CN112941076B

CN112941076B - FXR靶向的saRNA及其应用

Info

Publication number: CN112941076B
Application number: CN202110159772.XA
Authority: CN
Inventors: 郝海平; 王洪; 潘晓洁; 王广基; 崔双; 章鹏飞; 苏宇佩; 王康; 胡慧健; 陈安; 于洋
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-02-05
Filing date: 2021-02-05
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2041-02-05
Also published as: CN112941076A; WO2022166140A1

Abstract

本发明公开了一类FXR靶向的saRNA及其应用，该类saRNA可激活FXR的转录和表达，通过促进FXR的转录并上调该基因的表达水平，使疾病状态下下调的肝脏FXR表达水平恢复正常，并改善细胞凋亡。因此，该类saRNA可用于制备治疗由FXR表达下调引起的相关疾病的药物，还可以用于制备治疗具有凋亡表型的肝脏疾病的药物。

Description

FXR靶向的saRNA及其应用

技术领域

本发明涉及一类FXR靶向的saRNA及其应用，尤其涉及一类可上调FXR表达水平的saRNA及其应用。

背景技术

肝脏疾病，包括病毒性肝炎(HBV/HCV等)、非酒精性脂肪肝、酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝硬化和肝癌等，在全球范围的发病率居高不下，肝病已经成为威胁人类健康的重要杀手。目前全球约有1.85亿人感染HCV，其中慢性感染者约1.3-1.7亿人；另外，全球一般人群的非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)患病率超过25％，且已有超过1亿人口的进展为非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)，NASH已发展成为肝移植的主要原因，然而目前治疗各类肝脏疾病的特异性药物并不多。

细胞凋亡是一种基本的生物学现象，对生物体进化、内环境稳态及机体发育等具有重要作用；而凋亡过程紊乱则与多种疾病的发生发展密切相关，如肝细胞凋亡是各种肝病(包括NALFD/NASH，酒精性肝炎、药物性肝损伤、病毒性肝炎、胆汁淤积型肝损伤、缺血-再灌注性肝损伤、肝豆状核变性、肝纤维化/硬化、肝癌等)的共同特征和病理机制。

法尼醇X受体(Farnesoid X Receptor，FXR，又称NR1H4)是核受体超家族的一员，它在调节胆汁酸代谢、脂质代谢和糖代谢中发挥重要功能，同时它与能量平衡、炎症与免疫、肝纤维化以及肝脏再生密切相关。因此，FXR被广泛认为是重要的保肝药物研发靶标。目前基于FXR为靶点的药物研发策略主要集中于FXR激动剂或拮抗剂的研发，即旨在调控FXR的转录活性状态。FXR激动剂作为保肝药物的研发是当前的研究热点，其中，奥贝胆酸作为一种强FXR激动剂，为抗原发性胆汁性肝硬化药物，已于2016年5月被美国FDA批准上市，是以FXR为靶点成功上市的第一例药物；其抗NASH药效已完成临床III期研究，然而其临床药效欠佳：服用安慰剂组的患者中有12％发现肝纤维化指标有改善，而服用高剂量奥贝胆酸的患者中有23％发现肝纤维化指标有改善，提示通过奥贝胆酸等FXR激动剂转录激活FXR后的药理效应比较局限。

研究表明，NASH以及肝纤维化状态下，肝脏中FXR表达下调。靶标蛋白的缺失使得其激动剂或者拮抗剂无法通过调控该靶标来发挥作用，这是导致FXR激动剂临床药效不佳的主要原因；此外，肝细胞凋亡进程中伴随着FXR的表达下调，加速加重肝细胞凋亡；并且提高FXR表达具有抗凋亡作用；另外，随着年龄的增大，肝脏中FXR的表达显著下调，这是引起脂肪肝的重要因素。因此，需重视FXR自身表达对疾病发生发展以及其配体药理活性的作用；基于此，调控FXR的自身表达是新的靶向FXR的重要策略。然而如何调控FXR蛋白的基因表达尚无成熟的技术手段。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的是提供一类FXR靶向的saRNA，第二目的是提供所述saRNA的应用。

