CN112481272A - Nova1促smn2外显子7列入的验证方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法及其应用，验证方法包括如下步骤：（1）RT‑PCR及酶切电泳分析SMN2全长基因在不同组织中的表达；（2）寻找SMN2全长基因在中枢系统中高表达的机制；（3）验证NOVA1是促进SMN2全长基因表达重要的剪接因子；（4）通过体外细胞实验证明敲降和过表达NOVA1显著抑制和促进SMN2外显子7列入；（5）证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入；（6）构建小鼠模型，证实NOVA1治疗脊髓、脑、肌肉SMN2列入比例均明显上升，其中大脑中SMN2外显子7列入上调具有显著差异。本发明证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入，并显著提升SMN蛋白的表达，而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达，不用持续性给药。
Description
技术领域
本发明属于医学生物化学领域，具体涉及一种NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法及其应用。
背景技术
研究表明SMA是由于第五号染色体上运动神经元生存1（survival of motorneuron 1, SMN1）基因发生点突变或缺失导致该基因不能表达有功能的全长SMN蛋白。和动物不同，人类因为染色体5q13区的倒转复制（inverted duplication）产生了一个SMN1的平行同源基因称作SMN2；而两个基因包含9个外显子（1、2a、2b、3、4、5、6、7、8），编码完全相同294个氨基酸的SMN蛋白。两者的关键不同之处在于外显子7第6位核苷酸由SMN1中的C转变为SMN2中的T（C6T），虽然没有造成翻译中氨基酸的改变，却严重影响了该外显子列入(exon inclusion)。SMN2的成熟转录产物中约有90%不包含外显子7，而没有外显子7的蛋白（称作SMN∆7）基本没有功能且极不稳定。SMN2表达的少量全长SMN蛋白虽然不足以补偿SMN1基因的缺陷，却对病人的生存至关重要。
随着生物技术的飞速发展，CRISPR/Cas9基因编辑技术及基因治疗已成为研究热点。近年来国际权威期刊《科学》杂志（Science），频繁报道CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于型肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy, DMD）基因治疗的论文，以DMD动物模型-mdx小鼠为研究对象，进行动物体内试验。借助AAV载体运载基因编辑的CRISPR/Cas9进入体内细胞，做删除式基因编辑。删除了含有无义突变的23号外显子，形成永久性不含外显子23的DMD基因。治疗后肌肉病理得到改善，肌肉细胞膜上重新出现Dystrophin蛋白，小鼠肌肉力量得到增加。但是该项技术在SMA小鼠的治疗中尚没有相关研究报道，急需要开展新方法的探索研究。
基因表达RNA的异常剪接常常导致人类疾病，研究表明，超过60％的人类致病突变影响剪接，与基因突变造成的RNA剪接位点的错误选择有关，而不是直接影响编码序列。所有遗传性疾病中有三分之一可能具有剪接成分。在人类体内表达SMN蛋白有两个基因：SMN1和SMN2，但是起主要作用的SMN1基因突变失去功能后，由于SMN2基因外显子7大部分被剪切而仅有少量SMN全长基因，少量SMN有功能蛋白，目前最有效的方法是ASO反义寡核苷酸，靶向互补内含子7第10-27序列，比如商业化的Spinraza，靶向封闭内含子7剪接沉默子ISS序列，促进外显子7列入比例，但是ASO半衰期较短，必须持续性给药。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法及其应用，研究证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入，并显著提升SMN蛋白的表达，而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达，不用持续性给药。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，包括如下步骤：
（1）通过RT-PCR及酶切电泳分析SMN2全长基因在不同组织中的表达；
（2）寻找SMN2全长基因在中枢系统中高表达的机制；
（3）验证NOVA1是促进SMN2全长基因表达重要的剪接因子；
