JPWO2009044899A1 - 細胞の増殖を制御する核酸 - Google Patents
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Abstract
細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬、アポトーシス誘導剤、マイクロRNAなどの核酸の標的遺伝子の発現抑制剤または発現促進剤、細胞の増殖抑制方法または増殖促進方法に関する。
Description
本発明は、核酸を用いた細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬、細胞の増殖抑制方法または増殖促進方法、核酸の標的遺伝子の発現抑制方法または発現促進方法、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤のスクリーニング方法に関する。
核酸の1種であるマイクロRNA(miRNA)は、蛋白質に翻訳されない約22ヌクレオチドからなる小さな非コード一本鎖RNAであり、ヒトを含む生物に多数存在することが知られている(非特許文献1、2)。マイクロRNAは、単一又はクラスター化されたマイクロRNA前駆体に転写される遺伝子から生成される。すなわち、まず遺伝子から一次転写産物であるprimary-microRNA (pri-miRNA)が転写され、次いでpri-miRNAから成熟型マイクロRNAへの段階的プロセシングにおいて、特徴的なヘアピン構造を有する約70塩基のprecursor-microRNA (pre-miRNA)がpri-miRNAから生成される。さらに、Dicer介在によるプロセシングによりpre-miRNAから成熟型マイクロRNAが生成される(非特許文献3)。
成熟型マイクロRNAは、標的となるmRNAに相補的に結合してmRNAの翻訳を抑制するか、あるいはmRNAを分解することにより、遺伝子発現の転写後制御に関与していると考えられている。
マイクロRNAが標的mRNAの発現を抑制するメカニズムについては完全には明らかになっていないが、近年の研究により概要が解明されつつある。マイクロRNAは標的となるmRNAの3’-非翻訳領域(3’-UTR)中の部分的に相補的な配列に結合し、その翻訳を抑制し、または標的mRNAを分解することで発現を抑制する。上記の相補性は完全でなくても良いが、特にマイクロRNAの5’- 末端側から2番目から8番目までの塩基の相補性が重要であることが示されており、この領域をマイクロRNAの「シード配列(seed sequence)」と呼ぶこともある(非特許文献4)。シード配列が共通するマイクロRNAは他の配列が異なっていても、共通の標的mRNAの発現を抑制することが示されている。従って、任意のmRNAの3’-末端に存在する配列と相補的な配列をシード配列となるようにすることで、マイクロRNA様の活性を有するRNAを設計することができる。マイクロRNAはsiRNAとは異なり、通常「細胞内に天然に存在する」RNAのみを指すことが多いため、このようにして設計したマイクロRNA様配列を特に「人工マイクロRNA」と呼ぶ場合がある。
マイクロRNAが標的mRNAの発現を抑制するメカニズムについては完全には明らかになっていないが、近年の研究により概要が解明されつつある。マイクロRNAは標的となるmRNAの3’-非翻訳領域(3’-UTR)中の部分的に相補的な配列に結合し、その翻訳を抑制し、または標的mRNAを分解することで発現を抑制する。上記の相補性は完全でなくても良いが、特にマイクロRNAの5’- 末端側から2番目から8番目までの塩基の相補性が重要であることが示されており、この領域をマイクロRNAの「シード配列(seed sequence)」と呼ぶこともある(非特許文献4)。シード配列が共通するマイクロRNAは他の配列が異なっていても、共通の標的mRNAの発現を抑制することが示されている。従って、任意のmRNAの3’-末端に存在する配列と相補的な配列をシード配列となるようにすることで、マイクロRNA様の活性を有するRNAを設計することができる。マイクロRNAはsiRNAとは異なり、通常「細胞内に天然に存在する」RNAのみを指すことが多いため、このようにして設計したマイクロRNA様配列を特に「人工マイクロRNA」と呼ぶ場合がある。
2007年8月現在、マイクロRNAのデータベースmiRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)には、ヒトで533種、全生物種で5,071種のマイクロRNAが登録されている。ヒトを含む哺乳類で発現するマイクロRNAの中で、その生理的機能に関して知られているものは、血球系分化に関与するmiR-181(非特許文献5)やインシュリン分泌に関与するmiR-375(非特許文献6)などごく一部のみであり、多くはその生理的活性が未解明である。ただし、線虫やショウジョウバエを用いた研究からマイクロRNAが生物の発生、分化に様々な重要な役割を果たしていることが明らかとなってきており、ヒト疾患との関係においても、特に癌との深い関係を示唆する報告がされている(非特許文献7)。
マイクロRNAは様々な遺伝子の発現制御に関与することから、マイクロRNAの異常はヒトの種々の疾患に関与していることが予想される。特に癌においては研究が進展しており、多くの癌においてマイクロRNAの発現が正常組織と異なっていること、マイクロRNAの発現プロファイル解析により癌の分類が可能であることなどが報告されている(非特許文献8)。また、これまでに見出されたヒトのマイクロRNAの約半数が、ヒト癌で知られている染色体異常あるいは染色体の脆弱部位に存在することも知られている(非特許文献9)。
これまでに報告されている癌とマイクロRNAの関係の例としては、B細胞慢性リンパ性白血病(B-CLL)で欠失が見られる染色体13q14にmiR-15a/miR-16クラスターが含まれ、その欠失がB-CLLの原因の一つになっていると予測されること(非特許文献10)、B-CLLにおいてはさらにmiR-29とmiR-181の発現が低下しており、その標的の一つが癌原遺伝子として知られるTcl1であること(非特許文献11)が知られている。肺癌ではマイクロRNAの一つであるLet-7の発現が低下しており、その標的の一つが癌原遺伝子として知られるRasであること(非特許文献12、13)が知られている。また、癌における遺伝子の高メチル化修飾によりmiR-127やmiR-124aといったマイクロRNAの発現が減少しており、その標的として癌原遺伝子として知られるBcl6やCdk6であること(非特許文献14、15)などがあげられる。多くのマイクロRNAは癌細胞で発現が低下しているが、逆に癌細胞で遺伝子増幅や過剰発現が見られるマイクロRNAも存在する。例えば、悪性リンパ腫で遺伝子増幅が見られる領域には6種のマイクロRNAからなるクラスター(miR-17-92)が存在し、このmiRNAクラスター遺伝子をヒトB細胞リンパ腫のモデルマウスに強制発現させるとリンパ腫の発生が促進されることが知られている(非特許文献16)。また、以前からホジキンリンパ腫で過剰発現する蛋白質をコードしない癌遺伝子候補とされていたBICと呼ばれる遺伝子は、miR-155をコードしていることも明らかとなっている(非特許文献17)。
このように癌とマイクロRNAの関係は近年多数報告されているが、その多くは癌細胞での発現異常を示すものであり、マイクロRNAの機能を示した報告は、Let-7、miR-143やmiR-145を癌細胞株に強制発現させることで癌細胞株の増殖を阻害したという報告(非特許文献18、19、20)、miR-16やmiR-34を強制発現させることにより癌細胞株の細胞周期を停止させたという報告(非特許文献21、22)、miR-372やmiR-373を強制発現させることにより細胞の形質転換を引き起こしたという報告(非特許文献23)など、数少ない。体外からマイクロRNAあるいはその前駆体を投与することにより該マイクロRNAの発現を増大させることで、あるいはそのアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与してマイクロRNAの発現を減少させることで、動物モデルで癌の増殖を抑制させたという報告は、miR-34a投与により移植した大腸癌細胞株の腫瘍形成が抑制したという報告(非特許文献24)、miR-21のアンチセンス投与により移植した乳癌細胞株の腫瘍形成が抑制したという報告(非特許文献25)など、わずかしかない。
Science, 294, 853-858, (2001) Cell, 113, 673-676, (2003) Nature Reviews Genetics, 5, 522-531, (2004) Current Biology, 15, R458-R460 (2005) Science, 303, 83-86, (2004) Nature, 432, 226-230, (2004) Nature Reviews Cancer, 6, 259-269, (2006) Nature, 435, 839-843 (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2999-3004 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 15524-15529 (2002) Cancer Research, 66, 11590-11593 (2006) Cancer Research, 64, 3753-3756, (2004) Cell, 120, 635-647, (2005) Cancer Cell, 9, 435-443, (2006) Cancer Research, 67, 1424-1429, (2007) Nature, 435, 823-833 (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 3627-3632 (2005) Cancer Research, 64, 3753-3756, (2004) Oncology Reports, 16, 845-850, (2006) Cancer Research, 67, 7713-7722, (2007) Molecular and Cellular Biology, 27, 2240-2252, (2007) Nature, 447, 1130-1134, (2007) Cell, 124, 1169-1181, (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 15472-15477 (2007) Oncogenes, 26, 2799-2803, (2007)
Science, 294, 853-858, (2001) Cell, 113, 673-676, (2003) Nature Reviews Genetics, 5, 522-531, (2004) Current Biology, 15, R458-R460 (2005) Science, 303, 83-86, (2004) Nature, 432, 226-230, (2004) Nature Reviews Cancer, 6, 259-269, (2006) Nature, 435, 839-843 (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2999-3004 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 15524-15529 (2002) Cancer Research, 66, 11590-11593 (2006) Cancer Research, 64, 3753-3756, (2004) Cell, 120, 635-647, (2005) Cancer Cell, 9, 435-443, (2006) Cancer Research, 67, 1424-1429, (2007) Nature, 435, 823-833 (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 3627-3632 (2005) Cancer Research, 64, 3753-3756, (2004) Oncology Reports, 16, 845-850, (2006) Cancer Research, 67, 7713-7722, (2007) Molecular and Cellular Biology, 27, 2240-2252, (2007) Nature, 447, 1130-1134, (2007) Cell, 124, 1169-1181, (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 15472-15477 (2007) Oncogenes, 26, 2799-2803, (2007)
ヒトの種々の臓器で発現しているマイクロRNAを同定し、その機能を解析し、疾患との関係を解明することにより、新しい治療薬及び診断薬が開発されることが期待される。
特に、癌細胞の増殖または抑制を引き起こすマイクロRNAを見出すことは、発癌のメカニズムの理解に役立つのみならず、ヒトの癌の診断薬や治療薬の開発、さらにはそれらを利用した癌の新しい診断法や治療法につながることが期待される。さらに癌以外の疾患に関しても、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患など細胞の増殖異常、組織の過形成等が原因となっている疾患の診断薬・治療薬やそれらを利用した診断法・治療法の開発に貢献することが期待される。
特に、癌細胞の増殖または抑制を引き起こすマイクロRNAを見出すことは、発癌のメカニズムの理解に役立つのみならず、ヒトの癌の診断薬や治療薬の開発、さらにはそれらを利用した癌の新しい診断法や治療法につながることが期待される。さらに癌以外の疾患に関しても、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患など細胞の増殖異常、組織の過形成等が原因となっている疾患の診断薬・治療薬やそれらを利用した診断法・治療法の開発に貢献することが期待される。
目的は、細胞の増殖の制御に有用な核酸及び、それらの利用法を提供することにある。
本発明は以下の(1)〜(32)に関する。
(1)以下の(a)〜(h)のいずれかの核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤:
(a)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(b)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含有する、17〜28塩基の核酸
(c)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(d)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
(e)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列の2〜8番目の塩基配列を含む核酸
(f)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(g)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(h)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
(2)核酸がマイクロRNAまたはマイクロRNA前駆体である、(1)に記載の細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
(3)(1)に記載の核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
(4)(1)または(3)に記載の核酸を発現するベクターを有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
(5)(1)に記載の核酸の標的塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞の増抑制剤または増殖促進剤。
(6)(1)に記載の核酸の標的塩基配列を有する遺伝子の発現を促進する物質を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
(7)発現を抑制または促進する物質が核酸である、(5)または(6)に記載の細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
(8)核酸がsiRNAである、(7)に記載の細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
(9)(7)に記載の核酸を発現するベクターを有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
(10)(1)〜(9)のいずれか1項に記載の細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の治療薬。
(11)(1)、(3)および(7)のいずれか1項に記載の核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の治療薬。
(12)(1)に記載の核酸の発現量、該核酸の変異、該核酸をコードするゲノムの変異を検出する試薬を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬。
(13)細胞の増殖異常に起因する疾患が癌である、(10)〜(12)のいずれか1項に記載の治療薬または診断薬。
(14)(1)、(3)および(7)のいずれか1項に記載の核酸を有効量投与することを特徴とする、細胞の増殖異常に起因する疾患の治療方法。
(15)(1)に記載の核酸の発現量、該核酸の変異、該核酸をコードするゲノムの変異を検出することを特徴とする、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断方法。
(16)細胞の増殖異常に起因する疾患が癌である、(14)または(15)に記載の治療または診断方法。
(17)細胞の増殖異常に起因する疾患の治療薬の製造のための、(1)、(3)および(7)のいずれか1項に記載の核酸の使用。
(18)細胞の増殖異常に起因する疾患が癌である、(17)に記載の使用。
(19)(1)に記載の核酸を有効成分として含有する、該核酸の標的遺伝子の発現抑制剤。
(20)(3)に記載の核酸を有効成分として含有する、(1)に記載の核酸の標的遺伝子の発現促進剤。
(21)(4)に記載のベクターを有効成分として含有する、(1)に記載の核酸の標的遺伝子の発現抑制剤または発現促進剤。
(22)(1)または(3)に記載の核酸を用いることを特徴とする、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(23)(4)に記載のベクターを用いることを特徴とする、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(24)(1)に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制する物質を用いることを特徴とする、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(25)(1)に記載の核酸の標的遺伝子の発現を促進する物質を用いることを特徴とする、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(26)発現を抑制または促進する物質が核酸である、(24)または(25)に記載の細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(27)核酸がsiRNAである、(26)に記載の細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(28)(26)に記載の核酸を発現するベクターを用いる、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(29)(1)に記載の核酸を用いることを特徴とする、該核酸の標的遺伝子の発現抑制方法。
