CN117860761A - 齐墩果酸在改善胆汁酸受体tgr5诱导的细胞凋亡中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了齐墩果酸在改善胆汁酸受体TGR5诱导的细胞凋亡中的应用，属于生物医药技术领域。将齐墩果酸用于“牛磺胆酸‑TGR5过表达”细胞凋亡模型后，能显著改善其活力。将齐墩果酸用于胆汁酸过量腹泻的小鼠后，能缓解脾脏肥大和肠道长度缩短，减低小肠和结肠的损伤，减少杯状细胞的数量，还能降低TGR5、Bax和TNF‑α的表达，上调Bcl2的表达，进而达到防治胆汁酸性腹泻的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及齐墩果酸在改善胆汁酸受体TGR5诱导的细胞凋亡中的应用。
背景技术
胆汁酸受体TGR5(Takeda G protein-coupled receptor 5)是一种七膜跨膜受体，其结构包括一个N-端外胞质区、七个跨膜区、三个胞质环和一个C-端胞质区。TGR5的功能主要包括转导胆汁酸的信号、调节能量代谢以及参与炎症和免疫反应等生理过程。TGR5在人体中的功能多样，主要包括：胆汁酸信号转导：TGR5作为胆汁酸的受体，参与调节胆汁酸的合成、转运和排泄过程，并通过信号传递途径调节胆汁酸对胆固醇代谢、肝脏功能和胆道张力的影响。能量代谢调节：TGR5在胰岛素分泌、葡萄糖代谢和能量平衡等方面起到重要作用。它通过调节胆汁酸在肠道和肝脏的代谢过程，影响胰岛素敏感性和脂肪酸氧化，从而调节血糖水平和体重控制。
近年来研究发现，TGR5通过参与炎症和免疫反应过程，对炎症性肠病(Inflammatory bowel disease)、代谢性疾病和肿瘤等疾病具有调节作用。例如，TGR5的缺失会导致巨噬细胞对病原高度敏感，从而增加肠道的炎症性反应。在炎症性肠病的动物中，适当激活TGR5能通过Hippo信号通路促进肠道干细胞的增殖，促进肠道恢复。因此，TGR5可以通过调节炎症因子的产生和细胞免疫功能的调控，参与调节免疫系统的反应。
在胆结石等疾病的治疗中，往往会使用牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸等进行治疗。此外，在胆囊切除术的患者也会存在胆汁酸释放紊乱，引起肝功能损伤、胆汁酸性腹泻等问题。
胆汁酸受体是胆汁酸调控肠道的主要途径，但目前对于胆汁酸受体TGR5在肠上皮损伤和修复中研究和理解有不足，目前发现，在一般的溃疡性结肠炎和克罗恩病患者体内，存在TGR5表达缺失，肠道内容物中次级胆汁酸含量不足等问题，但这些问题与胆汁酸性腹泻的原理有根本性的差异。
在胆汁酸性腹泻中，我国在临床上目前有以下几种治疗方案：奥贝胆酸：奥贝胆酸是一种有效的FXR激动剂，间接抑制CYP7A1的基因表达，从而抑制肝内胆汁酸合成，减少到达结肠的胆汁酸量。国外已有研究评估了奥贝胆酸在胆汁酸腹泻患者中的疗效，发现在原发性胆汁酸腹泻患者以及继发性疾病和回肠切除小于45cm的患者中均存在有益作用。这种疗法似乎有很大的潜力，但存在用药安全性等问题还有待进一步研究。
胆汁酸会过量到达结肠是患者的主要病理生理改变，因此考来烯胺是BAD患者的一线用药。该类药物是碱性阴离子交换树脂，与肠内胆汁酸结合形成不溶性化合物，阻碍胆汁酸重吸收，从而使胆汁酸排泄量增加，可安全、有效的降低血浆胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。但消胆胺也会引起肝内胆汁酸合成增加，使得胆汁酸过量到达结肠。因此，临床实践中大部分患者治疗后复发可能与该机制相关。
因此，虽然临床上有部分药物和治疗方案，相关的药物都存在一定程度的安全性问题。且对于TGR5这一关键的胆汁酸受体在相关疾病中的作用没有给予足够的重视。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供齐墩果酸在改善胆汁酸受体TGR5诱导的细胞凋亡中的应用。
