CN114107190A - 一种sma模型小鼠骨髓间充质干细胞的建立方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医疗技术领域，本发明公开了一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的建立方法，包括以下步骤：通过对SMA模型小鼠进行基因型鉴定，选取基因型为SMA小鼠BMMSC提取分离，用培养基培养，次日进行换液；倒置显微镜观察细胞形态，待其长满后用胰酶消化，进行传代继续培养；F3代细胞用于后续实验。本发明还公开了SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的构建及鉴定试剂盒，另外还公开了本发明所构建的SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的应用，本发明首次利用原代培养的SMA小鼠骨髓间充质干细胞，原代细胞呈梭形，仅有两个拷贝的SMN2基因，无SMN1基因的干扰，因其来源于SMA小鼠自身，是脊髓性肌萎缩小鼠体外最真实的模拟。

Description

一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的建立方法及应用
技术领域
本发明属于生物医疗技术领域，具体涉及一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的建立方法及应用。
背景技术
脊髓性肌萎缩症（Spinal muscular atrophy，SMA），是一种由于脊髓前角的α运动神经元发生退行性病变，导致运动神经元退化，肌肉萎缩的罕见的常染色体隐性的神经退行性遗传病。目前是婴儿致死率最常见的遗传性神经疾病之一，在新生儿中患病率达1/6000。SMA的致病基因是SMN1基因突变失去功能后，无法产生正常的SMN蛋白，而最终导致疾病发生。在人类中和SMN1同源的SMN2基因外显子7大部分被剪切而仅有少量SMN全长基因，少量SMN有功能蛋白，因此很多研究针对SMN2基因剪接的纠正而增加SMN全长蛋白，来改善SMA症状，如ASO反义寡核苷酸。
关键问题是药物前期的筛选实验需要大量的活体样本进行验证药效，而SMN2基因仅在人类基因组中存在，不可能直接在人身上实验。针对开展大量药物对SMN2验证的方法，目前大体有两种方法，第一、有研究者收集病人来源的细胞进行实验，但是此方法面临伦理问题、收集困难、改造复杂、周期长以及花费高昂等问题。比如将SMA患者的皮肤成纤维细胞或者患者尿液分离的肾小管上皮细胞诱导成IPSC细胞株，进行实验药物筛选。但是该方法诱导产生IPSC的过程繁琐复杂、周期长、而且比较昂贵。或者用人源化的肿瘤细胞，但是这些细胞都有正常功能的SMN1基因，对于研究SMN2的功能有很大的干扰作用也不理想。第二、将SMN2基因导入小鼠，制作成人源化SMN2转基因鼠，直接在SMA疾病小鼠模型上进行试验。但是，构建的SMA转基因小鼠，由于本身SMN基因缺失，仅有2个拷贝的SMN2，产生的SMN蛋白极少，神经系统及外周神经系统功能发生异常，小鼠出生后状态逐渐变差，10天左右就死亡。因此用于药物前期的大量筛选十分也很困难。
SMN2基因功能的纠正对于脊髓性肌肉萎缩症（SMA）病人的重要性：研究表明SMA是由于第五号染色体上运动神经元生存1（survival of motor neuron 1， SMN1）基因发生点突变或缺失导致该基因不能表达有功能的全长SMN蛋白。和动物不同，人类因为染色体5q13区的倒转复制（inverted duplication）产生了一个SMN1的平行同源基因称作SMN2；在外显子7第6位核苷酸由SMN1中的C转变为SMN2中的T（C6T），虽然没有造成翻译中氨基酸的改变，却严重影响了外显子7的列入。SMN2的成熟转录产物中约有90%不包含外显子7，而没有外显子7的蛋白，称作SMN∆7，基本没有功能且极不稳定。SMN2表达的少量全长SMN蛋白虽然不足以补偿SMN1基因的缺陷，却对病人的生存至关重要。
对SMN2功能研究以及治疗药物筛选主要借助人类细胞系，HEK293和hela等细胞系，但这些细胞中SMN1功能正常并没有出现SMA相关表型，因此并不是很好的研究载体，也有研究收集SMA患者身体来源的细胞，并进行IPS诱导改造，但是面临伦理、收集困难、诱导复杂及昂贵等问题，并不广泛；还有就是用的较多的是有SMN2转基因的SMA小鼠，但是小鼠出生只能存活10天左右，给药剂量方式等不易控制，开发成本极高。