(30)(3)に記載の核酸を用いることを特徴とする、(1)に記載の核酸の標的遺伝子の発現促進方法。
(31)(4)に記載のベクターを用いることを特徴とする、(1)に記載の核酸の標的遺伝子の発現抑制方法または発現促進方法。
(32)(1)に記載の核酸の発現または機能を促進または抑制させることを指標とする、細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤のスクリーニング方法。
(1)以下の(a)〜(h)のいずれかの核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤:
(a)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(b)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含有する、17〜28塩基の核酸
(c)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(d)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
(e)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列の2〜8番目の塩基配列を含む核酸
(f)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(g)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(h)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
(2)核酸がマイクロRNAまたはマイクロRNA前駆体である、(1)に記載の細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
(3)(1)に記載の核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
(4)(1)または(3)に記載の核酸を発現するベクターを有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
(5)(1)に記載の核酸の標的塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞の増抑制剤または増殖促進剤。
(6)(1)に記載の核酸の標的塩基配列を有する遺伝子の発現を促進する物質を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
(7)発現を抑制または促進する物質が核酸である、(5)または(6)に記載の細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
(8)核酸がsiRNAである、(7)に記載の細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
(9)(7)に記載の核酸を発現するベクターを有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
(10)(1)〜(9)のいずれか1項に記載の細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の治療薬。
(11)(1)、(3)および(7)のいずれか1項に記載の核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の治療薬。
(12)(1)に記載の核酸の発現量、該核酸の変異、該核酸をコードするゲノムの変異を検出する試薬を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬。
(13)細胞の増殖異常に起因する疾患が癌である、(10)〜(12)のいずれか1項に記載の治療薬または診断薬。
(14)(1)、(3)および(7)のいずれか1項に記載の核酸を有効量投与することを特徴とする、細胞の増殖異常に起因する疾患の治療方法。
(15)(1)に記載の核酸の発現量、該核酸の変異、該核酸をコードするゲノムの変異を検出することを特徴とする、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断方法。
(16)細胞の増殖異常に起因する疾患が癌である、(14)または(15)に記載の治療または診断方法。
(17)細胞の増殖異常に起因する疾患の治療薬の製造のための、(1)、(3)および(7)のいずれか1項に記載の核酸の使用。
(18)細胞の増殖異常に起因する疾患が癌である、(17)に記載の使用。
(19)(1)に記載の核酸を有効成分として含有する、該核酸の標的遺伝子の発現抑制剤。
(20)(3)に記載の核酸を有効成分として含有する、(1)に記載の核酸の標的遺伝子の発現促進剤。
(21)(4)に記載のベクターを有効成分として含有する、(1)に記載の核酸の標的遺伝子の発現抑制剤または発現促進剤。
(22)(1)または(3)に記載の核酸を用いることを特徴とする、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(23)(4)に記載のベクターを用いることを特徴とする、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(24)(1)に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制する物質を用いることを特徴とする、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(25)(1)に記載の核酸の標的遺伝子の発現を促進する物質を用いることを特徴とする、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(26)発現を抑制または促進する物質が核酸である、(24)または(25)に記載の細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(27)核酸がsiRNAである、(26)に記載の細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(28)(26)に記載の核酸を発現するベクターを用いる、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
(29)(1)に記載の核酸を用いることを特徴とする、該核酸の標的遺伝子の発現抑制方法。
(30)(3)に記載の核酸を用いることを特徴とする、(1)に記載の核酸の標的遺伝子の発現促進方法。
(31)(4)に記載のベクターを用いることを特徴とする、(1)に記載の核酸の標的遺伝子の発現抑制方法または発現促進方法。
(32)(1)に記載の核酸の発現または機能を促進または抑制させることを指標とする、細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤のスクリーニング方法。
本発明により、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬、アポトーシス誘導剤、マイクロRNAなどの核酸の標的遺伝子の発現抑制剤または発現促進剤、細胞の増殖抑制方法または増殖促進方法を提供することができる。
本発明で用いる核酸としては、ヌクレオチドおよび該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなるものでもよく、例えば、リボヌクレオチドの重合体であるRNA、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、RNAおよびDNAが混合した重合体、および、ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体をあげることができ、さらに、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよい。また本発明における核酸は、一本鎖核酸または二本鎖核酸であってもよい。また二本鎖核酸には、一方の鎖に対し、他方の鎖がストリンジェントな条件でハイブリダイズする二本鎖核酸も含まれる。
本発明においてヌクレオチド類似体としては、RNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上または、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、あるいは細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、RNAまたはDNAに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよい。例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体やリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体等があげられる。
糖部修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、2’−O−メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−O−プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−O−メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−O−[2−(グアニジウム)エチル]リボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−O−フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、糖部に架橋構造を導入することにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)、より具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、およびエチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)]があげられ、さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、およびペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等をあげることができる。
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、ホスフォロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、N3'-P5'ホスフォアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体等をあげることができる[細胞工学, 16, 1463-1473 (1997)][RNAi法とアンチセンス法、講談社(2005)]。
核酸誘導体としては、核酸に比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、該核酸に別の化学物質を付加した分子であればいかなる分子でもよく、例えば、5’−ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Cy5付加誘導体、Cy3付加誘導体、6−FAM付加誘導体、およびビオチン付加誘導体等をあげることができる。
核酸としては、例えば以下の(a)〜(k)で示される核酸をあげることができる。
(a)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(b)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含有する、17〜28塩基の核酸
(c)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(d)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
(e)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列の2〜8番目の塩基配列を含む核酸
(f)(a)〜(e)の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなる二本鎖核酸、または該二本鎖核酸を含有する核酸
(g)(a)〜(e)の核酸と、該核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸とからなる二本鎖核酸、または該二本鎖核酸を含有する核酸
(h)(f)または(g)の二本鎖核酸が8〜28塩基からなるスペーサーオリゴヌクレオチドで連結されたヘアピン構造を有する一本鎖核酸、または該一本鎖核酸を含有する核酸
(i)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(j)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(k)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
(a)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(b)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含有する、17〜28塩基の核酸
(c)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(d)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
(e)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列の2〜8番目の塩基配列を含む核酸
(f)(a)〜(e)の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなる二本鎖核酸、または該二本鎖核酸を含有する核酸
(g)(a)〜(e)の核酸と、該核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸とからなる二本鎖核酸、または該二本鎖核酸を含有する核酸
(h)(f)または(g)の二本鎖核酸が8〜28塩基からなるスペーサーオリゴヌクレオチドで連結されたヘアピン構造を有する一本鎖核酸、または該一本鎖核酸を含有する核酸
(i)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(j)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(k)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
上記の核酸としては、マイクロRNAが好ましく用いられる。マイクロRNAとは、17〜28塩基長からなる一本鎖RNAをいう。マイクロRNAの該配列を含む周辺ゲノム配列はヘアピン構造を形成し得る配列を有しており、マイクロRNAは該ヘアピンのいずれか片鎖から切り出され得る。マイクロRNAは、その標的となるmRNAに相補的に結合してmRNAの翻訳を抑制し、あるいはmRNAの分解を促進することで遺伝子発現の転写後制御を行う。
マイクロRNAとしては、例えば、配列番号1〜129、803、819、916、917、925および2057〜2114のいずれかで表される塩基配列からなるヒトマイクロRNAをあげることができる。さらに配列番号1〜129、803、819、916、917、925および2057〜2114のいずれかで表される塩基配列からなるヒトマイクロRNAと同一の機能を有するマイクロRNAとして、該ヒトマイクロRNAのオーソログである、配列番号130〜802、822、823、826、827、829〜840、842、843、846〜848、850、851、2115〜2122、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸をあげることができる。具体的な例として、配列番号1のヒトマイクロRNAのオーソログは配列番号130〜139、2212で示される塩基配列からなるものがあげられる。配列番号1〜129、803、819、916、917、925および2057〜2114で表される塩基配列からなるマイクロRNAとそのオーソログの対応表を表1(表1−1から表1−4)に示す。なお、表1の最上段において示されている生物種はそれぞれ以下の通りである。has、Homo sapiens、ヒト;mmu、Mus musculus、マウス;rno、Rattus norvegicus、ラット;xla、Xenopus laevis、アフリカツメガエル;xtr、Xenopus tropicalis、ニシツメガエル;gga、Gallus gallus、ニワトリ;cfa、Canis familiaris、イヌ;mdo、Monodelphis domestica、ハイイロジネズミオポッサム;age、Ateles geoffroyi、アカクモザル;lla、Lagothrix lagotricha、フンボルトウーリーモンキー;sla、Saguinus labiatus、ムネアカタマリン;mml、Macaca mulatta、アカゲザル;mne、Macaca nemestrina、ブタオザル;ggo、Gorilla gorilla、ゴリラ;ppa、Pan paniscus、ボノボ;ptr、Pan troglodytes、チンパンジー;ppy、Pongo pygmaeus、オランウータン;lca、Lemur catta、ワオキツネザル;cgr、Cricetulus griseus、チャイニーズハムスター;bta、Bos taurus、ウシ;oar、Ovis aries、ヒツジ;ssc、Sus scrofa、ブタ;dre、Danio rerio、ゼブラフィッシュ;fru、Fugu rubripes、トラフグ;tni、Tetraodon nigroviridis、ミドリフグ。ヒト由来マイクロRNAとそのオーソログは、その配列同一性が高いことから、同様の機能を有していると考えられる。また、マイクロRNA名末尾に付加されたアルファベットによりサブグループ化されているマイクロRNA同士もまた、その配列同一性が高いことから、同様の機能を有していると考えられる。
マイクロRNA前駆体として、例えば、配列番号1のヒトマイクロRNAに対しては配列番号940または941で表される塩基配列からなる核酸をあげることができる。また、配列番号2〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロRNAに対しては配列番号942〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸をあげることができる。本発明におけるマイクロRNAとマイクロRNA前駆体の対応表を表3(表3−1から表3−17)に示す。また本発明において、マイクロRNA前駆体には人工マイクロRNA前駆体が含まれる。
