CN107812199A - 法尼醇x受体在制备治疗以肝细胞凋亡为病理变化的肝脏疾病的药物中的应用 - Google Patents

法尼醇x受体在制备治疗以肝细胞凋亡为病理变化的肝脏疾病的药物中的应用 Download PDF

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CN107812199A CN201711065974.8A CN201711065974A CN107812199A CN 107812199 A CN107812199 A CN 107812199A CN 201711065974 A CN201711065974 A CN 201711065974A CN 107812199 A CN107812199 A CN 107812199A
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Abstract

本发明公开了法尼醇X受体在制备治疗以肝细胞凋亡为病理变化的肝脏疾病的药物中的应用。尽管既往研究证实调控FXR的转录活性状态的药物在肝脏疾病的治疗中发挥重要作用，FXR激动剂在长期使用时可以引起高密度脂蛋白降低等多种不良反应。法尼醇X受体在对抗肝细胞凋亡方面的作用尚不明确。通过在肝细胞中过表达FXR，发现其显著对抗肝细胞凋亡，提高肝细胞活力；维持肝细胞形态和结构的完整性，降低血清转氨酶。因此将促进FXR表达试剂用于肝细胞凋亡或肝脏疾病的治疗，具有重要意义。

Description

法尼醇X受体在制备治疗以肝细胞凋亡为病理变化的肝脏疾 病的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物制药领域中，特别是涉及一种抗肝细胞凋亡的基因治疗药物，即利用法尼醇X受体(Farnesoid X Receptor，FXR)治疗以肝细胞凋亡为病理变化的肝病。
背景技术
肝脏疾病尤其是病毒性肝炎、脂肪肝病和肝癌等，在全球范围的发病率居高不下。如NAFLD在欧美普通成年人中的发病率为20-33％，肥胖人群中发病率达60-90％；在中国普通成年人患病率约为15％(Fan J G,Farrell G C.Epidemiology of non-alcoholicfatty liver disease in China.Journal of hepatology,2009,50(1): 204-10.)。肝病已经成为威胁人类健康的重要杀手。然而目前市场上用于治疗各类肝损伤的特异性药物并不多，临床上应用的肝保护药物主要有磷脂酰胆碱、谷胱甘肽等营养类物质；肝细胞生长因子(HGPF)等生物制剂；五味子、茵陈等传统中药以及近两年来上市的Sovaldi和Harvoni等抗丙肝药物。
细胞凋亡是一种基本的生物学现象，对生物体进化、内环境稳态及机体发育等具有重要作用；而凋亡过程紊乱则与多种疾病的发生发展密切相关，如肿瘤、自身免疫性疾病等。另外，文献调研结果显示肝细胞凋亡是各种肝病的共同特征和病理机制(Malhi H,Gores G J.Cellular and molecular mechanisms of liver injury.Gastroenterology,2008,134(6):1641-54.)。以非酒精性脂肪性肝炎(NASH)为例，其早期病理变化主要是脂质蓄积和炎症反应，脂肪酸和TNFα等炎症因子继而可诱导肝细胞凋亡，且肝细胞凋亡是NASH发展至纤维化这一不可逆阶段的重要节点。此外，凋亡也是酒精性肝炎、药物性肝损伤、病毒性肝炎、胆汁淤积型肝损伤、缺血-再灌注性肝损伤、肝豆状核变性、肝纤维化/硬化、肝癌等其他各种肝病的核心病理进程。因此，抑制凋亡被认为是缓解和治疗肝病的重要策略 (Canbay A,Friedman S,Gores G J.Apoptosis:the nexus of liverinjury and fibrosis. Hepatology,2004,39(2):273-8.)。
