CN109762069B - 一种融合蛋白、其药物组合物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种融合蛋白、其药物组合物及用途，属于融合蛋白领域。本发明的融合蛋白包括通过连接子与人血清白蛋白连接的两分子AC‑100，所述AC‑100的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的融合蛋白中2分子AC‑100显示协同作用，具有显著的促进软骨修复和新骨形成的效应，可以用于修复软骨，治疗骨关节炎、骨质疏松或骨折；同时本发明的融合蛋白克服了AC‑100类药物不稳定、半衰期短的缺点，在血浆和关节腔中具有显著更长的半衰期，有利于降低给药频率和给药量。

Description

一种融合蛋白、其药物组合物及用途

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白、其药物组合物及用途，属于融合蛋白领域。

背景技术

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的关节疾病，表现为关节疼痛、僵硬。软骨损伤是导致骨关节炎的主要成因。本病在中年以后多发，女性多于男性，40岁人群的患病率为10％～17％，60岁以上为50％，而在75岁以上人群则高达80％。该病有一定的致残率。随着人口的日益老龄化，骨关节炎将成为影响人们生活质量的重要问题，骨关节炎药物市场需求将不断扩大。

目前临床上对于骨关节炎的治疗药物分为特异性治疗药物与非特异性治疗药物。非特异性治疗药物以镇痛和控制症状为主，但对软骨没有保护作用，如非甾体抗炎药等。特异性治疗药物可保护关节软骨、延缓骨关节炎进展，这类药物例如氨基葡萄糖、硫酸软骨素、双膦酸盐等，但一般起效较慢，需治疗数周才见效，而且对受损软骨的再生没有作用。因此，开发一种安全性好、疗效突出的新型骨关节炎治疗药物成为医学界的一大目标。

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征，导致骨强度下降，脆性增加和易于骨折的代谢性骨病。伴随着人口老龄化，骨质疏松已成为全世界关注的老年疾病之一。患者骨折发生率高，可引起和加重心脑血管疾病等，对患者的生理、心理健康危害极大，并大大降低生活质量，也给社会带来了沉重经济负担。在40岁以上人群中，骨质疏松症患病率分别为女性19.9％，男性11.5％；在60岁以上人群中，骨质疏松症患病率分别为女性28.6％，男性15％；总患病率分别为22.6％和13.3％。

骨质疏松治疗药物有很多，但绝大多数为骨吸收抑制剂(如雌激素、双膦酸盐、降钙素等)，而骨形成促进剂(如甲状旁腺激素等)的种类却非常少。从药物的治疗效果来看，局限在于仅能改善症状，延缓病情发展的水平，尚未达到疾病改善或者治愈的效果，故而现有治疗方式并不能满足临床需求。

细胞外基质磷酸糖蛋白(matrix extracelluar phosphoglycoprotein，MEPE)，又称为成骨细胞/骨细胞因子(osteoblast/osteocyte factor，OF)-45或骨调节蛋白(osteoregulin)，是含525个氨基酸残基的糖蛋白，在骨的形成与代谢循环中具有重要作用，参与调节基质钙化、骨组织中的激素水平和对机械负荷的应答等。AC-100是源于MEPE的肽，为MEPE的242-264位氨基酸，属于MEPE的中间保守序列，含有23个氨基酸残基的多肽链以及RGD和SGDG元件。已有大量实验显示，AC-100具有明显的成骨和成软骨作用。Hayashibara等将AC-100注射到小鼠颅骨骨膜下发现，AC-100能促进成骨细胞增殖，刺激新骨形成，其刺激新骨形成的能力与BMP-2(骨形态发生蛋白-2，bone morphogeneticprotein-2)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)-1和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)-1相似。体外试验中，AC-100能刺激人原代成骨细胞的增殖，提高碱性磷酸酶(alkaline phospatase，AKP)活性，并可激活原位黏着斑激酶(focal adhension kinase，FAK)和细胞外信号调节蛋白激酶(extracellμlar signal-regμlated protein kinase，ERK)。