また上記においてストリンジェントな条件とは、一方の鎖をブロットしたメンブレンに対し、7.5 mL、1M Na2HPO4(pH7.2) 0.6 mL、10% SDS 21 mL、50xDenhardt's solution 0.6 mL、10 mg/mL sonicated salmon sperm DNA 0.3 mLから成るHybridization bufferに、32P-ATPで標識した他方の鎖を加え、50℃で一晩反応させた後、50 ℃で10分間、5xSSC/5%SDS液で洗浄し、更に50℃で10分間、1xSSC/1%SDS液で洗浄し、その後メンブレンを取り出し、X線フィルムに感光させることによりシグナルを検出できる条件である。
核酸を用いてマイクロRNAなどの核酸の発現を検出する方法としては、検体中のマイクロRNAまたはマイクロRNA前駆体などの核酸の存在が検出できる方法であれば、いかなる方法でもよく、例えば、(1)ノーザンハイブリダイゼーション、(2)ドットブロットハイブリダイゼーション、(3)in situハイブリダイゼーション、(4)定量的PCR、(5)デファレンシャル・ハイブリダイゼーション、(6)マイクロアレイ、(7)リボヌクレアーゼ保護アッセイ等があげられる。
核酸を用いてマイクロRNAなどの核酸の変異を検出する方法としては、検体中のマイクロRNAまたはマイクロRNA前駆体などの核酸の塩基配列の変異が検出できる方法であればいかなる方法でもよく、例えば、非変異型塩基配列を有する核酸と変異型塩基配列を有する核酸とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法や、あるいは、検体由来の塩基配列を直接配列決定して、変異の有無を検出する方法等をあげることができる。
核酸を発現するベクターとしては、細胞内に導入して転写されることによりマイクロRNAなどの核酸が生合成されるように設計されたベクターであればいかなるものであってもよい。細胞内でマイクロRNAなどの核酸を発現することができるベクターとしては、具体的には、pCDNA6.2-GW/miR(Invitrogen社製)、pSilencer4.1-CMV(Ambion社製)、pSINsi-hH1 DNA(タカラバイオ社製)、pSINsi-hU6 DNA(タカラバイオ社製)、pENTR/U6(Invitrogen社製)等をあげることができる。
マイクロRNAなどの核酸の標的塩基配列を有する遺伝子(以下、標的遺伝子という)の発現を抑制する方法としては、マイクロRNAなどの核酸の標的塩基配列を有するmRNAの発現を抑制する活性を利用して、該標的塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する方法であれば、いかなる方法でもよい。なお、ここで発現を抑制するとは、mRNAの翻訳を抑制させる場合、およびmRNAを切断あるいは分解することによって、結果としてmRNAから翻訳される蛋白質の量を減少させる場合も含まれる。該標的塩基配列を有するmRNAの発現を抑制する物質としては、具体的にはsiRNAやアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸があげられる。該siRNAは、該mRNAの連続した配列情報を基に作製することができる[Genes Dev., 13, 3191 (1999)]。siRNAの一方の鎖を構成する塩基の残基数は、好ましくは17〜30残基、より好ましくは18〜25残基、さらに好ましくは19〜23残基である。
マイクロRNAとしては、標的遺伝子のmRNAの3’非翻訳領域に存在する連続する7塩基の配列と相補する配列を2〜8番目の塩基配列として含む17〜28塩基長からなる一本鎖RNAである人工マイクロRNAも含まれる。配列を含みそれを前後に延長させた配列がヘアピン構造を形成し、該マイクロRNA配列が細胞内でそのヘアピン構造のいずれか片鎖からマイクロRNAの生合成経路によって切り出され得るRNAである場合、その延長された配列を人工マイクロRNA前駆体と呼ぶ。発現抑制したい遺伝子を標的遺伝子として、上記のような方法を用いて人工マイクロRNAおよび人工マイクロRNA前駆体を設計することができる。
マイクロRNAなどの核酸の標的塩基配列とは、本発明におけるマイクロRNAなどの核酸によって認識される数塩基からなる塩基配列で、かつ、該塩基配列を有するmRNAの発現が本発明におけるマイクロRNAなどの核酸により抑制される塩基配列をいう。マイクロRNAの5’末端側2〜8番目の塩基配列に対して相補的な塩基配列は、該塩基配列を有するmRNAが該マイクロRNAによって翻訳が抑制されるので[Current Biology, 15, R458-R460 (2005)]、本発明におけるマイクロRNAなどの核酸の5’末端側2〜8番目の塩基配列に対して相補的な塩基配列を標的塩基配列としてあげることができる。例えば、マイクロRNAの5’末端側2〜8番目の塩基配列に対して相補的な標的配列を用意し、ヒトmRNAの3'UTR塩基配列群に対して、完全に一致する配列を含有するmRNAを、文字列探索などの方法で選抜することで決定することができる。ヒトmRNAの3'UTR塩基配列群は、「UCSC Human Genome Browser Gateway(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)」より取得できるゲノム配列および遺伝子位置情報を用いて作製することができる。配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロRNAの標的塩基配列を有した遺伝子の具体的な例としては、米国国立バイオテクノロジー情報センターNational Center for Biotechnology Information(NCBI)のEntreGeneデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)で使われている名前(Official SymbolとGene ID)で表記された表4(表4−1から表4−157)に記載の遺伝子をあげることができる。
本発明で用いる核酸を合成する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等にて製造することができる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスフォロチオエート法、ホスホトリエステル法等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機(アプライドバイオシステムズ社製)により合成することができる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはDNAを鋳型として典型的なファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6 RNAポリメラーゼを用いた転写をあげることができる。
本発明で用いる核酸により、該核酸の発現または機能を促進あるいは抑制させる物質をスクリーニングする方法としては、例えば、該核酸を発現するベクターを細胞に導入し、それらの標的塩基配列を有するmRNAの発現または機能を促進または抑制する物質をスクリーニングする方法があげられる。
本発明で用いる核酸を有効成分とする医薬は、細胞の増殖などの異常や、組織の過形成等が原因となっている疾患の診断または治療に用いることができる。また核酸は、細胞の増殖抑制剤もしくは増殖促進剤として用いることもできる。ここで細胞の増殖の異常とは、生体内における通常の増殖速度ではない速度で細胞が増殖している状態をいう。
本発明で用いる核酸を有効成分とする医薬は、細胞の増殖などの異常や、組織の過形成等が原因となっている疾患の診断または治療に用いることができる。また核酸は、細胞の増殖抑制剤もしくは増殖促進剤として用いることもできる。ここで細胞の増殖の異常とは、生体内における通常の増殖速度ではない速度で細胞が増殖している状態をいう。
細胞の増殖異常や組織の過形成等が原因となっている疾患としては、具体的には、癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患等、好ましくは癌をあげることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
1.癌細胞で発現する、マイクロRNAおよびマイクロRNA前駆体などの核酸の発現を検出する方法
(1−1)マイクロRNAの同定
低分子RNA配列がマイクロRNAであるかは、アール エヌ エイ(RNA), 9, 277-279 (2003)に記載の基準に従うか否かで判定できる。例えば、新たに取得して塩基配列を決定した低分子RNAの場合、以下のようにして行うことができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
1.癌細胞で発現する、マイクロRNAおよびマイクロRNA前駆体などの核酸の発現を検出する方法
(1−1)マイクロRNAの同定
低分子RNA配列がマイクロRNAであるかは、アール エヌ エイ(RNA), 9, 277-279 (2003)に記載の基準に従うか否かで判定できる。例えば、新たに取得して塩基配列を決定した低分子RNAの場合、以下のようにして行うことができる。
取得した低分子RNA塩基配列に対応するDNA配列を5’末端側および3’末端側にそれぞれ50 nt程度伸ばした周辺ゲノム配列を取得し、そのゲノム配列から転写されることが予測されるRNAの2次構造を予測する。その結果、ヘアピン構造を有し、かつ該低分子RNAの塩基配列がヘアピンの片鎖に位置する場合、該低分子RNAはマイクロRNAであると判定できる。ゲノム配列は一般に公開されており、例えば、UCSC Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu/) から入手可能である。また、2次構造予測も様々なプログラムが公開されており、例えば、RNAfold [Nucleic Acids Research, 31, 3429-3431 (2003)]やMfold [Nucleic Acids Research, 31, 3406-3415 (2003)] 等を用いることができる。また、既存のマイクロRNA配列は英国サンガーセンターのmiRBaseというデータベースに登録されており、ここに記載の配列と同一か否かで、既存のマイクロRNAと同一か否かを判定することができる。
(1−2)低分子RNAの配列情報の取得
ヒト癌細胞株、または癌患者由来検体から全RNAを抽出し、該RNAを用い癌細胞または癌組織で発現するマイクロRNAを含有する低分子RNAを以下のようにして取得することができる。
(1−2)低分子RNAの配列情報の取得
ヒト癌細胞株、または癌患者由来検体から全RNAを抽出し、該RNAを用い癌細胞または癌組織で発現するマイクロRNAを含有する低分子RNAを以下のようにして取得することができる。
低分子RNAの取得法としては、具体的には、ジーンズ アンド デベロップメント(Genes & Development), 15, 188-200 (2000)に記載の方法に準じて、15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により低分子RNAを分離する方法があげられる。これより5’末端脱リン酸化、3’−アダプターライゲーション、リン酸化、5’−アダプターライゲーション、逆転写、PCR増幅、コンカテマー化、ベクターへのライゲーションを順次経て、低分子RNAをクローニングし、そのクローンの塩基配列を決定することができる。あるいは、例えばサイエンス(Science), 294, 858-862 (2001)に記載の方法に準じて、5’−アデニル化、3’−アダプターライゲーション、5’−アダプターライゲーション、逆転写、PCR増幅、コンカテマー化、ベクターへのライゲーションを順次経て、低分子RNAをクローニングし、そのクローンの塩基配列を決定することもできる。
また、Nucleic Acids Research, 34, 1765-1771 (2006)に記載の方法により、5’末端脱リン酸化、3’−アダプターライゲーション、リン酸化、5’−アダプターライゲーション、逆転写、PCR増幅、マイクロビーズベクターへのライゲーションを順次経て、低分子RNAをクローニングし、そのマイクロビーズの塩基配列を読み取ることで塩基配列を決定することにより低分子RNAの塩基配列情報を取得することができる。
低分子RNAを取得するための他の方法として、small RNA Cloning Kit(タカラバイオ社製)を用いた方法があげられる。
(1−3)マイクロRNAなどの核酸の発現量の検出法
マイクロRNAおよびその前駆体などの核酸の発現量を検出する方法としては、例えば、(1)ノーザンハイブリダイゼーション、(2)ドットブロットハイブリダイゼーション、(3)in situハイブリダイゼーション、(4)定量的PCR、(5)デファレンシャル・ハイブリダイゼーション、(6)マイクロアレイ、(7)リボヌクレアーゼ保護アッセイなどがあげられる。
(1−3)マイクロRNAなどの核酸の発現量の検出法
マイクロRNAおよびその前駆体などの核酸の発現量を検出する方法としては、例えば、(1)ノーザンハイブリダイゼーション、(2)ドットブロットハイブリダイゼーション、(3)in situハイブリダイゼーション、(4)定量的PCR、(5)デファレンシャル・ハイブリダイゼーション、(6)マイクロアレイ、(7)リボヌクレアーゼ保護アッセイなどがあげられる。
ノーザンブロット法とは、検体由来RNAをゲル電気泳動で分離後、ナイロンフィルター等の支持体に転写し、核酸の塩基配列をもとに適宜標識をしたプローブを作製し、ハイブリダイゼーションおよび洗浄をおこなうことで、核酸に特異的に結合したバンドを検出する方法であり、具体的には、例えば、Science, 294, 853-858 (2001)に記載の方法等に従って行うことができる。
標識プローブは、例えば、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングまたは5'末端のリン酸化等の方法により放射性同位体、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光基、化学発光基等を、本発明で用いる核酸の塩基配列と相補的な配列を有するDNAやRNA、あるいはLNAに取り込ませることで調製できる。標識プローブの結合量は該核酸の発現量を反映することから、結合した標識プローブの量を定量することで該核酸の発現量を定量することができる。電気泳動、メンブレンの移行、プローブの調製、ハイブリダイゼーション、核酸の検出については、モレキュラー・クローニング第3版[Cold Spring Harbor Press, (2001) Cold Spring Harbor, NY]に記載の方法により行うことができる。
ドットブロットハイブリダイゼーションは、組織や細胞から抽出したRNAを膜上に点状にスポットして固定し、プローブとなる標識したポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションを行い、プローブと特異的にハイブリダイズするRNAを検出する方法である。プローブとしてはノーザンハイブリダイゼーションと同様のものを用いることができる。RNAの調製、RNAのスポット、ハイブリダイゼーション、RNAの検出については、モレキュラー・クローニング第3版に記載の方法により行なうことができる。
in situハイブリダイゼーションは、生体から取得した組織のパラフィンまたはクリオスタット切片、あるいは固定化した細胞を検体として用い、標識したプローブとハイブリダイゼーションならびに洗浄の工程を行い、顕微鏡観察により、核酸の組織や細胞内での分布や局在を調べる方法である[Methods in Enzymology, 254, 419 (1995)]。プローブとしてはノーザンハイブリダイゼーションと同様のものを用いることができる。具体的には、Nature Method, 3, 27 (2006)に記載の方法に従って、マイクロRNAを検出することができる。
定量的PCRでは、検体由来RNAから、逆転写用プライマーと逆転写酵素を用いて合成したcDNA(以後、該cDNAを検体由来cDNAと称する)を測定に用いる。cDNA合成に供する逆転写用プライマーとして、ランダムプライマーあるいは特異的RTプライマー等を用いることができる。特異的RTプライマーとは、核酸およびその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列に相補する配列を有するプライマーをいう。
例えば、検体由来cDNAを合成後、これを鋳型とし、マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸およびその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列、あるいは逆転写用プライマーに対応する塩基配列から設計した鋳型特異的なプライマーを用いてPCRを行い、該核酸を含むcDNAの断片を増幅させ、ある一定量に達するまでのサイクル数から検体由来RNAに含まれる該核酸の量を検出する。鋳型特異的なプライマーとしては、核酸およびその周辺ゲノム配列に対応する適当な領域を選択し、その領域の塩基配列の5'端15〜40残基、好ましくは20〜30残基の配列からなるDNAまたはLNA、および3'端15〜40残基、好ましくは20〜30残基と相補的な配列からなるDNAまたはLNAの組を用いることができる。具体的には、Nucleic Acids Research, 32, e43 (2004)に記載の方法等に準じて行うことができる。
また、cDNA合成に供する逆転写用プライマーとして、ステム・ループ構造を有した特異的RTプライマーを用いることもできる。具体的には、Nucleic Acid Research, 33, e179 (2005)に記載の方法、あるいは、TaqMan MicroRNA Assays(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて行うことができる。
更に別の検体由来cDNA合成法として、検体由来RNAに対してpolyAポリメラーゼによりpolyA配列を付加し、オリゴdT配列を含む塩基配列を逆転写用プライマーとして用いることにより、逆転写反応を行うこともできる。具体的には、miScript System(キアゲン社製)やQuantiMir RT Kit(System Biosciences社製)を用いて行うことができる。更に、核酸を少なくとも1つ以上含む塩基配列に対応するDNAあるいはLNAを固定化させたフィルターあるいはスライドガラスやシリコンなどの基板に対して、検体由来RNAあるいはcDNAをハイブリダイゼーションし、洗浄を行うことにより、核酸の量の変動を検出することができる。
更に別の検体由来cDNA合成法として、検体由来RNAに対してpolyAポリメラーゼによりpolyA配列を付加し、オリゴdT配列を含む塩基配列を逆転写用プライマーとして用いることにより、逆転写反応を行うこともできる。具体的には、miScript System(キアゲン社製)やQuantiMir RT Kit(System Biosciences社製)を用いて行うことができる。更に、核酸を少なくとも1つ以上含む塩基配列に対応するDNAあるいはLNAを固定化させたフィルターあるいはスライドガラスやシリコンなどの基板に対して、検体由来RNAあるいはcDNAをハイブリダイゼーションし、洗浄を行うことにより、核酸の量の変動を検出することができる。
