CN102988985B - miR-146a作为调节血管生长靶标的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及miR-146a作为调节血管生长靶标的用途。首次公开了miR-146a在血管生长中发挥作用，其通过上调VEGF而促进血管的生长。因此，miR-146a抑制剂可用于抑制血管生长，从而预防、缓解或治疗血管过度生长相关的疾病，如关节炎；而miR-146a促进剂可用于促进血管生长，从而用于需要促进血管生长的疾病状态。

Description

miR-146a作为调节血管生长靶标的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及miR-146a作为调节血管生长靶标的用途。

背景技术

血管内皮生长因子(VEGF)是一种促进血管生长的因子，其表达上调代表着血管生长的促进；反之则血管生长缓慢。血管生长的失调与许多疾病相关，计入关节炎、肿瘤等。

关节炎是常见的慢性疾病，由炎症、感染、创伤或其他因素引起的关节炎性病变，常见的是骨关节炎(OA)和类风湿关节炎(RA)，我国关节炎患者估计有1亿以上，且人数在不断增加。据统计，我国50岁以上人群中半数患骨关节炎；65岁以上人群中90％女性和80％男性患骨关节炎。关节炎主要病理改变包括软骨退行性破坏，滑膜增生等。在关节炎中许多细胞因子参与这一过程，而IL-1β是主要的分解代谢因子，IL-1β上调导致细胞外基质的降解，加重了软骨的破坏。近年来发展了多种药物和疗法来减轻主要由关节炎的炎症引发的疼痛，但是对于治愈受累部位的软骨破坏却无计可施。

在过去的几十年中，miRNA作为动物和植物中一类新的基因调控分子越来越受到瞩目，超过三分之一的人类基因受到miRNA调节。Stanczyk等报道在RA滑膜中，miR-146表达上调[Stanczyk J，Pedrioli DM，Brentano F，Sanchez-Pernaute O，Kolling C，Gay RE，et al.Altered expression of MicroRNA insynovial fibroblasts and synovial tissue in rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum2008；58(4)：1001-9]。Nakasa等报道在来源于RA病人的滑膜组织中，miR-146a/b表达上升[Nakasa T，Miyaki S，Okubo A，Hashimoto M，Nishida K，Ochi M，et al.Expression of microRNA-146 in rheumatoid arthritis synovial tissue.ArthritisRheum 2008；58(5)：1284-92]。已有研究表明miR-146a在人类关节软骨的所有层面表达，尤其是在软骨表层[Yamasaki K，Nakasa T，Miyaki S，Ishikawa M，DeieM，Adachi N，et al.Expression of MicroRNA-146a in osteoarthritis cartilage.Arthritis Rheum 2009；60(4)：1035-41]。

目前，miR-146a与血管生长、关节炎等的关系以及具体的作用靶点还属未知。在药物开发过程中，药物靶点的研究是至关重要的。因此，本领域还有必要进一步研究miR-146a在调节血管生长过程中的作用机制和靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供miR-146a作为调节血管生长靶标的用途。

在本发明的第一方面，提供一种miR-146a调节剂(调节miR-146a的表达水平的试剂)的用途，用于制备调节血管生长的组合物。

在一个优选例中，所述的血管生长是血管内皮生长因子(VEGF)介导的血管生长。

在另一优选例中，所述的miR-146a调节剂是miR-146a抑制剂，用于制备抑制血管生长的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物还用于：

促进Smad4基因的转录或蛋白的表达；

抑制血管内皮生长因子的转录或表达；或

抑制软骨细胞的凋亡。

在另一优选例中，所述的血管是骨，软骨，滑膜中的血管。

在另一优选例中，所述的miR-146a抑制剂包括(但不限于)：化学合成的miRNA-146a抑制剂；以表达质粒为载体的抑制miRNA-146a的病毒和非病毒产品；与miR-146a互补的核酸序列或序列片段。

