CN111690657A - Fxr激动剂在生物人工肝种子细胞中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，尤其涉及FXR激动剂在人工肝种子细胞中的应用。利用基因编辑技术在C3A、HepG2等人肝癌细胞系中过表达FXR，并利用FXR的配体激活FXR。本发明通过实验证明，活化人肝癌细胞系HepG2/C3A，HepG2和人肝细胞系L02中的FXR，能有效的提高这些细胞的氨代谢能力。因此，本发明发现活化FXR能提高氨代谢能力，改善肝癌细胞系在生物人工肝应用中的缺陷，有助于开发出高效低副作用的新型人工肝。

Description

FXR激动剂在生物人工肝种子细胞中的应用
背景技术
本发明属于生物医药领域，尤其涉及FXR激动剂在人工肝种子细胞中的应用。
技术领域
肝移植，是治疗终末期肝病的最有效方法，但是由于肝脏供体来源匮乏，随着等待肝移植的患者越来越多，只有少数患者才能获得肝移植治疗的机会，其它患者只能在等待中死亡。
生物人工肝(bioartificial liver，BAL)是1986年Demetrion教授首先提出的概念，由微载体粘附的肝细胞和人工解毒装置共同组成的体外肝灌流系统，能发挥肝细胞合成并结合胆红素和合成肝特异性蛋白的作用。BAL是以人工培养的肝细胞为基础构建的体外生物反应装置，是当前体外人工肝支持系统研究领域的主流，主要由肝细胞来源、细胞培养方式和生物反应器三要素构成。这种装置至今已发展了30年，仍然存在许多理论和临床实践上迫切需要解决的问题。
BAL的细胞来源是制约生物人工肝发展的首要问题，临床BAL应用系统的成功很大程度上取决于肝细胞的功能性和稳定性，目前，生物人工肝的细胞来源主要有以下几种：(1)肝细胞，最理想的BAL细胞来源是自体肝细胞，但人源肝细胞存在来源稀缺的缺点，且在体外不能有效存活，许多学者都转向异种肝细胞，其中，成熟猪肝细胞的高除氨能力和代谢稳定性使其成为BAL装置最佳的细胞来源，然而，由于猪内源性逆转录病毒(PERV)基因组存在于所有猪细胞中，一直以来成为MPHs应用的最大顾虑；(2)肝细胞系，从人类肝脏肿瘤细胞分化而来的人肝细胞系，来源充足，有无限生长的潜能，而且具有许多正常肝细胞的合成和代谢功能，是BAL有希望的细胞来源，包括HepG2/C3A、HepG2等细胞系。但由于肝癌细胞系存在着潜在的致癌风险，并且其氨清除能力较弱，限制了肝癌细胞系的应用；(3)干细胞，近年来，干细胞成为BAL很有发展前景的一类细胞来源，在体外去分化状态下能分化成肝细胞，并无限增殖，利用肝细胞源性干细胞作为新的BAL组分。
由于肝功能的缺乏，影响氨的代谢，导致大量氨在血液中富集，运送到神经中枢，引起肝性脑病。因此，在生物人工肝中，去氨作用是核心要求，人们很早就确定了肝脏是尿素合成的主要器官，肾脏是尿素排泄的主要器官。机体中氨的代谢主要是通过鸟氨酸循环而生成尿素。
肝癌细胞系HepG2具有较完善的肝细胞功能，并且致瘤能力低下(在免疫缺陷小鼠不能成瘤)，是目前作为人工肝原材料的首选。但由于HepG2细胞尿素循环的五个关键酶中精氨酸酶I(ArgI)和鸟氨酸转氨酶(OTC)的表达完全缺失，其氨清除能力较弱，限制了它的应用。HepG2/C3A细胞系作为HepG2的克隆衍生物，其分化程度高于HepG2，HepG2/C3A有很强的接触生长抑制和高表达白蛋白与甲胎蛋白的特性，与HepG2相比，其最大的进步是具有细胞色素P450活性，在氧化代谢方面起重要作用，且已在英国急性肝衰竭患者的试用临床对照试验中用于肝辅助装置系统，然而，并未观察到对生存的显著影响，其代谢功能距原代肝细胞还有一定距离，仍需要进一步的功能优化。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供FXR激动剂在生物人工肝种子细胞中的应用。