（4）通过体外细胞实验证明敲降和过表达NOVA1显著抑制和促进SMN2外显子7列入；
（5）构建SMN2外显子7中NOVA1靶向结合位点突变以及RNA pull down实验，证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入，并显著提升SMN蛋白的表达；
（6）构建小鼠模型：构建lenti-virus NOVA1过表达病毒，皮下注射SMA刚出生小鼠，与Fast Green组进行比较，结果显示：NOVA1治疗脊髓、脑、肌肉SMN2列入比例均明显上升，其中大脑中SMN2外显子7列入上调具有显著差异。
其中，步骤（1）的具体步骤为：
SMA I型对照和I型小鼠冰上麻醉后，取出相应组织迅速入液氮，组织匀浆后Trizol 法提RNA。RNA逆转录，5×RT Buffer 4μL；dNTP Mix（10nM each） 1μL；Oligo（dT）18(50μM) 1μL；RNase inhibitor (40 U/µl) 1μL；Reverse Transcriptase (200 U/μl) 1μL；RNA 1μg；RNase-free ddH2O to 20 µl；
PCR反应体系，2×Taq master mix 12.5μL；引物E6-F Cy5-ATAAT TCCCC CACCACCTCC 1μL；引物E8-467R TTGCC ACATA CGCCT CACAT AC 1μL；cDNA 1μL；ddH2O 9.5μL to25µl；
半定量扩增了28个循环(94℃ 30s，55℃ 30s和72℃ 25s）；
PCR产物用DdeI酶进行酶切，并用2％琼脂糖凝胶进行电泳，Image J图像软件进行定量分析，外显子7的列入表示为FL与剪接转录本总量的百分比。
其中，步骤（2）的具体步骤为：
SMA I型小鼠中SMN2 外显子7列入的组织间差异，推测存在某些剪接因子，其在不同组织中表达具有差异，从而引起SMN2外显子 7列入差异。三类经典的剪接因子，即HNNRP、SR 及NOVA家族是神经疾病研究密切相关。因此，筛选了 HNNRP、 SR 及NOVA（引物如表1）家族部分成员共21个基因，检测其在SMA Ⅰ型小鼠中的表达差异，反应体系为2× ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix 5μL，F 0.5μL，R 0.5μL，cDNA 1μL，ddH2O 3μL；反应条件为：95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 20s，45个循环；60℃ 60s，95℃ 15s，统计剪接因子在中枢神经和周围非神经组织中的表达差异。
其中，步骤（3）的具体步骤为：
在SMA I型小鼠P1、P4 及 P7 各时间点，提取 RNA 及蛋白后，采用 QPCR 及western blot 方法分别检测 NOVA1和SMN全长基因及蛋白水平表达变化。结果显示在P1、P4 及 P7 阶段，SMN全长基因和蛋白表达随NOVA1呈递减趋势。
其中，步骤（4）的具体步骤为：
在细胞培养6 孔板中，种适量密度的U87MG细胞，并添加 2mL完全培养基，在细胞培养箱中培养过夜；次日，待细胞汇合达到 50%时，分别将 0.5μg NOVA1 过表达质粒或5μL20μM NOVA1 siRNA与1μg SMN2 minigene加入100μL opti-MEM 中混匀，室温放置 5min。同时，将3μLPEI加入100μLopti-MEM 中吹打混匀，室温放置5min；
将上述两种混合液加入同一离心管中，轻轻吹打混匀，室温静置20min。弃去6孔板中培养基，加800μL无血清培养基，再均匀加入配置好的转染混合物，十字摇晃混匀后培养；6h 后，用2mL新鲜预热的完全培养基换液。36~48h后检测SMN2外显子7列入。
其中，步骤（2）中，QPCR检测了21个剪接调控基因，发现NOVA1在中枢即大脑脊髓中高表达。
其中，步骤（4）的体外细胞实验中通过靶向沉默NOVA1和过表达NOVA1，SMN2全长基因和蛋白表达相应下调和上调，差异具有显著性。
其中，步骤（5）的具体步骤为：
根据NOVA1能够通过其 KH结构域（KH domain）与靶基因mRNA前体中的 YCAY基序（YACY motif；Y为嘧啶：Y=U 或C）结合的特点，预测SMN2外显子7第34-37位UCAC序列是NOVA1结合位点，通过定点删除和突变，把UCAC删除或突变为UAAC后，SMN2全长基因显著下调，RNA pull down实验表明该位点UCAC为NOVA1结合基序；进一步分二类突变该YCAY基序，其一，改变YCAY中Y的组合，发现SMN2全长基因有所下降，其二，改变YCAY中核心结合序列CA，发现SMN2全长基因极显著下降，有两个例外推测可能引入新的剪接因子；综上证明：NOVA1通过结合SMN2外显子7第34-37位UCAC序列促进外SMN2全长基因的表达，其中UCAC序列中CA最为重要。