在另一优选例中，所述的miR-146a抑制剂是：miRIDIAN microRNA HairpinInhibitors。

在另一优选例中，所述的miR-146a调节剂是miR-146a促进剂，用于制备增加血管内皮生长因子的转录或表达的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物促进血管生长、促进机体生长发育、促进损伤组织愈合、防治心血管疾病。

在另一优选例中，所述的miR-146a促进剂是表达miR-146a的表达载体、病毒、化学合成的小分子化合物等。

在另一优选例中，所述的表达miR-146a的表达载体中，包含有miR-146a的表达盒。

在另一优选例中，所述的表达miR-146a的表达载体中，包含有miR-146a前体的表达盒。

在本发明的另一方面，提供一种调节血管生长的方法，包括调节动物中miR-146a的表达。

在另一优选例中，所述的调节血管生长是抑制血管生长；所述的方法包括：给予动物有效量的miR-146a抑制剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、IL-1β促进miR-146a和VEGF的表达，同时下调Smad4。原代大鼠软骨细胞在相应时间点用白介素处理。miR-146a、Smad4和VEGF的表达水平用实时定量PCR和Western检测。

A，miR-146a表达在24h内逐渐增加。

B，IL-1β刺激后Smad4的mRNA水平下降。

C，IL-1β上调VEGF水平。数值为3次独立实验的均值±标准差。

D，Smad4和VEGF的蛋白水平在IL-1β刺激下分别下调和上调。条带底部数值表示蛋白以GAPDH为标准的相对表达水平。

图2、Smad4是miR-146a的直接靶基因。

A，图示Smad4的3’UTR与miR-146a的结合位点，上行序列为Smad4野生型序列(Smad-WT)，中行序列为miR-146a序列，下行序列为Smad4突变型序列(Smad-MT)。

B，miR-146a抑制Smad4 3’UTR的荧光素酶活性。HEK293T细胞分别转染含Smad4 3’UTR或相应突变3’UTR的片段。过表达miR-146a导致野生型(WT)3’UTR荧光素酶活性降低，而突变后(MT)荧光素酶活性不受影响。数值为3次独立实验的均值±标准差。Vector为空质粒对照。

C，过表达miR-146a抑制Smad4的表达，增加VEGF的表达。NC表示阴性对照，即转染了阴性对照(转染的对照RNA，序列为sense：5’-UUC UCC GAA CGUGUC ACG UTT-3’，anti-sense：5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’)的软骨细胞内蛋白表达情况。

D，下调miR-146a的表达导致Smad4上调和VEGF下调。条带底部数值表示蛋白以GAPDH为标准的相对表达水平。其中Inhibitors NC表示抑制剂的阴性对照miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitor Negative Control(购自Dharmacon)；miR-146a抑制剂指miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitors(购自Dharmacon)。

图3、抑制miR-146a削弱IL-1β引起的Smad4下调和VEGF上调。用miR-146a抑制剂转染软骨细胞，然后用IL-1β处理24h。

A，miR-146a抑制剂能够显著降低IL-1β引起的miR-146a升高。其中，Inhibitors NC表示抑制剂的阴性对照miRIDIAN microRNA Hairpin InhibitorNegative Control。

B，miR-146a抑制剂能够拮抗IL-1β对Smad4的抑制作用。

C，由IL-1β引起的VEGF上调可被miR-146a抑制剂削弱。数值为3次独立实验的均值±标准差。

D，蛋白水平，miR-146a抑制剂拮抗IL-1β引起的Smad4下调和VEGF上调。条带底部数值表示蛋白以GAPDH为标准的相对表达水平。

图4、VEGF受Smad4调控。利用RNAi的方法降低Smad4的表达上调VEGF的蛋白水平。软骨细胞转染Smad4的siRNA。

A，针对Smad4的siRNA有效降低Smad4的RNA水平。数值为3次独立实验的均值±标准差。

B，抑制Smad4增加VEGF的蛋白表达。其中siRNA ctrl表示无关序列对照。

C，共转miR-146a和Smad4的表达质粒逆转miR-146a导致的VEGF上调。条带底部数值表示蛋白以GAPDH为标准的相对表达水平。其中，Control为pcDNA3.1(+)空载体，NC为阴性对照(sense：5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACGUTT-3’，anti-sense：5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’)。