このようなハイブリダイゼーションに基づく方法には、ディファレンシャルハイブリダイゼーション[Trends Genet., 7, 314 (1991)]やマイクロアレイ[Genome Res., 6, 639 (1996)]を用いる方法があげられる。いずれの方法もフィルターあるいは基板上にU6 RNAに対応する塩基配列などの内部コントロールを固定化することで、対照検体と標的検体の間での核酸の量の違いを正確に検出することができる。また対照検体と標的検体由来のRNAをもとにそれぞれ異なる標識のdNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTPの混合物)を用いて標識cDNA合成を行い、1枚のフィルターあるいは1枚の基盤に2つの標識cDNAを同時にハイブリダイズさせることで正確な核酸の定量を行うことができる。更には、対照検体および/または標的検体由来のRNAを直接標識してハイブリダイズさせることで核酸の定量をおこなうこともできる。例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 9740-9744 (2004)やNucleic Acid Research, 32, e188 (2004)、RNA, 13, 151-159 (2007)等に記載のマイクロアレイを用いてマイクロRNAを検出することができる。具体的には、mirVana miRNA Bioarray(Ambion社製)、miRNA microarray kit(アジレント・テクノロジー社製)と同様にして検出または定量することができる。
リボヌクレアーゼ保護アッセイでは、まず核酸あるいはその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列の3'端にT7プロモーター、SP6プロモーターなどのプロモーター配列を結合し、標識したNTP(ATP、GTP、CTP、UTPの混合物)およびRNAポリメラーゼを用いたイン・ビトロの転写系により、標識したアンチセンスRNAを合成する。該標識アンチセンスRNAを、検体由来RNAと結合させて、RNA-RNAハイブリッドを形成させた後、1本鎖RNAのみを分解するリボヌクレアーゼAで消化する。該消化物をゲル電気泳動し、RNA-RNAハイブリッドを形成することにより消化から保護されたRNA断片を、核酸として、検出または定量する。具体的には、mirVana miRNA Detection Kit(Ambion社製)を用いて検出または定量することができる。
2.核酸の合成
上記1のようにして、癌細胞または癌組織で発現している、あるいは正常組織と比較して発現が増大または減少しているマイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸が同定された後は、塩基配列に基づいてリボヌクレオチドの重合体であるRNAだけでなく、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNAを合成することができる。例えば、上記1で同定したマイクロRNAの塩基配列をもとに、DNAの塩基配列を決定することができる。RNAの塩基配列に対応するDNAの塩基配列は、RNAの配列に含まれるU(ウラシル)をT(チミン)に読み替えることで一義的に決定できる。また、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混合した重合体や、ヌクレオチド類似体を含む重合体や核酸の誘導体も同様にして合成することができる。
2.核酸の合成
上記1のようにして、癌細胞または癌組織で発現している、あるいは正常組織と比較して発現が増大または減少しているマイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸が同定された後は、塩基配列に基づいてリボヌクレオチドの重合体であるRNAだけでなく、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNAを合成することができる。例えば、上記1で同定したマイクロRNAの塩基配列をもとに、DNAの塩基配列を決定することができる。RNAの塩基配列に対応するDNAの塩基配列は、RNAの配列に含まれるU(ウラシル)をT(チミン)に読み替えることで一義的に決定できる。また、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混合した重合体や、ヌクレオチド類似体を含む重合体や核酸の誘導体も同様にして合成することができる。
核酸を合成する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等にて製造することができる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスフォロチオエート法、ホスホトリエステル法等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機(アプライドバイオシステムズ社製)により合成することができる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはDNAを鋳型として典型的なファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6 RNAポリメラーゼを用いた転写による方法をあげることができる。
3.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸の機能を検出する方法
マイクロRNAなどの核酸の機能を検出する方法としては、標的塩基配列を有するmRNAの翻訳を抑制するか否かで検出する方法をあげることができる。
3.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸の機能を検出する方法
マイクロRNAなどの核酸の機能を検出する方法としては、標的塩基配列を有するmRNAの翻訳を抑制するか否かで検出する方法をあげることができる。
マイクロRNAは、その標的塩基配列を3’末端側untranslated region (3’UTR)に含むmRNAの翻訳を抑制することが知られている[Current Biology, 15, R458-R460 (2005)]。そこで測定しようとする一本鎖RNAに対する標的塩基配列を、適当なレポーター遺伝子発現ベクターの3’UTRに挿入したDNAを作製し、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入し、その細胞に一本鎖RNAを発現させた時にレポーター遺伝子の発現を測定することで、マイクロRNAの機能を有しているか否かを検出することができる。
レポーター遺伝子発現ベクターは、レポーター遺伝子の上流にプロモーターを有しており、宿主細胞においてレポーター遺伝子を発現できるものであればいかなるものでもよい。レポーター遺伝子としては、あらゆるレポーター遺伝子を使用することが可能であるが、例えば、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、グリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子およびDsRed蛍光遺伝子などが利用できる。こうした性質を有するレポーター遺伝子発現ベクターとして、例えば、psiCHECK-1(Promega社製)、psiCHECK-2(Promega社製)、pGL3-Control(Promega社製)、pGL4(Promega社製)、pRNAi-GL(タカラバイオ社製)、pCMV-DsRed-Express(CLONTECH社製)などがあげられる。また、一本鎖RNAは、後述の6に記載した方法で発現させることができる。
一本鎖RNAのマイクロRNAとしての機能は、具体的には以下のようにして検出することができる。まず宿主細胞をマルチウェルプレート等に培養し、標的配列を有したレポーター遺伝子発現ベクターと一本鎖RNAを発現させる。その後、レポーター活性を測定し、一本鎖RNAを発現させない場合に比べて、一本鎖RNAを発現させた場合のレポーター活性を測定することで、一本鎖RNAのマイクロRNAとしての機能を検出することができる。
4.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸の変異を検出する方法
マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸の変異を検出する方法として、正常型と変異型の核酸のハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法を用いることができる。
4.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸の変異を検出する方法
マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸の変異を検出する方法として、正常型と変異型の核酸のハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法を用いることができる。
ヘテロ二本鎖を検出する方法としては、(1)ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法 [Trends genet., 7, 5 (1991)]、(2)一本鎖コンフォメーション多型解析法 [Genomics, 16, 325-332 (1993)]、(3)ミスマッチの化学的切断法 (CCM, chemical cleavage of mismatches) [Human Genetics (1996), Tom Strachan and Andrew P. Read, BIOS Scientific Publishers Limited]、(4)ミスマッチの酵素的切断法 [Nature Genetics, 9, 103-104 (1996)]、(5)変性ゲル電気泳動法[Mutat. Res., 288, 103-112 (1993)]等の方法があげられる。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるヘテロ二本鎖検出法は、例えば、以下のようにして行う。まず、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAをテンプレートとして、核酸の塩基配列を含むゲノムの塩基配列を基に設計したプライマーにより、200 bpよりも小さい断片として増幅する。ヘテロ二本鎖が形成された場合は、変異を持たないホモ二本鎖よりも移動度が遅く、それらは余分なバンドとして検出することができる。200 bpよりも小さい断片であれば、1塩基以上のほとんどの挿入、欠失、置換を検出することができる。ヘテロ二本鎖解析は、次に述べる一本鎖コンフォメーション解析と組み合わせた1枚のゲルで行うことが望ましい。
一本鎖コンフォメーション多型解析(SSCP解析;single strand conformation polymorphism analysis)では、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAをテンプレートにして、核酸の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いて、200bpよりも小さい断片として増幅したDNAを変性後に、未変性ポリアクリルアミドゲル中で泳動する。DNA増幅を行う際にプライマーを同位体あるいは蛍光色素で標識するか、または未標識の増幅産物を銀染色することにより、増幅したDNAをバンドとして検出することができる。野生型のパターンとの相違を明らかにするために、コントロールの検体も同時に泳動すると、移動度の違いから変異を持った断片を検出することができる。
ミスマッチ化学的切断法(CCM法)では、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAをテンプレートとして、核酸の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したDNA断片を、核酸に同位体あるいは蛍光標識をとり込ませた標識核酸とハイブリダイズさせ、四酸化オスミウムで処理することでミスマッチの存在する箇所のDNAの一方の鎖を切断させ、変異を検出することができる。CCMは最も感度の高い検出法の1つであり、キロベースの長さの検体にも適応できる。
上記の四酸化オスミウムの代わりに、T4ファージリゾルベースとエンドヌクレアーゼVIIのような細胞内でミスマッチの修復に関与する酵素とRNaseAと組み合わせることで、酵素的にミスマッチを切断することもできる。
変性ゲル電気泳動法(denaturing gradient gel electrophoresis:DGGE法)では、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAをテンプレートに、核酸の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したDNA断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲルを用いて電気泳動する。増幅したDNA断片はゲル内を一本鎖に変性する位置まで移動し、変性後は移動しなくなる。変異がある場合とない場合では増幅したDNAのゲル内での移動が異なることから、変異の存在を検出することができる。検出感度を上げるにはそれぞれのプライマーにポリ(G:C)端末を付けるとよい。
変性ゲル電気泳動法(denaturing gradient gel electrophoresis:DGGE法)では、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAをテンプレートに、核酸の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したDNA断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲルを用いて電気泳動する。増幅したDNA断片はゲル内を一本鎖に変性する位置まで移動し、変性後は移動しなくなる。変異がある場合とない場合では増幅したDNAのゲル内での移動が異なることから、変異の存在を検出することができる。検出感度を上げるにはそれぞれのプライマーにポリ(G:C)端末を付けるとよい。
また、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAの塩基配列を直接的に決定し、解析することにより、核酸の変異を検出することもできる。
5.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を発現させる方法
既知のマイクロRNA配列、及びその前駆体の配列は英国サンガーセンターのmiRBaseというデータベースに登録されており、その配列を利用してマイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を作製することができる。また、1で記載した方法により取得したマイクロRNAの配列を用いて作製することもできる。
5.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を発現させる方法
既知のマイクロRNA配列、及びその前駆体の配列は英国サンガーセンターのmiRBaseというデータベースに登録されており、その配列を利用してマイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を作製することができる。また、1で記載した方法により取得したマイクロRNAの配列を用いて作製することもできる。
核酸は、細胞内に導入して転写されることにより生合成されるようなベクターを用いることにより発現させることができる。具体的には、核酸の塩基配列あるいは、その塩基配列を含むゲノムの塩基配列をもとに、ヘアピン部分を含むDNA断片を調製し、発現ベクターのプロモーター下流に挿入して発現プラスミドを造成し、次に該発現プラスミドを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、該核酸を発現させることができる。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能または染色体中への組込みが可能で、核酸の塩基配列を含む遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであれば、いかなるものでもよく、例えば、RNA polymerase II(pol II)系プロモーターやU6 RNAやH1 RNAの転写系であるRNA polymerase III(pol III)系プロモーター等をあげることができる。pol II系プロモーターとしては例えば、サイトメガロウィルス(ヒトCMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター等をあげることができる。それらを用いた発現ベクターとして、例えば、pCDNA6.2-GW/miR(Invitrogen社製)、pSilencer 4.1-CMV(Ambion社製)等をあげることができる。pol III系プロモーターとしてはU6 RNAやH1 RNAあるいはtRNA遺伝子のプロモーターをあげることができる。それらを用いた発現ベクターとして、例えば、pSINsi-hH1 DNA(タカラバイオ社製)、pSINsi-hU6 DNA(タカラバイオ社製)、pENTR/U6(Invitrogen社製)などをあげることができる。
または、核酸の塩基配列を含む遺伝子をウィルスベクター内のプロモーター下流に挿入して組換えウィルスベクターを造成し、該ベクターをパッケージング細胞に導入して組換えウィルスを生産して、該核酸の塩基配列を含む遺伝子を発現させることもできる。
パッケージング細胞はウィルスのパッケジ−ングに必要な蛋白質をコードする遺伝子のいずれかを欠損している組換えウィルスベクターの該欠損する蛋白質を補給できる細胞であればいずれの細胞もよく、例えばヒト腎臓由来のHEK293細胞、マウス繊維芽細胞NIH3T3由来の細胞などを用いることができる。パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウィルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のgag, pol, envなどの蛋白質が、レンチウィルスベクターの場合はHIVウィルス由来のgag, pol, env, vpr, vpu, vif, tat, rev, nefなどの蛋白質、アデノウィルスベクターの場合はアデノウィルス由来のE1A,E1Bなどの蛋白質、また、アデノ随伴ウィルスベクターの場合はRep(p5, p19, p40), Vp(Cap)などの蛋白質を用いることができる。
パッケージング細胞はウィルスのパッケジ−ングに必要な蛋白質をコードする遺伝子のいずれかを欠損している組換えウィルスベクターの該欠損する蛋白質を補給できる細胞であればいずれの細胞もよく、例えばヒト腎臓由来のHEK293細胞、マウス繊維芽細胞NIH3T3由来の細胞などを用いることができる。パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウィルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のgag, pol, envなどの蛋白質が、レンチウィルスベクターの場合はHIVウィルス由来のgag, pol, env, vpr, vpu, vif, tat, rev, nefなどの蛋白質、アデノウィルスベクターの場合はアデノウィルス由来のE1A,E1Bなどの蛋白質、また、アデノ随伴ウィルスベクターの場合はRep(p5, p19, p40), Vp(Cap)などの蛋白質を用いることができる。