技术方案：本发明的FXR靶向的saRNA包括与NR1H4基因启动子区-1000至-1位点区域互补的核苷酸序列。

进一步地，所述saRNA包括与NR1H4基因启动子区-102位点至-84位点区域互补的核苷酸序列。

进一步地，所述saRNA包括与NR1H4基因启动子区-103位点至-85位点区域互补的核苷酸序列。

进一步地，所述saRNA包括与NR1H4基因启动子区-105位点至-87位点区域互补的核苷酸序列。

进一步地，所述saRNA包括与NR1H4基因启动子区-318位点至-300位点区域互补的核苷酸序列。

进一步地，所述saRNA包括与NR1H4基因启动子区-319位点至-301位点区域互补的核苷酸序列。

更具体地，所述saRNA由序列如SEQ ID NO：2所示的正义链和序列如SEQ ID NO：3所示的反义链组成，或者由SEQ ID NO：4所示的正义链和序列如SEQ ID NO：5所示的反义链组成，或者由SEQ ID NO：6所示的正义链和序列如SEQ ID NO：7所示的反义链组成，或者由SEQ ID NO：8所示的正义链和序列如SEQ ID NO：9所示的反义链组成，或者由SEQ ID NO：10所示的正义链和序列如SEQ ID NO：11所示的反义链组成。

本发明从saRNA的角度，首次设计合成了特异性靶向FXR(NR1H4)的系列saRNA，其具有特异性高、专一性强的特点，可显著调控FXR的转录和表达，从而发挥抗肝细胞凋亡的活性，可用于制备对抗具有肝细胞凋亡表型的肝脏疾病的药物。

本发明还公开了所述的saRNA在制备由于FXR表达下调引起的相关疾病的药物中的应用。

本发明又公开了所述的saRNA在制备对抗肝细胞凋亡的药物中的应用。

上述药物为治疗肝脏疾病的药物，其中肝脏疾病具有肝细胞凋亡表型，可具体治疗不限于以下疾病：病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、肝纤维化、肝硬化、肝癌、胆汁淤积性肝病、药物性肝损害等。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

(1)该系列saRNA均能够促进FXR基因的转录，均能够恢复多种诱因导致下调的FXR表达水平，与对照组具有显著差异，最优达到***P<0.001；

(2)该系列saRNA均能够对抗各种诱因导致的肝细胞凋亡，与对照组具有显著差异，最优达到***P<0.001；

(3)该系列saRNA作用靶点精准，特异性高、专一性强，适应症广泛，可制备为治疗具有肝细胞凋亡表型的多种肝脏疾病的药物。

附图说明

图1为细胞凋亡状态下FXR的表达水平，其中：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图2为本申请的saRNA对健康细胞中NR1H4基因表达的调控作用，其中：*P<0.05，***P<0.001；

图3为本申请的saRNA对凋亡细胞中NR1H4基因表达的调控作用，其中：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图4为本申请的saRNA对细胞凋亡的缓解作用，其中：**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1：细胞凋亡状态下FXR的表达变化

1、实验材料

DMEM培养基购自GIBCO(Grand Island,New York,USA)。胎牛血清(Fetal bovineserum,FBS)购自Hyclone(Logan,Utah,USA)。胰蛋白酶Trypsin购自Amersco(Solon,Ohio,USA)。细胞培养耗材购于Costar(USA)。放线菌素D(Actinomycin,ActD)和放线菌酮(cycloheximide,CHX)购于MedChem Express公司(NJ,USA)。重组人肿瘤坏死因子α(TumorNecrosis Factor alpha,TNFα)购于Peprotech公司(Rocky Hill,USA)，重组人FasL蛋白和重组人TRAIL蛋白购于Sino Biological公司(Wayne,PA,USA)。RNAiso Plus购于RNAisoPlus购于TaKaRa Biotechnology(大连，中国)。