图5、miR-146a导致软骨细胞的凋亡。

A-D，TUNEL检测说明miR-146a增加软骨细胞的凋亡。凋亡细胞核被标记上绿色荧光。所有的细胞核用Hoechst33342复染。放大倍数：A，B，×200.C，D，×600。其中，NC表示未过表达miR-146a的情况，转染对照RNA(sense：5’-UUCUCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’，anti-sense：5’-ACG UGA CAC GUU CGGAGA ATT-3’。)。

E，TUNEL阳性细胞定量说明凋亡细胞增加了40.3％。

图6、miR-146a和Smad4在手术诱导的大鼠骨关节炎中呈现相反的表达。

A，OA组软骨中miR-146a水平增加。每组10只大鼠，数值显示为均值±标准差。^*P＜0.05；OA和假手术组(sham)股骨髁用番红O染色，并且用Smad4和VEGF抗体进行免疫组化。

B-C，OA组番红O染色减少。

D-E，OA组Smad4免疫组化阳性细胞减少。

F-G，OA组VEGF免疫组化阳性细胞增多。

放大倍数：B，C，×40；D-I，×400。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究，意外地发现了miR-146a在血管(特别是骨关节、滑膜区域的血管)生长中发挥作用，其通过上调VEGF而促进血管的生长。因此，miR-146a抑制剂可用于抑制血管生长，从而预防、缓解或治疗血管过度生长相关的疾病，如关节炎；而miR-146a促进剂可用于促进血管生长，从而用于需要促进血管生长的疾病状态，例如术后恢复时。

miR-146a及其用途

本发明中，所述的miR-146a是具有SEQ ID NO：1所示核酸序列的小核糖核酸：

21-ugagaacugaauuccauggguu(SEQ ID NO：1)-42

miR-146a是一种已发现与免疫应答相关的小核糖核酸。其在体内多种细胞内均有分布。

本发明人发现，miR-146a是一个新的、与血管生长密切相关的药物靶点，其藉由抑制Smad4蛋白表达，进而提高VEGF的表达来实现对血管生长的促进作用；而VEGF是公知的促进血管生长的因子，其表达上调必定代表着血管生长的促进，这是本领域公知的。针对miR-146a的各种治疗手段可以作为调节动物血管生长的新颖和有效的手段。

miR-146a调节剂及其用途

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种miR-146a调节剂的用途，用于制备调节血管生长的组合物(如药物)。

作为本发明的一种优选方式，提供了一种miR-146a抑制剂的用途，用于制备抑制血管生长的组合物。所述的miR-146a抑制剂藉由抑制miR-146a的表达，下调VEGF的表达，从而实现对血管生长的抑制作用。146a抑制剂还用于促进Smad4基因的转录或蛋白的表达；抑制血管内皮生长因子的转录或表达；或抑制软骨细胞的凋亡。

如本文所用，所述的“miR-146a抑制剂”包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够下调miR-146a的表达水平。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是抑制miR-146a表达的病毒产品。

所述的miR-146a抑制剂是指任何可降低miR-146a的活性、降低miR-146a的稳定性、下调miR-146a的表达、减少miR-146a有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调miR-146a有用的物质，从而可用于抑制血管的生长。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，核酸酶，核酸结合分子，只要其能够下调miR-146a的表达。

作为本发明的一种优选方式，所述的抑制剂选自：化学合成的miRNA抑制剂；以表达质粒为载体的抑制miRNA的病毒和非病毒产品；与miR-146a互补的核酸序列或序列片段。较佳地，所述的miR-146a抑制剂是miRIDIANmicroRNA Hairpin Inhibitors，其可以通过商购获得。

