CN112979824B - EphA7-Fc融合蛋白及其在预防和/或治疗骨质疏松疾病药物中的应用 - Google Patents

EphA7-Fc融合蛋白及其在预防和/或治疗骨质疏松疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及EphA7‑Fc融合蛋白及其在预防和/或治疗骨质疏松疾病药物中的应用，属于生物医学技术领域。所述EphA7‑Fc融合蛋白和骨靶向性EphA7‑Fc‑HA融合蛋白均能够显著促进成骨细胞的功能，能够显著抑制破骨细胞的功能；所述EphA7‑Fc和骨靶向性EphA7‑Fc‑HA融合蛋白均能够缓解不同原因造成的骨丢失。

Description

EphA7-Fc融合蛋白及其在预防和/或治疗骨质疏松疾病药物 中的应用
技术领域
本发明涉及EphA7-Fc融合蛋白及其在预防和/或治疗骨质疏松疾病药物中的应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
骨质疏松症定义为一种全身性的代谢性骨病，是一种发病隐匿、常见但又诊断不足的疾病；以骨量减少、骨的微结构破坏为特征，导致骨脆性增加，容易发生骨折，骨质有机成分生成不足、继发性钙盐减少及骨组织微隙结构破坏是其主要表现。骨质疏松症目前已经成为世界性问题，是继肿瘤、心血管疾病之后又一严重危害人类健康的一种疾病。有研究显示，骨质疏松症其发病率居常见病、多发病的第7位。目前医学上还未有安全而有效的根治方法帮助已疏松的骨胳恢复原状。其早期准确诊治将有助于为更好的防治骨质疏松提供依据。因此，正确认识、早期治疗显得尤为重要。
目前骨质疏松的诊断仍沿用1994年WHO颁布的以骨矿含量(BMC)和骨密度(BMD)为基础的骨质疏松诊断标准，即以双能X线吸收法(DEXA)为基本测量方法。BMC或BMD在青年成人平均值的1个标准差(s)以内者为正常；若以T评分(T值)表示，即T值≥-1.0为正常，-2.5＜T值＜-1.0为骨量减少，T值≤-2.5为骨质疏松。血清学上，利用检测反应成骨细胞代谢功能的I型前胶原氨基端前肽(PINP)和破骨细胞代谢功能的I型胶原C端肽β降解产物(β-CTX)等浓度来辅助判断骨质疏松症的状况。2001年美国国立卫生院发表的关于骨质疏松预防、诊断和治疗的共识，认为骨质疏松症的特征是骨强度的损害，骨折的危险性增加。骨强度主要反映骨密度和骨质量的整和，骨质量包含骨结构、骨转换、损伤的积累(如微骨折)、骨矿化和骨材料即胶原及矿盐的特性等。骨质疏松症治疗的目的包括：缓解骨痛，增加骨密度，降低骨折发生率。骨的强度和完整性取决于源于造血细胞的破骨细胞对骨的吸收和来自骨髓基质细胞的成骨细胞的骨的重建之间的平衡。随着绝经年龄老化或疾病等原因，使破骨细胞骨吸收超过了成骨细胞的骨形成，致使骨量丢失。治疗骨质疏松的药物中，大部分是抑制骨吸收药，通过减少破骨细胞的生成或减少破骨细胞活性为主的药物来抑制骨吸收，防止骨量过多丢失。对快速丢失的严重骨质疏松症患者可利用骨吸收抑制剂药物。用于治疗的质疏松症药物的主要包括以下几种：(1)维生素D和钙剂等，是治疗骨质疏松的基础用药；(2)抗骨吸收药物：如双膦酸盐、雌激素、选择性雌激素受体激动剂(以雷洛昔芬为代表)、RANKL的抑制剂狄诺塞麦和降钙素等，这类药物能抑制破骨细胞骨吸收，减缓骨质丢失过程；(3)促骨形成药物：如甲状旁腺激素、特立帕肽和氟化物，这类药物能促进成骨细胞骨形成作用；(4)其他药物：如他汀类药和地诺单抗等；(5)中药治疗，主要为淫羊藿类植物雌激素中草药。虽然目前的骨质疏松药物对骨质疏松症有一定的治疗效果，但是部分药物长期服用后还会产生一定的副作用，新的骨质疏松症治疗靶点亟待进一步开发。同时目前尚缺乏刺激成骨细胞活性的骨形成药物，对缓慢骨丢失的人群应用此类药物则有利于维护骨小梁结构的完整性。
生促红素人肝细胞受体(Eph)家族是哺乳动物基因组中成员最多的受体酪氨酸激酶(RTK)家族。Eph受体在个体发育的全过程中扮演着举足轻重的角色。在胚胎发育中，Eph受体广泛存在于各类细胞中，参与神经元突触的生长方向调控、血管发育控制等。在成年个体中，Eph家族受体的分布更加集中，其生理学作用转变为组织修复与炎症反应。Eph受体的配体为Ephrin，Eph受体可以和多种Ephrin配体分子结合，并能激活细胞的双向信号，生促红素人肝细胞受体A7(Eph-A7)是由正常B细胞产生的天然Eph-A2拮抗剂，B细胞表面的Eph-A7被蛋白酶切割后向胞外基质释放带有配体结合区(LBD)的Eph-A7片段，包含第29至第277的多肽链，命名为Eph-A7TR。目前尚无Eph-A7与骨质疏松相关的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于EphA7-Fc融合蛋白及其在预防和/或治疗骨质疏松疾病药物中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
EphA7-Fc融合蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。