発現ベクターを用いる以外にも、本発明で用いる核酸をベクターを用いずに直接細胞に導入することもできる。本手法に用いる核酸としては、DNAやRNA、あるいはヌクレオチド類似体の他、これらのキメラ分子、あるいは該核酸の誘導体を用いることができる。具体的には、Pre-miRTM miRNA Precursor Molecules(Ambion社製)やmiRIDIAN microRNA Mimics(GEヘルスケア社製)と同様にして、マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を発現させることができる。マイクロRNAを発現させる場合は、細胞内で最終的にマイクロRNAができる状態になればいかなる方法でもよく、例えば、(1)マイクロRNA前駆体である一本鎖RNAを導入する他、(2)マイクロRNAそのもの、およびマイクロRNAの相補鎖からなり、100%マッチの二本鎖からなるRNA、(3)マイクロRNAがDicerに切断された後の状態を想定した二本鎖RNAを導入させる方法があげられる。こうした方法を使用した製品としては、miCENTURY OX Precursor(B-Bridge社製)、miCENTURY OX siMature(B-Bridge社製)、miCENTURY OX miNatural(B-Bridge社製)をあげることができる。
6.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸の活性を抑制する方法
マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸は、アンチセンス技術[バイオサイエンスとインダストリー, 50, 322 (1992)、化学, 46, 681 (1991)、Biotechnology, 9, 358 (1992)、Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992) 、Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992)、細胞工学, 16, 1463 (1997)]、トリプル・ヘリックス技術[Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)]、リボザイム技術[Current Opinion in Chemical Biology, 3, 274 (1999)、FEMS Microbiology Reviews, 23, 257 (1999)、Frontiers in Bioscience, 4, D497 (1999)、Chemistry & Biology, 6, R33 (1999)、Nucleic Acids Research, 26, 5237 (1998)、Trends In Biotechnology, 16, 438 (1998)]、デコイDNA法[Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 56, 563 (1998)、Circulation Research, 82, 1023 (1998)、Experimental Nephrology, 5, 429 (1997)、Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 54, 2583 (1996)]、あるいはsiRNA(short interfering RNA)を用いて、その活性を抑制することができる。
6.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸の活性を抑制する方法
マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸は、アンチセンス技術[バイオサイエンスとインダストリー, 50, 322 (1992)、化学, 46, 681 (1991)、Biotechnology, 9, 358 (1992)、Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992) 、Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992)、細胞工学, 16, 1463 (1997)]、トリプル・ヘリックス技術[Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)]、リボザイム技術[Current Opinion in Chemical Biology, 3, 274 (1999)、FEMS Microbiology Reviews, 23, 257 (1999)、Frontiers in Bioscience, 4, D497 (1999)、Chemistry & Biology, 6, R33 (1999)、Nucleic Acids Research, 26, 5237 (1998)、Trends In Biotechnology, 16, 438 (1998)]、デコイDNA法[Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 56, 563 (1998)、Circulation Research, 82, 1023 (1998)、Experimental Nephrology, 5, 429 (1997)、Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 54, 2583 (1996)]、あるいはsiRNA(short interfering RNA)を用いて、その活性を抑制することができる。
アンチセンスとは、ある標的核酸の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸を塩基配列特異的にハイブリダイゼーションさせ、該標的核酸の発現を抑制できるものをいう。アンチセンスに用いる核酸はDNAやRNAまたはヌクレオチド類似体の他、これらのキメラ分子、あるいは該核酸の誘導体も用いることができる。具体的には、Nature, 432, 226 (2004)等に記載の方法に従うことでアンチセンスを作製し、発現を抑制することができる。また、Anti-miRTM miRNA Inhibitors(Ambion社製)やmiRIDIAN microRNA Inhibitors(GEヘルスケア社製)と同様にしてマイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸の発現を抑制することができる。
siRNAとは、ある標的核酸の塩基配列を含む短い二本鎖RNAであり、RNA干渉(RNAi)により、該標的核酸の発現を抑制できるものをいう。siRNAの配列は、標的とする塩基配列から文献[Genes Dev., 13, 3191 (1999)]の条件に基づいて適宜設計することができる。例えば選択した19塩基の配列および相補的な配列それぞれの3'端にTTを付加した配列を有する2本のRNAを核酸合成機により合成し、アニーリングすることによりsiRNAを作製できる。また、pSilencer 1.0-U6 (Ambion社製)、pSUPER(OligoEngine社製)等のsiRNA発現用ベクターに上記の選択した19塩基の配列に相当するDNAを挿入することにより、該遺伝子の発現を抑制できるsiRNAを発現するベクターを作製することができる。本発明で用いるマイクロRNAなどの核酸を抑制するsiRNAとしては、該核酸の活性を抑制できるものであればいかなるものでもよいが、配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列の、それぞれ9番目の塩基以降の連続した配列情報から設計されたsiRNAが好ましい。siRNAの一方の鎖を構成する塩基の残基数は、好ましくは17〜30残基、より好ましくは18〜25残基、さらに好ましくは19〜23残基である。
癌細胞で発現するマイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸に特異的なアンチセンスまたはsiRNAを用いて、癌細胞で発現するマイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの発現の抑制を行うことができる。例えば、該マイクロRNAまたは該マイクロRNA前駆体に特異的なアンチセンスDNAまたはsiRNAを投与することにより、該マイクロRNAの活性を抑制し、癌細胞におけるマイクロRNAまたはマイクロRNA前駆体の作用を制御することができる。
また、癌細胞で発現するマイクロRNAまたはその前駆体の発現異常による患者の場合、該マイクロRNAまたはその前駆体に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを患者に投与することにより、癌細胞の機能を制御し、上記発現異常により発症する疾患の治療をすることができる。すなわち、該マイクロRNAまたはその前駆体に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは、癌細胞の異常増殖に起因する疾患の治療剤として有用である。
マイクロRNAまたはその前駆体などの核酸に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを上記の治療剤として使用する場合は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを単独、あるいはこれらをコードする核酸をレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、下記9に記載した常法に従って医薬製剤とし、投与することができる。
7.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を用いて遺伝子の機能を抑制する方法
核酸の標的遺伝子の機能または発現を抑制する方法としては、標的塩基配列を有するmRNAの発現をマイクロRNAなどの核酸が抑制する活性を利用する方法であればいかなる方法を用いてもよい。例えば、マイクロRNAなどの核酸を発現させ、細胞内のマイクロRNAなどの核酸の量を増加させることにより、標的配列を有するmRNAの翻訳を抑制し、遺伝子の発現を抑制する方法をあげることができる。なお、核酸を発現させるには、上記5で記載した方法により行なうことができる。配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の標的塩基配列を有するmRNAとしては、例えば、それぞれ前述の表4で示される遺伝子群を例示することができる。
7.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を用いて遺伝子の機能を抑制する方法
核酸の標的遺伝子の機能または発現を抑制する方法としては、標的塩基配列を有するmRNAの発現をマイクロRNAなどの核酸が抑制する活性を利用する方法であればいかなる方法を用いてもよい。例えば、マイクロRNAなどの核酸を発現させ、細胞内のマイクロRNAなどの核酸の量を増加させることにより、標的配列を有するmRNAの翻訳を抑制し、遺伝子の発現を抑制する方法をあげることができる。なお、核酸を発現させるには、上記5で記載した方法により行なうことができる。配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の標的塩基配列を有するmRNAとしては、例えば、それぞれ前述の表4で示される遺伝子群を例示することができる。
また、表4で示される標的遺伝子に対するsiRNAを用いて、該標的遺伝子の機能を抑制することができる。
8.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を用いて該核酸の発現または機能を促進または抑制させる物質をスクリーニングする方法
核酸を用いて、マイクロRNAまたはその前駆体などの核酸の発現または機能を促進または抑制させる物質をスクリーニングすることができる。例えば、核酸の塩基配列から、スクリーニングの標的とする塩基配列を選択して、該塩基配列を有する核酸を発現する細胞を利用して、選択したマイクロRNAまたはその前駆体の発現または機能を促進または抑制させる物質をスクリーニングすることができる。
8.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を用いて該核酸の発現または機能を促進または抑制させる物質をスクリーニングする方法
核酸を用いて、マイクロRNAまたはその前駆体などの核酸の発現または機能を促進または抑制させる物質をスクリーニングすることができる。例えば、核酸の塩基配列から、スクリーニングの標的とする塩基配列を選択して、該塩基配列を有する核酸を発現する細胞を利用して、選択したマイクロRNAまたはその前駆体の発現または機能を促進または抑制させる物質をスクリーニングすることができる。
スクリーニングに用いる、マイクロRNAおよびマイクロRNA前駆体などを発現する細胞としては、癌細胞のほか、上記5で記載したように、該塩基配列を有する核酸を発現するベクターを動物細胞や酵母などの宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞や、該塩基配列を有する核酸をベクターを用いずに直接導入した細胞等を用いることもできる。
具体的なスクリーニング方法としては、スクリーニングの標的とするマイクロRNAまたはその前駆体などの核酸の発現量の変化を指標にする方法の他、マイクロRNAなどの核酸の標的配列を有するmRNAやそれにコードされる遺伝子産物の発現量の変化を指標にする方法があげることができる。
(a)スクリーニングの標的とするマイクロRNAまたはその前駆体などの核酸の発現量の変化を指標にするスクリーニング方法
該核酸を発現する細胞に対し、試験物質を接触させ、選択した核酸の発現量の変化を指標に、マイクロRNAおよびその前駆体の発現などの核酸を促進または抑制させる物質を得る。核酸の発現量は、上記3で記載した方法により検出することができる。
(b)スクリーニングの標的とするマイクロRNAなどの核酸の標的配列を有するmRNAやそれにコードされる遺伝子産物の発現量の変化を指標にするスクリーニング方法
該mRNAを発現する細胞に対し、試験物質を接触させ、選択した核酸の標的配列を有するmRNAやそれにコードされる遺伝子産物の発現量の変化を指標に、マイクロRNAおよびその前駆体などの核酸の発現または機能を促進または抑制させる物質を得る。または、マイクロRNAなどの核酸の標的配列を適当なレポーター遺伝子発現ベクターの3’UTRに挿入したDNAを作製して、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入し、その細胞に試験物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現量の変化を指標に、マイクロRNAおよびその前駆体などの核酸の発現または機能を促進または抑制させる物質を得る。
具体的なスクリーニング方法としては、スクリーニングの標的とするマイクロRNAまたはその前駆体などの核酸の発現量の変化を指標にする方法の他、マイクロRNAなどの核酸の標的配列を有するmRNAやそれにコードされる遺伝子産物の発現量の変化を指標にする方法があげることができる。
(a)スクリーニングの標的とするマイクロRNAまたはその前駆体などの核酸の発現量の変化を指標にするスクリーニング方法
該核酸を発現する細胞に対し、試験物質を接触させ、選択した核酸の発現量の変化を指標に、マイクロRNAおよびその前駆体の発現などの核酸を促進または抑制させる物質を得る。核酸の発現量は、上記3で記載した方法により検出することができる。
(b)スクリーニングの標的とするマイクロRNAなどの核酸の標的配列を有するmRNAやそれにコードされる遺伝子産物の発現量の変化を指標にするスクリーニング方法
該mRNAを発現する細胞に対し、試験物質を接触させ、選択した核酸の標的配列を有するmRNAやそれにコードされる遺伝子産物の発現量の変化を指標に、マイクロRNAおよびその前駆体などの核酸の発現または機能を促進または抑制させる物質を得る。または、マイクロRNAなどの核酸の標的配列を適当なレポーター遺伝子発現ベクターの3’UTRに挿入したDNAを作製して、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入し、その細胞に試験物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現量の変化を指標に、マイクロRNAおよびその前駆体などの核酸の発現または機能を促進または抑制させる物質を得る。
標的配列の選択は、上記7で記載した方法により行なうことができ、配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロRNAなどの核酸の標的配列を有するmRNAとしては、例えば、それぞれ前述の表4で示される遺伝子群を例示することができる。
9.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を用いた細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤
マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸、およびその塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸は、標的配列を有する遺伝子の発現を制御することにより、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤として利用することができる。
9.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を用いた細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤
マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸、およびその塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸は、標的配列を有する遺伝子の発現を制御することにより、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤として利用することができる。
細胞の増殖抑制剤としては、以下の(a)〜(h)であげられる核酸があげられる。
(a)配列番号1〜3、5〜7、11、14、15、17、24、25、29〜33、35、37、39〜54、56〜58、61〜63、66〜68、70、72〜82、84、85、87〜112、114〜121、125、128〜167、193〜219、263〜278、306〜324、357〜368、476〜492、522〜557、561〜564、572〜576、578〜683、693〜714、735〜743、746〜751、754〜762、765〜803、853〜855、888〜891、899〜912、914〜926、930〜939、2058、2060、2061、2063〜2065、2067〜2071、2073〜2078、2080、2082、2084〜2092、2096〜2108、2110、2111、2113、2117、2120〜2122、2125〜2128、2132、2212、2213、2216、2219、2220、2227〜2229、2231〜2237、2240〜2243、2248〜2253、2255〜2261、2317および2318のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(b)配列番号1〜3、5〜7、11、14、15、17、24、25、29〜33、35、37、39〜54、56〜58、61〜63、66〜68、70、72〜82、84、85、87〜112、114〜121、125、128〜167、193〜219、263〜278、306〜324、357〜368、476〜492、522〜557、561〜564、572〜576、578〜683、693〜714、735〜743、746〜751、754〜762、765〜803、853〜855、888〜891、899〜912、914〜926、930〜939、2058、2060、2061、2063〜2065、2067〜2071、2073〜2078、2080、2082、2084〜2092、2096〜2108、2110、2111、2113、2117、2120〜2122、2125〜2128、2132、2212、2213、2216、2219、2220、2227〜2229、2231〜2237、2240〜2243、2248〜2253、2255〜2261、2317および2318のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含有する、17〜28塩基の核酸