综上，AC-100肽具有显著的促进成骨和成软骨的作用，有希望开发为治疗骨关节炎、骨质疏松症等骨科疾病的新型药物。但AC-100半衰期比较短，其血浆半衰期仅为20分钟左右，难以用于需要全身给药的疾病(如骨质疏松症)的治疗，因此提高AC-100的活性，延长其半衰期，降低给药频率，有可能满足当前骨科疾病治疗领域迫切的临床需求，具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种融合蛋白、其药物组合物及用途，该融合蛋白能提高AC-100的活性，延长其半衰期，增强其成软骨和成骨的药效，具有开发一种稳定的可以用于修复软骨，治疗骨关节炎、骨质疏松或骨折的新型药物的前景。

本发明的发明人通过重组的方式构建和表达了两种融合蛋白HSA021-1和HSA021-2，其分别由1或2分子的AC-100与1分子的人血清白蛋白通过连接子连接而成。

其中，融合蛋白HSA021-1的氨基酸序列如下所示：

注：按照氨基酸序列从左至右的顺序，下划线代表AC-100序列，粗体代表连接子序列，边框代表人血清白蛋白序列，斜粗体代表纯化标签序列。

融合蛋白HSA021-2(即为本发明的融合蛋白)的氨基酸序列如下所示：

注：按照氨基酸序列从左至右的顺序，下划线代表AC-100序列，粗体代表连接子序列，边框代表人血清白蛋白序列，斜粗体代表纯化标签序列。

通过对融合蛋白的活性进行体外和体内检测，本发明人出乎意料的发现，本发明的融合蛋白HSA021-2的成软骨和成骨活性显著高于AC-100和HSA021-1，并且显示协同效应。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括通过连接子与人血清白蛋白连接的两分子AC-100，所述AC-100的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

作为本发明所述融合蛋白的优选实施方式，所述融合蛋白的连接方式为AC-100—连接子—AC-100—连接子—人血清白蛋白。

作为本发明所述融合蛋白的优选实施方式，所述连接子为GGGGS。

作为本发明所述融合蛋白的优选实施方式，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示。

第二方面，本发明提供了上述融合蛋白在制备治疗修复软骨、治疗骨关节炎、治疗骨质疏松或治疗骨折的药物中的用途。

作为本发明所述融合蛋白的用途的优选实施方式，所述融合蛋白与透明质酸或非甾体抗炎药联用用于治疗骨关节炎。

第三方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物由上述融合蛋白与药学上可接受的载体制成。

作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述药学上可接受的载体为盐水溶液或胶体溶液，所述药物组合物的给药方式为注射给药。

作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述胶体溶液为透明质酸凝胶。

作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述注射给药为膝关节腔注射、皮下注射或静脉注射。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的融合蛋白中2分子AC-100显示协同作用，具有显著的促进软骨修复和新骨形成的效应，可以用于修复软骨，治疗骨关节炎、骨质疏松或骨折；同时本发明的融合蛋白克服了AC-100类药物不稳定、半衰期短的缺点，在血浆和关节腔中具有显著更长的半衰期，有利于降低给药频率和给药量。

附图说明

图1为HSA021-1、HSA021-2表达纯化后SDS-PAGE电泳图(左)和Western-blot图(右)。其中，A为HSA021-1表达纯化后SDS-PAGE电泳图(左)和Western-blot图(右)，1～4均为HSA021-1诱导后的培养基上清，NC为未诱导的培养基上清，M为蛋白Marker，PC为阳性对照；B为HSA021-2表达纯化后SDS-PAGE电泳图(左)和Western-blot图(右)，1～4均为HSA021-2诱导后的培养基上清，NC为未诱导的培养基上清，M为蛋白Marker，PC为阳性对照。

