CN116694640A - 提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合、包含该核酸调控元件组合的腺相关病毒载体及其制备方法、以及该核酸调控元件组合或腺相关病毒载体的用途，特别适合运用于CRISPR/Cas9基因编辑系统或Cre‑Loxp重组系统等基因编辑系统等对低表达转基因反应灵敏的应用场景，可明显提高体内基因递送心脏特异性，并显著降低基因表达在肝脏中的泄漏，由此提高了通过基因编辑进行基因治疗的安全性。

Description

提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合及应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及能够提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合及应用。
背景技术
对于因基因突变等因素导致的遗传性疾病来说，基因治疗是很有前景的治疗手段，其基本的治疗思路为在患者体内补充正常的基因、沉默有害的基因或者将特定基因突变位点的碱基或片段纠正为正常序列，从而有望治愈遗传性疾病。例如，2017年美国FDA批准的治疗莱伯氏先天性黑蒙(Leber congenital amaurosis，LCA)的Luxturna基因疗法，通过以AAV作为载体携带正常的RPE65基因，直接注射到RPE65基因发生突变患者的眼底，在视网膜细胞表达正常的RPE65基因，从而使患者丧失的视力得以恢复。在基因突变导致的某些疾病中，单纯补充正常的基因并不能解决突变造成的细胞功能障碍。这时，基因治疗需要通过沉默突变的或有害的基因达到治疗目的。或者，需要对突变的基因进行修正，即应用基因编辑等技术把突变的位点或序列修改为正常的位点或序列才能起到治疗作用(基因治疗：过去、现在和未来，刘国庆等，中国医药导刊，第25卷第1期，第9-12页，2023年)。
心脏疾病是严重危害人类健康的疾病，随着对心脏疾病致病基因及其分子机制的深入研究，已有通过基因治疗手段来调控特定基因表达水平和改善基因分子功能从而达到防治心脏疾病的目的的研究被报导，并且目前针对心脏疾病的基因治疗方案的研究已取得多项进展。基因疗法已成为治疗和治愈受损心脏组织的一种有前景的方法，能够使心脏从功能受损的状态恢复到正常状态。特别是，随着基因组编辑技术的发展，通过基因编辑技术直接在体内修复致病突变或者敲除特定基因进行心脏疾病防治的基因方法也得到广泛关注(心血管疾病的基因治疗，丁秋蓉等，上海大学学报自然科学版，第22卷第3期，第270-279页，2016年)。
增加心肌组织中的有益基因的表达或者降低心肌组织中有害基因的表达也是心脏疾病基因治疗的基本思路之一，即使该心脏疾病属于非遗传性的心脏疾病亦是有效的。例如，钙离子/钙调蛋白依赖性激酶II(Ca2+/calmodulin-dependent kinase II，CaMKII)是丝氨酸-苏氨酸激酶家族成员之一，在心脏中以CaMKII δ亚型为主，CAMK2D是编码CaMKII δ的基因。CAMK2D表达升高，CaMKII δ的异常激活与心律失常、心肌病、心肌梗死、心力衰竭等的发生相关，因此CAMK2D被认为是心脏疾病的一个关键的治疗靶点(Bezzerides VJ等.Gene Therapy和rCatecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia byInhibition of Ca2+/Calmodulin-Dependent Kinase II.Circulation.140(5)：405-419，2019)。
在开发针对心脏疾病的基因治疗方法时，用于将具有预防或治疗作用的基因递送至治疗靶细胞的载体系统是开发策略的重要方面，特别是针对心脏细胞具有高度特异性的载体系统尤其具有价值。腺相关病毒(AAV)载体因其良好的安全性和较弱的机体炎症反应被认为是目前最具临床应用前景的病毒载体，目前已发现超过100种不同血清型的AAV载体，其中AAV1、AAV6、AAV8、AAV9血清型被认为具有较高的心脏特异性，特别是AAV9(人9型腺相关病毒)是感染心脏细胞最有效的血清型(心血管疾病的基因治疗，丁秋蓉等，上海大学学报自然科学版，第22卷第3期，第270-279页，2016年)。然而，AAV9也可以感染肝脏、肺脏、肾脏等其他器官。因此，为了提高AAV9递送的目的基因在心脏细胞中的特异性表达，常采用心脏特异性启动子，例如心肌肌钙蛋白T的启动子(Tnnt2或cTnT)。在已发表的研究中，AAV9-Tnnt2系统被认为有良好的心脏靶向性，因此将其用于心脏疾病研究和治疗的载体(Prasad K M等，Robust cardiomyocyte-specific gene expression followingsystemic injection of AAV：in vivo gene delivery follows a Poissondistribution，Gene Ther.，18：43-52，2011)。AAV9-Tnnt2作为传统的心脏特异性基因递送工具，在基因过表达等表达量较高的转基因环境下，采用灵敏检测的方法未明显检测到AAV9-Tnnt2递送基因在肝脏等其他器官中存在泄漏。随着基因重组、基因编辑等技术的发展，有研究发现AAV9-TNT4-Cre在肝脏、肺脏等器官存在泄漏情况(Werfel S等，Rapid andhighly efficient inducible cardiac gene knockout in adult mice using AAV-mediated expression of Cre recombinase，Cardiovasc Res.，104(1)：15-23，2014)。