本发明的另一目的在于提供齐墩果酸在制备防治胆汁酸性腹泻药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
齐墩果酸在改善胆汁酸受体TGR5诱导的细胞凋亡中的应用。
优选的，所述细胞凋亡的模型构建方法包括：用牛磺胆酸处理构建的TGR5过表达细胞。
更优选的，所述TGR5过表达细胞的构建方法包括：构建含有TGR5核苷酸的质粒，进行病毒包装和转染，即得；所述TGR5核苷酸的氮端添加Flag标签。
更优选的，所述牛磺胆酸的浓度为40μmol/L。
优选的，所述齐墩果酸的浓度为25-200μM。
本发明还提供了齐墩果酸在制备防治胆汁酸性腹泻药物中的应用。
优选的，所述齐墩果酸能缓解脾脏肥大和肠道长度缩短。
优选的，所述齐墩果酸能缓解小肠和结肠的损伤，以及损伤导致的杯状细胞的数量减少。
优选的，所述齐墩果酸能降低TGR5、Bax和TNF-α的表达，上调Bcl2的表达。
优选的，所述药物包括齐墩果酸和药学上可接受的辅料。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了齐墩果酸在改善胆汁酸受体TGR5诱导的细胞凋亡中的应用。细胞实验结果表明，齐墩果酸能显著改善凋亡细胞模型的细胞活力。动物实验结果表明，齐墩果酸能缓解由于胆汁酸过量腹泻引起的脾脏肥大和肠道长度缩短，解小肠和结肠的损伤，减少杯状细胞的数量，还能降低TGR5、Bax和TNF-α的表达，上调Bcl2的表达，进而达到防治胆汁酸性腹泻的效果。
附图说明
图1为不同细胞TGR5的蛋白质表达水平；
图2为TUNEL染色判定牛磺胆酸+TGR5能成功构建肠道胆汁酸性细胞凋亡的细胞模型；
图3为转录组学探究凋亡关键基因的表达水平；
图4为齐墩果酸显著改善“牛磺胆酸-TGR5过表达”的细胞活力；
图5为齐墩果酸对胆汁酸腹泻小鼠脾脏和肠道的影响；其中CON为对照组，OA为齐墩果酸组，BAs为胆汁酸组，BAs+OA：用齐墩果酸治疗的腹泻小鼠模型；
图6为胆汁酸性腹泻及齐墩果酸治疗对小鼠小肠和结肠上皮形态的影响；A为各组小鼠小肠和结肠石蜡切片苏木精&伊红染色(H&E染色)的代表图；B-D为各组小鼠小肠绒毛长度、隐窝深度及结肠隐窝深度；E为各组小鼠小肠和结肠石蜡切片PAS染色代表图；F-G为小肠、结肠中杯状细胞数量的统计；
图7为齐墩果酸对小鼠基因表达的影响；Intestine为小肠；Colon为结肠；
图8为小肠胆汁酸靶向代谢组和16sRNA测序技术分析结果；A为小肠胆汁酸靶向代谢组分析结果，B为16sRNA测序技术分析结果。
具体实施方式
本发明提供了齐墩果酸在改善胆汁酸受体TGR5诱导的细胞凋亡中的应用。
本发明所述细胞凋亡的模型构建方法优选包括：用牛磺胆酸处理构建的TGR5过表达细胞；本发明所述TGR5过表达细胞的构建方法优选包括：构建含有TGR5核苷酸的质粒，进行病毒包装和转染，即得；所述TGR5核苷酸的氮端添加Flag标签；所述牛磺胆酸的浓度优选为40μmol/L。
本发明所述齐墩果酸的浓度为25-200μM。
本发明以构建好的胆汁酸受体TGR5诱导的细胞凋亡模型为实验对象，研究齐墩果酸对其影响。实验结果表明，在25-200μM范围内，齐墩果酸能显著改善“牛磺胆酸-TGR5过表达”的凋亡细胞模型的细胞活力。
本发明还提供了齐墩果酸在制备防治胆汁酸性腹泻药物中的应用。
本发明所述齐墩果酸能缓解脾脏肥大和肠道长度缩短，能缓解小肠和结肠的损伤，以及损伤导致的杯状细胞的数量减少，降低TGR5、Bax和TNF-α的表达，上调Bcl2的表达。
