CN117752675B - 一种用于治疗骨质疏松的小分子rna及其应用 - Google Patents
一种用于治疗骨质疏松的小分子rna及其应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及一种用于治疗骨质疏松的小分子RNA及其应用。所述小分子RNA为tRF‑1:32‑Gly‑GCC‑4、tRF‑1:31‑Gly‑CCC‑3、tiRNA‑1:34‑Val‑CAC‑2或tiRNA‑1:33‑Gly‑GCC‑2‑M3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~4所示。本发明首次发现tRF‑1:32‑Gly‑GCC‑4、tRF‑1:31‑Gly‑CCC‑3、tiRNA‑1:34‑Val‑CAC‑2或tiRNA‑1:33‑Gly‑GCC‑2‑M3对于骨质疏松具有明显的治疗效果，细胞水平和小鼠水平的验证实验均表明了以上小分子RNA能够有效降低骨流失，提高骨密度、骨小梁数量和骨小梁体积分数，降低骨小梁分离度，促进骨形成，抑制骨髓内脂肪形成、破骨细胞数量和骨吸收，改善间充质干细胞分化异常及调控间充质干细胞分化，可以用于制备治疗骨质疏松的药物，为骨质疏松药物的临床治疗和发展提供了新方法和新思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于治疗骨质疏松的小分子RNA及其应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
骨质疏松（osteoporosis，OP）是一种以骨量减少、骨微观结构破坏和骨脆性增加为特征的骨代谢性疾病。患者通常出现周身骨痛、骨骼畸形、肌无力和易骨折等症状，严重影响患者身心健康和生活质量。其发病机制及防治策略的研究具有重要的科学意义和临床应用价值。目前，骨质疏松的治疗以促骨形成或抗骨吸收药物为主，但传统药物只能延缓骨质疏松进程，并不能改善患者骨质流失现象，且会引起颌骨骨坏死、血栓栓塞和中风等毒副作用。
小分子RNA药物能够通过多种途径调控致病基因表达，如基因沉默、剪接调节、基因编辑等，被认为是继抗体药物后的新一代药物。与传统药物相比，小分子RNA药物通常在基因或其表达水平上发挥作用，具有更高的特异性和靶向性，且小分子RNA药物活性高、半衰期短、副作用小、安全性高、成本低、无菌/微生物/杂质等控制策略充足、制备工艺和质量体系完善、治疗效果持续时间长。此外，与其他药物相比，小分子RNA药物设计方法简单，在致病基因序列的基础上即可设计相应的干预RNA，能够节省靶点筛选时间，可以靶向任何基因、预测脱靶效应、降低疾病治疗风险，使疾病精准治疗成为可能。这些优势使得小分子RNA药物成为临床药物研究的焦点，在生物制药领域掀起了一股小分子RNA药物的热潮。小分子RNA药物主要包括微小RNA（microRNA，miRNAs）、小干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）、适配体（aptamer）、以及转运RNA来源的衍生片段（transferRNA-derivedfragments，tRFs）等。
tRFs（transfer RNA-derived fragments，tRFs）是一类新兴的、长度小于40个碱基、来源于转运RNA（transfer RNA，tRNA）的非编码小片段RNA，由tRNA在低氧应激等特殊条件下由核酸内切酶和血管生成素（angiogenin，ANG）切割而成。随着高通量测序技术的发展，越来越多的证据表明，tRFs主要通过与蛋白质互作调控基因表达、靶向作用于基因来调控基因表达、影响翻译过程来调节蛋白质水平等方式，在干细胞自我更新、分化和增殖等关键过程中发挥重要调控作用，进而与癌症、病毒感染、代谢性疾病和神经退行性疾病等多种疾病的发生和发展密切相关。
目前，针对小分子RNA药物，尤其是tRFs的研究还处于初级阶段，有关小分子RNA药物（尤其是tRFs）在骨质疏松中的治疗作用相关研究依然非常欠缺。因此，急需探究小分子RNA药物（尤其是tRFs）在骨质疏松发生发展中的调控作用及其在骨质疏松治疗方面中的作用，同时为骨质疏松的治疗提供新型、有效、安全的小分子RNA药物。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于治疗骨质疏松的小分子RNA及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种用于治疗骨质疏松的小分子RNA，所述小分子RNA为tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3；
所述tRF-1:32-Gly-GCC-4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述tRF-1:31-Gly-CCC-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述tiRNA-1:34-Val-CAC-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