EphA7-Fc融合蛋白在制备预防和/或治疗骨质疏松疾病药物中的应用。
骨靶向性EphA7-Fc-HA融合蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。
骨靶向性EphA7-Fc-HA融合蛋白在制备预防和/或治疗骨质疏松疾病药物中的应用。
有益效果
发明人研究发现，EphA7-Fc融合蛋白能够显著促进成骨细胞的功能，能够显著抑制破骨细胞的功能；进一步的，发明人在所述EphA7-Fc融合蛋白的基础上又发现了具有骨靶向性的融合蛋白EphA7-Fc-HA，所述EphA7-Fc-HA融合蛋白同样具有促进成骨细胞和抑制破骨细胞的功能；所述EphA7-Fc融合蛋白和骨靶向性EphA7-Fc-HA融合蛋白均能够缓解不同原因造成的骨丢失。
附图说明
图1为实施例1中BSA和EphA7-Fc刺激人源成骨细胞系MG63细胞的碱性磷酸酶(ALP)染色分析图。
图2为实施例1中BSA和EphA7-Fc刺激人源成骨细胞系MG63细胞的蛋白质检测分析图。
图3为实施例1中BSA和EphA7-Fc刺激人源成骨细胞系MG63细胞成骨功能相关基因Collagen I的表达分析图。
图4为实施例1中BSA和EphA7-Fc刺激人源成骨细胞系MG63细胞成骨功能相关基因Alp的表达分析图。
图5为实施例2中BSA和EphA7-Fc刺激BMMs细胞破骨向分化过程中破骨细胞功能相关基因MMP9的表达分析图。
图6为实施例2中BSA和EphA7-Fc刺激BMMs细胞破骨向分化过程中破骨细胞功能相关基因CTSK的表达分析图。
图7为实施例2中BSA和EphA7-Fc刺激BMMs细胞破骨向分化过程中破骨细胞功能相关基因TRAP的表达分析图。
图8为实施例2中BSA和EphA7-Fc刺激BMMs细胞破骨向分化过程中破骨细胞功能相关转录因子NFATc1的表达分析图。
图9为实施例2中BSA和EphA7-Fc刺激BMMs细胞破骨向诱导分化7天后TRAP染色分析图。
图10为实施例3中假手术(SHAM)组和OVX组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后对小鼠骨量的microCT影响图。
图11为实施例3中SHAM组和OVX组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后小鼠骨体积分数(BV/TV)量化图。
图12为实施例3中SHAM组和OVX组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后小鼠骨小梁数量(Tb.N)量化图。
图13为实施例3中SHAM组和OVX组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后小鼠骨小梁厚度(Tb.Th)量化图。
图14为实施例3中SHAM组和OVX组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后小鼠骨小梁间隙(Tb.Sp)量化图。
图15为实施例3中SHAM组和OVX组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后小鼠连接系数(Conn.D)量化图。
图16为实施例3中SHAM组和OVX组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后小鼠结构模型指数(SMI)量化图。
图17为实施例3中SHAM组和OVX组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后小鼠骨矿物密度(BMD)量化图。
图18为实施例3中小鼠骨组织的切片染色图。
图19为实施例3中小鼠血清中反应成骨细胞代谢功能的PINP水平图。
图20为实施例3中小鼠血清中破骨细胞功能的β-CTX-I水平图。
图21为为实施例4中对照组和后肢去负荷组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后对小鼠骨量的microCT影响图。
图22为实施例4中对照组和后肢去负荷组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后对小鼠BV/TV的量化图。
图23为实施例4中对照组和后肢去负荷组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后对小鼠Conn.D的量化图。
图24为实施例4中对照组和后肢去负荷组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后对小鼠Tb.Th的量化图。
图25为为实施例4中对照组和后肢去负荷组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后对小鼠Tb.N的量化图。