图2为不同剂量的HSA021-1、HSA021-2和AC-100对大鼠间充质干细胞Col2A1基因表达的影响的统计图。

图3为不同剂量的HSA021-1、HSA021-2和AC-100对大鼠间充质干细胞Acan基因表达的影响的统计图。

图4为相同剂量的HSA021-1、HSA021-2和AC-100治疗兔软骨缺损模型，12周后的ICRS评分的统计图。

图5为相同剂量的HSA021-1、HSA021-2和AC-100治疗斑马鱼骨质疏松模型，各处理组的荧光强度的统计图。

图6为相同剂量的HSA021-1、HSA021-2和AC-100治疗斑马鱼骨质疏松模型，斑马鱼脊椎骨荧光强度拍照图。

图7为相同剂量的HSA021-1、HSA021-2和AC-100处理小鼠颅骨，HE染色显示对照组与治疗组颅骨厚度比较图。

图8为相同剂量的HSA021-1、HSA021-2和AC-100处理小鼠颅骨，各处理组小鼠颅骨厚度比较的统计图。

图9为HSA021-2和AC-100在兔血浆中半衰期比较图。

图10为对HSA021-2和AC-100在兔关节腔中半衰期比较图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1 AC-100肽的合成

AC-100肽(SEQ ID NO:1)委托上海翱博生物科技有限公司采用常规固相工艺合成，合成的肽纯度＞98％。

实施例2重组融合蛋白菌株的构建和表达

融合蛋白HSA021-1、HSA021-2的重组表达菌株的构建委托南京金斯瑞生物有限公司完成。主要步骤为：合成目标基因(SEQ ID NO:2，对应于编码HSA021-1的核苷酸序列，其中包含编码信号肽的序列；SEQ ID NO:4，对应于编码HSA021-2的核苷酸序列，其中包含编码信号肽的序列)，经XhoI/NotI双酶切连接于经同样酶切的表达酵母表达载体pPICZaA，用10μg连接后的表达载体转染毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33，PCR鉴定阳性克隆。挑选阳性克隆培养于BMGY培养基，OD₆₀₀达3.0时，收获菌体，并重悬于BMGY培养基，每隔24小时加入终浓度为1％的甲醇诱导4天。离心后收集上清，进行SDS-PAGE和western-blot鉴定，结果如图1所示。

由图1可知，分别成功构建HSA021-1和HSA021-2的表达载体和重组菌株，经诱导培养后，成功表达目的蛋白，分子量均为73kD左右。

实施例3对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的作用

取8周龄SD大鼠3只，脱臼处死，70％乙醇消毒后，剪开腹腔，分离股骨。用注射器吸取低糖DMEM培养液(含肝素1mL/L)反复冲洗骨髓腔，以冲出骨髓。

骨髓液制成单细胞悬液，加入含10％FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)的DMEM-F12完全培养基，以10⁷个/mL的密度接种在培养瓶中，置37℃、5％CO₂培养箱中培养，48h后换培养液，以后每3d更换培养液，以除去不贴壁的造血细胞。至细胞长满至80％～90％，进行传代，加入间质干细胞的完全培养液重悬细胞，置37℃、5％CO₂培养箱中培养。

用含不同浓度(0.1μM和1μM)的融合蛋白HSA021-1、HSA021-2或AC-100肽的完全成软骨培养基重悬BMSCs，使得细胞浓度为每毫升5.0×10⁵个，并以PBS(磷酸缓冲盐溶液)为阴性对照。处理的BMSCs置于37℃，5％CO₂饱和湿度条件下孵育。每2～3天更换含相应浓度的融合蛋白HSA021-2或AC-100肽的完全成软骨培养基，持续诱导21天后，收集细胞，Trizol法提取总RNA，逆转录获得cDNA，实时定量PCR测定Col2A1和Acan基因的表达，结果如图2和图3所示。