本发明还提供一种NOVA1促SMN2外显子7列入的应用，用于制备延长脊髓型肌肉萎缩症小鼠存活时间的药物。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明首次发现NOVA1过表达质粒，可以靶向结合SMN2外显子7第34-37位TCAC序列，显著上调SMN2促进外显子7列入，并促进SMN蛋白的表达上升，包装的过表达NOVA1病毒在SMA小鼠体内显著延长了小鼠的生存时间，并促进体内SMN2外显子7列入比例，而且该重组质粒可以整合入宿主细胞基因组内，在细胞内持续性表达，一次性转染即可，并且过表达病毒可以整合到基因组中持续表达。
附图说明
图1为本发明中SMN2外显子7在type 1 cnotrol和type 1 出生4天体内组织中的列入比例；
图2为本发明中不同剪接因子在type 1 cnotrol和type 1 出生4天体内不同组织中的表达热图；
图3为本发明中NOVA1和SMN蛋白表达相关与运动神经元共定位图；
图4为本发明中NOVA1与SMN2外显子7列入的表达关系图；
图5为本发明中NOVA1在SMN2外显子7剪接结合靶点验证结果图；
图6为本发明中lenti-virus NOVA1过表达病毒在type I小鼠体内实验结果图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供一种NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，包括如下步骤：
（1）通过RT-PCR及酶切电泳分析SMN2全长基因在不同组织中的表达；具体步骤为：
SMA I型对照和I型小鼠冰上麻醉后，取出相应组织迅速入液氮，组织匀浆后Trizol 法提RNA。RNA逆转录，5×RT Buffer 4μL；dNTP Mix（10nM each） 1μL；Oligo（dT）18(50μM) 1μL；RNase inhibitor (40 U/µl) 1μL；Reverse Transcriptase (200 U/μl) 1μL；RNA 1μg；RNase-free ddH2O to 20 µl；
PCR反应体系，2×Taq master mix 12.5μL；引物E6-F Cy5-ATAAT TCCCC CACCACCTCC 1μL；引物E8-467R TTGCC ACATA CGCCT CACAT AC 1μL；cDNA 1μL；ddH2O 9.5μL to25µl；
半定量扩增了28个循环(94℃ 30s，55℃ 30s和72℃ 25s）；
PCR产物用DdeI酶进行酶切，并用2％琼脂糖凝胶进行电泳，Image J图像软件进行定量分析，外显子7的列入表示为FL与剪接转录本总量的百分比。
（2）寻找SMN2全长基因在中枢系统中高表达的机制，QPCR检测了21个剪接调控基因，发现NOVA1在中枢即大脑脊髓中高表达；具体步骤为：
SMA I型小鼠中SMN2 外显子7列入的组织间差异，推测存在某些剪接因子，其在不同组织中表达具有差异，从而引起SMN2外显子 7列入差异。三类经典的剪接因子，即HNNRP、SR 及NOVA家族是神经疾病研究密切相关。因此，筛选了 HNNRP、 SR 及NOVA（引物如表1）家族部分成员共21个基因，检测其在SMA Ⅰ型小鼠中的表达差异，反应体系为2× ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix 5μL，F 0.5μL，R 0.5μL，cDNA 1μL，ddH2O 3μL；反应条件为：95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 20s，45个循环；60℃ 60s，95℃ 15s，统计剪接因子在中枢神经和周围非神经组织中的表达差异。
表 1
| Name | F (5’-3’) | R(5’-3’) |
| mGapdh | CCGTAGACAAAATGGTGAAGGT | CGTGAGTGGAGTCATACTGGAA |
| mHNRNPK | AGAAGAAACCTTCCCCAACACC | TGCGCAATTCAACCATCTCATC |
| mHNRNPL | AGTGGAAGCTGACCTTGTGGAAG | AGCACGTCTTCAAACTCTACCAG |