目前，骨髓间充质干细胞已广泛用于各种疾病的研究，特别是在一些神经退行性疾病例如帕金森、阿尔兹海默症等疾病上已有相关研究报道。同时，骨髓间充质干细胞在大鼠、小鼠、猪等动物以及人已有报道。关于骨髓间充质干细胞如何利用关于SMN2基因功能以及药物筛选，至今未见有相关研究报道，如果可以顺利培养，那么关于SMN2基因功能和相关药物前期的大量筛选，可以用低成本而且给药多种方式的SMA原代细胞进行，具有很大的研究价值，这正是本发明重点解决的问题。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在问题或不足，本发明提供一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的建立方法及应用。
为实现上述发明目的，本发明的实施例提供一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：通过对SMA 模型小鼠进行基因型鉴定，选取基因型为SMA（smn-/-SMN20/2tg）小鼠BMMSC提取分离，用含 10%-20% FBS的DME/F12完全培养基培养，次日进行换液；倒置显微镜观察细胞形态，待其长满（70%-80%）后用 0.25% 胰酶消化，进行传代继续培养；F3代细胞用于后续实验。
进一步的，所述建立方法，还包括细胞鉴定过程：以 1x106个/mL F3代细胞接种于含有小圆玻片的六孔板中，加入 1mL DME/F12完全培养基，混匀，37°C，5% CO2细胞培养箱内过夜培养；次日，从培养箱取出六孔板，弃去完全培养基，用预冷 PBS（1x）洗 3 遍；每孔加入 500μL 4%多聚甲醛溶液，室温 40min，固定；弃去多聚甲醛溶液，用 PBS洗 3次，每次10min；每孔加入 500 μL封闭液，室温 2h；封闭结束后，弃去封闭液，直接敷一抗（integrinbeta-1/CD29；CD44；CD34；CD45；均 1:100稀释），室温孵育 2h，然后 4°C过夜；次日，从 4°C冰箱取出小圆玻片，室温平衡 30min；弃去一抗，PBS洗 3次，每次 10min；避光滴加二抗（Alexa Fluor 488-conjugated Goat anti-rabbit IgG，1:1000稀释），室温孵育 2h；PBS洗 3次，每次 10min；避光条件下，加入抗荧光淬灭液含 DAPI，封片；荧光显微镜拍照保存。
本发明的实施例还提供一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞建立及鉴定用试剂盒，其特征在于，包括构建用试剂和鉴定用试剂，构建用试剂包括基因型为SMA小鼠的BMMSC、含 10%-20% FBS的DME/F12完全培养基、0.25% 胰酶；鉴定用试剂包括DME/F12完全培养基、 PBS、4%多聚甲醛溶液、封闭液、一抗（integrin beta-1/CD29；CD44；CD34；CD45；均1:100稀释）、二抗（Alexa Fluor 488-conjugated Goat anti-rabbit IgG，1:1000稀释）、抗荧光淬灭液含 DAPI。
优选的，该试剂盒还包括一含有小圆玻片的六孔板。
本发明的实施例另外还提供一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞在脊髓性肌萎缩药物开发或SMN2基因机制研究方面的应用。
优选的，将所建立的SMA骨髓间充质干细胞通过ASO10-29干预后，显著上调了SMN2FL基因和SMN蛋白，并促进BMMSC细胞增殖。
进一步的，将所建立的SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞接种于六孔板中，待SMA模型小鼠BMMSC长至70%-80%，弃去完培，用PBS（1x）洗三遍，弃去PBS，每孔加入2mL完培，设置空白对照组与实验组，空白对照组加入转染试剂，实验组中加入转染试剂+ASO 10-29，37°C，5% CO2培养箱培养48h；进行RT-PCR及Western blot分析，计算SMN2 exon7列入比率；细胞免疫荧光检测SMN蛋白表达情况，研究细胞核内 Gemini bodies数量情况；免疫荧光实验检测SMA BMMSC细胞增殖和细胞凋亡情况。
本发明还公开了一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞在SMA疾病治疗药物筛选方面的应用。
本发明还公开了一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞在作为SMN2基因纠正功能研究载体方面的应用。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