本发明的目的，在于提供FXR激动剂在生物人工肝种子细胞中的应用；所述的FXR激动剂可以为CDCA、奥贝胆酸(OCA)、GW4064、胆酸(CA)或脱氧胆酸(DCA)；优选为CDCA或GW4064。
本发明的另一个目的，提供核受体FXR在生物人工肝种子细胞中的应用，具体为以核受体FXR为靶点，得到生物人工肝的产品，包括增强或抑制的FXR表达的基因药物，和通过FXR的配体来调控FXR及其靶基因的表达化学药物。
所述的基因药物或化学药物包括药学上可接受的载体，形式为临床上可接受的形式。所述的基因药物含有FXR表达载体或干扰载体；所述的化学药物含有调控FXR的配体及调控FXR靶基因的配体。
所述FXR的配体包括鹅脱氧胆酸(CDCA)、奥贝胆酸(OCA)、GW4064、胆酸(CA)或脱氧胆酸(DCA)。
所述FXR的靶基因包括NAGS，ASCT1，SLC1A4，GLS和GDH等。
本发明的显著技术效果。
我们在前期的工作中，利用基因编辑技术在HepG2/C3A、HepG2等人肝癌细胞系中过表达FXR，并利用FXR的配体激活FXR。本发明通过实验证明，活化人肝癌细胞系HepG2/C3A能有效的提高这些细胞的氨代谢能力。因此，本发明发现活化FXR能提高氨代谢能力，改善肝癌细胞系在生物人工肝应用中的缺陷，有助于开发出高效低副作用的新型人工肝。
附图说明
图1构建FXR稳定表达细胞系，qRT-PCR检测FXR的基因表达。
图2激活FXR后氨代谢关键通路酶基因的表达。
图3实时细胞分析仪(RTCA)测定细胞增殖能力；其中，曲线1为Control，2为NH4CL10mM，3为NH4CL 20mM，4为FXR，5为FXR+NH4CL 10mM，6为NH4CL40mM、7为FXR+NH4CL 20mM，8为FXR+NH4CL 40mM。
图4生化分析仪检测ALT，AST，BUN等的含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1。
人肝癌细胞系HepG2/C3A，HepG2：购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，人肝细胞系L02购自上海中乔新舟生物科技有限公司。FXR稳转质粒由上海吉玛生物科技有限公司构建。DMEM培养基：购自Gibco，产品目录编号为12491-015。血清：购自Gibco，产品目录编号为10099-141。胰酶：购自Invitrogen，产品目录编号为25300-354。MEM培养基：购自Gibco，产品目录编号为12492-013。CDCA：购自陶素，产品目录编号为474-25-9。GW4064：购自陶素，产品目录编号为278779-30-9。氯化铵(NH4CL)：购自solarbio，产品目录编号为0621-500G。ALT，AST，BUN等检测试剂盒：购自日本富士公司。
1、人肝癌细胞系的培养。
取人肝癌细胞系HepG2/C3A，HepG2细胞和人肝细胞系L02，用添加10％胎牛血清、1％双抗的DMEM或MEM培养基于5％CO2培养箱中37℃培养。
2、构建FXR稳定表达细胞系。
(1)细胞种板：转染前20小时，将细胞配成2×105个/mL密度的完全MEM培养基细胞重悬液，取2mL接种到6孔板中，种四孔，4×105个/孔，尽量使次日细胞贴壁时50％左右的汇合度。
(2)质粒准备：转染当天取出-80℃冰箱保存的FXR-PEX4质粒，使用NanoDrop2000测其浓度，每孔转染3μg质粒加7.5μL Lip2000形成的结合复合物。
(3)转染过程。
①细胞换液：次日细胞贴壁后，移除6孔板原有的培养基，先用PBS清洗一次，再用MEM清洗一次，每孔加入1.2mL无血清、无抗生素的MEM，提前放入37℃，5％CO2培养箱孵育1小时。