由图2和图3可知，不同浓度的HSA021-1、HSA021-2或AC-100肽均可诱导Col2A1、Acan基因的mRNA表达量增加，并表现出明显的量效关系和时效关系，说明HSA021-1、HSA021-2和AC-100肽均可促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化，同时HSA021-2的效应显著高于HSA021-1或AC-100肽(p<0.05)，且HSA021-2的效应远远高于HSA021-1效应的2倍，表明融合蛋白HSA021-2中2分子的AC-100具有协同效应。

实施例4对兔软骨缺损模型的修复作用

取3月龄新西兰兔，随机分为4组，分别为阴性对照组、AC-100组(10mg)、HSA021-1(10mg)、HSA021-2组(10mg)，每组10只，雌雄各半；肌注氯胺酮麻醉动物，对动物右侧后肢膝关节部位剃毛，碘伏消毒，对兔右侧膝关节髌骨及韧带内侧进行纵向切口，依次切开皮肤、皮下组织和关节囊，暴露膝关节股骨端，用钻头钻出直径4.2mm、深3mm的关节软骨缺损，将髌骨复位后，依次缝合肌肉和皮肤切口。术后每只新西兰兔肌注14万U青霉素钠防止感染，2次/天，连续7天，建立软骨缺损模型。

各组动物于造模后的第7、14、21、28天，进行术侧关节腔注射给药。阴性对照组(生理盐水)、AC-100组(10mg/动物)、HSA021-1(10mg/动物)、HSA021-2组(10mg/动物)，分别给予相应的药物，给药体积为0.5mL。

对动物实施造模手术后，试验期间每天观察实验动物术侧关节情况(红肿、破损等)，并于末次给药后12周处死所有动物并进行解剖，对各组动物的受损关节软骨进行大体观察并拍照，并根据国际软骨修复协会(ICRS)的评分标准对新西兰兔右侧膝关节软骨缺损进行评分，结果如图4所示。

由图4可知，AC-100和HSA021-1、HSA021-2均可使关节软骨评分显著改善，且HSA021-2的修复作用显著优于HSA021-1或AC-100(p<0.05)。同时，HSA021-2的效应高于HSA021-1效应的2倍，提示HSA021-2中2分子的AC-100具有协同效应。

实施例5对斑马鱼骨质疏松模型的作用

受精后3天(3dpf)的正常野生型AB品系斑马鱼，用泼尼松处理96小时，建立斑马鱼骨质疏松症模型。骨质疏松症模型斑马鱼随机分为8组，每组30尾于六孔板中，分别静脉注射给予生理盐水作为阴性对照组、HSA021-1(剂量为10、100ng/尾)、HSA021-2(剂量为10、100ng/尾)、AC-100(剂量为10、100ng/尾)，特立帕肽(100ng/尾)作为阳性对照组，28℃培养箱孵育96小时后，用0.2％钙黄绿素进行染色，染色后进行拍照并采集数据，分析统计斑马鱼脊椎骨荧光强度(S)，以统计学意义评价供试品对泼尼松诱导的斑马鱼骨质疏松症的治疗作用，结果如图5和图6所示。用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异。

由图5和图6可知，与生理盐水对照组相比，AC-100、HSA021-1、HSA021-2和特立帕肽(Teriparatide)均可显著提高斑马鱼脊椎骨荧光强度，显示对泼尼松诱导的斑马鱼骨质疏松症的治疗有作用；其中AC-100(100ng组)、HSA021-1(10、100ng组)、HSA021-2(10、100ng组)和特立帕肽(100ng组)，差异具有统计学意义。

同时，相同剂量的HSA021-2效应显著优于HSA021-1、AC-100和特立帕肽，相同剂量的HSA021-2组效应高于HSA021-1组的2倍，提示融合蛋白HSA021-2中2分子的AC-100具有协同效应。