本发明以灌服胆汁酸、齐墩果酸的小鼠作为实验对象，称量小鼠的脾脏，测量小鼠小肠和结肠的长度，评估胆汁酸性腹泻及胆汁酸干预对器官的影响；使用H&E染色、PAS染色评估齐墩果酸对小鼠胆汁酸性腹泻的改善作用；利用qPCR检测小鼠小肠和结肠中TGR5、TNF-α、Bcl2和Bax的基因表达。实验结果表明，齐墩果酸能显著缓解胆汁酸性腹泻小鼠的脾脏肥大和肠道长度缩短；齐墩果酸处理则能使小肠和结肠上皮的损伤恢复至正常水平；齐墩果酸能显著降低TGR5、Bax和TNF-α的表达，上调Bcl2的表达。
本发明所述药物优选包括齐墩果酸和药学上可接受的辅料；所述辅料包括粘合剂、赋形剂、稀释剂、崩解剂、湿润剂、助溶剂和表面活性剂中的一种或多种。本发明中的活性成分齐墩果酸的含量为所述药物重量的1～99％。本发明的药物剂量可通过治疗胆汁酸性腹泻的严重性、给药途径、病人年龄、健康状况等因素确定，例如，本发明齐墩果酸的剂量可以为每个病人0.01μg～1000mg/d。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
TGR5过表达细胞的建立
基于小鼠小肠细胞Mode-K构建TGR5过表达的细胞模型
1、首先利用广州美基生物科技有限公司生产的HiPure Unviersal RNA Mini试剂盒从野生型Mode-K细胞中提取总RNA。使用翊圣生物科技股份有限公司的反转录试剂盒(货号11139ES10)，使用荧光定量PCR对小鼠小肠细胞Mode-K中TGR5的表达水平进行检测。结果表明，未检测到细胞中有TGR5的表达，因此该小肠细胞Mode-K可以进行过表达以构建工具细胞。
2、根据小鼠转录本预测序列(NM_174985.2)设计用于克隆TGR5的ORF的上下游引物序列，引物序列为Forward-atgatgacacccaacagcactg(如SEQ ID NO.1所示)和Reverse-agaagtggggcactgtgagat(如SEQ ID NO.2所示)。克隆序列除带有CDS区核酸外，还含有CDS区前后的内含子序列共计1017bp(如SEQ ID NO.3所示)。
3、在设计质粒时，使用的基础质粒为在基础市售质粒的基础上，经过特定修饰：LV-EF1A-Kozak/mPGK-Hygro质粒，分别在克隆序列的氮端、碳端及两侧序列设计加上Flag标签、6×His标签，并与基础质粒连接，即得到如下质粒：Flag-TGR5、TGR5-6×His、Flag-TGR5-6×His。
4、对上述质粒行慢病毒的制备和过表达细胞的构建
首先将各目标质粒进行慢病毒包装，在转染前1天传代准备细胞：用0.25％胰蛋白酶消化293T细胞，10％血清的DMEM培养基培养24h，当细胞密度增加至80％以上时即可用于转染。在转染前2-4h用5mL不含抗生素的完全培养基换液。将质粒导入293T细胞，产生高滴度慢病毒，完成病毒包装。取培养后的细胞，用计数板调整细胞密度并接种于六孔板，分别加入MOI为10的对照和实验组慢病毒，5％CO237℃培养24h。为了获得稳定表达细胞系，转染48h后将细胞转移至10cm培养皿进行培养，更换为含300μg/mL的潮霉素B(Hygro)的新鲜培养基培养，扩增后即可得到稳定转染细胞。
5、过表达后得到相应的细胞，利用广州美吉生物科技有限公司生产的HiPureUnviersal RNAMini试剂盒对过表达细胞的总RNA进行提取。使用翊圣生物科技股份有限公司的反转录(货号11119ES60)及qPCR(货号11203ES03)试剂盒对野生型、空质粒、Flag-TGR5、Flag-TGR5-6×His和TGR5-6×His细胞中的TGR5基因的表达进行检测，利用碧云天RIPA裂解液、蛋白质上样缓冲液制备细胞蛋白质样品、利用SDS-PAGE凝胶法分离蛋白质，检测TGR5蛋白质的表达。具体结果如表1和图1(Vector代表空质粒组，TGR5代表过表达组)所示。
表1不同质粒转染的细胞TGR5过表达倍数
结果发现，理论上碳端有过表达6×His标签的细胞在基因水平上显著提高，但蛋白质水平则无显著差异(几乎检测不到)。其余两种的TGR5过表达水平由无法检测到CT值，上调至与内参β-actin相近的水平，蛋白质表达水平显著提高，且Flag-TGR5过表达细胞的蛋白质表达水平最高，说明在该细胞中，如进行TGR5的过表达，在氮端添加标签是更好的选择。
6、细胞冻存和复苏条件的优化：Mode-K细胞的常规培养体系为RPMI-1640+10％胎牛血清，Flag-TGR5过表达细胞仅用原有的培养体系无法复苏，在同样的复苏条件下，与野生型和空载体对照组相比，Flag-TGR5过表达细胞的成活率不到3％。
因此，本发明优化了Flag-TGR5过表达细胞的冻存液。原冻存液体系为：95％完全培养基(即RPMI-1640+10％胎牛血清)+5％DMSO，新冻存液体系为95％条件性培养基(RPMI-1640+1％Glutamax+4μmol/L天冬氨酸+40％胎牛血清)+5％DMSO。
表2不同冻存体系过表达细胞复苏后的成活率
结果发现，本发明新冻存液体系可显著提高Flag-TGR5过表达细胞的成活率。
实施例2
胆汁酸和胆汁酸受体诱导的肠上皮细胞凋亡模型的建立
1、将实施例1得到的Flag-TGR5过表达细胞分别将牛磺胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、猪胆酸5种胆汁酸加入细胞培养基(终浓度为40μmol/L浓度)，并使用含有相应胆汁酸的培养基，在温度37℃、湿度100％、5％CO2条件下，培养细胞24h。使用CCK-8试剂盒(GLPBIO，货号GK10001)测量不同胆汁酸对细胞的影响，具体结果如表3所示。
表3不同胆汁酸对TGR5过表达细胞活力的影响
注：同行无相同小写字母(如a、b、c)者表示差异显著。
结果发现，牛磺胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸均能造成TGR5过表达细胞的细胞活力降低，而猪胆酸则没有明显效果，牛磺胆酸的效果最明显。
2、使用CCK-8法比较牛磺胆酸在空质粒细胞和Flag-TGR5过表达细胞中的作用差异，具体实验方法与实施例2中的1相同，具体结果如表4所示。
表4牛磺胆酸在空质粒细胞和TGR5细胞中的作用差异
结果表明，牛磺胆酸降低TGR5细胞活力超过30％，而在空质粒组细胞中仅降低5％，提示牛磺胆酸可能通过TGR5受体抑制细胞活力。
3、使用牛磺胆酸分别处理Flag-TGR5过表达细胞(TGR5组)和空质粒细胞(Vector组)，具体实验方法与实施例2中的1相同，使用TUNEL染色(碧云天C1089试剂盒)进行分析，具体结果如图2所示。
结果表明，牛磺胆酸能造成TGR5过表达细胞凋亡细胞数量上调15倍左右。因此，本发明成功构建了“牛磺胆酸-TGR5过表达”的凋亡细胞模型。
4、利用转录组学解析“牛磺胆酸-TGR5”细胞凋亡模型的形成原因，具体结果如图3所示。
结果表明，相对于Vector组，TGR5组能抑制凋亡因子Bcl2、MCL1的下调，促炎症因子BAX的上调是细胞模型构建成功的重要因素。
实施例3
齐墩果酸对“牛磺胆酸-TGR5过表达”细胞凋亡模型的影响
使用不同浓度25、50、100、200、400μM的齐墩果酸分别处理实施例2得到的“牛磺胆酸-TGR5过表达”细胞24h。利用CCK-8评估齐墩果酸对细胞凋亡和增殖的影响，具体结果如图4所示。
结果发现，在25-200μM范围内，齐墩果酸能显著改善“牛磺胆酸-TGR5过表达”的凋亡细胞模型的细胞活力。
实施例4
动物实验