根据本发明优选的，所述骨质疏松为原发性骨质疏松、继发性骨质疏松或特发性骨质疏松。
根据本发明优选的，所述用于治疗骨质疏松的小分子RNA能够降低骨流失，提高骨密度、骨小梁数量、骨小梁体积分数，降低骨小梁分离度，促进骨形成，抑制骨髓内脂肪堆积、破骨细胞数量和骨吸收，改善间充质干细胞分化异常及调控间充质干细胞分化命运。
进一步优选的，所述间充质干细胞为鼠、人和兔等来源的间充质干细胞。
上述小分子RNA在制备治疗骨质疏松药物中的应用。
一种治疗骨质疏松的药物，所述治疗骨质疏松的药物包括tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2、tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3中的一种或两种以上的组合；
所述tRF-1:32-Gly-GCC-4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述tRF-1:31-Gly-CCC-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述tiRNA-1:34-Val-CAC-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
上述小分子RNA在制备间充质干细胞的成骨诱导培养基中的应用。
上述小分子RNA在制备提高间充质干细胞成骨功能的试剂中的应用。
根据本发明优选的，所述治疗骨质疏松的药物还包括药学上可接受的载体。
根据本发明优选的，所述治疗骨质疏松的药物的剂型为注射剂、胶囊剂、片剂、口服制剂或微囊制剂。
有益效果：
1、本发明首次发现 tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3对骨质疏松具有显著的治疗效果，细胞水平和小鼠水平的验证实验均表明了以上小分子RNA能够有效抑制骨质疏松小鼠骨流失，提高骨密度、骨小梁数量、骨小梁体积分数，降低骨小梁分离度，促进骨形成，抑制骨髓内脂肪堆积、破骨细胞数量和骨吸收。此外，上述小分子RNA还能够改善骨质疏松小鼠和临床骨质疏松患者间充质干细胞分化异常及调控间充质干细胞分化命运，可以用于制备治疗骨质疏松的药物，为骨质疏松药物的临床治疗和发展提供了新方法和新思路。
2、本发明提供的小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3在制备治疗骨质疏松药物中的用途属于首次公开。该小分子RNA药物的具有制备方法简单、原料易获取、可实现工程化、规模化、标准化的制备和生产、治疗所需RNA剂量小等优点。与传统药物相比，小分子RNAs药物通常在基因或其表达水平上发挥作用，具有更高的特异性和靶向性，且小分子RNAs药物活性高、半衰期短、副作用小、安全性高、成本低、无菌/微生物/杂质等控制策略充足、制备工艺和质量体系完善、治疗效果持续时间长；此外，与其他药物相比，小分子RNA药物设计方法简单，在致病基因序列的基础上即可设计相应的干预RNA，能够节省靶点筛选时间，可以靶向任何基因、预测脱靶效应、降低疾病治疗风险，使疾病精准治疗成为可能。
附图说明
图1是本发明小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）具有显著治疗骨质疏松作用的结果图；
在图1中，A是各组小鼠股骨microCT扫描三维重建图；B是骨密度（BMD）的统计图；C是骨小梁（Tb.N）数量的统计图；D是骨体积分数（Tb.BV/TV）的统计图；E是骨小梁分离度（Tb.Sp）的统计图。
图2是本发明小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4）促进骨形成和抑制骨髓内脂肪形成的结果图；
在图2中，A是各组小鼠股骨HE染色检测骨小梁和脂肪细胞的结果图；B是各组小鼠血浆ALP活力统计图；C是各组小鼠血浆PINP水平统计图。
图3是本发明小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4）抑制破骨细胞数量和骨吸收的结果图；
在图3中，A是各组小鼠股骨TRAP染色结果图；B是各组小鼠血浆TRACP-5b水平统计图；C是各组小鼠血浆β-CTX水平统计图。
图4是本发明小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）修复骨质疏松小鼠骨髓间充质干细胞成骨/成脂分化异常的结果图；
在图4中，A是各组小鼠BMMSCs成骨诱导后茜素红染色结果图（200×）；B是各组小鼠BMMSCs成脂诱导后油红O染色结果图（比例尺为50 μm）。
图5是本发明小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）修复临床骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨/成脂分化异常的结果图；