法尼醇X受体(Farnesoid X Receptor，FXR)又称NR1H4(Nuclear ReceptorSubfamily 1，Group H，Member 4)，是核受体超家族的一员，是配体激活的转录因子，胆汁酸就是FXR的内源性配体。自1995年被克隆以来，该受体越来越多的功能被认识：FXR不仅在胆汁酸、脂质和糖代谢等生理过程中发挥重要作用，同时对多种病理进程具有调控作用：FXR通过FXR-FGF15/19信号通路介导了胆汁酸的促肝再生作用；FXR通过FXR/NF-κB负反馈环发挥抗炎作用(Wang Y D, Chen W D,Wang M,et al.Farnesoid X receptorantagonizes nuclear factor kappaB in hepatic inflammatoryresponse.Hepatology,2008,48(5):1632-43.)；FXR通过阻断 CREB-CRTC2复合体形成并抑制下游自噬相关基因表达进而发挥抗自噬作用 (Seok S,Fu T,Choi SE,etal.Transcriptional regulation of autophagy by an FXR-CREB axis.Nature 2014；516:108-U274.)。上述研究都是通过药物激活FXR，激活的FXR入核与另一核受体成员维甲类X受体结合形成异源二聚体，并结合到靶基因启动子上的FXR反应元件发挥转录调节作用，调节靶基因的表达。即在该调控模式中FXR可以被当成是沟通药物和下游靶基因之间的“桥梁”，药物作用于FXR，但是对FXR自身的表达量并不没有影响，而是使FXR下游靶基因的表达(如SHP、BSEP、CYP7A1等)发生变化，这些靶基因是直接参与并干预各种病理进程的分子。因此，目前基于FXR为靶点的药物研发策略主要集中于各种调控FXR转录活性的试剂(如激动剂和拮抗剂)的研发，即旨在通过调控FXR的转录活性状态进而调控下游靶基因。FXR激动剂作为保肝药物的研发是当前研究的热点，有大量相关的专利申报(Sepe V,DistruttiE,Fiorucci S, Zampella A.Farnesoid X receptor modulators(2011-2014):a patentreview.Expert Opin Ther Pat.2015；25(8):885-96.)，如CN201210482982.3提供了细格菌素类化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗FXR介导疾病药物中的应用，CN201180067346.8和CN201080043283.8(申请号)公开了FXR活性调节剂在药物组合物中的应用，均已被授权。另外，6E-CDCA(又称奥贝胆酸)作为一种强FXR激动剂，其抗NASH药效正在进行临床III期研究，作为抗原发性胆汁性肝硬化(PBC)药物已于2016年5月被美国FDA批准上市(Markham A,Keam SJ.Obeticholic Acid:First GlobalApproval.Drugs.2016Aug；76(12):1221-6.)，成为以FXR为靶点成功上市的第一例药物。但是FXR激动剂在长期使用时可以引起高密度脂蛋白降低等多种不良反应。
尽管既往研究证实调控FXR的转录活性状态的药物在肝脏疾病的治疗中发挥重要作用，但该核受体在对抗肝细胞凋亡方面的作用尚不明确。国内外亦未将上调FXR表达作为对抗肝细胞凋亡治疗手段加以研究。我们研究的创新之处在于：利用基因工程技术体外调控肝细胞中FXR基因表达，证实肝细胞中过表达 FXR显著对抗肝细胞凋亡，提高肝细胞活力；通过体内FXR腺病毒载体注射明确FXR表达上调可以抵抗肝细胞凋亡的作用，维持肝细胞形态和结构的完整性；这是核受体治疗以肝细胞凋亡为病理变化的肝脏疾病研究领域的全新探索。
发明内容
本发明的目的是提供法尼醇X受体在制备治疗以肝细胞凋亡为病理变化的肝脏疾病的药物中的应用。利用基因工程技术体外调控肝细胞中FXR基因表达及体内FXR腺病毒载体注射，明确FXR表达上调可以抵抗肝细胞凋亡的作用，为临床治疗肝病，尤其是伴有肝细胞凋亡的肝病提供新的治疗手段。