特别是，对于低表达转基因反应灵敏的应用场景，例如在CRISPR/Cas9基因编辑系统或Cre-Loxp重组系统等基因编辑系统中，即使是低水平或瞬时的基因表达也足以引发严重的生物学后果，导致基因治疗的安全性降低。因此，如何提高AAV9体内递送基因的心脏特异性并降低其在肝脏中的泄漏，成为心脏疾病的基因治疗领域亟待解决的技术问题。
发明内容
针对上述技术问题，发明人经过试验和研究，创造性地提供了本发明的解决方案。
在第一方面，本发明提供了一种提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合，包含(i)至少一种心脏特异性启动子，和(ii)miR122TS；其中，所述miR122TS的序列为：(a)SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者(b)与SEQ ID NO：1所示序列相比具有1-3个碱基差异并且同时仍能被miR122靶向结合的DNA序列。
在第一方面或其他方面的一些实施方式中，本发明所述的至少一种心脏特异性启动子包括Tnnt2、cTNT、MYH6、MYL2和/或ANF中的一种或多种。优选地，本发明所述的至少一种心脏特异性启动子为Tnnt2。
在第一方面或其他方面的一些实施方式中，本发明所述的核酸调控元件组合通过对心脏具有亲和性的AAV递送。优选地，所述对心脏具有亲和性的AAV为AAV2i8、AAV1、AAV6、AAV8、AAV9和/或MyoAAV中的一种或多种。更优选地，本发明所述的核酸调控元件组合通过AAV9递送。
在第一方面或其他方面的一些实施方式中，本发明所述的miR122TS位于所述AAV的基因的3′非翻译区(3′UTR)。
在第一方面或其他方面的一些实施方式中，本发明所述的核酸调控元件组合在基因编辑系统中使用。优选地，所述基因编辑系统为Cre-Loxp系统、Flp-FRT系统、Dre-ROX系统、vCre-vloxp系统、sCre-sloxp系统、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和/或CRISPR/Cas衍生的单碱基编辑系统中的一种或多种。更优选地，本发明所述的基因编辑系统为CRISPR/Cas9基因编辑系统和/或Cre-Loxp重组系统。
在第二方面，本发明提供了一种提高体内基因递送心脏特异性的腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体包含(i)AAV，和(ii)核酸调控元件组合，其中所述核酸调控元件组合为根据本发明第一方面所述的核酸调控元件组合。其中所述miR122TS位于所述AAV的基因的3′UTR中。
在第三方面，本发明提供了一种制备腺相关病毒载体的方法，所述腺相关病毒载体为根据本发明第二方面所述的腺相关病毒载体，所述方法包括：(i)制备包含至少一种心脏特异性启动子和miR122TS的DNA分子；和(ii)使用AAV9病毒包装所述DNA分子；其中，所述miR122TS位于所述AAV9的基因的3′UTR。
在第四方面，本发明提供了核酸调控元件组合或腺相关病毒载体的用途，所述核酸调控元件组合为根据本发明第一方面所述的提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合，所述腺相关病毒载体为根据本发明第二方面所述的腺相关病毒载体或根据本发明第三方面所述的方法制备所得的腺相关病毒载体，所述用途包括以下中的一种或多种：(i)在基因编辑系统中提高体内基因递送心脏特异性的用途；(ii)在基因编辑系统中降低或消除体内基因递送在肝脏中泄漏的用途；(iii)在制备预防或治疗心脏疾病的药物中的用途；(iv)在制备调节心脏细胞中基因表达的组合物中的用途；和/或(v)在调节心脏细胞的基因表达的用途。
在第四方面或其他方面的一些实施方式中，所述的基因编辑系统为Cre-Loxp系统、Flp-FRT系统、Dre-ROX系统、vCre-vloxp系统、sCre-sloxp系统、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和/或CRISPR/Cas衍生的单碱基编辑系统中的一种或多种。进一步地，所述CRISPR/Cas9系统中的Cas9为SaCas9、Nme2Cas9、SauriCas9、CjCas9和/或SpCas9中的一种或多种。
在第四方面或其他方面的一些实施方式中，所述心脏疾病既可以是遗传性心脏疾病，也可以是非遗传性心脏疾病。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明提供了一种新的能够提高心脏特异性的核酸调控元件组合，解决了目前本领域靶向心脏的腺相关病毒载体递送心脏特异性启动子在肝脏中存在驱动较低水平基因表达而导致心脏特异性基因操作不能实现的技术问题，特别适合用于低表达转基因反应灵敏的应用场景，例如应用于CRISPR/Cas9基因编辑系统或Cre-Loxp重组系统等基因编辑系统等；通过使用本发明提供的核酸调控元件组合并且使用AAV9递送目的基因，可明显提高目的基因在心脏细胞中表达的特异性，显著降低目的基因表达在肝脏中的泄漏，提高了通过基因编辑的方法进行基因治疗的安全性。
(2)本发明提供的核酸调控元件组合中的miR122TS明显减少了AAV9载体基因组整合到肝脏基因组中，进一步提高了以AAV9为载体的基因编辑方法进行基因治疗的安全性。
附图说明
附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明的技术方案，但并不构成对本发明技术方案的限制。