图26为为实施例4中对照组和后肢去负荷组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后对小鼠SMI的量化图。
图27为为实施例4中对照组和后肢去负荷组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后对小鼠Tb.Sp的量化图。
图28为实施例4中对照组和后肢去负荷组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后对小鼠BMD的量化图。
图29为实施例4中小鼠血清中反应破骨细胞功能的β-CTX-I的水平图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
所述EphA7-Fc融合蛋白的氨基酸序列SEQ NO.1如下：
EVLLLDSKAQQTELEWISSPPNGWEEISGLDENYTPIRTYQVCQVMEPNQNNWLRTNWISKGNAQRIFVELKFTLRDCNSLPGVLGTCKETFNLYYYETDYDTGRNIRENLYVKIDTIAADESFTQGDLGERKMKLNTEVREIGPLSKKGFYLAFQDVGACIALVSVKVYYKKCWSIIENLAIFPDTVTGSEFSSLVEVRGTCVSSAEEEAENAPRMHCSAEGEWLVPIGKCICKAGYQQKGDTCEPCGRGFYKSSSQDLQCSRCPTHSFSDKEGSSRCECEDGYYRAPSDPPYVACLEVLFQGPGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
所述EphA7-Fc-HA融合蛋白的氨基酸序列SEQ NO.2如下：
EVLLLDSKAQQTELEWISSPPNGWEEISGLDENYTPIRTYQVCQVMEPNQNNWLRTNWISKGNAQRIFVELKFTLRDCNSLPGVLGTCKETFNLYYYETDYDTGRNIRENLYVKIDTIAADESFTQGDLGERKMKLNTEVREIGPLSKKGFYLAFQDVGACIALVSVKVYYKKCWSIIENLAIFPDTVTGSEFSSLVEVRGTCVSSAEEEAENAPRMHCSAEGEWLVPIGKCICKAGYQQKGDTCEPCGRGFYKSSSQDLQCSRCPTHSFSDKEGSSRCECEDGYYRAPSDPPYVACLEVLFQGPGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGDDDDDD
所述EphA7-Fc和EphA7-Fc-HA的制备为本领域常规技术。
实施例1：
EphA7-Fc对成骨细胞骨功能的影响实验：
1、利用人源成骨细胞系MG63细胞，利用5.0μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)对照组和5.0μg/mL的EphA7-Fc及诱导分化培养基(含50g/mL维生素C，2.0mMβ-甘油磷酸钠，10nM地塞米松的DMEM高糖完全培养基)进行骨向诱导分化。
2、分别在诱导分化的2天后，用TriZol收集细胞，用4.0％多聚甲醛固定。
3、碱性磷酸酶ALP染色方法：
将转染siRNA后的细胞用吸液管吸出培养液，加入冷的PBS充分洗涤细胞表面2-3遍，利用4％的多聚甲醛固定液固定细胞10分钟，除去多聚甲醛固定液，用PBS清洗2次，按照如下比例配置ALP染色液(VECTOR Blue SK-5300)
pH 7.4Tris-HCl缓冲液5.0mL；
A液 80μL；
B液 80μL；
C液 10μL；
24孔板每孔加入500μL混匀的染色液，染色过夜，细胞着色变蓝。
4、细胞总RNA提取步骤：
将用Trizol收集好的细胞样本，按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min，4℃，12000g离心15min，吸取上层水相，至另一离心管中(注：尽量不要吸取中间界面)，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置5-10min，4℃，12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底，加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃，7500g离心5min，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥10-15min，加入30-50μl ddH2O，测O.D.值定量RNA浓度。
5、RNA的反转录反应：
使用Takara公司RT kit，具体方法如下：
反转录反应：
Figure BDA0002926430590000081
混匀，37℃反应15min；85℃，5s，放置冰上；将得到的10μL反转录反应后的cDNA稀释20倍，到200μL，-20℃保存以备下一步实时定量PCR检测。