本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供法尼醇X受体在制备治疗以肝细胞凋亡为病理变化的肝脏疾病的药物中的应用。
优选地，所述以肝细胞凋亡为病理变化的肝脏疾病包括酒精性肝炎、药物性肝损伤、病毒性肝炎、胆汁淤积型肝损伤、缺血-再灌注性肝损伤、肝豆状核变性、肝纤维化/硬化、肝癌。
第二方面，本发明提供含有治疗有效量的FXR表达载体和可药用赋形剂的组合物在制备治疗以肝细胞凋亡为病理变化的肝脏疾病的药物中的应用。
优选地，所述FXR表达载体包括携带FXR的病毒性载体或非病毒性载体。
优选地，所述携带FXR的病毒性载体是腺病毒、腺相关病毒或慢病毒等。
优选地，所述携带FXR的非病毒性载体是质粒。
第三方面，本发明提供法尼醇X受体基因作为药物靶标在筛选抗肝细胞凋亡的药物中的应用，所述的药物是促进法尼醇X受体基因表达的药物。
本发明的有益效果在于：本发明公开了法尼醇X受体在制备保肝药物中的应用，通过在肝细胞中过表达FXR进而显著对抗肝细胞凋亡，提高肝细胞活力；维持肝细胞形态和结构的完整性，降低血清转氨酶。因此将促进FXR表达试剂用于肝细胞凋亡或肝脏疾病的治疗，具有重要意义。
附图说明
图1 HepG2细胞中FXR沉默效率验证 A为PCR检测FXR表达；B为western blot检测FXR表达；
图2 HepG2细胞中FXR沉默后对ActD/TNFα诱导的细胞损伤的影响 A为细胞活力检测；B为细胞凋亡检测；
图3 HepG2细胞中FXR过表达(FXR质粒经脂质体转染法)效率验证 A为荧光显微镜检测FXR表达；B western blot检测FXR表达；
图4 HepG2细胞中FXR过表达(FXR质粒经脂质体转染法)对ActD/TNFα诱导的细胞损伤的影响 A为细胞活力检测；B为细胞凋亡检测；
图5 HepG2细胞中FXR过表达(FXR腺病毒转染法)效率验证 A为荧光显微镜检测FXR表达；B为western blot检测FXR表达；
图6 HepG2细胞中FXR过表达(FXR腺病毒转染法)对ActD/TNFα诱导的细胞损伤的影响 A为细胞活力检测；B为细胞凋亡检测；
图7 FXR敲除小鼠效率验证(PCR检测FXR表达)；
图8 FXR敲除对GalN/LPS诱导的血清转氨酶水平升高的影响 A为谷丙转氨酶；B为谷草转氨酶；
图9 FXR敲除对GalN/LPS诱导的肝细胞损伤/凋亡的影响 A为H&E染色；B为TUNEL染色；
图10小鼠肝脏中FXR过表达(FXR腺病毒尾静脉注射)效率验证；
图11小鼠肝脏中FXR过表达(FXR腺病毒尾静脉注射)对GalN/LPS诱导的血清转氨酶水平升高的影响 A为谷丙转氨酶；B为谷草转氨酶；
图12小鼠肝脏中FXR过表达(FXR腺病毒尾静脉注射)对GalN/LPS诱导的肝细胞损伤/凋亡的影响 A为H&E染色；B为TUNEL染色；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
发明人通过质粒或者腺病毒携带FXR基因，使其在HepG2细胞(一种肝癌细胞株)和小鼠肝脏中过表达，可以有效缓解肝细胞的凋亡情况，提高细胞活性，缓解小鼠肝衰竭的症状，小鼠肝功能和形态得到有效改善，说明本发明的技术方案适用于伴有肝细胞凋亡的肝脏疾病的治疗。
本发明实施例中所使用的生物材料(如细胞，实验动物，质粒等)和试剂，如无特别说明，均可从市售渠道获得。
【实施例1】HepG2细胞中FXR沉默(FXR siRNA转染)对细胞凋亡更敏感 1实验材料
本发明所用HepG2购自中国科学院细胞库；
本发明所用Control siRNA和FXR siRNA购自由Invitrogen公司设计合成 (XieY,Wang H,Cheng X,Wu Y,Cao L,Wu M,Xie W,Wang G,Hao H.Farnesoid X receptoractivation promotes cell proliferation via PDK4-controlled metabolicreprogramming.Sci Rep.2016Jan 5；6:18751.)；
放线菌素D(ActD)购自sigma公司，重组人肿瘤坏死因子TNFα购自 Peprotech公司；