| mHNRNPLL | AGCTGACCTTGTGGAGGCAC | AGGCACATCTGCAGCAAATG |
| mHNRNPU | AGTCTCCTCAGCCACCTGTTG | AGCACTCAGACGGTCTCTCG |
| mHNRNPD | ATCGACGCCAGTAAGAACGAG | TGTGGTGTCCCAGCTAAGG |
| mHNRNPH3 | TGCCATTTGGTTGCAGCAAAG | AGGCCTCCCCTGTGCTTC |
| mHNRNPM | ACCTTTTGATGTGAAATGGCAGTC | AGAGCTCCACGTATGTTACCTC |
| mHNRNPH2 | AGCCGTTTGAGGGAAGAAGAAG | ACCCTGTTAGAGTTTCTTCCAGG |
| mHNRNPF | TCGGGTGGAGTTTGAGTTCGTAAG | ACCACCACAGATGCCTTCTG |
| mSRSF10 | ACGTCTCTGTTCGTCAGGAACG | ACCATAACGACCAAATTCCCG |
| mSRSF1 | TTCGCCTTCGTTGAGTTCGAG | CGGTAGCCGTCGTAGTCGTAG |
| mSRPK1 | TCTAGGGTCTGACGATGACGAG | AGTGTCCCCAGCCCAATTTTC |
| mSRSF3 | ATTTGAGGATCCCCGAGATGC | TCTTTTCACCATTCGACAGTTCC |
| mSRSF6 | TGCCGTGTACGAGCTCAACAG | AGTTCTCCGACTGCTGTATCC |
| mSRSF2 | AGCCCACCCAAGTCTCCAGAAG | ATGGACCGATGGACTGAGTTTG |
| mSRSF4 | ATCCTGGAGGTGGATCTGAAG | ACACAGGTCTTTGCCGTTCAG |
| mSRSF5 | ACTCAGAGAGCGCAGTTGATTTG | TCTCCCTCGCTGCTGGATTTAG |
| mSRSF7 | ATTCCAAGCTAGAGCCGAGTAC | ACTCTCCTTTACCAGCACCAG |
| mSRSF9 | AGATCGAGCTCAAGAACCGG | ACACTGGCCATAATCGTAACCG |
| mNOVA1 | ACTGGAGCCACTATCAAGCTG | ATCCATGAACTGCGTTCAGCG |
| mNOVA2 | AGACAGGAGCCACCATCAAG | AGACAGGAGCCACCATCAAG |
| hGAPDH | GAAGGTCGGAGTCAACGGAT | TGGAAGATGGTGATGGGATT |
| hSMN1/2 | ACCACCCCACTTACTATCATGC | GAATGTGAGCACCTTCCTTCTT |
| hNOVA1 | GCCATCTTCCCCAACTACCA | TGCTCCATTACAGCCTTCACA |
（3）验证NOVA1是促进SMN2全长基因表达重要的剪接因子；具体步骤为：
在SMA I型小鼠P1、P4 及 P7 各时间点，提取 RNA 及蛋白后，采用 QPCR 及western blot 方法分别检测 NOVA1和SMN全长基因及蛋白水平表达变化。结果显示在P1、P4 及 P7 阶段，SMN全长基因和蛋白表达随NOVA1呈递减趋势。
（4）在体外细胞实验中，通过靶向沉默NOVA1和过表达NOVA1，SMN2全长基因和蛋白表达相应下调和上调，差异具有显著性，进一步表明NOVA1促进SMN2全长基因和蛋白表达表达，敲降和过表达NOVA1显著抑制和促进SMN2外显子7列入；具体步骤为：
在细胞培养6 孔板中，种适量密度的U87MG细胞，并添加 2mL完全培养基，在细胞培养箱中培养过夜；次日，待细胞汇合达到 50%时，分别将 0.5μg NOVA1 过表达质粒或5μL20μM NOVA1 siRNA与1μg SMN2 minigene加入100μL opti-MEM 中混匀，室温放置 5min。同时，将3μLPEI加入100μLopti-MEM 中吹打混匀，室温放置5min；
将上述两种混合液加入同一离心管中，轻轻吹打混匀，室温静置20min。弃去6孔板中培养基，加800μL无血清培养基，再均匀加入配置好的转染混合物，十字摇晃混匀后培养；6h 后，用2mL新鲜预热的完全培养基换液。36~48h后检测SMN2外显子7列入。
（5）构建SMN2外显子7中NOVA1靶向结合位点突变以及RNA pull down实验，证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入，并显著提升SMN蛋白的表达；具体步骤为：