实时定量PCR检测细胞中RNA的表达
使用Takara公司SYBR进行实时定量PCR检测。
具体步骤如下：
构建PCR反应体系为：
Figure BDA0002926430590000091
混匀，反应程序如下：
1)95℃，15min；
2)PCR扩增：94℃，15sec，变性；60℃，30sec，退火；72℃，30sec，延伸；共40个循环；
3)溶解曲线，进行产物鉴定。
根据溶解曲线确定q-PCR扩增的mRNA产物特异性，明确该产物为目的基因。本次步骤中使用的相关基因引物见步骤6。
6、成骨细胞功能相关基因的检测
引物序列如下表1所示。
表1
Hum-GAPDH F ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
Hum-GAPDH R GCCATCACGCCACAGTTTC
Hum-ALP F GTGAACCGCAACTGGTACTC
Hum-ALP R GAGCTGCGTAGCGATGTCC
Hum-Col1a F GAGGGCCAAGACGAAGACATC
Hum-Col1a R CAGATCACGTCATCGCACAAC
7、总蛋白质提取和分析：将5.0μg/mL的BSA(对照组)和5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激好的细胞，加入冷的PBS充分洗涤细胞表面2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作；细胞裂解缓冲液(RIPA裂解液，含PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂)裂解细胞，每孔加100μL细胞裂解缓冲液，冰上震荡10min，用细胞刮将细胞刮至孔一侧，将细胞碎片吸入1.5mL离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3s，重复3-4次；4℃，12000g离心10min，留取上清，测定蛋白浓度，加入5x buffer100℃加热10min；通过Western Bloting方法检测成骨细胞中关键转录因子ATF4(CellSignaling Technology,#11815)和RUNX2(Cell Signaling Technology,#12556)的表达，Gapdh作为总蛋白的内参。
实验结果如下：
图1为5.0μg/mL的BSA对照组和5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激人源成骨细胞系MG63细胞的碱性磷酸酶(ALP)染色分析图，结果表明5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激成骨细胞后成骨细胞的阳性细胞数量显著增加。
图2为5.0μg/mL的BSA对照组和5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激人源成骨细胞系MG63细胞的蛋白质检测分析图，结果表明5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激成骨细胞后成骨细胞功能相关的转录因子ATF4和Runx2蛋白水平显著升高。
图3-4为5.0μg/mL的BSA对照组和5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激人源成骨细胞系MG63细胞成骨功能相关基因Collagen I和Alp的表达分析图，结果表明5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激细胞后成骨功能相关基因Collagen I和Alp的表达水平显著升高，成骨功能增强。
实施例2：
EphA7-Fc对破骨细胞骨功能的影响实验：
1、从小鼠的骨髓中分离骨髓单核细胞进行破骨向诱导分化。C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级。6-8周龄雄性C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，75％酒精浸泡灭菌；取双侧股骨、胫骨，用无菌注射器吸取无菌PBS冲洗骨髓腔数次，收集液体于15mL离心管中，1000r/min离心5分钟；弃上清液，加入5mL红细胞裂解液，裂解5分钟；离心，弃上清液，用5ml含有10％胎牛血清和双抗的α-MEM培养基(完全培养基)+10ng/mL M-CSF重悬，接种于10cm培养皿中，置入5％CO2，37℃细胞培养箱培养24小时；收集上清离心，弃上清液，将细胞分成两组：5.0μg/mL的BSA(对照组)和5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激组，细胞用含有30ng/mL M-CSF+50ng/mL RANKL的完全培养基重悬，细胞计数后以1*105/孔的密度接种于24孔板中，每隔两天换一次含有30ng/ml M-CSF+50ng/ml RANKL的完全培养基，进行破骨向诱导分化1、3、7天。