图1显示了AAV9-Tnnt2-Cre-miR122TS系统相较于AAV9-Tnnt2-Cre系统可显著降低Tnnt2驱动的基因表达在肝脏中的泄漏。A：AAV9-Tnnt2-Cre注射于RosafsCas9-GFP和RosafsCas9-tdTomato报告基因小鼠实验设计流程图。B：小鼠心脏和肝脏冰冻切片中显示的GFP(绿色)和TOM(红色)报告基因荧光信号表达结果。C：GFP和TOM荧光信号分别在RosafsCas9-GFP(n＝4)和RosafsCas9-tdTomato(n＝3)报告基因小鼠各种不同组织冰冻切片(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、骨骼肌、生殖腺)中的定量分析结果。D：在AAV9-Tnnt2-Cre的3′UTR设计插入miR122TS获得AAV9-Tnnt2-Cre-miR122TS，注射AAV9-Tnnt2-Cre和AAV9-Tnnt2-Cre-miR122TS两种AAV9于RosafsCas9-tdTomato报告基因小鼠进行对比。E：显示AAV9-Tnnt2-Cre和AAV9-Tnnt2-Cre-miR122TS两种AAV9在小鼠心脏、肝脏冰冻切片中的TOM信号表达。F：AAV9-Tnnt2-Cre和AAV9-Tnnt2-Cre-miR122TS两种AAV9对小鼠心脏、肝脏组织切片中的荧光信号进行定量分析(n＝3)。标尺＝20μm。散点柱状图中的点数代表n值。TOM：tdTomato。FP：Fluorescent protein，荧光蛋白。D、E、F中的红色圆点表示AAV9-Tnnt2-Cre(对照组)，绿色圆点表示AAV9-Tnnt2-Cre-miR122TS(实验组)。Student’s t检验，*P＜0.05，**P＜0.01。
图2显示了AAV9-Tnnt2-SaCas9-miR122TS系统在野生型(WT)小鼠中减少AAV9-Tnnt2-SaCas9系统产生的肝脏组织基因编辑效应。A：AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9-HA质粒示意图(上)，设计针对小鼠Camk2d基因编辑的sgRNA，Camk2d包括11种不同的可变剪接体，sgRNA设计在Camk2d第2号外显子上(下)。B：注射AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9组和对照组小鼠心脏组织中HA、CAMK2D、GAPDH的蛋白表达(n＝5)。C：AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9分别注射至新生小鼠(n＝3)与成年小鼠(n＝3)后，心脏和肝脏组织中Camk2d靶基因位点插入或缺失突变(indels)的发生率。(s.c.为皮下注射，i.v.为静脉注射)。D：将AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9注射于WT小鼠作为对照组(n＝8，由红色圆点表示)，并且将AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9-miR122TS注射于WT小鼠作为实验组(n＝4，由绿色圆点表示)，其中AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9-miR122TS是通过在AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9的3′UTR插入miR122TS获得的；扩增子测序(AMP-seq)检测两组小鼠心脏及肝脏组织中靶基因位点indels发生率。散点柱状图中的点数代表n值。Student’s t检验，*P＜0.05，**P＜0.01。
图3显示了本发明的调控元件组合对心脏和肝脏基因组整合情况。A：AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9系统中，CRISPR/Cas9触发靶基因DNA双链断裂，使AAV9的DNA整合到由sgRNA引导的肝脏基因组的靶向位点和RT-qPCR检测引物设计的示意图；ITR，反向末端重复序列。B：基于RT-qPCR检测的AAV9的DNA在肝脏基因组中在CRISPR/Cas9编辑位点的整合程度的分析；FC，相对于AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9对照的定量PCR倍数变化，反映AAV9的相对整合率；施用AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9的对照组使用红色圆点表示，施用AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9-miR122TS的实验组使用绿色圆点表示。平均值±标准差。Student′st检验：*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.0001。
具体实施方式
下面将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。对示例性实施例的描述仅仅是说明性的，并不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。本发明可以以许多不同的形式实现，不限于这里所述的实施例。提供这些实施例是为了使本发明透彻且完整，并且向本领域技术人员充分表达本发明的范围。
除非另有定义，否则本文使用的所有术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。还应当理解的是，诸如在常用词典中定义的那些术语，应当被解释为具有与其在本发明和相关领域的上下文中的含义一致的含义。在本发明中没有明确定义的术语，应根据其共通用含义被理解。本发明说明书中使用的术语仅为用于描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用其全文并入本发明。
除非另有说明，本发明技术的实践将采用在本领域技术范围内的组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。