抗FXR抗体购自Abcam公司，抗GAPDH抗体购自Bioworld公司；
DMEM培养基和胰酶购自GIBCO公司，Opti-MEM培养基和Lipofectamine RNAiMAX购自Invitrogen公司，胎牛血清(Fetal Bovine Serum)购自Hyclone 公司；
Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒购自BD公司。
2实验方法
2.1细胞培养
人肝癌细胞系HepG2细胞，培养在37℃，含5％CO2的环境中，培养液为完全DMEM培养基，细胞生长于T-25组织培养曲颈瓶中，2至3天更换培养基一次，待细胞生长至90％融合时进行传代。
2.2细胞转染FXR siRNA
首先配制沉默体系，即每500μL Opti-MEM中加入5μL Lipofectamine RNAiMAX和1.5μL的Stealth siRNA(Control或FXR)，轻轻吹打混合均匀后，于室温避光静置20min，而后加入至细胞板中(6孔板每孔500μL，96孔板每孔20μL)。
而后将对数期生长的HepG2细胞用不含抗生素的含血清DMEM培养基以适宜的细胞密度接种于细胞板中(6孔板密度为1.5×105个/2.5mL/孔，96孔板为 7500个/100μL/孔)。48h后撤去含沉默体系的培养基，通过PCR法和western blot 法验证转染效率。
2.3 PCR
每1×106细胞中，加入1mL Trizol，用1mL移液枪吹至液体澄清且无细胞团块并转移入1.5mL EP管中，按照Takara总RNA提取试剂盒操作提取总RNA，并进行RNA定量。按照RT-PCR试剂盒将mRNA逆转录为cDNA，按照Thermal Cycler DiceTM Real Time System(TaKaRaCode：TP800)使用说明书要求进行PCR试验操作。
定量PCR反应条件：
Stage 1：预变性:95℃，30sec
Stage 2：PCR反应:95℃，5sec；Tm，15sec；72℃,30sec；45Cycles
Stage 3：融解曲线分析：95℃ 15sec；70℃ 15sec。
采用Livak法半定量分析RT-PCR检测结果。
2.4细胞蛋白提取
将细胞板从培养箱取出后，弃去原培养基并用PBS洗3次，而后用细胞刮将细胞从板底刮下并收集至1.5ml的EP管中，4000rpm离心5min后弃去上清，向沉淀中加入100μl的裂解液(含PMSF)，充分震荡混匀后，于冰浴中裂解30 min，并超声破碎5次，3s/次。而后于4℃，15000rpm离心10min，上清液即为总蛋白提取物，取一小部分通过BCA法确定蛋白浓度。将样本用裂解缓冲液稀释至相同浓度，而后按照1：3的比例加入4×的上样缓冲液，混合均匀后在开水浴热变性10min。冷却后立即使用，或-20℃保存备用。
2.5 western blot
按照常规配方配制SDS-PAGE胶，包括10％分离胶，3％浓缩胶。将上述准备好的样品按顺序用上样针加在泳道中，上样体积为20μl，使上样的蛋白量为 40μg。记录上样顺序，同时在旁边的空白泳道中加入5μl的预染marker作分子量参照。而后进行电泳分离，条件为浓缩胶恒压75V约40min，分离胶115V 约65min。分离充分后进行转膜，取出凝胶，置于转移缓冲液中平衡15min，平放底部电极(阳极)，在上面分别放置滤纸、PVDF膜、凝胶和滤纸，排除各层气泡后将上方电极(阴极)放于夹层物上。按恒流200mA通电，电转移1.5h。而后将PVDF膜于37℃在5％脱脂奶粉封闭液中封闭1h，按约0.1mL/cm2的量加入适量一抗(FXR和GAPDH)，4℃孵育过夜。TBST漂洗滤膜4次，每次5min。将膜与HRP结合的二抗于37℃摇荡孵育1h，然后用TBST充分洗膜，漂洗4次，每次5min。最后在ChemiDocTMXRS+凝胶成像系统中采用增强型化学发光法(ECL法)进行目的蛋白的检测。
2.6肝细胞凋亡模型建立
HepG2细胞的造模方法：首先给予ActD(0.2μM)，0.5h后再给予TNFα (20ng/ml)，继续培养12h，肝细胞凋亡模型复制成功。