根据NOVA1靶向结合YCAY基序（Y代表嘧啶）特点，预测SMN2外显子7第34-37位UCAC序列是NOVA1结合位点，通过定点删除和突变，把UCAC删除或突变为UAAC后，SMN2全长基因显著下调，RNA pull down实验表明该位点UCAC为NOVA1结合基序；进一步分二类突变该YCAY基序，其一，改变YCAY中Y的组合，发现SMN2全长基因有所下降，其二，改变YCAY中核心结合序列CA，发现SMN2全长基因极显著下降，有两个例外推测可能引入新的剪接因子；综上证明：NOVA1通过结合SMN2外显子7第34-37位UCAC序列促进外SMN2全长基因的表达，其中UCAC序列中CA最为重要。
（6）构建小鼠模型：构建lenti-virus NOVA1过表达病毒，皮下注射SMA刚出生小鼠，与Fast Green组进行比较，结果显示：NOVA1治疗脊髓、脑、肌肉SMN2列入比例均明显上升，其中大脑中SMN2外显子7列入上调具有显著差异。
本发明还提供一种NOVA1促SMN2外显子7列入的应用，用于制备延长脊髓型肌肉萎缩症小鼠存活时间的药物。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。
脊髓型肌肉萎缩症SMN1基因突变或缺失失去功能，仅有的同源基因SMN2是治疗的靶点，通过RT-PCR及酶切电泳分析，SMN2全长基因在type I control 和type I 小鼠在不同组织中的表达，发现在中枢即大脑和脊髓高表达，差异有统计学意义如图1所示，其中，图1A为在type 1 cnotrol和type 1小鼠不同组织中SMN2外显子7 列入电泳图，图1B为图1A的电泳图列入比例统计，“*”表示与liver组相比P＜0.05。
因此，SMN2全长基因表达差异具有组织特异性，为此，寻找SMN2全长基因在中枢系统中高表达的机制，QPCR（实时荧光定量核酸扩增检测系统）检测了21个剪接调控基因，发现NOVA1在中枢即大脑脊髓中高表达，如图2所示，其中，图2A和图2B分别为type 1 cnotrol和type 1小鼠不同组织中剪接因子的QPCR表达热图，均以liver组为对照，计算2-ΔΔ值，其中NOVA1在中枢中表达最高。
随着疾病发展进程P1、p4、p7 NOVA1和SMN蛋白表达具有协同性（图3A-F），NOVA1在脊髓前角运动神经元中NOVA1表达（图3G），推测NOVA1与脊髓性肌肉萎缩小鼠脊髓前角运动神经元退行性病变密切相关。其中，图3A表示NOVA1基因表达在SMA小鼠疾病发生过程表达逐渐下调；图3B和图3C表示NOVA1蛋白也逐渐下调；图3D和图3E表示SMN蛋白也逐渐下调；图3F表示SMN2表达全长基因也下调；图3G表示NOVA1和运动神经元ChAT表达共定位；图3H表示尼氏染色显示SMA小鼠疾病发展过程中运动神经元逐渐空泡化、数量减少、凋亡。
在体外细胞实验中，通过靶向沉默NOVA1和过表达NOVA1，SMN2全长基因和蛋白表达相应下调和上调，差异具有显著性（图4A-J）。进一步表明NOVA1促进SMN2全长基因和蛋白表达表达。其中，图4A为NOVA1敲降效率图；图4B为U87细胞中敲降NOVA1后SMN2剪接琼脂糖凝胶电泳图； 图4C为U87细胞中敲降NOVA1后SMN2剪接水平变化统计图；图4D为U87细胞中敲降NOVA1后SMN蛋白水平变化电泳图；图4E为U87细胞中敲降NOVA1后SMN蛋白水平变化统计图；图4F为U87细胞中过表达NOVA1后NOVA1 mRNA水平变化统计图；图4G为U87细胞中过表达NOVA1后SMN2剪接琼脂糖凝胶电泳图；图4H为U87细胞中过表达NOVA1后SMN2剪接水平变化统计图；图4I为U87细胞中过表达NOVA1后SMN蛋白水平变化电泳图；图4J为U87细胞中过表达NOVA1后SMN蛋白水平变化统计图。
根据NOVA1能够通过其 KH结构域（KH domain）与靶基因mRNA前体中的 YCAY基序（YACY motif；Y为嘧啶：Y=U 或C）结合的特点，预测SMN2外显子7第34-37位UCAC序列是NOVA1结合位点（图5 A），通过定点删除和突变，把UCAC删除或突变为UAAC后，SMN2全长基因显著下调（图5 B、C），RNA pull down实验表明该位点UCAC为NOVA1结合基序（图5 D）。进一步分二类突变该YCAY基序，其一，改变YCAY中Y的组合，发现SMN2全长基因有所下降，其二，改变YCAY中核心结合序列CA（图5 E），发现SMN2全长基因极显著下降，有两个例外推测可能引入新的剪接因子（图5 F、G、H）。综上，证明，NOVA1通过结合SMN2外显子7第34-37位UCAC序列促进外SMN2全长基因的表达，其中UCAC序列中CA最为重要。其中，图5A为预测SMN2外显子7第34-37位UCAC基序示意图；图5B为HEK293T细胞中突变UCAC序列后SMN2剪接琼脂糖凝胶电泳图；图5C为HEK293T细胞中突变UCAC序列后SMN2剪接水平变化统计图；图5D为SMN2外显子7 NOVA1结合序列UCAC pull down实验结果图；图5E为分二类突变该YCAY基序示意图；图5F、G为NOVA1结合序列分类突变对SMN2外显子7列入的影响图；图5H为对F和G图电泳的定量分析图。