本发明所有技术方案的用途均可以用于预防或治疗的目的或非预防或非治疗的目的。
术语“miR”又称为microRNA、miRNA、微RNA或小分子核糖核酸，其是在植物、动物和一些病毒中发现的小的非编码RNA分子(包含约22个核苷酸)，在RNA沉默和基因表达的转录后调控中起作用。miR122(也可记为MicroRNA-122或miR-122)是最早发现的组织特异性microRNA之一，具有高肝脏特异性，在其他组织中几乎检测不到，不同物种之间miR122序列高度保守。术语“miR122TS”(也可记为MicroRNA-122TS或miR-122TS)是指miR122的靶序列(miR122 target sequence)，在本发明中应用于不同物种时的miR122TS可以是相同的，例如应用于人和小鼠时所用的miR122TS均可以是caaacaccattgtcacactcca(如下文表1中的SEQ ID NO：1所示)。
本发明中所用的术语“泄漏”，是指基因表达在其他非靶器官中存在异常活动，例如指递送基因除了在靶器官心脏中表达之外还在肝脏等非靶器官中存在不期望的较低水平的基因表达。
AAV9指“人9型腺相关病毒”。本发明所用的术语“AAV9”是指以野生型AAV9为基础改造的能够递送目的基因的重组AAV9(rAAV9)及其经过各种工程化、重组、改造、修饰、修改获得的仍保留对心脏的亲和力的任何完整或部分的变体。在包括AAV9在内的AAV载体中，通常该AAV载体的DNA序列从5′端到3′端依次包括以下各部分：反向末端重复序列(invertedterminal repeat，ITR)-启动子-5′非翻译区域(5′UTR)-目的基因-3′非翻译区域(3′UTR)-3′末端多聚A尾(PolyA)-反向末端重复序列(ITR)。其中，本发明所用的miR122TS插入在AAV9病毒的3′UTR序列中，具体为将肝脏特异性表达的microRNA122靶序列(miR122TS)克隆到AAV9载体的3′UTR中，使3′UTR包含3个miR122TS。
本发明提供的能够提高提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合以及腺相关病毒载体，如从业者预期，能够用于因基因缺陷导致的遗传性心脏疾病，同时也能够用于非遗传性的心脏疾病。
“遗传性心脏疾病”是指发病由基因突变引起，可以遗传给后代的心脏疾病，例如可以是《临床心血管遗传病学》(张开滋等著，科学技术出版社，2011年)第一章第三节“遗传性心血管病的特点和分类”记载的疾病种类，包括但不限于心肌病、心脏离子通道病、遗传性主动脉疾病、遗传性易栓症以及家族性高胆固醇血症等。
对于非遗传性的心脏疾病，增加心肌组织中的有益基因的表达或者降低心肌组织中有害基因的表达，也可以作为治疗心脏疾病的思路。例如，CaMKII(Ca2+/calmodulin-dependent kinase II，钙离子/钙调蛋白依赖性激酶II)是一个激酶家族，可使靶蛋白中的丝氨酸/苏氨酸磷酸化。CaMKII δ亚型是分布于心脏中的主要亚型。CaMKII的过度激活在心血管疾病的发病机制中起着关键作用，这些心血管疾病包括心肌梗死、心肌病和心力衰竭等(Zhang M等，CaMKII-δ9promotes cardiomyopathy through disrupting UBE2T-dependent DNA repair.Nat Cell Biol.21(9)：1152-1163，2019)。CAMK2D是编码CaMKII δ的基因，研究表明其与多种心脏疾病的发病机制相关，被认为是心脏疾病的治疗靶点(Wu Y等，Myocardial death and dysfunction after ischemia-reperfusion injury requireCaMKIIδ oxidation.Sci Rep.9(1)：9291，2019)。
下表列出了在本发明中的描述中所用的核酸序列编号及对应序列(其中下划线和斜体标示的index表示高通量测序时所用引物中用于区分样本的“标签”，也被称为条形码或barcode，可由高通量测序的技术人员根据需要自由选择)。
表1本发明中所用核酸序列编号及其对应序列
实施例1 Tnnt2和miR122TS的核酸调控元件组合在Cre-Loxp系统中提高AAV9体内基因递送的心脏特异性
在本实施例中，针对Cre-Loxp系统，我们首先构建了AAV9-Tnnt2-Cre腺相关病毒载体，用于评估AAV9-Tnnt2驱动的基因表达在心脏中的表达情况及在其他各器官中的泄漏情况；并且进一步构建了AAV9-Tnnt2-Cre-miR122TS，用于评估Tnnt2和miR122TS的核酸调控元件组合是否具有改善AAV9体内基因递送的心脏特异性的作用。具体过程如下所述。
(1)构建AAV-Tnnt2-Cre质粒和AAV-Tnnt2-Cre-miR122TS质粒
以发明人已发表论文(Guo Y等，Analysis of Cardiac Myocyte MaturationUsing CASAAV，a Platform for Rapid Dissection of Cardiac Myocyte Gene FunctionIn Vivo.Circ Res.，120(12)：1874-1888，2017)中公开的AAV-U6sgRNA-U6sgRNA-Tnnt2-Cre质粒载体为基础，构建AAV-Tnnt2-Cre质粒和AAV-Tnnt2-Cre-miR122TS质粒。