（1）本发明首次利用原代培养的SMA小鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrowmesenchymal stem cells, BMMSC），具有贴壁生长、可以传代、增殖能力强、分化程度低等优点，原代细胞呈梭形，仅有两个拷贝的SMN2基因，无SMN1基因的干扰，因其来源于SMA小鼠自身，是脊髓性肌萎缩小鼠体外最真实的模拟，本发明的建立方法所获得的SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞可用于SMN2机制研究及SMA疾病治疗相关药物开发。本发明所获得SMA小鼠骨髓间充质干细胞可以用于关于SMA疾病治疗药物筛选和SMN2基因纠正功能研究载体。
（2）本发明的实施例验证了通过ASO10-29治疗后，显著上调了SMN2 FL基因和SMN蛋白，并促进BMMSC细胞增殖。因此，本发明建立的SMA BMMSC细胞是体外研究SMN2基因功能或药物筛选的最佳工具细胞。
附图说明
图1为本发明的实施例中 BMMSC细胞培养前期取材过程图。
图2为本发明的实施例中 SMA BMMSC细胞形态及细胞免疫荧光鉴定情况图。图中，骨髓间充质干细胞阳性标志物CD29和CD44表达显著，阴性标志物CD34、CD45基本无表达，符合BMMSC应该有的标志物特异性表达。
图3 为本发明的实施例中ASO治疗SMA BMMSC后SMN2基因和蛋白表达检测结果图。图3A为SMA BMMSC 转染ASO后PCR产物DdeI酶切结果；图3B为SMA BMMSC 转染ASO后SMN蛋白western blot结果；图3C为图3A的定量统计图；图3D为图3B的定量统计图。
图4为本发明的实施例中转染ASO后细胞核内Gemini bodies (gems) 免疫荧光结果图。图中，箭头所示为绿色荧光标记的Nuclear Gemini bodies显著增多。
图5为本发明的实施例中 ASO 治疗后SMA BMMSC细胞增殖情况及凋亡情况图。图5A为EDU 实验，SMA BMMSC 转染ASO后细胞免疫荧光结果；图5B为TUNEL 实验，SMA BMMSC转染ASO后细胞免疫荧光结果；图5C为图5A 的定量统计图；图5D为图5B的定量统计图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例一
SMA新生小鼠BMMSC取材方法及细胞培养鉴定
取新生 SMA 模型小鼠（P4）尾尖，进行快速基因型鉴定（Beyotime，D7283M，上海，中国），选取基因型为SMA（smn-/-SMN20/2tg）小鼠BMMSC提取分离，冰上麻醉，于75%乙醇中浸泡，取其四肢，剥离肌肉，取股骨以及肱骨骨髓，用含 10%-20% FBS的DME/F12（Cytiva，Hyclone，USA）完全培养基培养，次日进行换液。倒置显微镜观察细胞形态，待其长满（70%-80%）后用 0.25% 胰酶消化，进行传代继续培养。F3代细胞用于后续实验（图1）。
以 1x106个/mL接种于含有小圆玻片的六孔板中，加入 1mL DME/F12完全培养基，混匀，37°C，5% CO2细胞培养箱内过夜培养。次日，从培养箱取出六孔板，弃去完全培养基，用预冷 PBS（1x）洗 3 遍；每孔加入500μL 4%多聚甲醛溶液，室温 40min，固定；弃去多聚甲醛溶液，用 PBS洗 3次，每次10min；每孔加入 500μL封闭液，室温 2h；封闭结束后，弃去封闭液，直接敷一抗（integrin beta-1/CD29；CD44；CD34；CD45；均 1:100稀释），室温孵育2h，然后 4°C过夜；次日，从 4°C冰箱取出小圆玻片，室温平衡 30min；弃去一抗，PBS洗 3次，每次 10min；避光滴加二抗（Alexa Fluor 488-conjugated Goat anti-rabbit IgG，1:1000稀释），室温孵育 2h；PBS洗 3次，每次 10min；避光条件下，加入抗荧光淬灭液含DAPI，封片；荧光显微镜拍照保存。
本发明所提取分离培养的BMMSC细胞具有贴壁生长、可进行传代及冻存特点，细胞形态呈梭形或扁平型，传至 F3代后细胞形态稳定。对 F3代 BMMSC细胞进行细胞免疫荧光实验，发现BMMSC阳性标志物CD29、CD44分子高表达，而阴性标志物CD34、CD45 分子不表达或低表达。因此，本发明提取分离得到的 SMA 模型 BMMSC 具有骨髓间充质干细胞的特征（图1，2）。
本发明通过对SMA 模型小鼠进行基因型鉴定，选择SMA基因型小鼠进行骨髓间充质干细胞BMMSC提取分离，初步建立SMA疾病动物模型BMMSC培养体系。
其中骨髓间充质干细胞阳性标志物CD29和CD44表达显著，阴性标志物CD34、CD45基本无表达，符合BMMSC应该有的标志物特异性表达。
实施例二
RT-PCR及Western blot分析
SMA BMMSC细胞转染及Total RNA和总蛋白提取