2、在诱导分化1、3、7天收取细胞总RNA和总蛋白，细胞总RNA提取、反转录、检测方法同实施例1。
3、破骨细胞功能相关基因的检测引物见下表2。
表2
TRAP-F 5’-GCGACCATTGTTAGCCACATACG-3’
TRAP-R 5’-CGTTGATGTCGCACAGAGGGAT-3’
MMP9-F 5’-GCTGACTACGATAAGGACGGCA-3’
MMP9-R 5’-GCGGCCCTCAAAGATGAACGG-3’
Ctsk-F 5’-CAGCAGAGGTGTGTACTATG-3
Ctsk-R 5’-GCGTTGTTCTTATTCCGAGC-3’
Gapdh-F 5’-TCACCACCATGGAGAAGGC-3’
Gapdh-R 5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3’
破骨细胞功能相关基因的检测以Gapdh为内参，所有基因的表达水平均相对于Gapdh的表达水平。
4、破骨细胞功能相关蛋白的检测，利用Western Bloting技术分析破骨细胞分化过程中NFATc1(Cell Signaling Technology,#8032)的蛋白水平。
5、TRAP染色按Sigma TRAP染色试剂盒说明进行。
细胞诱导分化7天后，去离子水37℃预热备用，细胞用PBS冲洗，将25mL柠檬酸盐溶液，65mL丙酮和8mL 37％甲醛配制成细胞固定液，室温固定细胞30秒，去离子水冲洗3次；将六偶氮副品红液0.5mL和亚硝酸盐溶液0.5mL混匀30秒，静置2分钟；取100mL烧杯，加入下列溶液：37℃预热的去离子水45mL、预先配置好的六偶氮副品红液和亚硝酸盐溶液混合液1mL、萘酚AS-BI磷酸盐0.5mg、醋酸缓冲液2mL、酒石酸盐溶液1mL配成染色孵育液，水浴加热至37℃，将染色孵育液孵育细胞，37℃，0.5小时，去离子水冲洗，镜下观察，光镜下观察含有3个细胞核以上的染色阳性的多核巨细胞为破骨细胞。
实验结果：
图5-7分别为5.0μg/mL的BSA对照组和5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激BMMs细胞破骨向分化过程中破骨细胞功能相关基因MMP9、CTSK和TRAP的表达分析图，结果表明5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激后，破骨细胞诱导分化过程中MMP9、CTSK和TRAP的表达显著降低，破骨细胞的功能受到抑制。
图8为5.0μg/mL的BSA对照组和5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激BMMs细胞破骨向分化过程中破骨细胞功能相关转录因子NFATc1的表达分析图，结果表明5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激细胞后NFATc1的蛋白水平显著降低。
图9为5.0μg/mL的BSA对照组和5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激BMMs细胞破骨向诱导分化7天后，TRAP染色分析图，结果表明5.0μg/mL的EphA7-Fc刺激细胞后破骨细胞的大小及数量显著降低。
实施例3：
EphA7-Fc及骨特异靶向的EphA7-Fc-HA对卵巢切除术导致的小鼠骨丢失的影响：
1、C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，雌性8周龄，饲养至4个月龄，利用灭菌的手术器械从背部去除小鼠双侧卵巢，构建卵巢去除模型，假手术组保留卵巢；
2、待小鼠恢复一周后，将小鼠进行随机分组，每组8-10只小鼠，假手术组注射100μL PBS(磷酸盐缓冲液)，手术对照组注射100μL PBS，手术组分别按如下四组注射不同剂量的EphA7-Fc或骨特异靶向的EphA7-Fc-HA药物，四组剂量如下(药物/小鼠体重比)：EphA7-Fc(25μg,1.0mg/kg)，EphA7-Fc-HA(10μg,0.4mg/kg)，EphA7-Fc-HA(25μg,1.0mg/kg)，EphA7-Fc-HA(75μg,3.0mg/kg)，小鼠每隔4天给以尾静脉注射药物一次，连续给药8周。
3、眼球取血，收集小鼠外周血，4度冰箱静置30min，3000rpm离心15分钟，收集上清，冻存于-80度冰箱中，用于检测血清中成骨细胞和破骨细胞代谢的标志物。
4、颈椎脱臼处死小鼠，将后肢取下，分离小鼠后肢骨，右侧完整股骨固定于75％乙醇当中，用于microCT分析小鼠骨表型，剩余骨组织冲去骨髓，冷冻保存于-80℃冰箱中，用于骨组织总RNA和总蛋白提取。
5、microCT分析骨表型：