具体步骤为：在AAV-U6sgRNA-U6sgRNA-Tnnt2-Cre质粒载体中选择限制性内切酶KpnI与NheI作为酶切位点，加入并混合如下组分：AAV-U6sgRNA-U6sgRNA-Tnnt2-Cre质粒3μg；KpnI 0.5μL；NheI 0.5μL；10×Flycut缓冲液3μL；无核酸酶水，添加至30μL。将所得混合物置入PCR仪中，反应程序为：37℃2h；85℃15min；4℃保存。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并胶回收酶切产物。对Tnnt2序列进行PCR扩增，所用引物对序列如表1中SEQ ID NO：3(上游引物，用F表示，下同)和SEQ ID NO：4(下游引物，用R表示，下同)所示；对PCR产物进行胶回收，将PCR产物利用无缝克隆技术克隆到酶切后的质粒载体中，制备过程中所用的酶和无缝克隆试剂盒均可通过市售(全式金生物技术(北京)有限公司，JK101-01，JN301-01，生工生物工程(上海)股份有限公司，B632219)获得。连接产物转化到Stable3感受态细胞中，涂布在含氨苄的LB培养基平板上，挑取单克隆进行Sanger测序，即可获得克隆成功的AAV-Tnnt2-Cre质粒备用。
在成功制备AAV-Tnnt2-Cre质粒的基础上，选择3′UTR内的限制性内切酶HindIII酶切位点进行酶切，同时加Quick Cip酶防止酶切后质粒自连；将化学合成的3×miR122TS基因序列的DNA片段(如表1中SEQ ID NO：2所示，委托北京擎科生物科技股份有限公司合成)克隆至AAV-Tnnt2-Cre载体上，即可成功构建AAV-Tnnt2-Cre-miR122TS质粒。
(2)制备AAV9病毒AAV9-Tnnt2-Cre和AAV9-Tnnt2-Cre-miR122TS
本步骤将构建好的AAV-Tnnt2-Cre质粒和AAV-Tnnt2-Cre-miR122TS质粒分别进行AAV9病毒包装制备。使用HEK293T细胞作为宿主细胞制备AAV9。对于包装AAV9所需的质粒，可利用无内毒素质粒大量提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP117)，进行质粒的高质量抽提。
具体步骤为：①传代培养HEK293T细胞，待细胞生长至85～90％融合，对于15cm细胞培养皿的每10盘细胞，分别加入2.4mL转染试剂PEI(1mg/mL)、140μg AAV质粒、140μgAAV9-Rep/Cap质粒和320μg pHelper(pAd-deltaF6，Penn Vector Core)质粒，转染HEK293T细胞，37℃培养12小时后换不含血清、含1％双抗的新鲜培养基，37℃继续培养60～72小时后，收取细胞；②4℃下2000rpm离心5min，分离细胞与培养基，将细胞重悬于裂解缓冲液(20mM Tris pH 8，150mM NaCl，1mM MgCl2，50μg/ml全能核酸酶)中，反复冻融3次进行裂解；③向第②步中收集的细胞培养基中加入1/4体积的40％PEG8000的2.5M NaCl溶液，4℃静置2h，4000rpm离心30min，以析出沉淀，弃上清，将得到的沉淀在裂解缓冲液中重悬，与细胞裂解液混合；④4℃下4000rpm离心30min，收集上清，并将上清铺在梯度碘克沙醇-OptiPrep上，采用密度梯度超速离心进行AAV纯化；⑤在分子截流量为100kDa的离心滤管中，用含0.001％的Pluronic F-68的PBS溶液对AAV进行清洗和浓缩，通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定AAV滴度。
通过以上步骤，制备获得了AAV9-Tnnt2-Cre和AAV9-Tnnt2-Cre-miR122TS。
(3)评估Tnnt2驱动的基因表达在各器官中泄漏状况
准备在Rosa26安全位点敲入CAG启动子-Loxp-stop-Loxp-Cas9-2A-tdTomato的荧光报告基因小鼠(集萃药康，Strain No.T002249，用RosafsCas9-tsTomato表示)，以及在Rosa26安全位点敲入CAG启动子-Loxp-stop-Loxp-Cas9-2A-GFP的荧光报告基因小鼠(JacksonLab，Stock No：026175，用RosafsCas9-GFP表示)。这两种小鼠体内都存在可Cre激活的荧光报告基因。
如图1A所示，将AAV9-Tnnt2-Cre按照5×1010vg/g(vg/g是vector genome pergram body weight的缩写，指每克体重中病毒载体的基因组数量，下同)分别皮下注射至RosafsCas9-GFP(n＝4)和RosafsCas9-tdTomato(n＝3)新生小鼠(出生后第1-3天)体内，7天后处死小鼠，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、骨骼肌、生殖腺，进行固定、脱水、包埋、冰冻切片(切片厚度为7μm)。对组织切片进行麦胚凝集素(WGA)染色，共聚焦显微镜成像。利用ImageJ和Graphpad Prism软件对GFP和tdTomato(TOM)报告基因的荧光蛋白阳性的细胞进行计数及统计学分析。结果如图1B和图1C所示，在心脏组织切片中阳性细胞率达到90％以上，而在肝脏组织切片中阳性细胞率达50％左右，在其余器官如脾脏、肺脏、肾脏、骨骼肌、脑、生殖腺中阳性细胞率几乎均为0％。
结论：在Cre-Loxp系统中，心脏特异性启动子Tnnt2驱动的基因表达在肝脏中存在泄漏情况。
(4)miR122TS降低Tnnt2驱动的基因表达在肝脏组织中的泄漏并提高AVV9心脏递送特异性
按照本实施例第(3)步骤中所述的相同方法，准备RosafsCas9-tdTomato荧光报告基因小鼠。
如图1D所示，将AAV9-Tnnt2-Cre和AAV9-Tnnt2-Cre-miR122TS均按照5×1010vg/g的剂量皮下注射至两组RosafsCas9-tdTomato新生小鼠体内(n＝3)，7天后处死小鼠，取两组小鼠的心脏、肝脏进行冰冻切片及WGA、DAPI共染。结果如图1E和图1F所示，两组小鼠心脏组织切片中阳性细胞率达95％左右，而注射AAV9-Tnnt2-Cre-miR122TS组的小鼠，肝脏组织切片中阳性细胞率显著下降，降低至5％以下。