将细胞接种于六孔板中，待SMA模型小鼠BMMSC长至70%-80%，弃去完培，用PBS（1x）洗三遍，弃去PBS，每孔加入2mL完培，设置空白对照组与实验组，空白对照组加入转染试剂（Lipofectamine™ 3000 Reagent，Inviteogen， Thermo Fisher Scientific，USA），实验组中加入转染试剂+ASO 10-29（简称ASO），37°C，5% CO2培养箱培养48h。取转染48h的细胞，弃去完全培养基，用PBS洗3次；每孔加入1mLTrizol（Vazyme，R401-01-AA，南京，中国），收集Total RNA，根据Trizol试剂盒操作说明抽提RNA，离心，用NanoDrop™ 1000Spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific，USA）检测细胞RNA浓度。
总RNA的提取及产物酶切电泳
每孔加入120μL蛋白裂解液收集细胞蛋白。取1μg TotalRNA进行逆转录反应，按Reverse Transcriptase试剂盒（Vazyme，南京，中国）说明以总体积10μL建立RT-PCR反应体系，按42°C，45min；85°C，5min；进行RT反应，产物即为cDNA。以此RT产物为模板进行PCR反应，按总体积25μL（12.5μL 2x Taq Master mix，1μL上游引物（HSMNG7-F），1μL下游引物（HSMNG7-R），1μL RT-PCR产物，7μL ddH2O）建立PCR反应体系，95°C，5min；（95°C，30s；60°C，30s；72°C，1min）×35；72°C，7min ；hold 4°C。取少量PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，120V，30min；核酸成像系统显影拍照。取剩下的PCR产物加入DdeI限制性内切酶，37°C水浴锅，酶切过夜。第二天，将酶切过夜的产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，120V，60min；核酸成像系统显影拍照，计算SMN2 exon7列入比率。
Western blot分析
按以下条件进行：80V，30min，调节电压至120V，60min继续进行电泳；300mA，90min进行转膜；5%脱脂奶粉室温封闭2h；敷一抗（β-Actin；Purified Mouse Anti-SMN），4°C过夜；弃一抗，PBST洗3次，每次10min；滴加二抗（HRP标记山羊抗小鼠；HRP标记山羊抗兔；均1:1000稀释），室温2h；弃二抗，PBST洗4次，每次15min；显影仪发光显影。
通过 PCR及酶切反应结果表明：实验组与对照组相比 SMN2 exon7的列入水平显著上升， SMN2 有功能的全长基因显著增多， SMN2 exon7 列入比率由原来的 40%上升至80%（n=3，p<0.05）。通过 western blot实验结果表明：实验组与对照组相比 SMN蛋白表达量显著上调，SMN/β-Actin比值由原来的 1上升至 2（n=3，p<0.05）（图3）。
实施例三
细胞免疫荧光检测SMN蛋白表达情况
将BMMSC细胞接种于含有小圆玻片的12孔板内，转染48h后进行细胞免疫荧光实验。从培养箱取出12孔板，弃去完全培养基，用PBS（1x）洗2-3遍；每孔加入500μL 4%多聚甲醛溶液，室温40min，进行固定；弃去多聚甲醛溶液，用PBS洗3次，每次10min；每孔加入500μL封闭液，室温2h；封闭结束后，弃去封闭液，直接敷一抗（Anti-SMN/Gemin 1，Abcam，ab108531，1:100稀释，U.K；α-TubuLin Antibodyx，Cell Signaling Technology，#3873，1:100，USA），室温2h，然后4℃过夜；第二天，从4℃冰箱取出小圆玻片，复温30min；弃去一抗，PBS洗3次，每次10min；避光滴加二抗（FITC标记的山羊抗小鼠，beyotime，A0568；CY3标记的山羊抗兔，生工生物，D1120062-0100；均1:1000稀释，上海，中国），室温2h；PBS洗3次，每次10min；避光条件下，加入抗荧光淬灭液（含DAPI），封片；使用荧光显微镜拍照。
细胞免疫荧光实验结果表明：实验组与对照组相比细胞核内 Gemini bodies数量显著增多（n=5，p<0.05）（图4）。
实施例四
SMA BMMSC细胞增殖和细胞凋亡检测