作为本发明的一种优选方式，提供了一种miR-146a促进剂的用途，用于制备促进血管生长的组合物。所述的miR-146a促进剂藉由上调miR-146a的表达，进而上调VEGF，从而促进血管的生长。在一些疾病状态下，促进血管生长是需要的，例如在术后的恢复阶段。

如本文所用，所述的“miR-146a促进剂”包括了激动剂、上调剂、稳定剂等，只要它们能够上调miR-146a的表达水平，或维持miR-146a的稳定性，或增加miR-146a的有效作用时间等。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是上调miR-146a表达的病毒产品。

所述的miR-146a促进剂是指任何可提高miR-146a的活性、提高miR-146a的稳定性、上调miR-146a的表达、增加miR-146a有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调miR-146a有用的物质，从而可用于促进血管的生长。例如，所述的促进剂是：表达miR-146a的质粒/病毒、化学合成的小分子化合物。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的miR-146a调节剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于调节(促进或抑制)血管生长。任何前述的miR-146a的调节剂均可用于组合物的制备。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

在得知了所述miR-146a调节剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的调节剂或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。所述的抑制剂较佳的给药方式是局部部位的注射给药，例如可采取关节内给药的方式。

本发明所述的miR-146a的调节剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的miR-146a的调节剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》(科学出版社，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料和方法

原代细胞培养和转染

原代软骨细胞分离自SD大鼠的股骨髁和胫骨平台。大鼠关节软骨被切成小碎片，0.25％胰酶消化半小时，0.2％胶原酶37℃消化5小时。细胞悬液过滤，800g离心10分钟。然后用含10％FBS的F12培养液重悬细胞。用Human ChondrocyteNucleofector kit实现质粒DNA和miRNA在软骨细胞中的共转[Haag J，Voigt R，Soeder S，Aigner T.Efficient non-viral transfection of primary human adultchondrocytes in a high-throughput format.Osteoarthritis Cartilage 2009；17(6)：813-7]。

质粒构建和定点突变

如前所述构建miR-146a的表达质粒[Tang Y LX，Cui H，Ni X，Yuan M，Guo Y，Huang X，Zhou H，de Vries N，Tak PP，Chen S，Shen N.MicroRNA-146Acontributes to abnormal activation of the type I interferon pathway in human lupusby targeting the key signaling proteins.Arthritis Rheum.2009；60(4)：1065-7]。从基因组DNA中扩增miR-146a的前体序列，克隆到pSuper载体(Oligo-Engine，Seattle，WA)中。扩增miR-146a的前体序列使用的引物对为5’-GTGAGATCTGCATTGGATTTACC(正向，SEQ ID NO：1)和5’-GACCTCGAGACTCTGCCTT CTGT(反向，SEQ ID NO：2)。

Smad4的3’UTR被克隆到pGL3-control载体(购自promega)的Xba I位点。以基因组DNA为模板进行Smad4的3’UTR扩增。引物如下：上游引物：5’-CCGCTCGAGTGAAGGAATCATTCCAGTGCTAG-3(SEQ ID NO：3)’；下游引物：5’-TGCTCTAGACTTGGTAAAATTAACTCACCCACA-3’(SEQ ID NO：4)。

基于前段构建的质粒，利用QuikChange site-directed mutagenesis kit构建突变的3’UTR荧光素酶报告质粒。含有突变位点的引物如下：上游引物：5’-TTAAAGGCAGAGAACAAGAGAAAGTTAATTCACC-3’(SEQ ID NO：5)；下游引物：5’-GGTGAATTAACTTTCTCTTGTTCTCTGCCTTTAA-3’(SEQ ID NO：6)。