实施例6体内颅骨成骨作用

雄性5～6周KM小鼠，分为8组，每组10只，分别为阴性对照组(生理盐水)、AC-100低剂量组(40μg/kg)、AC-100高剂量组(400μg/kg)、HSA021-1低剂量组(40μg/kg)、HSA021-1高剂量组(400μg/kg)、HSA021-2低剂量组(40μg/kg)、HSA021-2高剂量组(400μg/kg)、阳性对照组(特立帕肽30μg/kg)。小鼠头皮剃毛消毒，以正中线与两侧眶上缘连线交点为进针点，向右后方进针至皮下，用微量注射器小鼠右侧颅骨表面注射相应药物10μL，每天1次，连续给药5天。动物分笼饲养，自由摄食饮。

22天后处死所有小鼠，迅速取出颅骨(主要包括双侧顶骨)，去除软组织后用4％多聚甲醛固定，EDTA脱钙液处理，至脱钙完全后修剪标本，冠状位从前向后连续冰冻切片，切片厚度为40μm。所有切片进行HE染色，常规脱水、透明、封片。利用Image-Pro Plus软件及相关系统完成图像采集。每张切片以矢状缝两侧厚度最大处为起始点，向左右两侧每隔1mm取一个测量点，每侧取3点，按左右侧分别记录，测量所得平均值作为颅骨厚度值，结果如图7和图8所示。

由图7和图8可知，与阴性对照组相比，AC-100高剂量组、HSA021-1高剂量组、HSA021-2低、高剂量组和特立帕肽组小鼠颅骨厚度显著增加，且差异具有统计学意义。相同剂量的HSA021-2组小鼠颅骨厚度显著高于HSA021-1或AC-100组，且HSA021-2促进颅骨成骨的效应高于HSA021-1的2倍，提示融合蛋白HSA021-2中2分子的AC-100具有协同效应。

实施例7血浆半衰期的比较试验

为了证实表达的融合蛋白HSA021-2比AC-100具有更长的半衰期，利用LC/MSMS方法检测HSA021-2蛋白和AC-100肽在兔体内的半衰期。

LC/MSMS方法学建立，Finnigan TSQ Discovery Max液质联用仪，配以SurveyorHPLC系统，检测限为1-1000ng/mL，回收率大于80％。

取6只新西兰兔，随机分成两组(每组3只)，每组分别静脉注射0.5mg/kg HSA021-2蛋白和AC-100，并在5、10、15、30、60、120、180、300分钟分别取血样0.5mL于抗凝管中，2000rpm离心，取血浆-20℃保存至测定。

利用LC/MSMS法测定血药浓度，取血浆100μL，加入含内标(Internal standard，IS)2000ng/mL乙腈：甲醇(70:30)的混合溶剂500μL，振荡，12000rpm离心10分钟，上清液进样20μL，进行LC/MSMS分析，采用3P97药代动力学软件计算主要药代动力学参数，结果如图9所示。

由图9可知，HSA021-2蛋白的半衰期为7天，AC-100的半衰期为0.75小时，HSA021-2蛋白的半衰期显著高于AC-100(p<0.01)。HSA021-2蛋白较长的半衰期有利于药物持久的发挥药效，降低给药次数。

实施例8关节腔局部半衰期的比较试验

为了证实合成的HSA021-2蛋白在关节腔局部同样具有较长的半衰期，利用LC/MSMS方法检测HSA021-2蛋白和AC-100在兔膝关节腔的半衰期。

LC/MSMS方法学建立，Finnigan TSQ Discovery Max液质联用仪，配以SurveyorHPLC系统，检测限为1-1000ng/mL，回收率大于80％。

取6只新西兰兔，随机分成两组(每组3只)，每组分别右后肢关节腔注射10mgHSA021-2蛋白或AC-100，并在5、10、15、30、60、120、180、300分钟分别取关节滑液0.1mL于EP管中，2000rpm离心，-20℃保存至测定。