表2注射两种AAV9病毒后心脏组织和肝脏组织中阳性细胞率
AAV9病毒 心脏组织 肝脏组织
AAV9-Tnnt2-Cre(n＝3) 95％ 50％
AAV9-Tnnt2-Cre-miR122TS(n＝3) 95％ ＜5％
结论：Tnnt2和含miR122TS的3′UTR组合调控元件可以在Cre-Loxp系统的应用中减少AAV9体内基因递送在肝脏组织泄漏，使得AAV9体内基因递送的心脏特异性大大提高。
实施例2 Tnnt2和miR122TS的核酸调控元件组合在CRISPR/Cas9系统中提高AAV9体内基因递送的心脏特异性
与Cre-Loxp系统一样，短暂或微量的Cas9表达也足以永久地修改基因组。因此，我们首先构建了一个AAV-Tnnt2-SaCas9-U6-sgRNA载体来测试AAV-Tnnt2载体是否能在肝脏中引起异位基因编辑，其中SaCas9(金黄色葡萄球菌Cas9)是一种Cas9变体，允许所有的CRISPR/Cas9组件由一个AAV载体传递。
我们设计了一个靶向Camk2d第2外显子的SaCas9单链向导RNA(single-guideRNA，sgRNA)，该外显子是该基因所有剪接变体共有的。Camk2d编码钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)的主要心脏异构体CaMKII δ，而CaMKII δ是一个被大量研究的治疗靶点，需要严格的心脏特异性来安全治疗心脏疾病。本实施例的具体实施步骤如下。
(1)构建AAV-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9质粒和AAV-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9-miR122TS质粒
从Addgene购买AAV-U6-sgRNA-CB-SaCas9的质粒(Addgene 109320)，利用软件CRISPick(https：//portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)对小鼠Camk2d基因进行sgRNA的设计，Camk2d基因共有11种不同的可变剪接体，其中二号外显子在各种不同的可变剪接体中高度同源，基于软件设计和sgRNA在基因上的位置(如图2A所示)，筛选出位于二号外显子上最优的sgRNA，如表1中SEQ ID NO：5所示。从上述构建成功的AAV-U6-sgRNA-CB-SaCas9优选BbSI的酶切位点，合成sgRNA的引物，引物序列分别如表1中SEQ IDNO：6(F)和SEQ ID NO：7(R)所示，T4连接即可成功克隆出AAV-U6-sgRNA-CB-SaCas9的质粒。接着，选择限制性内切酶XbaI和XhoI的酶切位点，以实施例1中所述的AAV-U6-sgRNA-U6-sgRNA-Tnnt2-Cre为模板，PCR扩增Tnnt2启动子片段，PCR引物如表1中SEQ ID NO：8(F)和SEQ ID NO：9(R)所示，用无缝克隆将Tnnt2片段克隆到上述的酶切载体中，即可成功构建AAV-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9质粒。
在构建成功的AAV-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9的基础上，为了确保3×miR122TS序列加入后AAV载体的长度不会超过AAV包装的最大承载范围，对AAV-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9质粒的标签序列位置做了部分截短同时插入3×miR122TS的DNA片段，选择限制性内切酶FseI和EcoRI的酶切位点，将化学合成的包括部分载体骨架序列及3×miR122TS的DNA片段(如表1中SEQ ID NO：10所示，委托安升达生物科技有限公司合成)克隆至酶切后的载体上，即可成功构建AAV-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9-miR122TS质粒。
(2)AAV9病毒包装：
按照实施例1中第(2)步骤所述的制备AAV9病毒的相同方法，仅将其中的AAV质粒替换为本实施例第(1)步骤中的质粒，由此完成两种质粒的AAV9病毒包装，获得AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9和AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9-miR122TS。
(3)评估Tnnt2驱动的基因表达在心脏和肝脏中的泄漏状况
将AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9按照5×1010vg/g的剂量皮下注射至野生型(WT)新生小鼠体内(新生组)，继续饲养7天后，取心脏，肝脏组织进行蛋白免疫印迹(Westernblot)实验和扩增子测序(AMP-Seq)分析。具体操作流程如下。
①Western blot：取出小鼠(n＝5)心脏、肝脏组织后，立即置于冰上，按组织重量每10mg加100μL RIPA裂解液(25mM Tris，pH 7～8；150mM NaCl；0.1％SDS；0.5％脱氧胆酸钠；1％Triton X-100)，充分研磨后，4℃下12000rpm离心15min，取上清。BCA法测定蛋白浓度后加入4×Sample buffer，调整至每个样品浓度为2μg/μL，70℃煮10min使蛋白变性。配制SDS-PAGE凝胶，进行电泳、转膜，5％脱脂牛奶室温封闭1～2h后，4℃孵育一抗过夜(抗体稀释比例为HA 1：2000，CST公司，CAMK2D1：2000，Gene Tex公司，GAPDH 1：10000，Transgen公司)。TBST清洗PVDF膜后，室温孵育二抗1h，TBST洗膜后，配置超敏化学发光液(ECL)，将PVDF膜置于BIO-RAD曝光仪对膜进行显影。结果显示：小鼠注射AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9后，心脏组织中CAMK2D蛋白水平显著下降，HA表达明显上升(如图2B所示)。