2.7 MTT法检测细胞活力
精密称取50mg MTT，加于10mL PBS中搅拌至溶解，使成5mg/mL的MTT 溶液，过滤除菌，避光冷藏保存，两个星期内使用有效。
弃去含药培养基，更换为无血清DMEM 180μl，同时每孔加入MTT溶液20 μl，使其终浓度为0.5mg/ml，继续培养4h后弃去培养基并用吸水纸吸干，每孔再加入150μl DMSO，37℃温孵10min，结晶紫完全溶解后，用酶标仪于570/695 nm测定吸光度值(A)。各给药组细胞存活率计算如下：
2.8 Annexin V-APC/7-AAD双染法检测细胞凋亡
采用Annexin V-APC/7-AAD双染法检测细胞凋亡：细胞给药后，用0.25％不含EDTA的胰酶收集并轻柔吹打成单个细胞，并用冰PBS洗涤两遍。按说明书使用Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒对细胞染色，即PBS洗涤一次后加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞；加入5μl Annexin V-APC混匀后，加入5μl 7-AAD染液，混匀；室温避光反应15min后进行用流式细胞仪检测荧光。 3实验结果
3.1 FXR沉默效率验证
首先，我们通过PCR技术和Western Blot技术对细胞中FXR的沉默效率进行了验证。PCR结果显示，与给予Control siRNA组相比，给予FXR siRNA后， HepG2细胞中FXR的mRNA表达量降低至15％左右；而Western Blot结果则显示，给予FXR siRNA后，几乎检测不到FXR的蛋白条带(图1B)。
3.2 FXR沉默对细胞活力的影响
通过ActD/TNFα法在HepG2细胞中复制了凋亡模型，通过MTT法考察了细胞中FXR沉默后对细胞活力的影响。结果显示，HepG2细胞经ActD/TNFα刺激后，与给予Control siRNA组相比，给予FXR siRNA组中细胞活力更低(图 2A)。
3.3 FXR沉默对细胞活力的影响
通过Annexin V-APC/7-AAD双染结合流式细胞仪检测的方法，来考察 HepG2细胞的凋亡情况。结果显示，细胞经ActD/TNFα刺激后，与给予Control siRNA组相比，给予FXRsiRNA组中发生凋亡的细胞数目更多(图2B)。
【实施例2】HepG2细胞中FXR过表达(FXR质粒脂质体转染)可以显著对抗细胞凋亡，提高细胞活力
1实验材料
本发明所用FXR质粒为pLVX-FXR-AcGFP1-PGK-Puro，由深圳百恩维生物科技有限公司设计合成并扩增；
Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；
其余生物材料/试剂同实施例1或均可从市售途径获得。
2实验方法
2.1细胞培养
具体方法同实施例1。
2.2细胞转染质粒
HepG2细胞传代后，用无抗10％DMEM将细胞接种于6孔板中，培养24h 后，对细胞进行转染。首先准备转染体系：对于每孔细胞，用500μl的Opti-MEM 培养基稀释2.5μg质粒，用500μl的Opti-MEM培养基稀释5.0μl的Lipofectamine 2000转染试剂，而后将稀释的质粒和转染试剂混合，室温避光静置20min。而后将上述质粒-转染试剂混合物加至细胞板中，每孔1ml，摇动细胞板使其混匀，在37℃含5％CO2的环境中培养8h后，弃去原培养基并更换为无抗10％DMEM，继续培养48h。通过western blot法和荧光显微镜验证转染效率。
2.3细胞蛋白提取
具体方法同实施例1。
2.4 western blot
具体方法同实施例1。
2.5肝细胞凋亡模型建立
具体方法同实施例1。
2.6 MTT法检测细胞活力
具体方法同实施例1。
2.7 Annexin V-APC/7-AAD双染法检测细胞凋亡
具体方法同实施例1。
3实验结果
3.1 FXR质粒转染效率验证