ⅢRT SuperMix for qPCR及ChamQSYBR qPCR Master Mix均购于Vazyme Biotechnology(南京，中国)。所有引物均由Invitrogen公司(上海，中国)设计合成。DEPC水购于碧云天生物技术研究所(上海，中国)。

2、实验方法

2.1细胞培养及给药处理

人肝细胞系L02培养于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞按2×10⁵个/孔接种于12孔板中。24h后分别用TRAIL，ActD/TNFα，CHX/FasL法造凋亡模型。TRAIL给药浓度为50ng/ml，给药时间为0、2、4、8、12、24h。ActD/TNFα给药浓度为0.2μM和20ng/ml，其中ActD预给30min，给药时间为0、1、2、4、8、12h。CHX/FasL给药浓度为50μM和50ng/ml，其中CHX预给30min，给药时间为0、2、4、8h。

2.2PCR

RNAiso Plus试剂提取细胞总RNA，将其反转录为cDNA然后通过荧光定量PCR法分析FXR的转录表达变化。荧光定量PCR所使用的引物见下表1：

表1荧光定量PCR所使用的引物

3、实验结果

如图1所示，在TRAIL、ActD/TNFα、CHX/FasL 3种凋亡模型下，FXR的mRNA水平均表现出时间依赖性的下降。

实施例2：靶向FXR的saRNA设计及验证

1、实验材料

Lipofectamine RNAiMAX购于Thermo Fisher(CA,USA)。Opti-MEM培养基购于GIBCO(Grand Island,New York,USA)。所有saRNA均由吉满生物科技有限公司(上海，中国)合成。重组人TRAIL蛋白同实施例1。

其余试剂同实施例1。

2、实验方法

2.1FXR启动子序列查询

在网站NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得FXR启动子区序列。

根据saRNA序列的设计原则，设计获得FXR的5对saRNA及其对应FXR启动子区位点。FXR启动子区位点-1000位点至-1位点的序列(SEQ ID NO:1)如下所示：

GAGCTTGGTACAGGTTGGCAGAGGTTGGGATGTCTGAAGGGACAGAATGTGAGAAAATCCTAGAGACATTAGGGCTAGATCTTCAGGTGTGGAAGGGGTTCTAAATGTCAAGCATTTTGTGTTCGTTTTTTAGGCATAGAGAGTGCATTGGGGATTTTCGATGAGGGGAGTGCCTAGCAAGTTGCTGGGTACATAGTAGGCTGATAATCAATCAATGATGGTTCAACTAATGAAGGAGAGAAATAATAATTGCCACAAATTATTGGGTGATTGCTATCTGCCACACACTTTTCTAAACATTTTCACTACTCATGTAATTCTCACCACAGCCCATGAGATGGTTTCTCCATATCCATTCTACAGATGAGGAAACTGAGACTCAGAGAGGCTAAGTGTCTTGCTCAAGGCTGTGACTAAAGAGTGGGCATCTAACCAGAGCCTGTGCTTCCACACTGCTGTGCAATTTGGAAAACAGAAGAAGGGGAGAGAAGAAAAAGGGGTTGTGGGACCAATGTCATCCAGAAAGGAAGCTATGATAGGCCCAAAGTAGGAGAAGAACAATGTGGGTTGGAAATAAGAGACATTCCAAAGATGCAATCAACCCAAATCTGTTATTATTTGATATGGGTGGCTGGGCAGAGGGAAGGGTCAAAAAGGCTCCCAGCTTCTAGTTCAGTCCCGGGGAAGTGATAGAGCTATTCAAAGAAGTTGTAGTGAGAGAGAGGGAAGATGACAGTTTGGTTTTAGTTGATGTGTACAGAAATACGGGTGCCCAGGAGCCCACAAAACGGCCAGAGGAGAAATGCTTTCAAAGGCAAGCTGCAGGGCTCCTTGGTTTTGTCACATTCCTCATTCTGGGGCTTTGCGGTTTTGTCTTGGGAATCTCGAGGCTCTCCCAAGGTTCCTTTCTATGTTTATATCATTTAGCAGGGAAGGATTGTTAATGACTAATCTGTGTCCATGAGGCACAGAGCCAAGGAAGAGATGCTGCTGCTAGCCC。