扩增产物的DNA序列都经过测序验证。

荧光素酶报告实验

用于转染的质粒用QIAGEN plasmid purification kit抽提。HEK293T细胞(ATCC)用lipo2000瞬转，pRL-SV40质粒(购自promega)用作转染效率的内参。转染后24小时，裂解细胞，测量Firefly和Renilla荧光素酶的活性。每个实验重复至少3次。

RNA和实时定量PCR

总RNA包括小RNA用miRNeasy Mini Kit抽提。1μg总RNA用特异性的茎环引物反转成miRNA，随机引物反转成cDNA。定量PCR使用SYBR Premix ExTaq^TM在ABI 7900HT system仪器上进行。引物如下：

大鼠β-actin：

上游引物：5’-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3’(SEQ ID NO：7)；

下游引物：5’-TCATCGTACTCCTGCTTGCT-3’(SEQ ID NO：8)；

大鼠Smad4：

上游引物：5’-CCACCAACTTCCCCAACATT-3’(SEQ ID NO：9)；

下游引物：5’-TGCAGTCCTACTTCCAGTCCAG-3’(SEQ ID NO：10)；

大鼠VEGF：

上游引物：5’-TTGAGACCCTGGTGGACATCT-3’(SEQ ID NO：11)；

下游引物：5’-CTCCTATGTGCTGGCTTTGG-3’(SEQ ID NO：12)。

蛋白检测

预冷已加好蛋白酶抑制剂的裂解液，在冰上裂解细胞。蛋白通过SDS凝胶电泳分离，转移至PVDF膜。膜封闭后与一抗(抗Smad4，VEGF或GAPDH抗体，分别购自Santa Cruz，Santa Cruz，Kangcheng)杂交。

Smad4 RNA干扰

RNA干扰用针对Smad4的siGENOME SMARTpool siRNA试剂(购自Dharmacon)进行。原代软骨细胞用Lipofectamine RNAiMAX reagent转染。

TUNEL实验

转染后48小时，细胞用4％多聚甲醛室温固定20分钟。凋亡测定用In SituCell Death Detection Kit-Fluorescein进行。

手术诱导骨关节炎

所有动物实验均在健康科学研究所动物福利和管理委员会授权同意下进行。20只雄性SD大鼠随机分成2组：手术组和假手术组。通过切除膝关节内侧副韧带和移除内侧半月板造成关节不稳来诱导骨关节炎[Kamekura S，Hoshi K，Shimoaka T，Chung U，Chikuda H，Yamada T，etal.Osteoarthritis developmentin novel experimental mouse models induced by knee joint instability.Osteoarthritis Cartilage 2005；13(7)：632-41]。假手术组不切除韧带和半月板。手术后头三天，给予大鼠青霉素，每天一次。术后8周杀老鼠，取关节软骨进行分子生物学和组织学分析。

组织学和免疫组织化学

膝关节用4％的多聚甲醛固定过夜，然后石蜡包埋。组织切片(5μm)经二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化，PBS冲洗。切片用番红O/快绿染色以识别蛋白聚糖的丢失[Zemmyo M，Meharra EJ，Kuhn K，Creighton-Achermann L，Lotz M.Accelerated，aging-dependent development of osteoarthritis in alpha1integrin-deficient mice.Arthritis Rheum 2003；48(10)：2873-80]。对于免疫组化，切片经柠檬酸钠修复后，内源性的过氧化酶活性用3％的过氧化氢处理。然后用5％的BSA封闭非特异性结合，一抗4℃过夜，二抗及DAB显色使用EnVisiondetection Kit。正常免疫球蛋白和不加一抗的染色作为阴性对照。