(c)配列番号1〜3、5〜7、11、14、15、17、24、25、29〜33、35、37、39〜54、56〜58、61〜63、66〜68、70、72〜82、84、85、87〜112、114〜121、125、128〜167、193〜219、263〜278、306〜324、357〜368、476〜492、522〜557、561〜564、572〜576、578〜683、693〜714、735〜743、746〜751、754〜762、765〜803、853〜855、888〜891、899〜912、914〜926、930〜939、2058、2060、2061、2063〜2065、2067〜2071、2073〜2078、2080、2082、2084〜2092、2096〜2108、2110、2111、2113、2117、2120〜2122、2125〜2128、2132、2212、2213、2216、2219、2220、2227〜2229、2231〜2237、2240〜2243、2248〜2253、2255〜2261、2317および2318のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(d)配列番号1〜3、5〜7、11、14、15、17、24、25、29〜33、35、37、39〜54、56〜58、61〜63、66〜68、70、72〜82、84、85、87〜112、114〜121、125、128〜167、193〜219、263〜278、306〜324、357〜368、476〜492、522〜557、561〜564、572〜576、578〜683、693〜714、735〜743、746〜751、754〜762、765〜803、853〜855、888〜891、899〜912、914〜926、930〜939、2058、2060、2061、2063〜2065、2067〜2071、2073〜2078、2080、2082、2084〜2092、2096〜2108、2110、2111、2113、2117、2120〜2122、2125〜2128、2132、2212、2213、2216、2219、2220、2227〜2229、2231〜2237、2240〜2243、2248〜2253、2255〜2261、2317および2318のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
(e)配列番号1〜3、5〜7、11、14、15、17、24、25、29〜33、35、37、39〜54、56〜58、61〜63、66〜68、70、72〜82、84、85、87〜112、114〜121、125、128〜167、193〜219、263〜278、306〜324、357〜368、476〜492、522〜557、561〜564、572〜576、578〜683、693〜714、735〜743、746〜751、754〜762、765〜803、853〜855、888〜891、899〜912、914〜926、930〜939、2058、2060、2061、2063〜2065、2067〜2071、2073〜2078、2080、2082、2084〜2092、2096〜2108、2110、2111、2113、2117、2120〜2122、2125〜2128、2132、2212、2213、2216、2219、2220、2227〜2229、2231〜2237、2240〜2243、2248〜2253、2255〜2261、2317および2318のいずれかで表される塩基配列の2〜8番目の塩基配列を含む核酸
(f)配列番号940〜945、947、948、952、953、956〜958、960、968、969、973〜978、980、982、984〜1001、1003〜1005、1008〜1009、1012〜1014、1016、1018〜1029、1031、1033〜1059、1064〜1069、1073、1076〜1133、1163〜1188、1232〜1259、1288〜1309、1343〜1354、1479〜1495、1529〜1566、1572〜1576、1585〜1589、1591〜1709、1719〜1744、1765〜1777、1780〜1788、1791〜1829、1898〜1900、1998〜2001、2009〜2050、2052〜2056、2134、2136、2137、2139〜2143、2145〜2151、2153〜2158、2160、2162、2164〜2172、2176〜2188、2190、2191、2193、2197、2200〜2202、2205〜2207、2211、2262〜2265、2268、2271〜2273、2281〜2283、2285〜2292、2295〜2297、2302〜2306、2308〜2314、2324および2325のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(g)配列番号940〜945、947、948、952、953、956〜958、960、968、969、973〜978、980、982、984〜1001、1003〜1005、1008〜1009、1012〜1014、1016、1018〜1029、1031、1033〜1059、1064〜1069、1073、1076〜1133、1163〜1188、1232〜1259、1288〜1309、1343〜1354、1479〜1495、1529〜1566、1572〜1576、1585〜1589、1591〜1709、1719〜1744、1765〜1777、1780〜1788、1791〜1829、1898〜1900、1998〜2001、2009〜2050、2052〜2056、2134、2136、2137、2139〜2143、2145〜2151、2153〜2158、2160、2162、2164〜2172、2176〜2188、2190、2191、2193、2197、2200〜2202、2205〜2207、2211、2262〜2265、2268、2271〜2273、2281〜2283、2285〜2292、2295〜2297、2302〜2306、2308〜2314、2324および2325のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(h)配列番号940〜945、947、948、952、953、956〜958、960、968、969、973〜978、980、982、984〜1001、1003〜1005、1008〜1009、1012〜1014、1016、1018〜1029、1031、1033〜1059、1064〜1069、1073、1076〜1133、1163〜1188、1232〜1259、1288〜1309、1343〜1354、1479〜1495、1529〜1566、1572〜1576、1585〜1589、1591〜1709、1719〜1744、1765〜1777、1780〜1788、1791〜1829、1898〜1900、1998〜2001、2009〜2050、2052〜2056、2134、2136、2137、2139〜2143、2145〜2151、2153〜2158、2160、2162、2164〜2172、2176〜2188、2190、2191、2193、2197、2200〜2202、2205〜2207、2211、2262〜2265、2268、2271〜2273、2281〜2283、2285〜2292、2295〜2297、2302〜2306、2308〜2314、2324および2325のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
(a)配列番号1〜3、5〜7、11、14、15、17、24、25、29〜33、35、37、39〜54、56〜58、61〜63、66〜68、70、72〜82、84、85、87〜112、114〜121、125、128〜167、193〜219、263〜278、306〜324、357〜368、476〜492、522〜557、561〜564、572〜576、578〜683、693〜714、735〜743、746〜751、754〜762、765〜803、853〜855、888〜891、899〜912、914〜926、930〜939、2058、2060、2061、2063〜2065、2067〜2071、2073〜2078、2080、2082、2084〜2092、2096〜2108、2110、2111、2113、2117、2120〜2122、2125〜2128、2132、2212、2213、2216、2219、2220、2227〜2229、2231〜2237、2240〜2243、2248〜2253、2255〜2261、2317および2318のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(b)配列番号1〜3、5〜7、11、14、15、17、24、25、29〜33、35、37、39〜54、56〜58、61〜63、66〜68、70、72〜82、84、85、87〜112、114〜121、125、128〜167、193〜219、263〜278、306〜324、357〜368、476〜492、522〜557、561〜564、572〜576、578〜683、693〜714、735〜743、746〜751、754〜762、765〜803、853〜855、888〜891、899〜912、914〜926、930〜939、2058、2060、2061、2063〜2065、2067〜2071、2073〜2078、2080、2082、2084〜2092、2096〜2108、2110、2111、2113、2117、2120〜2122、2125〜2128、2132、2212、2213、2216、2219、2220、2227〜2229、2231〜2237、2240〜2243、2248〜2253、2255〜2261、2317および2318のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含有する、17〜28塩基の核酸
(c)配列番号1〜3、5〜7、11、14、15、17、24、25、29〜33、35、37、39〜54、56〜58、61〜63、66〜68、70、72〜82、84、85、87〜112、114〜121、125、128〜167、193〜219、263〜278、306〜324、357〜368、476〜492、522〜557、561〜564、572〜576、578〜683、693〜714、735〜743、746〜751、754〜762、765〜803、853〜855、888〜891、899〜912、914〜926、930〜939、2058、2060、2061、2063〜2065、2067〜2071、2073〜2078、2080、2082、2084〜2092、2096〜2108、2110、2111、2113、2117、2120〜2122、2125〜2128、2132、2212、2213、2216、2219、2220、2227〜2229、2231〜2237、2240〜2243、2248〜2253、2255〜2261、2317および2318のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(d)配列番号1〜3、5〜7、11、14、15、17、24、25、29〜33、35、37、39〜54、56〜58、61〜63、66〜68、70、72〜82、84、85、87〜112、114〜121、125、128〜167、193〜219、263〜278、306〜324、357〜368、476〜492、522〜557、561〜564、572〜576、578〜683、693〜714、735〜743、746〜751、754〜762、765〜803、853〜855、888〜891、899〜912、914〜926、930〜939、2058、2060、2061、2063〜2065、2067〜2071、2073〜2078、2080、2082、2084〜2092、2096〜2108、2110、2111、2113、2117、2120〜2122、2125〜2128、2132、2212、2213、2216、2219、2220、2227〜2229、2231〜2237、2240〜2243、2248〜2253、2255〜2261、2317および2318のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
(e)配列番号1〜3、5〜7、11、14、15、17、24、25、29〜33、35、37、39〜54、56〜58、61〜63、66〜68、70、72〜82、84、85、87〜112、114〜121、125、128〜167、193〜219、263〜278、306〜324、357〜368、476〜492、522〜557、561〜564、572〜576、578〜683、693〜714、735〜743、746〜751、754〜762、765〜803、853〜855、888〜891、899〜912、914〜926、930〜939、2058、2060、2061、2063〜2065、2067〜2071、2073〜2078、2080、2082、2084〜2092、2096〜2108、2110、2111、2113、2117、2120〜2122、2125〜2128、2132、2212、2213、2216、2219、2220、2227〜2229、2231〜2237、2240〜2243、2248〜2253、2255〜2261、2317および2318のいずれかで表される塩基配列の2〜8番目の塩基配列を含む核酸
(f)配列番号940〜945、947、948、952、953、956〜958、960、968、969、973〜978、980、982、984〜1001、1003〜1005、1008〜1009、1012〜1014、1016、1018〜1029、1031、1033〜1059、1064〜1069、1073、1076〜1133、1163〜1188、1232〜1259、1288〜1309、1343〜1354、1479〜1495、1529〜1566、1572〜1576、1585〜1589、1591〜1709、1719〜1744、1765〜1777、1780〜1788、1791〜1829、1898〜1900、1998〜2001、2009〜2050、2052〜2056、2134、2136、2137、2139〜2143、2145〜2151、2153〜2158、2160、2162、2164〜2172、2176〜2188、2190、2191、2193、2197、2200〜2202、2205〜2207、2211、2262〜2265、2268、2271〜2273、2281〜2283、2285〜2292、2295〜2297、2302〜2306、2308〜2314、2324および2325のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(g)配列番号940〜945、947、948、952、953、956〜958、960、968、969、973〜978、980、982、984〜1001、1003〜1005、1008〜1009、1012〜1014、1016、1018〜1029、1031、1033〜1059、1064〜1069、1073、1076〜1133、1163〜1188、1232〜1259、1288〜1309、1343〜1354、1479〜1495、1529〜1566、1572〜1576、1585〜1589、1591〜1709、1719〜1744、1765〜1777、1780〜1788、1791〜1829、1898〜1900、1998〜2001、2009〜2050、2052〜2056、2134、2136、2137、2139〜2143、2145〜2151、2153〜2158、2160、2162、2164〜2172、2176〜2188、2190、2191、2193、2197、2200〜2202、2205〜2207、2211、2262〜2265、2268、2271〜2273、2281〜2283、2285〜2292、2295〜2297、2302〜2306、2308〜2314、2324および2325のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(h)配列番号940〜945、947、948、952、953、956〜958、960、968、969、973〜978、980、982、984〜1001、1003〜1005、1008〜1009、1012〜1014、1016、1018〜1029、1031、1033〜1059、1064〜1069、1073、1076〜1133、1163〜1188、1232〜1259、1288〜1309、1343〜1354、1479〜1495、1529〜1566、1572〜1576、1585〜1589、1591〜1709、1719〜1744、1765〜1777、1780〜1788、1791〜1829、1898〜1900、1998〜2001、2009〜2050、2052〜2056、2134、2136、2137、2139〜2143、2145〜2151、2153〜2158、2160、2162、2164〜2172、2176〜2188、2190、2191、2193、2197、2200〜2202、2205〜2207、2211、2262〜2265、2268、2271〜2273、2281〜2283、2285〜2292、2295〜2297、2302〜2306、2308〜2314、2324および2325のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
また細胞の増殖促進剤としては、以下の(i)〜(p)であげられる核酸があげられる。
(i)配列番号4、8〜10、12、13、16、18〜23、26〜28、34、36、38、55、59、60、64、65、69、71、83、86、113、122〜124、126、127、168〜192、220〜262、279〜305、325〜356、369〜475、493〜521、558〜560、565〜571、577、684〜692、715〜734、744、745、752、753、763、764、804〜852、856〜887、892〜898、913、927〜929、2057、2059、2062、2066、2072、2079、2081、2083、2093〜2095、2109、2112、2114〜2116、2118、2119、2123、2124、2129〜2131、2214、2215、2218、2221〜2226、2230、2238、2239、2244〜2247、2254、2315、2316および2319〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(j)配列番号4、8〜10、12、13、16、18〜23、26〜28、34、36、38、55、59、60、64、65、69、71、83、86、113、122〜124、126、127、168〜192、220〜262、279〜305、325〜356、369〜475、493〜521、558〜560、565〜571、577、684〜692、715〜734、744、745、752、753、763、764、804〜852、856〜887、892〜898、913、927〜929、2057、2059、2062、2066、2072、2079、2081、2083、2093〜2095、2109、2112、2114〜2116、2118、2119、2123、2124、2129〜2131、2214、2215、2218、2221〜2226、2230、2238、2239、2244〜2247、2254、2315、2316および2319〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含有する、17〜28塩基の核酸