2.2细胞培养及saRNA转染

人肝细胞系L02培养于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞按2×10⁵个/孔接种于12孔板中。24h后以50nM转染细胞，转染48h后收获细胞。RNAiso Plus试剂提取细胞总RNA，将其反转录为cDNA然后通过荧光定量PCR法分析FXR的转录表达变化。

2.3TRAIL诱导的细胞凋亡模型

同实施例1。

2.4PCR

同实施例1。

3、实验结果

3.1saRNA序列

hdsFXR-102：

正义链：5’-AGGUUCCUUUCUAUGUUUA[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:6)

反义链：5’-UAAACAUAGAAAGGAACCU[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:7)

(FXR启动子区-102位点至-84位点)。

hdsFXR-103：

正义链：5’-AAGGUUCCUUUCUAUGUUU[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:2)

反义链：5’-AAACAUAGAAAGGAACCUU[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:3)

(FXR启动子区-103位点至-85位点)。

hdsFXR-105：

正义链：5’-CCAAGGUUCCUUUCUAUGU[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:8)

反义链：5’-ACAUAGAAAGGAACCUUGG[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:9)

(FXR启动子区-105位点至-87位点)。

hdsFXR-318：

正义链：5’-GGAAGUGAUAGAGCUAUUC[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:10)

反义链：5’-GAAUAGCUCUAUCACUUCC[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:11)

(FXR启动子区-318位点至-300位点)。

hdsFXR-319：

正义链：5’-GGGAAGUGAUAGAGCUAUU[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:4)

反义链：5’-AAUAGCUCUAUCACUUCCC[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:5)

(FXR启动子区-319位点至-301位点)。

3.2saRNA验证

首先在正常L02细胞中考察验证了上述saRNA对FXR基因表达的调控作用。如图2所示，5对saRNA均具有激活效果，均可以显著促进FXR基因的转录，使其mRNA水平上调；且hdsFXR-103和hdsFXR-319优于hdsFXR-102、hdsFXR-105和hdsFXR-318。

3.3saRNA对凋亡细胞中FXR表达的调控作用

同实施例1所述，凋亡状态下FXR基因表达水平呈时间依赖性的下调。如图3所示，TRAIL诱导的L02凋亡状态下，FXR基因表达呈时间依赖性的下调；而上述saRNA对此具有显著的逆转作用，对凋亡模型中各个时间点和不同程度的FXR下调均具有显著的逆转作用。

实施例3：系列saRNA对细胞凋亡的药理活性

1、实验材料

噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)购于MedChemExpress公司(NJ,USA)。

其余试剂同实施例2。

2、实验方法

2.1细胞培养、转染和给药处理

人肝细胞系L02培养于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞按5×10³个/孔接种于96孔板中。24h后以50nM转染细胞，转染48h后进行凋亡造模。TRAIL给药浓度为50ng/ml，给药24h。ActD/TNFα给药浓度为0.2μM和20ng/ml，其中ActD预给30min，给药时间为8h。CHX/FasL给药浓度为50μM和50ng/ml，其中CHX预给30min，给药时间为8h。

2.2细胞活力检测

给药时间结束后，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，37℃继续孵育4h，吸出弃去培养基，每孔加入150μl DMSO，37℃孵育10min，490nm波长测定吸光度。

3、实验结果

如图4所示，hdsFXR-102、hdsFXR-103、hdsFXR-105、hdsFXR-318和hdsFXR-319在TRAIL(图4A和图4D)、ActD/TNFα(图4B和图4E)和CHX/FasL(图4C和图4F)3种经典凋亡模型下均具有显著的抗细胞凋亡效果。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> FXR靶向的saRNA及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1000