统计学分析

数据以均值±标准差来表示，n代表实验的次数。统计学分析通过学生t检验。P＜0.05被认为有显著性差异。

II.实施例

实施例1、白介素-1β刺激改变了软骨细胞中miR-146a的表达

为了找出在关节炎发病过程中涉及的miRNA，本发明人用IL-1β刺激原代软骨细胞，这是研究关节炎最常用的体外细胞炎症模型。在IL-1β刺激下，很多miRNA发生了调变。其中，本发明人选择miR-146a进行进一步的研究，因为已有文章报道miR-146a介导炎症反应[Taganov KD，Boldin MP，Chang KJ，Baltimore D.NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146，an inhibitortargeted to signaling proteins of innate immune responses.Proc Natl Acad Sci U SA 2006；103(33)：12481-6]，且其表达在OA中上调[Yamasaki K，Nakasa T，MiyakiS，Ishikawa M，Deie M，Adachi N，et al.Expression of MicroRNA-146a inosteoarthritis cartilage.Arthritis Rheum 2009；60(4)：1035-41]，本发明人认为miR-146a很有可能在慢性炎症性疾病，如类风湿性关节炎和骨关节炎中发挥作用。大鼠原代软骨细胞经IL-1β刺激不同时间。miR-146a迅速被诱导，而且它的表达在24小时内逐渐上升(图1A)，提示miR-146a影响细胞信号级联中一些重要的关键调节分子。

经过反复分析，本发明人集中研究了Smad4，因为TGF-β能够拮抗一些IL-1β引起的软骨破坏的效应，而Smad4是TGF-β通路关键的信号分子。由于miRNAs一般是在转录后水平抑制其靶基因的表达，本发明人检测了IL-1β刺激后，Smad4在软骨细胞中的表达水平。如图1B所示，IL-1β以时间依赖性的方式下调Smad4的表达，提示Smad4是miR-146a的靶基因。Irmgard Schwarte-Waldhoff等报道在人胰腺癌细胞中Smad4通过抑制血管生成来抑制肿瘤形成，同时血管内皮生长因子(vaseular endothelial growth factor，VEGF)下调[Schwarte-Waldhoff I，Volpert OV，Bouck NP，Sipos B，Hahn SA，Klein-Scory S，et al.Smad4/DPC4-mediated tumor suppression through suppression of angiogenesis.Proc Natl Acad Sci U S A 2000；97(17)：9624-9]。而VEGF上调对OA中的炎症和病理性血管生成有作用[Bonnet CS，Walsh DA.Osteoarthritis，angiogenesis andinflammation.Rheumatology(Oxford)2005；44(1)：7-16]，提示在骨关节炎中可能存在一个包含miR-146a和Smad4的调控网络，该调控网络与炎症相关的血管生成相关。检测的结果与假设相一致，本发明人观察到IL-1β使VEGF的mRNA和蛋白水平表达上升，与miR-146a表达上调的趋势一致(图1C和1D)。

实施例2、miR-146a通过与Smad4的3’UTR结合直接调控Smad4的表达

接着，本发明人进一步研究Smad4是否确实是miR-146a的靶基因，寻找smad4编码或非编码区中含有miR-146a结合位点的序列(图2A)，位于Smad4的3’UTR区域。进一步把这一序列克隆到荧光素酶报告载体中荧光素酶编码基因的上游。共转miR-146a和报告质粒使荧光素酶活性显著降低，然而通过突变破坏了miR-146a的结合位点后这一抑制作用被削弱(图2B)。

本发明人又在蛋白水平来确证这种抑制作用，将miR-146a表达质粒转化原代软骨细胞。结果，在原代软骨细胞中过表达miR-146a显著抑制Smad4的蛋白水平，说明miR-146a通过转录后水平调控Smad4的表达。而且，过表达miR-146a导致VEGF的上调(图2C)。

反之，本发明人用miRNA抑制剂(miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitors，购自Dharmacon)来减少内源性miR-146a的水平，发现miR-146a下调增加了Smad4的表达，同时VEGF的表达减少(图2D)。

实施例3、IL-1β通过miR-146a调控VEGF

为了阐明miR-146a在介导IL-1β通路中的作用，本发明人利用miR-146a的抑制剂(miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitors，购自Dharmacon)来阻断它的功能。