利用LC/MSMS法测定药物浓度，取关节滑液20μL，加入含IS 2000ng/mL乙腈：甲醇(70:30)的混合溶剂100μL，振荡，12000rpm离心10分钟，上清液进样20μL，进行LC/MSMS分析，采用3P97药代动力学软件计算主要药代动力学参数，结果如图10所示。

由图10可知，HSA021-2蛋白关节腔内的半衰期约为18小时，AC-100关节腔内的半衰期为0.26小时，HSA021-2蛋白关节腔内的半衰期显著高于AC-100(p<0.01)。

由上述实施例可知，本发明融合蛋白HSA021-1、HSA021-2在体外可以促进间充质干细胞向软骨细胞分化，并刺激软骨细胞的增殖；在体内，HSA021-1、HSA021-2对软骨损伤具有明显的修复作用，对新骨的生成具有明显的促进作用；且HSA021-2的效应高于同剂量的HSA021-1的2倍，表明融合蛋白HSA021-2中2分子的AC-100具有协同效应；并且HSA021-2在血浆和膝关节腔中的半衰期也明显长于AC-100。因此，本发明的HSA021-2呈现出明显优于AC-100的促进软骨修复和新骨形成的效应，且融合蛋白中的2分子AC-100具有协同效应；同时HSA021-2具有更长的半衰期，有利于降低药物用量和给药频率，有希望用于软骨修复或骨关节炎以及骨质疏松的治疗。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州安辰新药研究院有限公司

<120> 一种融合蛋白、其药物组合物及用途

<130> 20181015

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Thr Asp Leu Gln Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly

1 5 10 15

Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp

20

<210> 2

<211> 1883

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcgagaaaa gaacagactt gcaggagaga ggagacaacg acatttcccc attcagtgga 60