将固定好的骨组织置于Scanco MedicalμCT40设备中进行扫描，扫描选择最高分辨率(10μm)参数，扫描股骨远端630个层面，通过设备进行三维重建，选取生长板最远端+1cm的位置往近端80个层面进行分析，分析小鼠骨体积分数(BV/TV)，骨小梁数量(Tb.N)，骨小梁间隙(Tb.Sp)，骨小梁厚度(Tb.Th)，连接系数(Conn.D)，结构模型指数(SMI)，骨矿物密度(BMD)等。
6、小鼠骨组织切片分析实验：
利用分离出来的小鼠后肢胫骨，用4％多聚甲醛固定液固定3天，然后转入20％EDTA溶液进行脱钙7天，直至小鼠骨头变软，将小鼠骨组织用梯度乙醇进行脱水；用石蜡进行包埋，切片成5-8微米厚度，展片至载玻片上，接着将玻片放入55度烘箱中烤片2h；再将片子转移到二甲苯中进行脱蜡，转移至梯度酒精(高到低)中进行复水；最后在分别放入苏木精和伊红染液(或阿尔新蓝染液)进行染色，洗片，封片，观察。
实验结果如下：
图10为假手术(SHAM)组和OVX组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后对小鼠骨量的microCT影响图，每组呈现代表性的三只图片，结果表明OVX手术后小鼠骨量显著降低，给以PBS并不能改善骨量，而给以1.0mg/kg的EphA7-Fc后，小鼠骨量得到明显改善，给以0.4mg/kg，1.0mg/kg和3.0mg/kg浓度的EphA7-Fc-HA后小鼠骨量随着剂量的升高骨量得到明显改善。
图11-17为microCT量化图，结果表明，OVX手术后，小鼠骨体积分数(BV/TV)，骨小梁数量(Tb.N)，骨小梁厚度(Tb.Th)，连接系数(Conn.D)，骨矿物密度(BMD)显著降低，而结构模型指数(SMI)和骨小梁间隙(Tb.Sp)显著升高，反应出雌激素缺乏导致小鼠骨量显著降低，给以1.0mg/kg的EphA7-Fc和给以0.4mg/kg，1.0mg/kg和3.0mg/kg浓度的EphA7-Fc-HA后小鼠骨体积分数(BV/TV)，骨小梁数量(Tb.N)，骨小梁厚度(Tb.Th)，连接系数(Conn.D)，骨矿物密度(BMD)得到一定恢复，部分参数甚至恢复到假手术组水平，而结构模型指数(SMI)和骨小梁间隙(Tb.Sp)的升高得到抑制，说明给以EphA7-Fc或EphA7-Fc-HA能够一定程度上改善小鼠的骨量。
图18为小鼠骨组织的切片染色图，通过HE和甲苯胺兰染色，结果表明，OVX手术后小鼠骨量显著降低，给以PBS后小鼠骨量并不能改善，而给以1.0mg/kg的EphA7-Fc和给以0.4mg/kg，1.0mg/kg和3.0mg/kg浓度的EphA7-Fc-HA后小鼠骨量随着剂量的升高骨量得到明显改善。
图19-20为小鼠血清中反应成骨细胞代谢功能的PINP和破骨细胞功能的β-CTX-I的水平图，通过ELISA分析实验，结果表明，OVX手术后，反应成骨细胞的代谢功能的PINP水平显著降低，给以1.0mg/kg的EphA7-Fc或给以0.4mg/kg，1.0mg/kg和3.0mg/kg浓度的EphA7-Fc-HA后小鼠成骨细胞的代谢活性得到一定恢复，OVX手术后，体现破骨细胞代谢水平的β-CTX-I显著升高，给以1.0mg/kg的EphA7-Fc或给以0.4mg/kg，1.0mg/kg和3.0mg/kg浓度的EphA7-Fc-HA后，β-CTX-I水平受到显著抑制，说明给以EphA7-Fc或EphA7-Fc-HA能够显著抑制雌激素缺乏模型导致的破骨细胞功能增强，并能促进成骨细胞的功能。
实施例4：
EphA7-Fc及骨特异靶向的EphA7-Fc-HA对后肢去负荷导致的小鼠骨丢失的影响：
1、构建小鼠的后肢去负荷模型：
C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，雄性，8周龄，饲养至4个月龄，将小鼠尾部悬挂，与地面水平线呈30°角，使小鼠后肢处于悬挂状态，持续时间4周，此状态适用于模拟后肢去负荷导致的骨丢失。
2、给药处理：将小鼠随机进行分组，分别设定对照组(给以100μL PBS安慰剂)、去负荷组(给以100μL体积，1.0mg/kg Fc剂量蛋白安慰剂)、去负荷组分别通过腹腔注射给以(药物/小鼠体重比)0.4mg/kg，1.0mg/kg和3.0mg/kg浓度的EphA7-Fc(TG-HS)和1.0mg/kg的EphA7-Fc-HA(体积为100μL)，每隔4天给以一次注射，持续给药4周，4周后颈椎脱臼法处死小鼠，将后肢小心剪下(胫骨、股骨保留完整)；
3、眼球取血，收集小鼠外周血，4℃冰箱静置30min，3000rpm离心15分钟，收集上清，冻存于-80℃冰箱中，用于检测血清中成骨细胞和破骨细胞代谢的标志物。
4、小鼠后肢股骨远端的骨表型分析；小心将肌肉剔除，将完整股骨置于75％乙醇中固定；将固定好的骨组织置于Scanco MedicalμCT40设备中进行扫描，扫描选择最高分辨率(10μm)参数，扫描股骨远端630个层面，通过设备进行三维重建，选取生长板最远端+1cm的位置往近端80个层面进行分析，分析小鼠骨体积分数(BV/TV)，骨小梁数量(Tb.N)，骨小梁间隙(Tb.Sp)，骨小梁厚度(Tb.Th)，连接系数(Conn.D)，结构模型指数(SMI)，骨矿物密度(BMD)等。