在图5中，A是临床骨质疏松患者BMMSCs成骨诱导后茜素红染色结果图（200×）；B是临床骨质疏松患者BMMSCs成脂诱导后油红O染色结果图（比例尺为50 μm）。
图6是本发明小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）能够调控骨髓间充质干细胞成骨/成脂分化的结果图；
在图6中，A是正常小鼠BMMSCs转染tRFs并成骨诱导后茜素红染色结果图（200×）；B是正常小鼠BMMSCs转染tRFs并成脂诱导后油红O染色结果图（比例尺为50 μm）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。
其中，小鼠骨髓间充质干细胞来自C57BL/6J小鼠原代培养。
本发明小分子RNA药物（tRFs）中tRF-1:32-Gly-GCC-4的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；tRF-1:31-Gly-CCC-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；tiRNA-1:34-Val-CAC-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。然后委托中国擎科生物技术有限公司以化学方法按照上述具体核苷酸序列人工合成，得到tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2和 tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3。
实验用C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，获得山东大学药学院伦理委员会批准。
实施例1
通过摘除小鼠双侧卵巢构建绝经后骨质疏松小鼠模型，给予骨质疏松小鼠4种小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3进行治疗，具体实施过程如下：
（1）选取8周龄雌性C57BL/6J小鼠，适应性饲养1周后，进行腹腔注射麻醉；将麻醉后小鼠俯卧位固定于手术台上，剃毛备皮。充分消毒后，于脊柱两侧分别做一纵行切口，分离肌肉，打开腹腔。找出双侧卵巢，结扎子宫及动脉，去除双侧卵巢，并逐层关腹，切除双侧卵巢小鼠为骨质疏松模型组（OVX）；小鼠切除卵巢旁脂肪组织但保留卵巢为假手术组（SHAM）；8周后获得绝经后骨质疏松模型组（OVX）和假手术组（SHAM）的小鼠模型；
（2）应用脂质纳米粒，将小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3分别制备成负载小分子RNA药物的纳米递送系统；
步骤如下：将4种小分子RNA分别和PEG-PGu（聚乙二醇-胍基聚合物）按质量比1:20分别置于微流控装置的A管和B管中，调节流速，使其充分混匀，混匀后静置15min，形成静电相互作用力，得到初级纳米颗粒a；然后将PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）按照与PEG-PGu质量比1：1分别置于微流控装置的A管（PLGA溶液）和B管（初级纳米颗粒a混悬液）中，慢流速轻柔混匀，混匀后静置15min，形成静电相互作用力，分别得到负载tRF-1:32-Gly-GCC-4的纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs、负载tRF-1:31-Gly-CCC-3的纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs、负载tiRNA-1:34-Val-CAC-2的纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs和负载tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3的纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs；
同时按照相同的方法以siRNA-NC制备负载siRNA-NC的纳米颗粒混悬液；
（3）将步骤（2）制备的4种纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs给予骨质疏松小鼠（OVX）进行治疗，具体给药方式是通过尾静脉注射，按照小鼠体重分别给予0.02 μg/g的步骤（2）制备的4种纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs，按照隔天注射1次的频率，连续注射4周，得到4组分别注射4种小分子RNA的实验组小鼠；OVX+NC组则是按照相同方法给予OVX小鼠相同剂量的负载siRNA-NC的纳米颗粒混悬液，作为阴性对照组；