②AMP-Seq：取出小鼠(n＝3)心脏、肝脏组织后，使用组织基因组DNA(gDNA)提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行心脏、肝脏组织的gDNA提取。对靶基因位点进行高通量测序文库构建的引物设计，引物序列分别如表1中SEQ ID NO：11(F)和SEQ ID NO：12(R)所示。以gDNA为模板进行目的片段PCR扩增，加入如下组分：gDNA，1μg；上游引物(F)，2μL；下游引物(R)，2μL；2×TaqMix，20μL；无核酸酶水，添加至40μL。将加好的样品置入PCR仪中，PCR反应程序如下：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃20s，循环33次；72℃5min；12℃保持。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段进行胶回收纯化，纯化片段进行二代测序(北京诺禾致源科技股份有限公司)，测序结果使用CRISPResso2进行分析，GraphpadPrism软件进行统计学分析及绘图。结果显示：小鼠心脏、肝脏组织均产生了基因编辑(插入/缺失突变，用indels表示)，心脏组织中indels产生率为～24％，肝脏组织中indels产生率为10～20％(如图2C的新生组所示)。
另外，为评估泄漏的结果是否受受试对象年龄和给药方式影响，我们对成年小鼠(5周龄，成年组，n＝3)进行尾静脉注射病毒AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9，2周后取心脏、肝脏组织进行扩增子测序。结果显示：可观察到小鼠心脏、肝脏组织中均明显产生基因编辑，心脏中indels产生率为～21％，肝脏中indels产生率为6～9％(如图2C的成年组所示)。
结论：在使用CRISPR/Cas9进行基因编辑的过程中，心脏特异性启动子Tnnt2驱动的基因表达在肝脏中存在泄漏情况，且这种泄漏不受给药途径和动物年龄的影响。
(4)miR122TS降低Tnnt2驱动的基因表达在肝脏组织中的泄漏并提高AVV9心脏递送特异性
将AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9和AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9-miR122TS两种AAV9均按照5×1010vg/g剂量分别注射至WT新生小鼠体内，继续饲养7天后，取心脏、肝脏组织进行扩增子测序分析，具体操作与本实施例第(2)步骤中的第②项相同。结果如图2D所示，可以观察到注射两种AAV9后，两组小鼠心脏组织中indels产生率无统计学差异，但肝脏组织中indels产生率差别明显(参见表3)，注射AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9-miR122TS的小鼠的肝脏组织中的indels产生率约为1％，具体数值如下。
表3注射两种AAV9病毒后心脏组织和肝脏组织中的indels
结论：Tnnt2和含miR122TS的3′UTR组合调控元件可以在AAV9体内基因递送的CRISPR/Cas9基因编辑应用中减少基因编辑在肝脏组织中的泄漏，使得AAV9体内基因递送的CRISPR/Cas9基因编辑的心脏特异性大大提高。
实施例3 Tnnt2和miR122TS的核酸调控元件组合对心脏和肝脏基因组整合情况评估
AAV基因治疗的一个安全性问题与载体整合到肝脏基因组相关。特别是，CRISPR/Cas9触发的DNA双链断裂促使AAV的DNA整合到sgRNA靶向的肝脏基因组的靶基因位点。因此，我们进一步测试了含miR122TS的3′UTR组合调控元件是否能减少AAV的DNA在肝脏基因组的整合，即对比分别注射AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9和AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9-miR122TS后心脏、肝脏基因组整合情况。我们通过RT-qPCR检测了AAV的DNA在宿主基因组的相对整合率(图3A)，具体过程如下。
小鼠心脏、肝脏的gDNA来源于实施例2的步骤(4)。针对CRISPR/Cas系统切割靶基因的位置，可得AAV的DNA在宿主基因组的整合情况如图3A所示，针对其插入位点设计两对RT-qPCR引物，进行定量检测。引物序列Pair1分别如表1中SEQ ID NO：13(F)和SEQ ID NO：14(R)所示，引物序列Pair2分别如表1中SEQ ID NO：14(F)和SEQ ID NO：15(R)所示。内参基因(Tnni3)的引物序列如表1中SEQ ID NO：16(F)和SEQ ID NO：17(R)所示。加入如下各组分：gDNA 500ng；上游引物(F)0.4μL；下游引物(R)0.4μL；2×QPCR-Mix(SYBGreen)10μL；无核酸酶水，添加至20μL。在Agilent-Aria3.1QPCR仪上按以下反应程序进行QPCR反应：95℃2min；95℃15s，61.5℃20s，72℃10s，循环40次；95℃1min；65℃30s；95℃30s。