FXR质粒通过脂质体法转染HepG2细胞48h后，分别通过荧光显微镜和 westernblot法观察和检测了FXR的转染情况和效率。FXR质粒和对照质粒均接有EGFP，因此若质粒成功转染后，细胞中将表达绿色荧光。基于此，我们首先通过荧光显微镜观察了细胞内的绿色荧光，发现转染对照质粒(图3A左)和FXR 质粒(图3A右)的细胞中均有浓烈的绿色荧光。接着，通过western blot法检测了细胞内FXR的蛋白表达量，结果显示与转染对照质粒相比，HepG2细胞转染FXR质粒后，细胞内FXR蛋白水平明显升高(图3B)。
3.2 FXR质粒转染后对细胞活力的影响
通过ActD/TNFα法在HepG2细胞中复制了凋亡模型，通过MTT法考察了细胞转染FXR质粒后对细胞活力的影响。结果显示，细胞给予ActD/TNFα刺激后细胞活力显著降低，而转染FXR质粒后，可以显著逆转下降的细胞活力(图 4A)。
3.3 FXR质粒转染后对细胞凋亡的影响
通过Annexin V-APC/7-AAD双染结合流式细胞仪检测的方法，来考察 HepG2细胞的凋亡情况。结果显示，细胞给予ActD/TNFα刺激后，发生凋亡的细胞数显著升高，而转染FXR则可以显著降低发生凋亡的细胞数(图4B)，提示FXR表达升高具有显著的抗凋亡作用。
【实施例3】HepG2细胞中FXR过表达(FXR腺病毒转染)可以显著对抗细胞凋亡，提高细胞活力
1实验材料
携带FXR的腺病毒(Ad-FXR)由美国NIH中心Frank J Gonzalez教授惠赠 (ZhangY,Lee FY,Barrera G,Lee H,Vales C,Gonzalez FJ,Willson TM,Edwards PA.Activationof the nuclear receptor FXR improves hyperglycemia and hyperlipidemia indiabetic mice.Proc Natl Acad Sci U S A.2006Jan 24；103(4):1006-11.)，并由深圳百恩维生物科技有限公司扩增，对照腺病毒 (Ad-Ctrl)由该公司设计合成并扩增；
其余生物材料/试剂同实例1或均可从市售途径获得。
2实验方法
2.1细胞培养
具体方法同实施例1。
2.2细胞转染腺病毒
HepG2细胞腺病毒转染方法：对数期生长的HepG2细胞传代后，以适宜的密度接种于细胞板中，使转染时(24h后)的细胞密度大约为50％左右。腺病毒转染的量为20MOI，即取腺病毒(滴度为1×109pfu/ml)25μl加入至1ml完全培养基中。弃去原培养基更换给含病毒培养基(开始时加入少量，能覆盖住板底即可)，每隔20min晃一晃，三次后补充完全培养基至2ml(6孔板)或200μl (96孔板)。而后补足培养基，并将细胞置于培养箱中继续培养48h。
2.3细胞蛋白提取
具体方法同实施例1。
2.4 western blot
具体方法同实施例1。
2.5肝细胞凋亡模型建立
具体方法同实施例1。
2.6 MTT法检测细胞活力
具体方法同实施例1。
2.7 Annexin V-APC/7-AAD双染法检测细胞凋亡
具体方法同实施例1。
3实验结果
3.1 FXR腺病毒转染效率验证
FXR腺病毒转染HepG2细胞48h后，分别通过荧光显微镜和western blot 法观察和检测了FXR的转染情况和效率。FXR腺病毒和对照腺病毒均接有 EGFP，因此成功转染后，细胞中将表达绿色荧光。基于此，我们首先通过荧光显微镜观察了细胞内的绿色荧光，发现转染对照腺病毒和FXR腺病毒的细胞中均有浓烈的绿色荧光(图5A)。接着，通过western blot法检测了细胞内FXR的蛋白表达量，结果显示与转染对照腺病毒相比，HepG2细胞转染FXR腺病毒后，细胞内FXR蛋白水平明显升高(图5B)。
3.2 FXR腺病毒转染后对细胞活力的影响
通过ActD/TNFα法在HepG2细胞中复制了凋亡模型，通过MTT法考察了细胞转染FXR质粒后对细胞活力的影响。结果显示，细胞给予ActD/TNFα刺激后细胞活力显著降低，而转染FXR质粒后，可以显著逆转下降的细胞活力(图 6A)。
3.3 FXR腺病毒转染后对细胞凋亡的影响