（4）采用3.6%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉上述不同处理的小鼠，取小鼠双侧股骨，应用microCT对其双侧股骨远端松质骨及接近中段皮质骨进行扫描、三维重建和数据分析，检测小鼠骨微观结构相关指标，包括骨密度（BMD）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁骨体积分数（Tb.BV/TV）和骨小梁分离度（Tb.Sp），结果如图1所示。
由图1的microCT三维重建结果可知，与假手术组（SHAM）小鼠相比，阴性对照组（OVX+NC）小鼠的骨密度、骨小梁数量、骨小梁体积分数显著降低，而骨小梁分离度显著升高，即阴性对照组（OVX+NC）小鼠骨出现微观结构破坏和骨质流失现象，说明骨质疏松小鼠模型构建成功。而与阴性对照组（OVX+NC）小鼠相比，给予小分子RNA药物的OVX+4种小分子RNA小鼠的骨密度、骨小梁数量、骨小梁体积分数明显升高，骨小梁分离度明显降低，说明4种小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）能够有效提高OVX小鼠的骨密度、骨小梁数量、骨小梁体积分数，并降低其骨小梁分离度，即4种小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）显著抑制OVX组小鼠骨质流失，改善OVX组小鼠骨微观结构破坏程度。
本实施例的结果说明，本发明小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2和 tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3均具有显著的治疗骨质疏松的作用。
实施例2
按照实施例1所述方法通过摘除小鼠双侧卵巢构建绝经后骨质疏松小鼠模型，然后给予骨质疏松小鼠小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4进行治疗，检测tRF-1:32-Gly-GCC-4对骨质疏松小鼠骨形成和脂肪形成的影响，具体实施过程如下：
（1）将实施例1步骤（2）制备的负载tRF-1:32-Gly-GCC-4的纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs给予骨质疏松小鼠（OVX）进行治疗，具体给药方式是通过尾静脉注射，按照小鼠体重分别给予0.02 μg/g的步骤（2）制备的负载tRF-1:32-Gly-GCC-4的纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs，按照隔天注射1次的频率，连续注射4周，得到注射tRF-1:32-Gly-GCC-4的实验组小鼠；OVX+NC组则是按照相同方法给予OVX小鼠相同剂量的负载siRNA-NC的纳米颗粒混悬液，作为阴性对照组；
（2）H&E染色检测骨髓内骨小梁数量和面积，具体是取上述不同处理的小鼠的股骨置于10%多聚甲醛溶液中固定，用PBS缓冲液清洗后置于10%EDTA中脱钙，并包埋在石蜡中；切片后，将5μm脱蜡切片用于HE染色，结果如图2的A所示；
（3）采用眼眶取血法收集小鼠血清，应用ELISA实验检测上述不同处理的小鼠的血清I型原胶原N端前肽（PINP）和碱性磷酸酶（ALP），结果如图2的B和图2的C所示。
由图2的A的H&E染色结果可知，与假手术组（SHAM）相比，阴性对照组（OVX+NC）小鼠的骨小梁数量和面积显著减少，而脂肪细胞数量和面积显著增加，即出现骨形成能力降低和骨髓内脂肪堆积现象。而与阴性对照组（OVX+NC）小鼠相比，给予负载tRF-1:32-Gly-GCC-4的纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs的OVX小鼠的骨小梁数量和面积显著增加，骨髓内脂肪细胞数量和面积显著减少，说明小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4能够显著提高OVX组小鼠骨形成能力，抑制其骨髓内脂肪形成能力。
由图2的B和图2的C的ELISA实验结果可知，与假手术组（SHAM）相比，阴性对照组（OVX+NC）小鼠血浆中ALP活力和PINP水平显著降低。而与阴性对照组（OVX+NC）小鼠相比，给予小负载tRF-1:32-Gly-GCC-4的纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs的OVX小鼠的血浆ALP活力和PINP水平显著提高，说明小分子RNA药物 tRF-1:32-Gly-GCC-4能够显著提高OVX组小鼠骨形成能力。
本实施例的结果说明，本发明小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4具有促进骨形成并抑制骨髓内脂肪形成的作用。
实施例3
按照实施例1所述方法通过摘除小鼠双侧卵巢构建绝经后骨质疏松小鼠模型，然后给予骨质疏松小鼠小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4进行治疗，检测tRF-1:32-Gly-GCC-4对骨质疏松小鼠骨吸收的影响，具体实施过程如下：