反应结束后得到各组样品的CT值(循环数)，用Pair1或Pair2引物反应结束后得到的CT值减去内参基因的CT值，得到ΔCT，进一步计算出2-ΔCT，以AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9组为对照，计算这组样品2-ΔCT值的平均值，用AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9和AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9-miR122TS两组每个样品的2-ΔCT值都除以这个平均值，得到2-ΔΔCT，即计算出各组样品AAV的DNA整合到宿主基因组的相整合率。利用Graphpad Prism软件进行绘图及统计学分析。结果如图3B所示，可以观察到，在心脏中，AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9-miR122TS组的AAV相对整合率与AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9组相比无统计学差异；但是，在肝脏中，AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9-miR122TS组的AAV相对整合率相较于AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9组明显降低。
结论：AAV9-U6-sgRNA-Tnnt2-SaCas9载体会导致AAV9的DNA在肝脏基因组中在CRISPR/Cas9编辑位点的整合显著增加(图3B)，但Tnnt2启动子与miR122TS组合后，AAV9的DNA在肝脏基因组中在CRISPR/Cas9编辑位点的整合程度明显降低，可达到与未处理的对照组相似的水平(图3B)。因此，miR122TS明显地减少了AAV9的DNA在肝脏基因组的整合，提高了AAV9基因治疗的安全性。
因此，根据本发明的实施例，已证明本发明的心脏特异性启动子Tnnt2和含miR122TS的3′UTR的核酸调控元件组合，能够提高体内基因递送的心脏特异性，降低肝脏的非特异表达，在对低表达转基因反应灵敏的应用场景下(特别是例如Cre-Loxp和CRISPR/Cas基因操作)能够实现高度的心脏特异性，且具有高度的安全性。

Claims (10)

1.一种提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合，包含(i)至少一种心脏特异性启动子，和(ii)miR122TS；
其中，所述miR122TS的序列为：(a)SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者(b)与SEQ ID NO：1所示序列相比具有1-3个碱基差异并且同时仍能被miR122靶向结合的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的核酸调控元件组合，其中所述至少一种心脏特异性启动子包括Tnnt2、cTNT、MYH6、MYL2和/或ANF中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的核酸调控元件组合，其中所述核酸调控元件组合通过对心脏具有亲和性的AAV递送。
4.根据权利要求3所述的核酸调控元件组合，其中所述AAV为选自AAV2i8、AAV1、AAV6、AAV8、AAV9和/或MyoAAV中的一种或多种。
5.根据权利要求3或4所述的核酸调控元件组合，其中所述miR122TS位于所述AAV的基因的3′UTR中。
6.一种提高体内基因递送心脏特异性的腺相关病毒载体，包含：
(i)AAV，和
(ii)核酸调控元件组合；
其中，所述核酸调控元件组合为根据权利要求1-5中任一项所述的核酸调控元件组合，并且其中所述miR122TS位于所述AAV的基因的3′UTR中；
其中，所述AAV为选自AAV2i8、AAV1、AAV6、AAV8、AAV9和/或MyoAAV中的一种或多种。
7.一种制备根据权利要求6所述的腺相关病毒载体的方法，所述腺相关病毒载体用于提高体内基因递送心脏特异性，所述方法包括：
(i)制备包含至少一种心脏特异性启动子和所述miR122TS的DNA分子；和
(ii)使用AAV病毒包装所述DNA分子。
8.核酸调控元件组合或腺相关病毒载体的用途，其中所述核酸调控元件组合为根据权利要求1-5中任一项所述的核酸调控元件组合，所述腺相关病毒载体为根据权利要求6所述的腺相关病毒载体或根据权利要求7中所述的方法制备所得的腺相关病毒载体，所述用途包括以下中的一种或多种：
(i)在基因编辑系统中提高体内基因递送心脏特异性的用途；
(ii)在基因编辑系统中降低或消除体内基因递送在肝脏中泄漏的用途；
(iii)在制备预防或治疗心脏疾病的药物中的用途；
(iv)在制备调节心脏细胞中基因表达的组合物中的用途；和/或
(v)在调节心脏细胞的基因表达的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述的基因编辑系统为Cre-Loxp系统、Flp-FRT系统、Dre-ROX系统、vCre-vloxp系统、sCre-sloxp系统、CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cas12系统，和/或CRISPR/Cas衍生的单碱基编辑系统中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述CRISPR/Cas9系统中的Cas9为SaCas9、Nme2Cas9、SauriCas9、CjCas9和/或SpCas9中的一种或多种。
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