(k)配列番号4、8〜10、12、13、16、18〜23、26〜28、34、36、38、55、59、60、64、65、69、71、83、86、113、122〜124、126、127、168〜192、220〜262、279〜305、325〜356、369〜475、493〜521、558〜560、565〜571、577、684〜692、715〜734、744、745、752、753、763、764、804〜852、856〜887、892〜898、913、927〜929、2057、2059、2062、2066、2072、2079、2081、2083、2093〜2095、2109、2112、2114〜2116、2118、2119、2123、2124、2129〜2131、2214、2215、2218、2221〜2226、2230、2238、2239、2244〜2247、2254、2315、2316および2319〜2321のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(l)配列番号4、8〜10、12、13、16、18〜23、26〜28、34、36、38、55、59、60、64、65、69、71、83、86、113、122〜124、126、127、168〜192、220〜262、279〜305、325〜356、369〜475、493〜521、558〜560、565〜571、577、684〜692、715〜734、744、745、752、753、763、764、804〜852、856〜887、892〜898、913、927〜929、2057、2059、2062、2066、2072、2079、2081、2083、2093〜2095、2109、2112、2114〜2116、2118、2119、2123、2124、2129〜2131、2214、2215、2218、2221〜2226、2230、2238、2239、2244〜2247、2254、2315、2316および2319〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
(m)配列番号4、8〜10、12、13、16、18〜23、26〜28、34、36、38、55、59、60、64、65、69、71、83、86、113、122〜124、126、127、168〜192、220〜262、279〜305、325〜356、369〜475、493〜521、558〜560、565〜571、577、684〜692、715〜734、744、745、752、753、763、764、804〜852、856〜887、892〜898、913、927〜929、2057、2059、2062、2066、2072、2079、2081、2083、2093〜2095、2109、2112、2114〜2116、2118、2119、2123、2124、2129〜2131、2214、2215、2218、2221〜2226、2230、2238、2239、2244〜2247、2254、2315、2316および2319〜2321のいずれかで表される塩基配列の2〜8番目の塩基配列を含む核酸
(n)配列番号946、949〜951、954、955、959、961〜967、970〜972、979、981、983、1002、1006、1007、1010、1011、1015、1017、1030、1032、1060〜1063、1070〜1072、1074、1075、1134〜1162、1189〜1231、1260〜1287、1310〜1342、1355〜1478、1496〜1528、1567〜1571、1577〜1584、1590、1710〜1718、1745〜1764、1778、1779、1789、1790、1830〜1897、1901〜1997、2002〜2008、2051、2133、2135、2138、2144、2152、2159、2161、2163、2173〜2175、2189、2192、2194〜2196、2198、2199、2203、2204、2208〜2210、2266、2267、2270、2274〜2280、2284、2293、2294、2298〜2301、2307、2322、2323および2326〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(o)配列番号946、949〜951、954、955、959、961〜967、970〜972、979、981、983、1002、1006、1007、1010、1011、1015、1017、1030、1032、1060〜1063、1070〜1072、1074、1075、1134〜1162、1189〜1231、1260〜1287、1310〜1342、1355〜1478、1496〜1528、1567〜1571、1577〜1584、1590、1710〜1718、1745〜1764、1778、1779、1789、1790、1830〜1897、1901〜1997、2002〜2008、2051、2133、2135、2138、2144、2152、2159、2161、2163、2173〜2175、2189、2192、2194〜2196、2198、2199、2203、2204、2208〜2210、2266、2267、2270、2274〜2280、2284、2293、2294、2298〜2301、2307、2322、2323および2326〜2328のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(p)配列番号946、949〜951、954、955、959、961〜967、970〜972、979、981、983、1002、1006、1007、1010、1011、1015、1017、1030、1032、1060〜1063、1070〜1072、1074、1075、1134〜1162、1189〜1231、1260〜1287、1310〜1342、1355〜1478、1496〜1528、1567〜1571、1577〜1584、1590、1710〜1718、1745〜1764、1778、1779、1789、1790、1830〜1897、1901〜1997、2002〜2008、2051、2133、2135、2138、2144、2152、2159、2161、2163、2173〜2175、2189、2192、2194〜2196、2198、2199、2203、2204、2208〜2210、2266、2267、2270、2274〜2280、2284、2293、2294、2298〜2301、2307、2322、2323および2326〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
(i)配列番号4、8〜10、12、13、16、18〜23、26〜28、34、36、38、55、59、60、64、65、69、71、83、86、113、122〜124、126、127、168〜192、220〜262、279〜305、325〜356、369〜475、493〜521、558〜560、565〜571、577、684〜692、715〜734、744、745、752、753、763、764、804〜852、856〜887、892〜898、913、927〜929、2057、2059、2062、2066、2072、2079、2081、2083、2093〜2095、2109、2112、2114〜2116、2118、2119、2123、2124、2129〜2131、2214、2215、2218、2221〜2226、2230、2238、2239、2244〜2247、2254、2315、2316および2319〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(j)配列番号4、8〜10、12、13、16、18〜23、26〜28、34、36、38、55、59、60、64、65、69、71、83、86、113、122〜124、126、127、168〜192、220〜262、279〜305、325〜356、369〜475、493〜521、558〜560、565〜571、577、684〜692、715〜734、744、745、752、753、763、764、804〜852、856〜887、892〜898、913、927〜929、2057、2059、2062、2066、2072、2079、2081、2083、2093〜2095、2109、2112、2114〜2116、2118、2119、2123、2124、2129〜2131、2214、2215、2218、2221〜2226、2230、2238、2239、2244〜2247、2254、2315、2316および2319〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含有する、17〜28塩基の核酸
(k)配列番号4、8〜10、12、13、16、18〜23、26〜28、34、36、38、55、59、60、64、65、69、71、83、86、113、122〜124、126、127、168〜192、220〜262、279〜305、325〜356、369〜475、493〜521、558〜560、565〜571、577、684〜692、715〜734、744、745、752、753、763、764、804〜852、856〜887、892〜898、913、927〜929、2057、2059、2062、2066、2072、2079、2081、2083、2093〜2095、2109、2112、2114〜2116、2118、2119、2123、2124、2129〜2131、2214、2215、2218、2221〜2226、2230、2238、2239、2244〜2247、2254、2315、2316および2319〜2321のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(l)配列番号4、8〜10、12、13、16、18〜23、26〜28、34、36、38、55、59、60、64、65、69、71、83、86、113、122〜124、126、127、168〜192、220〜262、279〜305、325〜356、369〜475、493〜521、558〜560、565〜571、577、684〜692、715〜734、744、745、752、753、763、764、804〜852、856〜887、892〜898、913、927〜929、2057、2059、2062、2066、2072、2079、2081、2083、2093〜2095、2109、2112、2114〜2116、2118、2119、2123、2124、2129〜2131、2214、2215、2218、2221〜2226、2230、2238、2239、2244〜2247、2254、2315、2316および2319〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
(m)配列番号4、8〜10、12、13、16、18〜23、26〜28、34、36、38、55、59、60、64、65、69、71、83、86、113、122〜124、126、127、168〜192、220〜262、279〜305、325〜356、369〜475、493〜521、558〜560、565〜571、577、684〜692、715〜734、744、745、752、753、763、764、804〜852、856〜887、892〜898、913、927〜929、2057、2059、2062、2066、2072、2079、2081、2083、2093〜2095、2109、2112、2114〜2116、2118、2119、2123、2124、2129〜2131、2214、2215、2218、2221〜2226、2230、2238、2239、2244〜2247、2254、2315、2316および2319〜2321のいずれかで表される塩基配列の2〜8番目の塩基配列を含む核酸
(n)配列番号946、949〜951、954、955、959、961〜967、970〜972、979、981、983、1002、1006、1007、1010、1011、1015、1017、1030、1032、1060〜1063、1070〜1072、1074、1075、1134〜1162、1189〜1231、1260〜1287、1310〜1342、1355〜1478、1496〜1528、1567〜1571、1577〜1584、1590、1710〜1718、1745〜1764、1778、1779、1789、1790、1830〜1897、1901〜1997、2002〜2008、2051、2133、2135、2138、2144、2152、2159、2161、2163、2173〜2175、2189、2192、2194〜2196、2198、2199、2203、2204、2208〜2210、2266、2267、2270、2274〜2280、2284、2293、2294、2298〜2301、2307、2322、2323および2326〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(o)配列番号946、949〜951、954、955、959、961〜967、970〜972、979、981、983、1002、1006、1007、1010、1011、1015、1017、1030、1032、1060〜1063、1070〜1072、1074、1075、1134〜1162、1189〜1231、1260〜1287、1310〜1342、1355〜1478、1496〜1528、1567〜1571、1577〜1584、1590、1710〜1718、1745〜1764、1778、1779、1789、1790、1830〜1897、1901〜1997、2002〜2008、2051、2133、2135、2138、2144、2152、2159、2161、2163、2173〜2175、2189、2192、2194〜2196、2198、2199、2203、2204、2208〜2210、2266、2267、2270、2274〜2280、2284、2293、2294、2298〜2301、2307、2322、2323および2326〜2328のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(p)配列番号946、949〜951、954、955、959、961〜967、970〜972、979、981、983、1002、1006、1007、1010、1011、1015、1017、1030、1032、1060〜1063、1070〜1072、1074、1075、1134〜1162、1189〜1231、1260〜1287、1310〜1342、1355〜1478、1496〜1528、1567〜1571、1577〜1584、1590、1710〜1718、1745〜1764、1778、1779、1789、1790、1830〜1897、1901〜1997、2002〜2008、2051、2133、2135、2138、2144、2152、2159、2161、2163、2173〜2175、2189、2192、2194〜2196、2198、2199、2203、2204、2208〜2210、2266、2267、2270、2274〜2280、2284、2293、2294、2298〜2301、2307、2322、2323および2326〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
上記核酸は、マイクロRNAまたはマイクロRNA前駆体が好適に用いられる。
細胞の増殖促進剤としては上記(a)〜(h)に記載の核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸があげられ、細胞の増殖抑制剤としては上記(i)〜(p)に記載の核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸があげられる。また上記の核酸や、これらと相補的な核酸を発現するベクターを細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤として用いることもできる。
細胞の増殖促進剤としては上記(a)〜(h)に記載の核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸があげられ、細胞の増殖抑制剤としては上記(i)〜(p)に記載の核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸があげられる。また上記の核酸や、これらと相補的な核酸を発現するベクターを細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤として用いることもできる。
一方、上記マイクロRNAなどの核酸の標的遺伝子の発現を抑制する物質や、該標的遺伝子の発現を促進する物質を細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤として用いることもできる。この物質として核酸やこれを発現するベクターを用いることもできる。また標的遺伝子の発現を抑制する物質としては、該標的遺伝子のmRNAに対するsiRNAや該標的遺伝子に対するアンチセンスがあげられ、標的遺伝子の発現を促進する物質としては、該標的遺伝子特異的なマイクロRNAに対するsiRNAや、該標的遺伝子に対するアンチセンスがあげられる。
細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤の製剤形態や、投与方法などについては、10で後述するマイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を含有する診断薬および治療薬と同様である。
10.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を含有する診断薬および治療薬
マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸は、標的配列を有する遺伝子の発現を制御したり、マイクロRNAなどの核酸の発現を制御することにより、癌等の細胞の増殖異常等に起因する疾患の治療薬として利用することができる。さらに、該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAは、当該遺伝子の発現を制御することにより、細胞の増殖または分化の異常等に起因する疾患の治療薬として利用することができる。細胞の増殖異常等に起因する疾患としては、癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎および自己免疫疾患等をあげることができる。
10.マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸を含有する診断薬および治療薬
マイクロRNAやマイクロRNA前駆体などの核酸は、標的配列を有する遺伝子の発現を制御したり、マイクロRNAなどの核酸の発現を制御することにより、癌等の細胞の増殖異常等に起因する疾患の治療薬として利用することができる。さらに、該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAは、当該遺伝子の発現を制御することにより、細胞の増殖または分化の異常等に起因する疾患の治療薬として利用することができる。細胞の増殖異常等に起因する疾患としては、癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎および自己免疫疾患等をあげることができる。
また、核酸の定量または変異の検出により、癌等の細胞の増殖または分化の異常等に起因する疾患の診断をすることができる。