转染48h后，弃去培养基，用预冷PBS洗2-3次；按照EDU检测试剂盒（Beyotime，C0071S，上海，中国）说明进行细胞增殖实验。弃PBS，每孔加入500μL已配置好的10μM EDU溶液，37°C孵育2h；弃去培养基，用PBS洗3次，每次5min；每孔加入1mL细胞固定液（PBS配制的含4%多聚甲醛溶液）室温孵育30min；弃固定液，每孔加入1mL 2mg/mL甘氨酸，摇床孵育5min；弃甘氨酸溶液，每孔加入PBS，摇床上洗5min；弃PBS，每孔加入200μL通透液（PBS配制的含0.5% TritonX-100溶液），摇床孵育10min；弃渗透液，PBS洗1次，5min；每孔加入1mL洗涤液（PBS配制的含3% BSA溶液）洗3次，每次5min；每孔加入500μL Click反应液，室温避光孵育30min；弃去反应液，用洗涤液洗3次，每次5min；每孔加入1Ml DAPI，室温避光孵育10min；用洗涤液洗3次，每次10min；用抗荧光淬灭液封片；使用荧光显微镜拍照。
转染48h后，弃去培养基，用预冷PBS洗2-3次，弃PBS，每孔加入500μL 4%多聚甲醛溶液，4°C孵育30min，进行细胞固定；弃去多聚甲醛溶液，用PBS洗3次，每次10min；每孔加入500 μL 0.5% TritonX-100溶液（1xPBS配制），室温孵育10min；弃去0.5% TritonX-100溶液，用PBS洗3次；每孔加入100 μL 1xEquilibration Buffer，室温平衡30min；弃去Equilibration Buffer，避光条件下，每个小圆玻片上加入50 μL TdT缓冲液，37°C孵育1h；弃去TdT缓冲液，用PBS溶液洗4次，每次10min；避光条件下，加入抗荧光淬灭液（含DAPI），封片；使用荧光显微镜拍照。
免疫荧光实验结果表明：实验组与对照组相比 EDU标记的细胞核数量显著增加（n=5，p<0.05），表明 ASO促进SMA模型小鼠BMMSC细胞增殖（图5 A 和图5C）。而实验组与对照组TUNEL标记的细胞核数量没有差异，不具有统计学意义（n=5，p>0.05）。表明ASO不影响SMA模型小鼠BMMSC细胞凋亡（图5 B 和图5D）。
本发明所建立的SMA小鼠骨髓间充质干细胞可通过改变培养基或者血清含量来培养SMA BMMSC，通过SMA小鼠取出的骨髓获得的骨髓间充干细胞培养筛选药物以及SMN2基因机制研究均属于本专利保护范围。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：通过对SMA 模型小鼠进行基因型鉴定，选取基因型为SMA（smn-/-SMN20/2tg）小鼠BMMSC提取分离，用培养基培养，次日进行换液；倒置显微镜观察细胞形态，待其长满（70%-80%）后用 0.25%胰酶消化，进行传代继续培养；F3代细胞用于后续鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的建立方法，其特征在于，所述培养基为含 10%-20% FBS的DME/F12完全培养基。
3.根据权利要求1所述的一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的建立方法，其特征在于，还包括细胞鉴定过程：以 1x106个/mL F3代细胞接种于含有小圆玻片的六孔板中，加入1mL DME/F12完全培养基，混匀，37°C，5% CO2细胞培养箱内过夜培养；次日，从培养箱取出六孔板，弃去完全培养基，用预冷 PBS（1x）洗 3 遍；每孔加入 500μL 4%多聚甲醛溶液，室温 40min，固定；弃去多聚甲醛溶液，用 PBS洗 3次，每次10min；每孔加入 500 μL封闭液，室温 2h；封闭结束后，弃去封闭液，直接敷一抗（integrin beta-1/CD29；CD44；CD34；CD45；均为 1:100稀释），室温孵育 2h，然后 4°C过夜；次日，从 4°C冰箱取出小圆玻片，室温平衡30min；弃去一抗，PBS洗 3次，每次 10min；避光滴加二抗（Alexa Fluor 488-conjugatedGoat anti-rabbit IgG，1:1000稀释），室温孵育 2h；PBS洗 3次，每次 10min；避光条件下，加入抗荧光淬灭液含 DAPI，封片；荧光显微镜拍照保存。
4.一种根据权利要求2所述的SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞建立及鉴定用试剂盒，其特征在于，包括构建用试剂和鉴定用试剂，构建用试剂包括基因型为SMA小鼠的BMMSC、含10%-20% FBS的DME/F12完全培养基、0.25% 胰酶；鉴定用试剂包括DME/F12完全培养基、PBS、4%多聚甲醛溶液、封闭液、一抗（integrin beta-1/CD29；CD44；CD34；CD45；均 1:100稀释）、二抗（Alexa Fluor 488-conjugated Goat anti-rabbit IgG，1:1000稀释）、抗荧光淬灭液含 DAPI。