（1）将实施例1步骤（2）制备的负载tRF-1:32-Gly-GCC-4的纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs给予骨质疏松小鼠（OVX）进行治疗，具体给药方式是通过尾静脉注射，按照小鼠体重分别给予0.02 μg/g的步骤（2）制备的负载tRF-1:32-Gly-GCC-4的纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs，按照隔天注射1次的频率，连续注射4周，得到注射tRF-1:32-Gly-GCC-4的实验组小鼠；OVX+NC组则是按照相同方法给予OVX小鼠相同剂量的负载siRNA-NC的纳米颗粒混悬液，作为阴性对照组；
（2）TRAP染色检测上述不同处理的小鼠的骨髓内破骨细胞数量和面积，结果如图3的A所示；
（3）采用眼眶取血法收集小鼠血清：应用ELISA实验检测上述不同处理的小鼠的血清I型胶原C端肽（β-CTX）和抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP-5b）水平，结果如图3的B和图3的C所示。
由图3的A的TRAP染色结果可知，与假手术组（SHAM）相比，阴性对照组（OVX+NC）小鼠骨髓内破骨细胞数量和面积显著增加。而与阴性对照组（OVX+NC）小鼠相比，给予负载tRF-1:32-Gly-GCC-4的纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs的OVX小鼠的破骨细胞数量和面积显著降低，说明小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4能够显著降低OVX组小鼠的破骨细胞数量。
由图3的B和图3的C的ELISA实验结果可知，与假手术组（SHAM）相比，阴性对照组（OVX+NC）小鼠血浆中TRACP-5b和β-CTX水平显著升高。而与OVX组小鼠相比，给予负载tRF-1:32-Gly-GCC-4的纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs的OVX小鼠的血浆TRACP-5b和β-CTX水平显著降低，说明小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4能够显著降低OVX组小鼠骨吸收能力。
本实施例的结果说明，本发明小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4具有抑制破骨细胞数量和骨吸收能力的作用。
实施例4
按照实施例1所述方法通过摘除小鼠双侧卵巢构建绝经后骨质疏松小鼠模型，给予骨质疏松小鼠4种小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3进行治疗，分离和提取各组小鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs），检测tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2和tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3对骨质疏松小鼠BMMSCs成骨/成脂分化的影响，具体实施过程如下：
（1）将实施例1步骤（2）制备的4种纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs分别给予骨质疏松小鼠（OVX）进行治疗，具体给药方式是通过尾静脉注射，按照小鼠体重分别给予0.02 μg/g的步骤（2）制备的4种纳米颗粒混悬液tRFs@PPNPs，按照隔天注射1次的频率，连续注射4周，得到4组分别注射4种小分子RNA的实验组小鼠；OVX+NC组则是按照相同方法给予OVX小鼠相同剂量的负载siRNA-NC的纳米颗粒混悬液，作为阴性对照组；
（2）分离和提取小鼠的BMMSCs：取上述不同处理的小鼠，分离小鼠双侧胫骨、股骨，去掉周围组织，暴露骨髓腔，收集全骨髓，置于离心机中，以1000 r/min离心5 min，并接种于细胞培养瓶中，应用含有10%胎牛血清（BI公司，美国）和1%青-链霉素（碧云天，中国）的F12培养液（Hyclone公司，美国）培养，放入37℃、5% CO2细胞培养箱（Thermo，美国）中培养；
（3）BMMSCs成骨诱导分化：当BMMSCs融合度达到80%时，应用成骨诱导液（10%胎牛血清、α-MEM培养液、地塞米松100 nM、β-磷酸甘油10 mM、维生素C 50 μg/mL、盘尼西林100U/mL和链霉素100 μg/mL）进行诱导，每3天更换一次培养液，诱导14天；
（4）BMMSCs成脂诱导分化：当BMMSCs融合度达到80%时，应用成脂诱导液（10%胎牛血清、α-MEM培养液、地塞米松10 nM、胰岛素10 μg/mL、3-异丁醇-1-甲基-黄嘌呤0.45 mM、吲哚美辛50 μM、盘尼西林100 U/mL和链霉素100 mg/mL）进行诱导，每3天更换一次培养液，诱导16天；