构建lenti-virus NOVA1过表达病毒（图6 A、B），皮下注射SMA刚出生小鼠（图6C），与Fast Green组相比NOVA1治疗脊髓、脑、肌肉SMN2列入比例均明显上升，其中大脑中SMN2外显子7列入上调具有显著差异（图6 D），与Fast Green组相比NOVA1治疗组明显延缓了type1小鼠存活最长至15天（图6 E）。其中，图6A中，A1为lenti-virus GFP对照，A2-4分别为滴度1×109的lenti-virus NOVA1体积为5ul、10ul、20ul；图6B为A图QPCR检测统计图，“***”表示与对照组相比，P＜0.0001；图6C为小动物活体成像拍摄小鼠皮下注射荧光图；图6C中，C1为Fast Green注射对照组，C2-4为颈背部皮下注射lenti-virus NOVA1 2ul、4ul、8ul；图6D为与Fast Green组相比NOVA1治疗脊髓、脑、肌肉SMN2列入比例上调统计图；图6E为与Fast Green组相比NOVA1治疗组明显延缓了type1小鼠存活最长至15天，（n=5，n=7，n=8）。
本发明的NOVA1过表达质粒，可以靶向结合SMN2外显子7第34-37位TCAC序列，显著上调SMN2促进外显子7列入，并促进SMN蛋白的表达上升，包装的过表达NOVA1病毒在SMA小鼠体内显著延长了小鼠的生存时间，并促进体内SMN2外显子7列入比例，而且该重组质粒可以整合入宿主细胞基因组内，在细胞内持续性表达，一次性转染即可，并且过表达病毒可以整合到基因组中持续表达。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南通大学
<120> NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法及其应用
<141> 2020-12-23
<160> 52
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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20
Claims (9)
1.一种NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）通过RT-PCR及酶切电泳分析SMN2全长基因在不同组织中的表达；
（2）寻找SMN2全长基因在中枢系统中高表达的机制；
（3）验证NOVA1是促进SMN2全长基因表达重要的剪接因子；
（4）通过体外细胞实验证明敲降和过表达NOVA1显著抑制和促进SMN2外显子7列入；
（5）构建SMN2外显子7中NOVA1靶向结合位点突变以及RNA pull down实验，证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入，并显著提升SMN蛋白的表达；
（6）构建小鼠模型：构建lenti-virus NOVA1过表达病毒，皮下注射SMA刚出生小鼠，与Fast Green组进行比较，结果显示：NOVA1治疗脊髓、脑、肌肉SMN2列入比例均明显上升，其中大脑中SMN2外显子7列入上调具有显著差异。
2.根据权利要求1所述的NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（1）的具体步骤为：
SMA I型对照和I型小鼠冰上麻醉后，取出相应组织迅速入液氮，组织匀浆后Trizol 法提RNA；RNA逆转录，5×RT Buffer 4μL；dNTP Mix 1μL；Oligo 18 1μL；RNase inhibitor 1μL；Reverse Transcriptase 1μL；RNA 1μg；RNase-free ddH2O to 20 µl；
PCR反应体系，2×Taq master mix 12.5μL；引物E6-F Cy5-ATAAT TCCCC CACCA CCTCC1μL；引物E8-467R TTGCC ACATA CGCCT CACAT AC 1μL；cDNA 1μL；ddH2O 9.5μL to 25µl；
半定量扩增了28个循环；