实验结果如下：
图21为对照组(Ctrl)和后肢去负荷组在给以不同剂量的EphA7-Fc和EphA-Fc-HA后对小鼠骨量的microCT影响图，每组呈现代表性的三只小鼠骨组CT图片，结果表明，后肢去负荷后小鼠骨量显著降低，给以PBS并不能改善骨量，而给以0.4mg/kg，1.0mg/kg和3.0mg/kg浓度的EphA7-Fc后，小鼠骨量得到明显改善，给以1.0mg/kg浓度的EphA7-Fc-HA后小鼠骨量随着剂量的升高骨量得到明显改善。
图22-28为microCT量化图，结果表明，后肢去负荷后，给以PBS安慰剂组小鼠骨体积分数(BV/TV)，骨小梁数量(Tb.N)，骨小梁厚度(Tb.Th)，连接系数(Conn.D)，骨矿物密度(BMD)显著降低，而结构模型指数(SMI)和骨小梁间隙(Tb.Sp)显著升高，反应出后肢去负荷导致小鼠骨量显著降低，给以0.4mg/kg，1.0mg/kg和3.0mg/kg浓度的EphA7-Fc或给以1.0mg/kg浓度的EphA7-Fc-HA后小鼠骨体积分数(BV/TV)，骨小梁数量(Tb.N)，骨小梁厚度(Tb.Th)，连接系数(Conn.D)，骨矿物密度(BMD)得到一定恢复，而结构模型指数(SMI)和骨小梁间隙(Tb.Sp)的升高得到抑制，说明给以EphA7-Fc或EphA7-Fc-HA能够一定程度上改善小鼠的骨量。
图29为小鼠血清中反应破骨细胞功能的β-CTX-I的水平图，通过ELISA分析实验，结果表明，后肢去负荷后，体现破骨细胞代谢水平的β-CTX-I显著升高，给以0.4mg/kg，1.0mg/kg和3.0mg/kg浓度的EphA7-Fc或给以1.0mg/kg浓度的EphA7-Fc-HA后，β-CTX-I水平受到显著抑制，说明给以EphA7-Fc或EphA7-Fc-HA能够显著抑制后肢去负荷模型导致的破骨细胞功能增强。
通过实验数据发现EphA7-Fc和EphA7-Fc-HA对于卵巢切除术(OVX)导致的骨丢失的治疗效果均能使骨体积分数(BV/TV)和骨矿物密度(BMD)等反应骨量的参数恢复到对照组水平，而对于后肢去负荷模型小鼠导致的骨丢失模型中，EphA7-Fc和EphA7-Fc-HA均可使骨体积分数(BV/TV)和骨矿物密度(BMD)等反应骨量的参数恢复到对照组水平的70％左右。与其他骨质疏松症药物相比，包括维生素D、钙剂、双膦酸盐、雌激素、选择性雌激素受体激动剂(以雷洛昔芬为代表)、RANKL的抑制剂狄诺塞麦、及降钙素、甲状旁腺激素、特立帕肽、氟化物及淫羊藿类植物雌激素中草药等，他们对于卵巢切除术(OVX)导致导致骨丢失的治疗效果最多只能恢复到对照组90％左右，而对于去负荷导致的骨丢失最多能到达对照组的70％，说明EphA7-Fc和EphA7-Fc-HA对于骨质疏松症的治疗效果均有更好的优势。
综上所述，EphA7-Fc融合蛋白的细胞优势浓度为5μg/mL，有效浓度范围为2.5-10μg/mL，动物实验优势浓度为1.0mg/kg，有效浓度范围为0.4-3.0mg/kg，骨靶向性EphA7-Fc-HA的优势浓度为1.0mg/kg，有效浓度范围为0.4-3.0mg/kg。通过上述实施例有效验证了以下技术效果：
1、通过EphA7-Fc对成骨细胞骨功能的影响实验，证实EphA7-Fc刺激促进成骨细胞的功能；
2、通过EphA7-Fc对破骨细胞功能的影响实验，证实EphA7-Fc刺激后破骨细胞功能显著降低破骨细胞的活性显著降低；
3、通过尾静脉注射不同浓度的EphA7-Fc或骨特异靶向的EphA7-Fc-HA对卵巢切除术(OVX)小鼠的骨丢失影响实验，证实EphA7-Fc或骨特异靶向的EphA7-Fc-HA处理的OVX小鼠骨量降低收到抑制，成骨细胞的功能降低收到抑制，破骨细胞功能的增强得到恢复；
4、通过腹腔注射不同浓度的EphA7-Fc或骨特异靶向的EphA7-Fc-HA对后肢去负荷小鼠的骨丢失影响实验，证实EphA7-Fc或骨特异靶向的EphA7-Fc-HA处理的小鼠骨量降低收到抑制，成骨细胞的功能降低收到抑制，破骨细胞功能的增强得到恢复。
综上所述，发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
氨基酸序列表
<110> 中国航天员科研训练中心
<120> EphA7-Fc融合蛋白及其在预防和/或治疗骨质疏松疾病药物中的应用
<160> 2
<210> 1
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Leu Leu Leu Asp Ser Lys Ala Gln Gln Thr Glu Leu Glu Trp
1 5 10 15
Ile Ser Ser Pro Pro Asn Gly Trp Glu Glu Ile Ser Gly Leu Asp Glu