gacggtcagc cttttaagga cggtggtgga ggttcagacg ctcataaatc cgaagtcgcc 120

cacagattca aggatttggg tgaagagaac ttcaaagctc ttgttttgat tgcctttgca 180

caatacttgc aacagtgtcc attcgaagat catgttaagt tggtcaacga agttactgag 240

tttgctaaaa cctgtgttgc agatgaatct gctgagaatt gcgacaagtc ccttcacact 300

ttgttcggtg acaaattgtg tactgttgct acccttagag aaacctatgg agagatggcc 360

gattgttgcg caaagcaaga accagagaga aacgaatgtt tcttgcagca taaagatgac 420

aacccaaatc ttcctagatt ggttagacct gaggttgatg tcatgtgcac agcttttcat 480

gacaatgaag agactttctt gaagaaatac ctttacgaaa tcgctagaag acacccatac 540

ttctatgccc ctgagttgtt gtttttcgca aaaagataca aggctgcctt tactgaatgt 600

tgccaagcag ctgataaagc cgcatgtttg cttccaaagc ttgatgaatt gagagacgag 660

ggtaaagcat cttccgctaa acaaagattg aagtgcgcta gtcttcagaa atttggagaa 720

agagccttca aggcttgggc cgttgcaaga ttgtcccaaa gatttcctaa agccgaattc 780

gcagaggtct caaaattggt tacagatctt actaaggttc atactgaatg ttgccacgga 840

gatttgcttg agtgtgctga tgacagagct gacttggcca agtatatttg cgaaaaccag 900

gattccatct caagtaaatt gaaagaatgt tgcgagaaac cattgcttga aaagtcacat 960

tgtattgcag aagttgagaa cgatgagatg ccagccgacc ttccttcatt ggctgccgat 1020

ttcgtcgaaa gtaaagacgt ttgtaagaat tacgctgagg ccaaggacgt tttcttggga 1080

atgttccttt acgaatatgc tagaagacat ccagattact cagttgtctt gcttttgaga 1140

ttggctaaga cttatgaaac taccttggag aaatgttgcg cagctgccga ccctcacgaa 1200

tgttatgcta aagtctttga tgagttcaag ccattggttg aagagcctca aaacttgatc 1260

aagcagaatt gtgaattgtt cgagcaactt ggagaataca aatttcagaa cgctcttttg 1320

gttagatata ccaagaaagt cccacaagtt tctacaccta ctttggttga ggtctccaga 1380

aatttgggta aagttggatc aaaatgttgc aagcatccag aagcaaaaag aatgccttgt 1440

gctgaggact acttgagtgt tgtccttaat cagttgtgcg tccttcacga aaagacccca 1500

gtctctgata gagttaccaa atgttgcaca gagagtttgg ttaacagaag accatgtttc 1560

tctgctttgg aagtcgacga gacatatgtt cctaaggaat tcaacgctga gacctttaca 1620

ttccatgccg atatttgtac cttgtctgaa aaagagagac aaatcaagaa acagacagct 1680

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gatgactttg cagctttcgt tgaaaaatgt tgcaaggccg atgacaagga gacttgtttt 1800

gcagaagagg gtaaaaagtt ggtcgcagca tcacaggcag cattgggtct tcatcatcat 1860

catcatcatt aatgagcggc cgc 1883

<210> 3

<211> 619

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Asp Leu Gln Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly

1 5 10 15

Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys

20 25 30

Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys

35 40 45

Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe

50 55 60

Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr

65 70 75 80

Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr

85 90 95

Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr

100 105 110

Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu

115 120 125

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130 135 140

Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu

145 150 155 160

Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr

165 170 175

Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala

180 185 190

Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro

195 200 205

Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln

210 215 220

Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys

225 230 235 240

Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe

245 250 255

Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu

260 265 270

Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys

290 295 300

Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu

305 310 315 320

Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp

325 330 335

Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp

340 345 350

Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp

355 360 365

Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr

370 375 380

Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys

385 390 395 400

Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile

405 410 415

Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln

420 425 430

Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr

435 440 445

Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys

450 455 460

Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr

465 470 475 480

Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro

485 490 495

Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg

500 505 510

Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys

515 520 525

Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu

530 535 540

Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu

545 550 555 560

Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met

565 570 575

Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys

580 585 590

Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln

595 600 605

Ala Ala Leu Gly Leu His His His His His His

610 615

<210> 4

<211> 1967

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgagaaaa gaacagactt gcaggagaga ggagacaacg acatttcccc attcagtgga 60