软骨细胞在使用或者不使用miR-146a抑制剂的情况下用IL-1β处理24小时。用其抑制剂可以显著下调IL-1β引起的miR-146a升高(图3A)。

相应的，Smad4和VEGF的mRNA经实时定量PCR检测，发现IL-1β诱导的Smad4下调可被miR-146a的抑制剂逆转(图3B)。

同时，miR-146a的抑制剂削弱IL-1β诱导的VEGF上调(图3C和3D)，说明炎症情况下miR-146a在介导VEGF表达中发挥重要作用。

实施例4、miR-146a对VEGF的上调是通过Smad4实现的

为了阐明IL-1β使VEGF上调是否是由Smad4的下调引起的，本发明人进行了RNA干扰实验。软骨细胞用干扰Smad4的siRNA进行转染，然后在mRNA和蛋白水平检测Smad4的下调情况。

如图4A和4B所示，针对Smad4的siRNA有效地减少了内源性Smad4的mRNA和蛋白水平。当Smad4表达被下调，VEGF的表达呈现出与过表达miR-146a类似的结果。VEGF的蛋白水平上调(图4B)。

随后，本发明人用Smad4的表达质粒和miR-146a共转软骨细胞来恢复Smad4的表达，发现miR-146a介导的VEGF上调被Smad4逆转(图4C)。这些结果说明IL-1β诱导的VEGF上调是由miR-146a和Smad4介导的。

实施例5、miR-146a增加软骨细胞的凋亡

软骨细胞凋亡增加是OA的一个显著特征，而且IL-1β可以诱导软骨细胞的凋亡[Lopez-Armada MJ，Carames B，Lires-Dean M，Cillero-Pastor B，Ruiz-Romero C，Galdo F，et al.Cytokines，tumor necrosis factor-alpha andinterleukin-1beta，differentially regulate apoptosis in osteoarthritis cultured humanchondrocytes.Osteoarthritis Cartilage 2006；14(7)：660-9]。所以接着，本发明人通过TUNEL检测过表达miR-146a是否对细胞凋亡有影响。

结果显示，过表达miR-146a增加了软骨细胞中TUNEL阳性细胞的数量(图5)，说明miR-146a参与介导IL-1β诱导的凋亡。

实施例6、大鼠关节炎模型中miR-146a、Smad4和VEGF的表达

本发明人还制备了大鼠关节炎(OA)模型，测定其中miR-146a、Smad4和VEGF的表达变化。结果，OA模型中，miR-146a的表达高于假手术组。MicroRNA通过与靶mRNA的互补序列结合发挥调节作用，从而抑制基因表达。Smad4的表达在OA模型的软骨中较低，VEGF的表达在关节炎模型中较高，见图6。

III.讨论

在体外关节炎炎症细胞模型中，本发明人发现关节炎(类风湿性关节炎与骨关节炎)核心致病因子IL-1β明显提高miR-146a的表达，在培养的人软骨细胞中本发明人观察到类似的结果。大鼠关节炎(OA)模型中miR-146a的表达高于假手术组。MicroRNA通过与靶mRNA的互补序列结合发挥调节作用，从而抑制基因表达。本发明人发现Smad4是miR-146a的一个新的靶基因。Smad4的表达在OA软骨中较低，和miR-146a的高表达相符。进一步本发明人的结果显示：软骨中上调的miR-146a抑制Smad4，而这种抑制作用致使VEGF上调，而VEGF最终促进关节软骨及滑膜中病理性血管生成。在关节炎病程中起着关键作用。