PCR产物用DdeI酶进行酶切，并用2％琼脂糖凝胶进行电泳，Image J图像软件进行定量分析，外显子7的列入表示为FL与剪接转录本总量的百分比。
3.根据权利要求1所述的NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（2）的具体步骤为：
筛选了 HNNRP、 SR 及NOVA家族部分成员共21个基因，检测其在SMA Ⅰ型小鼠中的表达差异，反应体系为2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5μL，F 0.5μL，R 0.5μL，cDNA 1μL，ddH2O 3μL；反应条件为：95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 20s，45个循环；60℃ 60s，95℃ 15s，统计剪接因子在中枢神经和周围非神经组织中的表达差异。
4.根据权利要求1所述的NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（3）的具体步骤为：
在SMA I型小鼠P1、P4 及 P7 各时间点，提取 RNA 及蛋白后，采用 QPCR 及westernblot 方法分别检测 NOVA1和SMN全长基因及蛋白水平表达变化。
5.根据权利要求1所述的NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（4）的具体步骤为：
在细胞培养6 孔板中，种适量密度的U87MG细胞，并添加 2mL完全培养基，在细胞培养箱中培养过夜；次日，待细胞汇合达到 50%时，分别将 0.5μg NOVA1 过表达质粒或5μL 20μM NOVA1 siRNA与1μg SMN2 minigene加入100μL opti-MEM 中混匀，室温放置 5min；同时，将3μLPEI加入100μLopti-MEM 中吹打混匀，室温放置5min；
将上述两种混合液加入同一离心管中，轻轻吹打混匀，室温静置20min；
弃去6孔板中培养基，加800μL无血清培养基，再均匀加入配置好的转染混合物，十字摇晃混匀后培养；6h 后，用2mL新鲜预热的完全培养基换液；
36~48h后检测SMN2外显子7列入。
6.根据权利要求1或3所述的NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（2）中，QPCR检测了21个剪接调控基因，发现NOVA1在中枢即大脑脊髓中高表达。
7.根据权利要求1或5所述的NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（4）的体外细胞实验中通过靶向沉默NOVA1和过表达NOVA1，SMN2全长基因和蛋白表达相应下调和上调，差异具有显著性。
8.根据权利要求1所述的NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（5）的具体步骤为：
根据NOVA1靶向结合YCAY基序特点，预测SMN2外显子7第34-37位UCAC序列是NOVA1结合位点，通过定点删除和突变，把UCAC删除或突变为UAAC后，SMN2全长基因显著下调，RNApull down实验表明该位点UCAC为NOVA1结合基序；进一步分二类突变该YCAY基序，其一，改变YCAY中Y的组合，发现SMN2全长基因有所下降，其二，改变YCAY中核心结合序列CA，发现SMN2全长基因极显著下降，有两个例外推测可能引入新的剪接因子；综上证明：NOVA1通过结合SMN2外显子7第34-37位UCAC序列促进外SMN2全长基因的表达，其中UCAC序列中CA最为重要。
9.一种NOVA1促SMN2外显子7列入的应用，其特征在于，用于制备延长脊髓型肌肉萎缩症小鼠存活时间的药物。
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|---|---|---|---|---|
| CN114107190A (zh) * | 2021-12-02 | 2022-03-01 | 南通大学 | 一种sma模型小鼠骨髓间充质干细胞的建立方法及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103911346A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-07-09 | 江苏雄鸣医药科技有限公司 | 一种脊髓性肌萎缩症smn基因的敲除方法及细胞模型 |
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