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

gagcttggta caggttggca gaggttggga tgtctgaagg gacagaatgt gagaaaatcc 60

tagagacatt agggctagat cttcaggtgt ggaaggggtt ctaaatgtca agcattttgt 120

gttcgttttt taggcataga gagtgcattg gggattttcg atgaggggag tgcctagcaa 180

gttgctgggt acatagtagg ctgataatca atcaatgatg gttcaactaa tgaaggagag 240

aaataataat tgccacaaat tattgggtga ttgctatctg ccacacactt ttctaaacat 300

tttcactact catgtaattc tcaccacagc ccatgagatg gtttctccat atccattcta 360

cagatgagga aactgagact cagagaggct aagtgtcttg ctcaaggctg tgactaaaga 420

gtgggcatct aaccagagcc tgtgcttcca cactgctgtg caatttggaa aacagaagaa 480

ggggagagaa gaaaaagggg ttgtgggacc aatgtcatcc agaaaggaag ctatgatagg 540

cccaaagtag gagaagaaca atgtgggttg gaaataagag acattccaaa gatgcaatca 600

acccaaatct gttattattt gatatgggtg gctgggcaga gggaagggtc aaaaaggctc 660

ccagcttcta gttcagtccc ggggaagtga tagagctatt caaagaagtt gtagtgagag 720

agagggaaga tgacagtttg gttttagttg atgtgtacag aaatacgggt gcccaggagc 780

ccacaaaacg gccagaggag aaatgctttc aaaggcaagc tgcagggctc cttggttttg 840

tcacattcct cattctgggg ctttgcggtt ttgtcttggg aatctcgagg ctctcccaag 900

gttcctttct atgtttatat catttagcag ggaaggattg ttaatgacta atctgtgtcc 960

atgaggcaca gagccaagga agagatgctg ctgctagccc 1000

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagguuccuu ucuauguuu 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaacauagaa aggaaccuu 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggaagugau agagcuauu 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aauagcucua ucacuuccc 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agguuccuuu cuauguuua 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uaaacauaga aaggaaccu 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccaagguucc uuucuaugu 19

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acauagaaag gaaccuugg 19

<210> 10

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggaagugaua gagcuauuc 19

<210> 11

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaauagcucu aucacuucc 19

Claims

1.一种FXR靶向的saRNA，其特征在于，所述saRNA由序列如SEQ ID NO：2所示的正义链和序列如SEQ ID NO：3所示的反义链组成，或者由SEQ ID NO：4所示的正义链和序列如SEQID NO：5所示的反义链组成，或者由SEQ ID NO：6所示的正义链和序列如SEQ ID NO：7所示的反义链组成，或者由SEQ ID NO：8所示的正义链和序列如SEQ ID NO：9所示的反义链组成，或者由SEQ ID NO：10所示的正义链和序列如SEQ ID NO：11所示的反义链组成。

2.根据权利要求1所述的saRNA，其特征在于，所述saRNA包括与NR1H4基因启动子区-1000至-1位点区域互补的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的saRNA，其特征在于，所述saRNA包括与NR1H4基因启动子区-102位点至-84位点区域互补的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的saRNA，其特征在于，所述saRNA包括与NR1H4基因启动子区-103位点至-85位点区域互补的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的saRNA，其特征在于，所述saRNA包括与NR1H4基因启动子区-105位点至-87位点区域互补的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的saRNA，其特征在于，所述saRNA包括与NR1H4基因启动子区-318位点至-300位点区域互补的核苷酸序列。

7.根据权利要求1所述的saRNA，其特征在于，所述saRNA包括与NR1H4基因启动子区-319位点至-301位点区域互补的核苷酸序列。

8.一种权利要求1-7任一所述的saRNA在制备由于FXR表达下调引起的相关疾病的药物中的应用，所述药物为治疗肝脏疾病的药物。

9.一种权利要求1-7任一所述的saRNA在制备对抗肝细胞凋亡的药物中的应用。