许多促血管生成和抗血管生成的因子是血管生成的正调控者和负调控者，包括生长因子、炎症因子、趋化因子及其受体等。在这些介导分子中，VEGF是生理病理状态下主要的血管生成调控分子。一方面，在慢性炎症性疾病的发病机制中，炎症经常伴随着血管生成。炎症细胞能分泌细胞因子和生长因子以促进血管生成，同时新形成的血管能够加重炎症。无论是OA还是RA中，滑膜关节的炎症都促进血管生成。RA和OA软骨和滑液中存在IL-1β和许多其他的炎症介导分子。本发明人证明IL-1β刺激VEGF的表达，而且这一过程是由miR-146a和Smad4介导的。VEGF在关节炎的滑膜中上调。Hiroyuki Enomoto等证明VEGF能够在人类正常和关节炎膝关节标本中被检测到，而且VEGF阳性细胞的比例在关节炎软骨中显著增加。VEGF在关节炎发病机理中充当炎症和血管生成的桥梁。如前所述，VEGF的表达是肥大软骨细胞的特征之一，诱导血管入侵软骨。在大鼠关节炎模型中，本发明人发现VEGF在软骨中上调，同时伴随着Smad4下调。这一结果与体外结果相符：软骨细胞中Smad4下调导致VEGF上调，并且miR-146a和Smad4共转软骨细胞逆转了miR-146a对VEGF的作用。

另一方面，VEGF上调与骨关节炎软骨内骨化密切相关。软骨内骨化是指无血管的软骨被血管化的骨组织所取代。在软骨内骨化过程中，软骨细胞进行肥大分化，然后肥大软骨细胞分泌基质金属蛋白酶(MMPs)和VEGF，前者启动细胞外基质重塑，后者诱导血管侵入肥大化的软骨。随后，软骨细胞凋亡，被成骨细胞和破骨细胞取代。而且，软骨内骨化在关节炎发病中也有重要作用。例如，OA中骨赘的形成与软骨内骨化相关，骨赘部位的肥大软骨细胞有VEGF表达。近年来的研究表明，VEGF在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)病理过程中起着关键作用。VEGF通过与其受体结合发挥生物学作用，可增加血管通透性，提高炎性渗透.促进内皮细胞生长、迁移和新生血管形成，RA血管增殖确保了滑膜血管翳的发生和发展，维持血管翳的侵袭性，促进软骨和骨破坏及关节重塑，最终造成关节畸形和强直，功能丧失。

本发明人的研究发现，miR-146a通过抑制Smad4上调VEGF。抑制血管生成将会抑制骨关节炎骨赘的形成及类风湿性关节炎滑膜血管翳的形成，这为骨关节炎及类风湿性关节炎的治疗提供新的有效的治疗策略。

且本发明人发现过表达miR-146a使软骨细胞凋亡增加。关节软骨中细胞组分减少对于骨关节炎的发生和发展具有重要意义。OA病人软骨中凋亡细胞的比例增加。凋亡的标志性分子，如caspase-3和caspase-8在其中表达增加。因此，miR-146a不仅通过直接靶向Smad4刺激VEGF的表达，而且调控软骨细胞的生存。

综上所述，本发明人发现一条新的miR-146a介导的信号级联，此通路对于IL-1β在关节炎中造成的病理现象，如血管生成和细胞凋亡，是非常关键的。本发明人的结果首次证实Smad4是miRNA-146a的直接靶基因。在关节炎中，miR-146a介导的Smad4下调使VEGF表达增加，鉴于VEGF在骨关节炎及类风湿性关节炎中的关键地位。miR-146a毋庸置疑是关节炎(骨关节炎及类风湿性关节炎)极有前途的治疗靶标。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.一种miR-146a抑制剂的用途，用于制备抑制血管内皮生长因子介导的血管生长的组合物；所述的血管是骨，软骨，滑膜中的血管。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于：

促进Smad4基因的转录或蛋白的表达；

抑制血管内皮生长因子的转录或表达；或

抑制软骨细胞的凋亡。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-146a抑制剂选自：化学合成的miR-146a抑制剂；以表达质粒为载体的抑制miR-146a的病毒和非病毒产品；与miR-146a互补的核酸序列或序列片段。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的miR-146a抑制剂是：miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitors。