CN114315969A - 一种软骨再生肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种软骨再生肽及其应用。所述软骨再生肽为：(a).如SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列；或者，(b).在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)中氨基酸具有90％以上同源性的氨基酸序列。本发明的软骨再生肽可显著促进COL2A1基因、ACAN基因的mRNA表达量增加，促进间充质干细胞向软骨细胞的分化；此外，软骨再生肽SNV10还可以促进软骨细胞的增殖和修复，改善骨关节炎症状。

Description

一种软骨再生肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种软骨再生肽及其应用。

背景技术

骨关节炎为一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病。关节软骨损伤是骨关节炎的主要病理改变。关节软骨损伤后没有或很少有自我修复能力，这与关节软骨内无血管、神经及淋巴管支配有关。目前关节软骨损伤修复的主要治疗措施包括局部用药、软骨细胞移植、手术(关节置换)等，虽然可在一定程度上缓解症状，但由于未能充分激活关节软骨本身的修复机制，修复往往不完全，甚至可能引发周围组织发生降解，出现继发性骨关节炎。因此，关节软骨损伤修复成为骨科领域重要问题。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有强大的增殖能力、多向分化潜能及低免疫原性，在免疫调节、减轻炎症反应、损伤修复方面表现出广阔的应用前景，以间充质干细胞为种子细胞的组织工程学技术为治疗关节软骨损伤提供了新的方法，间充质干细胞具有向软骨细胞分化的潜能，研究发现间充质干细胞向软骨细胞分化并可修复动物的软骨缺损。运用间充质干细胞防治关节软骨损伤，不仅能在结构上影响组织修复，同时可以进行有效的免疫修饰及抗炎。但是，如何使间充质干细胞更有效的向软骨细胞分化是目前有待解决的问题。现在实验室常规使用的促进间充质干细胞分化增值的诱导剂是各种细胞因子，如转化生长因子TGF-β、胰岛素样生长因子IGF-1，然而这些细胞因子具有高浓度、高价格、高不良反应的缺点，而且人体的内环境是很难靠细胞因子来模拟的故寻找一种天然、安全、高效且可替代生长因子的药物成为当务之急。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种软骨再生肽SNV10及其应用。本发明的软骨再生肽可以促进软骨修复和/或治疗骨关节炎。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供了一种软骨再生肽，所述软骨再生肽为：

(a).如SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列；或者，

(b).在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)中氨基酸具有90％以上同源性的氨基酸序列。

在本发明中，SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列为Ser Asn Val IIe Leu Lys LysTyr Arg Asn，共10个氨基酸，发明人将其命名为软骨再生肽SNV10。

作为本发明所述软骨再生肽的优选实施方式，所述软骨再生肽采用固相合成工艺合成。合成的软骨再生肽纯度＞95％。

本发明还提供了一种组合物，包括上述软骨再生肽。

优选地，所述组合物还包括药物上可用的载体。所述载体为本领域常规的药物载体，例如葡萄糖、环糊精等。

所述组合物为胶囊剂、片剂、颗粒剂或粉剂的形式。

本发明还提供了上述软骨再生肽在促进COL2A1基因和ACAN基因表达量中的应用。

本发明的软骨再生肽SNV10可显著促进COL2A1基因、ACAN基因的mRNA表达量增加，并表现出明显的量效关系和时效关系，说明软骨再生肽SNV10可以诱导进COL2A1基因和ACAN基因的表达，促进间充质干细胞向软骨细胞的分化。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述软骨再生肽的浓度为0.1～10μM。

本发明还提供了上述软骨再生肽在促进间充质干细胞分化中的应用。

本发明还提供了上述软骨再生肽在制备软骨修复和/或骨关节炎药物中的应用。

本发明还提供了上述软骨再生肽在由IL-1β诱导损伤的大鼠软骨细胞增殖中的应用。

加入不同浓度的软骨再生肽SNV10处理IL-1β诱导损伤的大鼠软骨细胞，其结果为OD490明显升高，表明软骨再生肽SNV10促进了大鼠软骨细胞的增殖，其中1、10μM软骨再生肽SNV10剂量组在处理3、7天后，软骨细胞的增殖与模型对照组有显著的统计学意义。

本发明还提供了上述软骨再生肽在修复斑马鱼软骨损伤模型中的应用。在该应用中，软骨再生肽SNV10的浓度为20～500ng/尾。

在本发明中，中剂量(100ng/尾)、高剂量(500ng/尾)的软骨再生肽SNV10均显示出明显的软骨修复效果，尤其高剂量软骨再生肽SNV10修复软骨效果更佳，且量效关系明显。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种软骨再生肽SNV10及其应用，该可显著促进COL2A1基因、ACAN基因的mRNA表达量增加，促进间充质干细胞向软骨细胞的分化；此外，软骨再生肽SNV10还可以促进软骨细胞的增殖和修复，改善骨关节炎症状。

附图说明

图1为软骨再生肽SNV10的HPLC检测图谱图；

图2为不同浓度的软骨再生肽SNV10对间充质干细胞COL2A1基因和ACAN基因mRNA表达情况图；

图3为不同浓度的软骨再生肽SNV10在不同作用时间下对IL-1β损伤的大鼠软骨细胞增殖的影响图；

图4为不同剂量的软骨再生肽SNV10修复斑马鱼软骨损伤模型的荧光强度图；

图5为不同剂量的软骨再生肽SNV10修复斑马鱼软骨损伤模型结果图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、软骨再生肽SNV10的固相合成

本发明的软骨再生肽SNV10委托合肥国肽生物科技有限公司采用常规固相工艺合成，合成的软骨再生肽SNV10的纯度＞95％，其HPLC检测图谱分别如图1所示，合成500mg。软骨再生肽SNV10的氨基酸序列为：Ser Asn Val IIe Leu Lys Lys Tyr Arg Asn(如SEQ IDNO:1所示)，共10个氨基酸。

实施例2、软骨再生肽SNV10对间充质干细胞分化的作用

1、人间充质干细胞的培养和传代：将人骨髓间充质干细胞(BMSCs，购自广州赛业生物科技有限公司)复苏，加入完全培养基，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。复苏后的第二天，给复苏的细胞换用新鲜的完全培养基，每两天给细胞换新鲜的完全培养基直到细胞达80％-90％的汇合度，然后进行传代培养。

2、成软骨诱导：将软骨再生肽SNV10用磷酸缓冲液(PBS)溶解。用含不同浓度的软骨再生肽SNV10(0.1μM、1μM和10μM)的完全成软骨培养基重悬细胞，使得BMSCs的浓度为每毫升5.0×10⁵个细胞，并以PBS为阴性对照，1μM人胰岛素生长因子1(IGF-1)为阳性对照。处理的BMSCs置于37℃，5％C O2饱和湿度条件下孵育。每2-3天更换培养基，每管加入0.5mL新鲜完全成软骨培养基。

3、qPCR检测：收集细胞，Trizol法提取总RNA，逆转录得cDNA，反应条件为：30℃保温10分钟；42℃保温60分钟；85℃保温10分钟。以cDNA为模板，利用下列引物，对II型胶原(Col2A1)和蛋白聚糖(Aggrecan，Acan)进行定量PCR，反应条件为：50℃2分钟；95℃2分钟；95℃15秒，60℃32秒读板，40个循环。

表1

COL2A1-F1	CAAGAACAGCATTGCCTATC
		COL2A1-R1	ATAACAGTCTTGCCCCACTT
ACAN-F1	TGGGTCTGGAGTAGAAGTATCA
		ACAN-R1	GTTAGCTTCGTGGAATGCA
β-actin-F1	TGGATCAGCAAGCAGGAGTA
		β-actin-R1	TCGGCCACATTGTGAACTTT

参考图2，相对于空白组，浓度为0.1μM、1μM或10μM的软骨再生肽SNV10可显著促进COL2A1、ACAN的mRNA表达量增加，并表现出明显的量效关系和时效关系，说明软骨再生肽SNV10可促进间充质干细胞向软骨细胞的分化。

实施例3、软骨再生肽SNV10对IL-1β损伤的大鼠软骨细胞增殖的影响

原代培养：8周龄SD大鼠处死，取膝关节经75％酒精消毒后，在超净台中以α-MEM培养基洗涤3遍；将大鼠膝关节组织切开，剔除肌肉组织、脂肪组织，暴露膝关节软骨，用α-MEM洗二次，用解剖剪将膝关节软骨锐性切碎；用2倍体积含有4mg/mlⅠ型胶原酶(Gibco，货号：17018029)的α-MEM消化120分钟；消化的细胞悬液经70μm细胞滤网过滤，1500-2000rpm离心6分钟；细胞沉淀用α-MEM离心洗涤2次，用记数板进行细胞计数。细胞最终悬浮于含有10％胎牛血清的α-MEM中，接种到培养瓶中，于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养，每2-3天换液一次。

药物处理：取对数生长期的软骨细胞，消化后计数，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，接种到96孔板，每孔100ul，即每孔细胞为1×10⁴个。加入终浓度为10ng/mL的IL-1β处理24h，建立体外软骨细胞损伤模型。同时设立阴性对照组，不以IL-1β处理，而以同体积α-MEM培养基处理。IL-1β处理的软骨细胞分别加入不同浓度(0、0.01、0.1、1、10μM)的SNV10处理，并以30ng/ml的胰岛素生长因子1(IGF-1)作为阳性对照。收集各个时间点的细胞(0、1、3、7天)加入cellTiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂(Promega，Cat.No.G3582)，孵育4小时后，酶标仪测定OD490。

结果：如图3所示，软骨细胞经10ng/mL的IL-1β处理后，细胞活力明显下降，说明模型成立。

加入不同浓度的软骨再生肽SNV10处理，OD490明显升高，表明软骨再生肽SNV10促进了软骨细胞的增殖，其中1、10μM剂量组在处理3、7天后，软骨细胞的增殖与模型对照组有显著的统计学意义(P＜0.01)。

实施例4、软骨再生肽SNV10对斑马鱼软骨损伤模型的修复作用

随机选取受精后2天的转基因软骨荧光斑马鱼于六孔板中，每孔(即每浓度组)30尾斑马鱼，给予地塞米松处理建立斑马鱼软骨损伤模型。模型斑马鱼分别静脉注射给予生理盐水溶解的软骨再生肽SNV10，剂量为20、100、500n g/尾，给予浓度为1000μg/mL的硫酸软骨素处理作为阳性对照，同时设置正常对照组(给予生理盐水)和模型对照组(给予生理盐水)，每孔容量为3mL，28℃培养箱孵育72小时。实验结束后，每组随机选取10尾斑马鱼在显微镜下观察、拍照并保存图片，用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件，测定斑马鱼软骨荧光强度、斑马鱼角舌骨和Meckel’s软骨的长度和角度。软骨再生作用计算公式如下：

用T检验进行统计学分析，统计学处理结果用

表示，p<0.05表明具有显著性差异。

表2

正常对照组	892147±39372
		模型对照组	592361±52386
SNV10低剂量组	632587±58436
		SNV10中剂量组	703482±63694<sup>**</sup>
SNV10高剂量组	837452±65673<sup>**</sup>
		阳性对照组	886953±66376<sup>**</sup>

注：^**代表与模型对照相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

结果：与模型对照组相比，中、高剂量(分别为100、500ng/尾)的软骨再生肽SNV10处理，均显示出明显的软骨修复作用，表现为软骨再生肽SNV10中、高剂量组的斑马鱼的荧光强度明显高于模型对照组(**代表P＜0.01)，且量效关系明显(见表2、图4)，提示软骨再生肽SNV10有促进受损软骨再生的作用，各组斑马鱼软骨的荧光成像结果见图5(A为正常对照组，B为模型对照组，C为阳性对照组，D为软骨再生肽SNV10低剂量组，E为软骨再生肽SNV10中剂量组，F为软骨再生肽SNV10高剂量组)。

综上所述，本发明的软骨再生肽SNV10可以用于软骨修复和/或骨关节炎的应用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州领晟医疗科技有限公司

<120> 一种软骨再生肽及其应用

<130> 2021-12-27

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn

1 5 10

Claims (10)

1.一种软骨再生肽，其特征在于，所述软骨再生肽为：

(a).如SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列；或者，

(b).在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)中氨基酸具有90％以上同源性的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的软骨再生肽，其特征在于，所述软骨再生肽采用固相合成工艺合成。

3.一种组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的软骨再生肽。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物为胶囊剂、片剂、颗粒剂或粉剂的形式。

5.如权利要求1所述的软骨再生肽在促进COL2A1基因和ACAN基因表达量中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述软骨再生肽的浓度为0.1～10μM。

7.如权利要求1所述的软骨再生肽在促进间充质干细胞分化中的应用。

8.如权利要求1或2所述的软骨再生肽在制备软骨修复和/或骨关节炎药物中的应用。

9.如权利要求1或2所述的软骨再生肽在由IL-1β诱导损伤的大鼠软骨细胞增殖中的应用。

10.如权利要求1或2所述的软骨再生肽在修复斑马鱼软骨损伤模型中的应用。

Images