②配制混合液：取30μL Lip2000加入盛有370μL MEM的Ep管中，再分别取3μg FXR-PEX4质粒及相应的对照加入100μL MEM的Ep管中，分别用枪轻柔吹打混匀后静置5分钟；然后分别取100μL Lip2000稀释液加入四种不同的质粒中，用枪轻微吹打混匀，室温放置20分钟以便形成质粒/Lip2000结合复合物。
③加入复合物：将质粒结合复合物逐滴滴加到6孔板孔中，上下左右轻柔循环摇晃培养板以便混匀。放回培养箱孵育6小时后，吸除转染培养基，更换MEM完全培养基继续生长。
(4)G418筛选：转染24小时后吸出培养基，先用灭菌PBS液洗一遍，再用含有终浓度为750μg/mL的遗传霉素(G418)的新鲜培养基替换。此后，隔天更换含有G418的完全培养基持续筛选细胞。
(5)筛选鉴定：高浓度的G418(750μg/mL)筛选十天后镜下观察不再出现大量漂浮死亡细胞，此时，取少量细胞沉淀提取RNA，反转cDNA后，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析鉴定FXR mRNA表达水平跟预期一致，则视为筛选成功。
(6)维持培养：过表达FXR基因的细胞通过qRT-PCR鉴定成功后，用含200μg/mLG418的完全培养基维持培养，进行下一步实验分析。
本实验过程，通过转染FXR稳定表达质粒，克隆筛选，获取稳定过表达FXR的细胞株，荧光定量PCR检测FXR过表达效率，见图1。结果显示，HepG2/C3A，HepG2和L02三种细胞系的FXR表达均有显著升高，HepG2/C3A和L02上调最为显著，HepG2过表达效果一般。
3、激活FXR能不同程度的改善氨代谢通路关键酶的表达。
(1)提RNA
①将取出的肝脏，大脑等组织液氮速冻，保存在零下80度的冰箱备用。
②取适量冻存组织，加tri-regent，组织破碎仪裂解细胞。
③加BCP分层细胞/组织裂解液，12000g 15min 4℃离心，将上清液转移到新的EP管中。
④加2-protocal(异丙醇)(2-protocal:上清液＝1:1)，上下混匀10多次，放置10min，让RNA充分析出。12000g，10min，4℃离心。
⑤弃上清，加入75％DEPC乙醇1ml，洗RNA一次，轻吹起来。7500g 5min4℃离心。
⑥吸净上清液，放置超净台上干燥10min。
⑦加适量PCR水溶解RNA，放55℃水浴10min，放置-20℃冰箱保存。
(2)RNA反转录cDNA
①加样顺序：H2O-RNA-oligdT，充分混匀，微离后，将PCR管放置PCR仪中，65℃，10min。
②反应体系，见表1。
表1 PCR反应体系。
试剂名称 5*buffer DTT(0.1M) 25uMdNTP inhibiter reverse transcriptase 总体积
试剂体积 6ul 2ul 0.7ul 0.3ul 1ul 10ul
混匀后，加入上述PCR管中，混匀，微离。将PCR管放到PCR仪中，42℃90min，95℃5min。反应结束后，cDNA放到-20℃冰箱中保存。
(3)real-time PCR
①稀释cDNA样品
②倍比稀释标准曲线的样品：取出一个稀释后的cDNA样品进行倍比稀释，终浓度别为6ng/ul、0.6ng/ul、0.06ng/ul、0.006ng/ul、0.0006ng/ul。
③配β-actin、FXR、SHP和CYP7A1等基因的混合液(mix)
④上样：使用real-time PCR专用的8排管，加液顺序为mix 15ul/well→稀释的cDNA样品5ul/well.上样结束后，将PCR专用的8排管或96孔板放在涡旋振荡器上震荡混匀，离心后。打开7500real time PCR system，将PCR专用的8排管孔板放置机器中进行检测。
⑤结果分析：将每个孔的数值除以相对应的内参值(β-actin)后，再进行相关实验组的比较。
