5(A为正常对照组,B为模型对照组,C为阳性对照组,D为多肽GQG15低剂量组,E为多肽GQG15中剂量组,F为多肽GQG15高剂量组)。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州领晟医疗科技有限公司
<120> 一种多肽及其在制备软骨修复和/或骨关节炎药物中的应用
<130> 2021.10.19
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Val Phe Ser Thr Gln
1 5 10 15
Claims (10)
1.一种多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽采用固相合成工艺合成。
3.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽用于软骨修复,和/或用于治疗骨关节炎。
4.如权利要求1或2所述的多肽在促进COL2A1基因和ACAN基因表达量中的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述多肽的浓度为0.1~10μM。
6.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,其与其他治疗骨关节炎的药物联用来治疗骨关节炎,所述其他治疗骨关节炎的药物包括非甾体抗炎药和/或玻璃酸钠注射液。
7.如权利要求1所述的多肽的药学上可接受的盐,其特征在于,所述盐为醋酸盐、盐酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐中的一种。
8.一种药物,其特征在于,所述药物含有治疗有效剂量的如权利要求1所述的多肽和药学上可接受的载体。
9.如权利要求8所述的药物,其特征在于,所述载体包括生理盐水、磷酸钠缓冲液、玻璃酸钠溶液中的至少一种。
10.如权利要求1所述的多肽在制备软骨修复和/或骨关节炎药物中的应用。
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2021
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