（5）应用茜素红（ARS）染色检测基质矿化沉积情况：PBS缓冲液冲洗细胞3次，于室温条件下加入4%多聚甲醛固定细胞，10 min后，应用2%茜素红染色液孵育细胞15 min。PBS缓冲液冲洗3次后，置于标准光学显微镜下观察细胞，结果如图4的A所示；
（6）应用油红O（ORO）染色检测脂滴形成情况：用PBS缓冲液润洗细胞，在室温条件下应用4%多聚甲醛固定细胞30min，PBS缓冲液洗清细胞3次后，加入油红O染色工作液孵育细胞20 min，置于标准光学显微镜下观察细胞，结果如图4的B所示。
由图4的A的茜素红染色结果可知，与假手术组（SHAM）相比，阴性对照组（OVX+NC）小鼠BMMSCs矿化结节形成数量和面积显著减少，即BMMSCs成骨分化能力降低。而与阴性对照组（OVX+NC）小鼠相比，给予小分子RNA药物的OVX+4种小分子RNA小鼠BMMSCs的矿化结节形成数量和面积显著提高，说明4种小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）能够改善OVX小鼠的BMMSCs成骨分化能力。
由图4的B的油红O染色结果可知，与假手术组（SHAM）相比，阴性对照组（OVX+NC）小鼠BMMSCs脂滴形成数量和面积显著增加，即阴性对照组（OVX+NC）小鼠BMMSCs成脂分化能力提高。而与阴性对照组（OVX+NC）小鼠相比，给予小分子RNA药物的OVX+4种小分子RNA小鼠的BMMSCs脂滴形成数量和面积显著降低，说明4种小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）能够抑制OVX小鼠的BMMSCs成脂分化能力。
本实施例的结果说明，本发明的小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2和 tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3均能够修复骨质疏松小鼠BMMSCs成骨/成脂分化异常现象。
实施例5
本实施例内容是经过山东大学齐鲁医院医学伦理委员会批准，得到了患者的知情同意。
分离提取临床骨质疏松患者BMMSCs，并通过细胞转染法分别给予4种小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3进行治疗，检测tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2和 tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3对临床骨质疏松患者BMMSCs成骨/成脂分化的影响，具体实施过程如下：
（1）分离提取临床骨质疏松患者BMMSCs（OP-BMMSCs）
A、无菌条件下抽取骨髓液5 mL，用等体积PBS缓冲液稀释混匀，室温下1500 rpm离心10 min；
B、弃去脂肪层，将稀释骨髓液沿离心管壁缓慢加到等体积Ficoll分离液（1.077g/mL）上面，室温2500 rpm离心30 min；
C、吸取界面白膜状层的单个核细胞，用PBS混悬后，室温1500 rpm离心10 min；
D、弃上清并重复洗涤2次；
E、用含10%FBS的BMMSCs专用培养基重悬细胞，调整细胞密度为2×105/mL，接种于底面积为25 cm2培养瓶中置于37℃、5% CO2培养箱中进行培养；
F、次日换液，弃去悬浮细胞后，每2~3天换液一次；每日镜下观察细胞形态及生长变化，待细胞生长达80%-90%融合时，用胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，按1：2比例进行传代培养；
（2）细胞转染
按照步骤（1）所述方法分离提取临床骨质疏松患者BMMSCs，然后应用RNA专用转染试剂RNAFit（汉恒生物）和无血清Opti-MEM培养基（Thermo）进行细胞转染，分别向临床骨质疏松患者BMMSCs（OP-BMMSCs）转染tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2和 tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3，使小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2和 tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3的终浓度均为100nM，得到4组分别转染4种小分子RNA的实验组OP-BMMSCs；同时，向OP-BMMSCs按照相同方法转染相同浓度的siRNA-NC，作为阴性对照组（OP-BMMSCs+NC）；转染6 h后更换含10%血清的新鲜培养液，转染48 h后分别进行成骨或成脂诱导；
（3）BMMSCs成骨诱导分化：当BMMSCs融合度达到80%时，应用成骨诱导液（10%胎牛血清、α-MEM培养液、地塞米松100 nM、β-磷酸甘油10 mM、维生素C 50 μg/mL、盘尼西林100U/mL和链霉素100 μg/mL）进行诱导，每3天更换一次培养液，诱导14天；