通过Annexin V-APC/7-AAD双染结合流式细胞仪检测的方法，来考察 HepG2细胞的凋亡情况。结果显示，细胞给予ActD/TNFα刺激后，发生凋亡的细胞数显著升高，而转染FXR则可以显著降低发生凋亡的细胞数(图6B)，提示FXR表达升高具有显著的抗凋亡作用。
【实施例4】FXR敲除小鼠对肝损伤更加敏感
1实验材料
FXR敲除小鼠(FXR KO)及对照野生型小鼠(WT)由美国NIH中心Frank J Gonzalez教授惠赠，自行繁殖。
半乳糖胺(GalN)和脂多糖(LPS)购自sigma公司；
其余生物材料/试剂同实例1或均可从市售途径获得。
2实验方法
2.1肝组织PCR
称取肝组织50mg，加入1mL Trizol匀浆至无明显组织团块，12000g离心 5min后转移上清至1.5mL EP管中，按照Takara总RNA提取试剂盒操作提取总RNA，并进行RNA定量。具体方法同实施例1。
2.2肝组织蛋白提取
称取50mg左右的肝组织，加入1.0ml的RIPA裂解液(含PMSF)，在冰浴中匀浆2-3次，7-8sec/次，而后在冰浴中裂解30min，并超声破碎5次，3sec/ 次。而后于4℃，15000rpm离心10min，上清液即为总蛋白提取物，取一小部分通过BCA法确定蛋白浓度。将样本用裂解缓冲液稀释至相同浓度，而后按照 1：3的比例加入4×的上样缓冲液，混合均匀后在开水浴热变性10min。冷却后立即使用，或-20℃保存备用。
2.3 western blot
具体方法同实施例1。
2.4小鼠急性肝衰竭模型诱导
小鼠(WT小鼠和FXR KO小鼠)通过腹腔注射半乳糖胺(GalN)和脂多糖(LPS)复制肝损伤模型，即首先腹腔注射GalN 600mg/kg，0.5h后腹腔注射 LPS 10μg/kg。5h后小鼠肝衰竭模型复制成功。
2.5血清生化指标检测
收集各组别的小鼠全血样本，并于8000rpm离心10min，转移上清得到血清样本，送于江苏省中医院检验科，通过全自动生化检测仪，对血清中谷丙转氨酶(Alanineaminotransferase，ALT)和谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase， AST)水平进行检测分析。
2.6小鼠肝脏病理切片分析
肝脏组织于4％中性甲醛中固定后，送于武汉谷歌生物科技有限公司(武汉，中国)进行双盲分析检测，检测项目分别为H&E染色分析和TUNEL染色分析。
3实验结果
3.1小鼠肝脏FXR表达量分析
首先，我们通过PCR法对比分析了WT小鼠和FXR KO小鼠肝脏中FXR的表达量。结果发现，FXR KO小鼠肝脏中FXR的mRNA水平显著低于WT小鼠 (图7)。
3.2 FXR敲除对GalN/LPS诱导的血清转氨酶水平的影响
收集各组小鼠血清样本，通过全自动生化仪对肝功能主要指标谷丙转氨酶 (ALT)和谷草转氨酶(AST)水平进行分析，结果发现，给予GalN/LPS后， WT小鼠和FXR KO小鼠的血清ALT和AST水平均显著升高，且FXR KO小鼠的升高水平显著高于WT小鼠(图8)，提示FXR表达缺失后肝脏对凋亡信号更敏感。
3.3 FXR敲除对GalN/LPS诱导的肝细胞损伤/凋亡的影响
解剖小鼠后，观察肝脏，发现正常小鼠肝组织色泽红润，而注射GalN/LPS 后可使小鼠肝脏明显肿胀淤血，FXR KO小鼠肿胀和淤血症状更重。肝脏H&E 染色结果显示(图9A)，正常小鼠肝脏组织结构完整，肝细胞围绕中央静脉呈条索状排列，肝细胞边界清晰，结构正常，核大而圆，肝细胞未见明显的变性、坏死，肝窦无扩张充血，间质无炎细胞浸润。而腹腔注射GalN/LPS后，肝小叶结构不清，肝窦明显扩张充血，部分肝细胞弥漫性散在坏死，核溶解，碎裂，FXR KO小鼠比WT小鼠更严重。另外，肝脏TUNEL结果(图9B)显示，GalN/LPS 刺激后，小鼠大量肝细胞呈现明显的TUNEL阳染，且呈弥散性分布，而FXR KO 小鼠肝脏中TUNEL阳染更多，提示FXR表达缺失后肝细胞凋亡增加。
【实施例5】小鼠肝脏中FXR过表达(FXR腺病毒尾静脉注射)可以显著改善肝衰竭症状
1实验材料
实验小鼠购自扬州大学比较医学中心；