在过表达FXR的HepG2/C3A细胞株中，加入FXR的激动剂CDCA和GW4064，激活FXR，荧光定量PCR检测氨代谢通路关键酶的表达。见图2，结果发现，激活FXR能上调氨代谢通路关键酶的表达，其中以NAGS，ASCT2，SLC1A2，SLC1A4，GLS和GDH等FXR的靶基因尤为明显。这说明激活FXR可改善氨代谢通路。
4、细胞增殖实验：通过使用实时细胞分析仪(RTCA)测定细胞增殖能力。
(1)选择生长状态良好的HepG2/C3A单克隆细胞系，同传代的方法取得细胞沉淀于15mL离心管中，对照组采取同样的处理方法。
(2)根据细胞沉淀量决定，抽弃上清后加入适量的完全DMEM培养基重悬细胞，用细胞计数板在10倍显微镜下计数。
(3)分别稀释细胞悬液，使得每1mL完全DMEM培养基中含有8×104个细胞。
(4)先向E-板16中加入50μL完全DMEM培养基测基线，然后再分别取100μL细胞稀释液加入E-板16的8个孔中，安装在RTCA仪器中并在37℃，5％CO2培养箱中温育。
(5)细胞沉降半小时后，开始用RTCA仪器监测细胞生长，每隔5-15分钟记录增殖指数。
(6)连续监测60小时以上，从每组4个平行孔的平均值产生细胞生长指数曲线图。
在HepG2/C3A细胞培养中加入不同浓度的NH4CL，通过使用实时细胞分析仪(RTCA)测定细胞增殖能力。见图3及表2，结果发现随着NH4CL浓度的升高，对细胞增值能力抑制的越明显，但过表达FXR后，NH4CL对细胞增值能力的抑制效果下降。这说明激活FXR能提高细胞对氨的耐受能力。
表2.NH4CL浓度变化对细胞增值能力的抑制影响。
Figure BDA0002503278220000081
5、细胞上清中尿素，ALT，AST含量的检测。
将HepG2/C3A分为四组，对照组，过表达FXR组，对照组加20mM的NH4CL，过表达FXR组加20mM的NH4CL。不同处理后的细胞培养48小时，取上清，立即用日本富士生化分析仪检测ALT，AST，BUN等的含量。
结果见图4，加入20mM的NH4CL后上清中尿素含量明显上升，其中又以过表达FXR的细胞上升最多，这说明激活FXR能提高尿素的生成。加入NH4CL后ALT，AST的表达有一定程度的升高。

Claims (8)

1.核受体FXR在生物人工肝种子细胞中的应用。
2.如权利要求1所述的核受体FXR在生物人工肝种子细胞中的应用，其特征在于，具体为以核受体FXR为靶点，得到生物人工肝的产品。
3.如权利要求2所述的核受体FXR在生物人工肝种子细胞中的应用，其特征在于，所述的以FXR为靶点的生物人工肝产品，包括增强或抑制的FXR表达的基因药物，或通过FXR的配体来调控FXR及其靶基因的表达的化学药物。
4.如权利要求3所述的核受体FXR在生物人工肝种子细胞中的应用，其特征在于，所述的基因药物含有FXR表达载体或干扰载体；所述的化学药物含有调控FXR的配体及调控FXR靶基因的配体。
5.如权利要求4所述的核受体FXR在生物人工肝种子细胞中的应用，其特征在于，所述FXR的配体包括鹅脱氧胆酸、奥贝胆酸、GW4064、胆酸或脱氧胆酸；所述FXR的靶基因包括NAGS，ASCT1，SLC1A4，GLS或GDH。
6.如权利要求3所述的核受体FXR在生物人工肝种子细胞中的应用，其特征在于，所述的增强FXR表达的化学药物为FXR激动剂。
7.如权利要求6所述的核受体FXR在生物人工肝种子细胞中的应用，其特征在于，所述的FXR激动剂为CDCA、OCA、GW4064、CA或DCA。
8.如权利要求7所述的核受体FXR在生物人工肝种子细胞中的应用，其特征在于，所述的FXR激动剂为CDCA或GW4064。
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