（4）BMMSCs成脂诱导分化：当BMMSCS融合度达到80%时，应用成脂诱导液（10%胎牛血清、α-MEM培养液、地塞米松10 nM、胰岛素10 μg/mL、3-异丁醇-1-甲基-黄嘌呤0.45 mM、吲哚美辛50 μM、盘尼西林100 U/mL和链霉素100 mg/mL）进行诱导，每3天更换一次培养液，诱导16天；
（5）应用茜素红（ARS）染色检测基质矿化沉积情况：PBS缓冲液冲洗细胞3次，于室温条件下加入4%多聚甲醛固定细胞，10 min后，应用2%茜素红染色液孵育细胞15 min。PBS缓冲液冲洗3次后，置于标准光学显微镜下观察细胞，结果如图5的A所示；
（6）应用油红O（ORO）染色检测脂滴形成情况：用PBS缓冲液润洗细胞，在室温条件下应用4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS缓冲液洗清细胞3次后，加入油红O染色工作液孵育细胞20 min，置于标准光学显微镜下观察细胞，结果如图5的B所示。
由图5的A的茜素红染色结果可知，与临床骨质疏松患者BMMSCs（OP-BMMSCs）相比，阴性对照组（OP-BMMSCs +NC）BMMSCs矿化结节形成数量和面积无差异。而与阴性对照组（OP-BMMSCs +NC）相比，给予小分子RNA药物的OVX+4种小分子RNA的临床骨质疏松患者BMMSCs的矿化结节形成数量和面积显著提高，说明4种小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）能够改善临床骨质疏松患者BMMSCs成骨分化能力。
由图5的B的油红O染色结果可知，与临床骨质疏松患者BMMSCs（OP-BMMSCs）相比，阴性对照组（OP-BMMSCs +NC）BMMSCs脂滴形成数量和面积显著无差异。而与阴性对照组（OP-BMMSCs +NC）组相比，给予小分子RNA药物的OVX+4种小分子RNA的临床骨质疏松患者BMMSCs脂滴形成数量和面积显著降低，说明4种小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）能够抑制临床骨质疏松患者BMMSCs成脂分化。
本实施例的结果说明，本发明的小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2和 tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3均能够修复临床骨质疏松患者BMMSCs成骨/成脂分化异常现象。
实施例6
分离和提取正常C57BL/6J小鼠BMMSCs，通过细胞转染法分别给予BMMSCs细胞4种小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2、tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3进行处理，检测tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2和 tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3对正常小鼠BMMSCs成骨和成脂分化的影响，具体实施过程如下：
（1）按照实施例4步骤（2）所述方法分离提取正常C57BL/6J小鼠BMMSCs，然后应用RNA专用转染试剂RNAFit（汉恒生物）和无血清Opti-MEM培养基（Thermo）进行细胞转染，向BMMSCs分别转染tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2和tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3，使小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2和 tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3的终浓度均为100 nM，得到4组分别转染4种小分子RNA的实验组BMMSCs；同时，向BMMSCs按照相同方法转染相同浓度的siRNA-NC，作为阴性对照组（NC）；正常小鼠BMMSCs作为空白组（CTL）；转染6 h后更换含10%血清的新鲜培养液，转染48 h后分别进行成骨或成脂诱导；
（2）BMMSCs成骨诱导分化：当BMMSCs融合度达到80%时，应用成骨诱导液（10%胎牛血清、α-MEM培养液、地塞米松100 nM、β-磷酸甘油10 mM、维生素C 50 μg/mL、盘尼西林100U/mL和链霉素100 μg/mL）进行诱导，每3天更换一次培养液，诱导14天；
（3）BMMSCs成脂诱导分化：当BMMSCs融合度达到80%时，应用成脂诱导液（10%胎牛血清、α-MEM培养液、地塞米松10 nM、胰岛素10 μg/mL、3-异丁醇-1-甲基-黄嘌呤0.45 mM、吲哚美辛50 μM、盘尼西林100 U/mL和链霉素100 mg/mL）进行诱导，每3天更换一次培养液，诱导16天；