gacggtcagc cttttaagga cggtggtgga ggttcaacag acttgcagga gagaggagac 120

aacgacattt ccccattcag tggagacggt cagcctttta aggacggtgg tggaggttca 180

gacgctcata aatccgaagt cgcccacaga ttcaaggatt tgggtgaaga gaacttcaaa 240

gctcttgttt tgattgcctt tgcacaatac ttgcaacagt gtccattcga agatcatgtt 300

aagttggtca acgaagttac tgagtttgct aaaacctgtg ttgcagatga atctgctgag 360

aattgcgaca agtcccttca cactttgttc ggtgacaaat tgtgtactgt tgctaccctt 420

agagaaacct atggagagat ggccgattgt tgcgcaaagc aagaaccaga gagaaacgaa 480

tgtttcttgc agcataaaga tgacaaccca aatcttccta gattggttag acctgaggtt 540

gatgtcatgt gcacagcttt tcatgacaat gaagagactt tcttgaagaa atacctttac 600

gaaatcgcta gaagacaccc atacttctat gcccctgagt tgttgttttt cgcaaaaaga 660

tacaaggctg cctttactga atgttgccaa gcagctgata aagccgcatg tttgcttcca 720

aagcttgatg aattgagaga cgagggtaaa gcatcttccg ctaaacaaag attgaagtgc 780

gctagtcttc agaaatttgg agaaagagcc ttcaaggctt gggccgttgc aagattgtcc 840

caaagatttc ctaaagccga attcgcagag gtctcaaaat tggttacaga tcttactaag 900

gttcatactg aatgttgcca cggagatttg cttgagtgtg ctgatgacag agctgacttg 960

gccaagtata tttgcgaaaa ccaggattcc atctcaagta aattgaaaga atgttgcgag 1020

aaaccattgc ttgaaaagtc acattgtatt gcagaagttg agaacgatga gatgccagcc 1080

gaccttcctt cattggctgc cgatttcgtc gaaagtaaag acgtttgtaa gaattacgct 1140

gaggccaagg acgttttctt gggaatgttc ctttacgaat atgctagaag acatccagat 1200

tactcagttg tcttgctttt gagattggct aagacttatg aaactacctt ggagaaatgt 1260

tgcgcagctg ccgaccctca cgaatgttat gctaaagtct ttgatgagtt caagccattg 1320

gttgaagagc ctcaaaactt gatcaagcag aattgtgaat tgttcgagca acttggagaa 1380

tacaaatttc agaacgctct tttggttaga tataccaaga aagtcccaca agtttctaca 1440

cctactttgg ttgaggtctc cagaaatttg ggtaaagttg gatcaaaatg ttgcaagcat 1500

ccagaagcaa aaagaatgcc ttgtgctgag gactacttga gtgttgtcct taatcagttg 1560

tgcgtccttc acgaaaagac cccagtctct gatagagtta ccaaatgttg cacagagagt 1620

ttggttaaca gaagaccatg tttctctgct ttggaagtcg acgagacata tgttcctaag 1680

gaattcaacg ctgagacctt tacattccat gccgatattt gtaccttgtc tgaaaaagag 1740

agacaaatca agaaacagac agctttggtc gaacttgtta agcacaaacc taaggcaaca 1800

aaagagcaat tgaaggctgt catggatgac tttgcagctt tcgttgaaaa atgttgcaag 1860

gccgatgaca aggagacttg ttttgcagaa gagggtaaaa agttggtcgc agcatcacag 1920

gcagcattgg gtcttcatca tcatcatcat cattaatgag cggccgc 1967

<210> 5

<211> 647

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Thr Asp Leu Gln Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly

1 5 10 15

Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Leu Gln

20 25 30

Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly Asp Gly Gln Pro

35 40 45

Phe Lys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

50 55 60

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

65 70 75 80

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

85 90 95

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

100 105 110

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

115 120 125

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

130 135 140

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

145 150 155 160

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

165 170 175

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

180 185 190

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

195 200 205

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

210 215 220

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

225 230 235 240

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

245 250 255

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

260 265 270

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

275 280 285

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

290 295 300

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

305 310 315 320

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

325 330 335

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

340 345 350

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

355 360 365

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

370 375 380

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

385 390 395 400

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

405 410 415

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

420 425 430

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

435 440 445

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

450 455 460

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

465 470 475 480

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

485 490 495

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

500 505 510

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

515 520 525

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

530 535 540

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

545 550 555 560

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

565 570 575

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

580 585 590

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

595 600 605

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

610 615 620

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

625 630 635 640

Leu His His His His His His

645

Claims (7)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括通过连接子与人血清白蛋白连接的两分子AC-100，所述AC-100的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述融合蛋白的连接方式为AC-100—连接子—AC-100—连接子—人血清白蛋白；所述连接子为GGGGS；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

2.如权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗修复软骨、治疗骨关节炎、治疗骨质疏松或治疗骨折的药物中的用途。

3.如权利要求2中所述的用途，其特征在于，所述融合蛋白与透明质酸或非甾体抗炎药联用用于治疗骨关节炎。

4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由权利要求1所述的融合蛋白与药学上可接受的载体制成。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体为盐水溶液或胶体溶液，所述药物组合物的给药方式为注射给药。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述胶体溶液为透明质酸凝胶。

7.如权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述注射给药为膝关节腔注射、皮下注射或静脉注射。

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