20 25 30
Asn Tyr Thr Pro Ile Arg Thr Tyr Gln Val Cys Gln Val Met Glu Pro
35 40 45
Asn Gln Asn Asn Trp Leu Arg Thr Asn Trp Ile Ser Lys Gly Asn Ala
50 55 60
Gln Arg Ile Phe Val Glu Leu Lys Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Pro Gly Val Leu Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr
85 90 95
Tyr Glu Thr Asp Tyr Asp Thr Gly Arg Asn Ile Arg Glu Asn Leu Tyr
100 105 110
Val Lys Ile Asp Thr Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr Gln Gly Asp
115 120 125
Leu Gly Glu Arg Lys Met Lys Leu Asn Thr Glu Val Arg Glu Ile Gly
130 135 140
Pro Leu Ser Lys Lys Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Val Gly Ala
145 150 155 160
Cys Ile Ala Leu Val Ser Val Lys Val Tyr Tyr Lys Lys Cys Trp Ser
165 170 175
Ile Ile Glu Asn Leu Ala Ile Phe Pro Asp Thr Val Thr Gly Ser Glu
180 185 190
Phe Ser Ser Leu Val Glu Val Arg Gly Thr Cys Val Ser Ser Ala Glu
195 200 205
Glu Glu Ala Glu Asn Ala Pro Arg Met His Cys Ser Ala Glu Gly Glu
210 215 220
Trp Leu Val Pro Ile Gly Lys Cys Ile Cys Lys Ala Gly Tyr Gln Gln
225 230 235 240
Lys Gly Asp Thr Cys Glu Pro Cys Gly Arg Gly Phe Tyr Lys Ser Ser
245 250 255
Ser Gln Asp Leu Gln Cys Ser Arg Cys Pro Thr His Ser Phe Ser Asp
260 265 270
Lys Glu Gly Ser Ser Arg Cys Glu Cys Glu Asp Gly Tyr Tyr Arg Ala
275 280 285
Pro Ser Asp Pro Pro Tyr Val Ala Cys Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly
290 295 300
Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
305 310 315 320
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
325 330 335
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
340 345 350
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
355 360 365
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
370 375 380
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
385 390 395 400
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435 440 445
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (2)

1.EphA7-Fc融合蛋白在制备预防和/或治疗骨质疏松疾病药物中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。
2.骨靶向性EphA7-Fc-HA融合蛋白在制备预防和/或治疗骨质疏松疾病药物中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。
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