（4）茜素红（ARS）染色：PBS缓冲液冲洗细胞3次，于室温条件下加入4%多聚甲醛固定细胞，10 min后，应用2%茜素红染色液孵育细胞15 min；PBS缓冲液冲洗3次后，置于标准光学显微镜下观察细胞，结果如图6的A所示；
（5）油红O（ORO）染色检测脂滴形成情况：用PBS缓冲液润洗细胞，在室温条件下应用4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS缓冲液洗清细胞3次后，加入油红O染色工作液孵育细胞20 min，置于标准光学显微镜下观察细胞，结果如图6的B所示。
由图6的A的茜素红染色结果可知，与空白组（CTL）相比，阴性对照组（NC）组BMMSCs矿化结节面积和数量无显著变化；与阴性对照组（NC）组相比，转染4种小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）的实验组BMMSCs的矿化结节面积和数量显著增加，说明4种小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）能够显著提高BMMSCs成骨分化能力。
由图6的B的油红O染色结果显示，与空白组（CTL）相比，阴性对照组（NC）组BMMSCs脂滴数量和面积无显著变化；与阴性对照组（NC）组相比，转染4种小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）的实验组BMMSCs的脂滴数量和面积显著减少，说明4种小分子RNA（tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3）能够显著降低BMMSCs成脂分化能力。
本实施例的结果说明，本发明小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2和 tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3均能够促进BMMSCs成骨分化，并抑制其成脂分化，即小分子RNA药物tRF-1:32-Gly-GCC-4、tRF-1:31-Gly-CCC-3、tiRNA-1:34-Val-CAC-2和 tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3均能够决定BMMSCs成骨/成脂分化命运。
本发明所述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.小分子RNA在制备治疗骨质疏松的药物中的应用，其特征在于，所述小分子RNA为tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3；
所述tiRNA-1:34-Val-CAC-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的小分子RNA在制备治疗骨质疏松的药物中的应用，其特征在于，所述骨质疏松为原发性骨质疏松或继发性骨质疏松。
3.如权利要求1所述的小分子RNA在制备治疗骨质疏松的药物中的应用，其特征在于，所述小分子RNA能够降低骨流失，提高骨密度、骨小梁数量、骨小梁体积分数，降低骨小梁分离度，促进骨形成，抑制骨髓内脂肪形成、破骨细胞数量和骨吸收，改善间充质干细胞分化异常及调控间充质干细胞分化；所述间充质干细胞为鼠、人来源的间充质干细胞。
4.如权利要求1所述的小分子RNA在制备治疗骨质疏松的药物中的应用，其特征在于，所述治疗骨质疏松的药物还包括药学上可接受的载体。
5.如权利要求1所述的小分子RNA在制备治疗骨质疏松的药物中的应用，其特征在于，所述治疗骨质疏松的药物的剂型为注射剂、胶囊剂、片剂、口服制剂或微囊制剂。
6.小分子RNA在制备间充质干细胞成骨诱导培养基中的应用，其特征在于，所述小分子RNA为tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3；
所述tiRNA-1:34-Val-CAC-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.小分子RNA在制备提高间充质干细胞成骨功能的试剂中的应用，其特征在于，所述小分子RNA为tiRNA-1:34-Val-CAC-2或tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3；
所述tiRNA-1:34-Val-CAC-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述tiRNA-1:33-Gly-GCC-2-M3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
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