1、选用C57BL6小鼠32只，每组8只，设置对照组、胆汁酸处理组、齐墩果酸组、胆汁酸+齐墩果酸组，其中胆汁酸处理组、胆汁酸+齐墩果酸组给每只小鼠以100mg/kg的剂量灌服(胆酸：猪胆酸＝1:1，w:w)的胆汁酸混合物共7天，造成胆汁酸过量的小鼠腹泻，胆汁酸+齐墩果酸组小鼠另以50mg/kg的剂量同时处理7天。齐墩果酸组以50mg/kg的剂量处理14天。对照组使用蒸馏水用同样的手法处理相同的时间，在第15天结束试验并采集样品。
试验结束后，称量小鼠的脾脏，测量小鼠小肠和结肠的长度，评估胆汁酸性腹泻及胆汁酸干预对器官的影响。具体结果如图5所示。
结果表明，胆汁酸能引起脾脏肥大(图5A)以及小肠(图5B)和结肠(图5C)长度的缩短，表明过量的胆汁酸对动物有负面作用。而单独使用齐墩果酸对脾脏和肠道长度没有显著影响，但齐墩果酸能显著缓解胆汁酸性腹泻小鼠的脾脏肥大和肠道长度缩短。
2、对各组小鼠的小肠和结肠组织用H&E染色、PAS染色，评估齐墩果酸对小鼠胆汁酸性腹泻的改善作用，具体结果如图6所示。
结果表明，胆汁酸性腹泻显著损害了小鼠小肠和结肠上皮的形态(图6A-D)，还显著减少了杯状细胞的数量(图6E-G)。而齐墩果酸处理则能使损伤恢复至正常水平。表明齐墩果酸能显著改善胆汁酸诱导的腹泻。
3、利用qPCR检测小鼠小肠和结肠中TGR5、TNF-α、Bcl2和Bax的基因表达，具体结果如图7所示。
结果表明，与细胞一致，齐墩果酸能显著降低TGR5、Bax和TNF-α的表达，上调Bcl2的表达。
4、在灌服齐墩果酸后，使用靶向代谢组学对各组小鼠的肠道内容物中胆汁酸的含量进行检测，使用主成分分析法(PCA)对胆汁酸的整体变化情况进行分析；并利用16sRNA基因测序检测，利用非度量多维排列法(NMDS)对各组小鼠肠道菌群的整体变化进行分析，具体结果如图8所示。
结果表明，灌服齐墩果酸几乎不影响小鼠肠道中胆汁酸的丰度(图8A)，并且齐墩果酸缓解TGR5诱导肠上皮细胞凋亡和损伤的过程几乎不依赖与肠道微生物和小鼠肠道内胆汁酸的变化(图8B)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.齐墩果酸在改善胆汁酸受体TGR5诱导的细胞凋亡中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞凋亡的模型构建方法包括：用牛磺胆酸处理构建的TGR5过表达细胞。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述TGR5过表达细胞的构建方法包括：构建含有TGR5核苷酸的质粒，进行病毒包装和转染，即得；所述TGR5核苷酸的氮端添加Flag标签。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述牛磺胆酸的浓度为40μmol/L。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述齐墩果酸的浓度为25-200μM。
6.齐墩果酸在制备防治胆汁酸性腹泻药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述齐墩果酸能缓解脾脏肥大和肠道长度缩短。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述齐墩果酸能缓解小肠和结肠的损伤，以及损伤导致的杯状细胞的数量减少。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述齐墩果酸能降低TGR5、Bax和TNF-α的表达，上调Bcl2的表达。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物包括齐墩果酸和药学上可接受的辅料。
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