其余生物材料/试剂同实施例1、4或均可从市售途径获得。
2实验方法
2.1腺病毒转染小鼠
动物适应性饲养一周后，将小鼠随机分为4组，每组10只，共计40只，分别为空白对照组，FXR Adenovirus组，模型组，FXR Adenovirus给药保护组。腺病毒经由生理盐水稀释后，通过尾静脉注射的方式给予，首次剂量为1×109 pfu/只，而后每次减半，每天1次，连续3天。
2.2肝组织蛋白提取
具体方法同实施例4。
2.3 western blot
具体方法同实施例1。
2.4小鼠急性肝衰竭模型诱导
具体方法同实施例4。
2.5血清生化指标检测
具体方法同实施例4。
2.6小鼠肝脏病理切片分析
具体方法同实施例4。
3实验结果
3.1小鼠尾静脉注射FXR腺病毒后肝脏转染效率验证
首先，收集小鼠肝脏组织并制备冰冻切片，将制备好的切片置于荧光显微镜下观察绿色荧光。结果显示，尾静脉注射对照和FXR腺病毒的小鼠肝脏中均有显著的绿色荧光(图10A)，提示转染成功。接着，提取肝脏总蛋白，通过western blot法考察FXR蛋白的表达量，结果显示，与注射对照腺病毒的小鼠相比，尾静脉注射FXR腺病毒后肝脏中FXR蛋白水平明显升高(图10B)。
3.2 FXR转染小鼠后对GalN/LPS诱导的血清转氨酶水平的影响
收集各组小鼠血清样本，通过全自动生化仪对肝功能主要指标谷丙转氨酶 (ALT)和谷草转氨酶(AST)水平进行分析，结果发现，给予GalN/LPS后，小鼠ALT和AST水平均显著升高，二者分别升高了100倍和40倍左右，提示小鼠肝脏出现较严重损伤，而通过尾静脉注射FXR腺病毒，则可以显著缓解ALT 和AST水平的升高(图11)，提示FXR表达水平升高具有肝保护作用。
3.3 FXR转染小鼠后对GalN/LPS诱导的肝细胞损伤/凋亡的影响
解剖小鼠后，观察肝脏，发现正常小鼠肝组织色泽红润，而注射GalN/LPS 后可使小鼠肝脏明显肿胀淤血，给予FXR腺病毒后肿胀和淤血症状减轻。肝脏 H&E染色结果显示(图12A)，肝脏组织结构完整，肝细胞围绕中央静脉呈条索状排列，肝细胞边界清晰，结构正常，核大而圆，肝细胞未见明显的变性、坏死，肝窦无扩张充血，间质无炎细胞浸润。而腹腔注射GalN/LPS后，肝小叶结构不清，肝窦明显扩张充血，部分肝细胞弥漫性散在坏死，核溶解，碎裂；给予FXR 腺病毒后，肝小叶边界不清楚，肝窦扩张充血，肝细胞弥漫性散在坏死，并可见灶性炎细胞浸润，肝细胞的病理形态学改变明显轻于模型组。表明FXR过表达后可有效缓解GalN/LPS引起的肝细胞损伤。另外，肝脏TUNEL结果(图12B) 显示，GalN/LPS刺激后，小鼠大量肝细胞呈现明显的TUNEL阳染，且呈弥散性分布，而FXR腺病毒转染均可显著降低肝细胞的TUNEL阳染率，提示FXR 表达水平升高具有显著的抗凋亡保肝作用。

Claims (7)

1.法尼醇X受体在制备治疗以肝细胞凋亡为病理变化的肝脏疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述以肝细胞凋亡为病理变化的肝脏疾病包括酒精性肝炎、药物性肝损伤、病毒性肝炎、胆汁淤积型肝损伤、缺血-再灌注性肝损伤、肝豆状核变性、肝纤维化/硬化、肝癌。
3.含有治疗有效量的FXR表达载体和可药用赋形剂的组合物在制备治疗以肝细胞凋亡为病理变化的肝脏疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述FXR表达载体包括携带FXR的病毒性载体或非病毒性载体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述携带FXR的病毒性载体是腺病毒、腺相关病毒或慢病毒中的任意一种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述携带FXR的非病毒性载体是质粒。
7.法尼醇X受体基因作为药物靶标在筛选抗肝细胞凋亡的药物中的应用，所述的药物是促进法尼醇X受体基因表达的药物。
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