5.根据权利要求2所述的一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞建立及鉴定用试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括一含有小圆玻片的六孔板。
6.一种权利要求1所述建立的SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞在脊髓性肌萎缩药物开发或SMN2基因机制研究方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将所建立的SMA骨髓间充质干细胞通过ASO10-29干预后，能够显著上调了SMN2 FL基因和SMN蛋白，并促进BMMSC细胞增殖。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所建立的SMA骨髓间充质干细胞接种于六孔板中，待SMA模型小鼠BMMSC长至70%-80%，设置空白对照组与实验组，空白对照组加入转染试剂，实验组中加入转染试剂+ASO 10-29；对实验组和空白对照组，进行RT-PCR及Western blot分析，计算SMN2 exon7列入比率及检测SMN蛋白表达量；进行细胞免疫荧光检测SMN蛋白表达情况，研究细胞核内 Gemini bodies数量情况；进行免疫荧光实验检测SMABMMSC细胞增殖和细胞凋亡情况。
9.一种权利要求1所述建立的SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞在SMA疾病治疗药物筛选方面的应用。
10.一种权利要求1所述建立的SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞在作为SMN2基因纠正功能研究载体方面的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117363660A (zh) * 2023-09-16 2024-01-09 赛业（苏州）生物科技有限公司 一种构建sma小鼠模型的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103911346A (zh) * 2014-03-27 2014-07-09 江苏雄鸣医药科技有限公司 一种脊髓性肌萎缩症smn基因的敲除方法及细胞模型
US20190136192A1 (en) * 2017-11-09 2019-05-09 Cell Medicine, Inc. Mesenchymal stem cell therapy for spinal muscular atrophy
CN112481272A (zh) * 2020-12-23 2021-03-12 南通大学 Nova1促smn2外显子7列入的验证方法及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103911346A (zh) * 2014-03-27 2014-07-09 江苏雄鸣医药科技有限公司 一种脊髓性肌萎缩症smn基因的敲除方法及细胞模型
US20190136192A1 (en) * 2017-11-09 2019-05-09 Cell Medicine, Inc. Mesenchymal stem cell therapy for spinal muscular atrophy
CN112481272A (zh) * 2020-12-23 2021-03-12 南通大学 Nova1促smn2外显子7列入的验证方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIA-YEN WU等: "Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy", 《BMC NEUROSCI 》, vol. 12, no. 25, pages 2 *
LI-KAI TSAI等: "Therapy development for spinal muscular atrophy in SMN independent targets", 《NEURAL PLAST 》, vol. 2012, pages 1 - 13 *
罗新明等: "丙戊酸对脊髓性肌萎缩症患者神经元样细胞 ＳＭＮ2基因ｍＲＮＡ表达的影响", 《中华神经科杂志》, vol. 39, no. 3, pages 2 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117363660A (zh) * 2023-09-16 2024-01-09 赛业（苏州）生物科技有限公司 一种构建sma小鼠模型的方法

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