核酸を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、核酸の定量あるいは変異の検出を行うために必要な試薬、例えば緩衝剤、塩、反応用酵素、核酸と結合する標識された蛋白、および検出用発色剤等を含んでもよい。
核酸を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、核酸の定量あるいは変異の検出を行うために必要な試薬、例えば緩衝剤、塩、反応用酵素、核酸と結合する標識された蛋白、および検出用発色剤等を含んでもよい。
核酸を有効成分として含有する治療薬は、単独で投与することもできるが、通常は薬理学的に許容される1つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与するのが望ましい。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。核酸またはマイクロRNA前駆体、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人1日当たり10 μg/kg〜20 mg/kgである。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人1日当たり10 μg/kg〜20 mg/kgである。
また、核酸を有効成分として含有する治療薬は、核酸を発現するベクターと核酸治療薬に用いる基剤とを調合することにより製造することもできる[Nature Genet., 8, 42(1994)]。
治療薬剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、pH調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。治療剤は、治療の直前に液体の場合はそのままで、個体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に溶解して治療に使用することができる。
治療薬剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、pH調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。治療剤は、治療の直前に液体の場合はそのままで、個体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に溶解して治療に使用することができる。
核酸を発現するベクターは、上記5の方法で作製した組換えウィルスベクターウィルスベクターをあげることができ、より具体的には、レトロウィルスベクター及びレンチウィルスベクター等をあげることができる。
例えば、核酸を、アデノウィルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウィルスベクターに結合させることにより、ウィルスベクターを調製することができる。該ウィルスベクターは安定に目的の細胞に到達し、エンドソームによる細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され核酸を効率的に発現させることができる。
例えば、核酸を、アデノウィルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウィルスベクターに結合させることにより、ウィルスベクターを調製することができる。該ウィルスベクターは安定に目的の細胞に到達し、エンドソームによる細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され核酸を効率的に発現させることができる。
また、(-)鎖RNAウィルスであるセンダイウィルスをベースにしたウィルスベクターも開発されており(WO97/16538、WO97/16539)、当該センダイウィルスを用いて、核酸を組み込んだセンダイウィルスを作製することができる。
核酸は、非ウィルス核酸移入法によっても移入することができる。例えば、リン酸カルシウム共沈法[Virology, 52, 456-467 (1973);Science, 209, 1414-1422 (1980)]、マイクロインジェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5399-5403 (1980);Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7380-7384 (1980);Cell, 27, 223-231 (1981);Nature, 294, 92-94 (1981)]、リポソームを介した膜融合-介在移入法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987);Biochemistry, 28, 9508-9514 (1989);J. Biol. Chem., 264, 12126-12129 (1989);Hum. Gene Ther., 3, 267-275 (1992);Science, 249, 1285-1288 (1990);Circulation, 83, 2007-2011 (1992)]あるいは直接DNA取り込みおよび受容体-媒介DNA移入法[Science, 247, 1465-1468 (1990);J. Biol. Chem., 266, 14338-14342 (1991);Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3655-3659 (1991);J. Biol. Chem., 264,
16985-16987 (1989);BioTechniques, 11, 474-485 (1991);Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3410-3414 (1990);Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4255-4259 (1991);Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 4033-4037 (1990);Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8850-8854 (1991);Hum. Gene Ther., 3, 147-154 (1991)]等により移入することができる。
核酸は、非ウィルス核酸移入法によっても移入することができる。例えば、リン酸カルシウム共沈法[Virology, 52, 456-467 (1973);Science, 209, 1414-1422 (1980)]、マイクロインジェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5399-5403 (1980);Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7380-7384 (1980);Cell, 27, 223-231 (1981);Nature, 294, 92-94 (1981)]、リポソームを介した膜融合-介在移入法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987);Biochemistry, 28, 9508-9514 (1989);J. Biol. Chem., 264, 12126-12129 (1989);Hum. Gene Ther., 3, 267-275 (1992);Science, 249, 1285-1288 (1990);Circulation, 83, 2007-2011 (1992)]あるいは直接DNA取り込みおよび受容体-媒介DNA移入法[Science, 247, 1465-1468 (1990);J. Biol. Chem., 266, 14338-14342 (1991);Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3655-3659 (1991);J. Biol. Chem., 264,
16985-16987 (1989);BioTechniques, 11, 474-485 (1991);Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3410-3414 (1990);Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4255-4259 (1991);Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 4033-4037 (1990);Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8850-8854 (1991);Hum. Gene Ther., 3, 147-154 (1991)]等により移入することができる。
リポソームを介した膜融合−介在移入法は、リポソーム調製物を目的とする組織に直接投与することにより、核酸を当該組織の局所に取り込み、および発現させることができる[Hum. Gene Ther., 3, 399 (1992)]。DNAを病巣に直接ターゲッティングするには、直接DNA取り込み技術が好ましい。
受容体−媒介DNA移入は、例えば、ポリリジンを介して、蛋白質リガンドにDNA(通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる)を結合することによって行う方法をあげることができる。リガンドは、目的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−DNAコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびDNA−蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。DNAの細胞内破壊を防止するために、アデノウィルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
11.癌細胞や他の細胞の増殖を測定する方法
細胞増殖の測定法としては、細胞数や細胞増殖速度を反映する指標を測定できる方法であれば特に限定されない。生細胞数測定、DNA合成速度測定、総蛋白質量測定などを用いることができる。生細胞数を評価する方法としては、細胞中のATP量を測定する方法があげられる。細胞中のATP量は培養下の細胞数と比例関係にあることが知られている(J. Immunol. Meth., 160, 81-88 (1993))。細胞中のATP量測定のより具体的な方法は、MTT法、XTT法などがあげられる(J. Immunol. Meth., 65, 55-63 (1983))。また、ATP依存性酵素ルシフェラーゼによるルシフェリン基質の発光にてATPを測定する方法もあげられる。細胞中のATP量の測定キットとして、例えばCellTite-GloR Luminescent Cell viability Assay(Promega社製)等を用いてもよい。
12.癌細胞の細胞死の程度を測定する方法
細胞死の程度を測定する方法としては、死細胞をPropium Iodide等の色素で染色する方法や、細胞死に伴い細胞外に漏出した酵素の活性を測定する方法等を用いることができる。後者については、例えば細胞外に漏出したアデニル酸キナーゼの酵素活性を測定する方法が利用できる。より具体的には、ToxiLight Non-Destructive Cytotoxicity BioAssay Kit (Lonza社製)等を用いてもよい。
受容体−媒介DNA移入は、例えば、ポリリジンを介して、蛋白質リガンドにDNA(通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる)を結合することによって行う方法をあげることができる。リガンドは、目的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−DNAコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびDNA−蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。DNAの細胞内破壊を防止するために、アデノウィルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
11.癌細胞や他の細胞の増殖を測定する方法
細胞増殖の測定法としては、細胞数や細胞増殖速度を反映する指標を測定できる方法であれば特に限定されない。生細胞数測定、DNA合成速度測定、総蛋白質量測定などを用いることができる。生細胞数を評価する方法としては、細胞中のATP量を測定する方法があげられる。細胞中のATP量は培養下の細胞数と比例関係にあることが知られている(J. Immunol. Meth., 160, 81-88 (1993))。細胞中のATP量測定のより具体的な方法は、MTT法、XTT法などがあげられる(J. Immunol. Meth., 65, 55-63 (1983))。また、ATP依存性酵素ルシフェラーゼによるルシフェリン基質の発光にてATPを測定する方法もあげられる。細胞中のATP量の測定キットとして、例えばCellTite-GloR Luminescent Cell viability Assay(Promega社製)等を用いてもよい。
12.癌細胞の細胞死の程度を測定する方法
細胞死の程度を測定する方法としては、死細胞をPropium Iodide等の色素で染色する方法や、細胞死に伴い細胞外に漏出した酵素の活性を測定する方法等を用いることができる。後者については、例えば細胞外に漏出したアデニル酸キナーゼの酵素活性を測定する方法が利用できる。より具体的には、ToxiLight Non-Destructive Cytotoxicity BioAssay Kit (Lonza社製)等を用いてもよい。
また、細胞死の中でも特に癌との関係で重要なアポトーシス(programmed cell death)に限定してその程度を測定することもできる。細胞のアポトーシスを評価する方法としては、DNAの断片化の程度を測定する方法や、細胞膜の構成脂質の変化を測定する方法、アポトーシスに伴って誘導される細胞中のプロテアーゼであるカスパーゼ3/7活性を測定する方法があげられる。細胞中のカスパーゼ3/7活性測定のより具体的な方法は、カスパーゼ3/7活性により遊離されたルシフェリン基質を、ルシフェラーゼ酵素反応によるルシフェリン発光にて測定する方法があげられる。細胞中のカスパーゼ3/7活性の測定キットとして、例えばCaspase-GloR3/7 Assay(Promega社製)等を用いてもよい。
以下に実施例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
マイクロRNAを強制発現させた大腸癌由来細胞株における生細胞率、アポトーシス活性
Pre-miRTMmiRNA Precursor Molecules(Ambion社製)を大腸癌由来細胞株に導入し、該分子から生成されるマイクロRNAが生細胞率、アポトーシス活性に及ぼす影響を調べた。
DLD-1ヒト大腸癌由来細胞株(以下、DLD-1と称す)はAmerican Type Culture Collection(以下、ATCCと称す)より入手し、10%ウシ胎児血清(FBS、JRH Biosciences社製)を含むRPMI1640培地(Invitrogen社製)で37℃の5%CO2濃度のインキュベーター中で培養した。
Pre-miRTMmiRNA Precursor Molecules(Ambion社製)を大腸癌由来細胞株に導入し、該分子から生成されるマイクロRNAが生細胞率、アポトーシス活性に及ぼす影響を調べた。
DLD-1ヒト大腸癌由来細胞株(以下、DLD-1と称す)はAmerican Type Culture Collection(以下、ATCCと称す)より入手し、10%ウシ胎児血清(FBS、JRH Biosciences社製)を含むRPMI1640培地(Invitrogen社製)で37℃の5%CO2濃度のインキュベーター中で培養した。
DLD-1を96穴プレートに1穴あたり2500個になるように播種し、10% FBSを含むRPMI培地で一晩培養した。1日後、hsa-miR-7(配列番号3), 15a, 15b, 16, 18a(配列番号5), 18a*(配列番号7), 28(配列番号17), 95(配列番号24), 124a, 132(配列番号29), 133a(配列番号31), 133b(配列番号32), 147(配列番号37), 181b, 181c(配列番号39), 181d(配列番号40), 184(配列番号43), 192(配列番号44), 193a(配列番号46), 193b(配列番号47), 195(配列番号48), 196a(配列番号51), 196b(配列番号52), 197(配列番号53), 202(配列番号56), 204(配列番号57), 211(配列番号58), 212(配列番号30), 215(配列番号45), 299-3p(配列番号62), 299-5p(配列番号63), 324-3p(配列番号66), 337(配列番号70), 342(配列番号72), 362(配列番号74), 368(配列番号75), 376a(配列番号77), 376b(配列番号78), 380-5p(配列番号81), 422a(配列番号84), 422b(配列番号85), 424(配列番号49), 432*(配列番号88), 452(配列番号92), 452*(配列番号93), 455(配列番号94), 483(配列番号95), 489(配列番号98), 491(配列番号99), 493-5p(配列番号100), 494(配列番号101), 497(配列番号50), 501(配列番号102), 504(配列番号103), 506(配列番号105), 512-3p(配列番号110), 512-5p(配列番号111), 517*(配列番号114), 517b(配列番号117), 517c(配列番号116), 518b(配列番号118), 518c*(配列番号121), 518d(配列番号120), 523(配列番号125), 527(配列番号129), let-7g, let-7iを生成するPre-miRTMmiRNA Precursor Moleculesを、リポフェクション法、具体的には、Lipofectamine2000(Invitrogen社製)を用いた方法により、終濃度が5nMあるいは25nMとなるようにDLD-1に導入した。また、Pre-miR・miRNA Precursor Molecules-Negative Control #2(以下、miR-negacon#2と称す)(Ambion社製)もDLD-1に導入し、陰性コントロールとした。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
リポフェクション法により該分子を導入した3日後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay(Promega社製)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い生細胞率を測定した。対照区(Lipofectamine2000のみ)のDLD-1の生細胞率を1.0として、それぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表5に示したように、hsa-miR-7, 28, 95, 147, 181d, 192, 193a, 193b, 195, 196a, 197, 211, 215, 299-3p, 299-5p, 337, 342, 362, 368, 376a, 376b, 380-5p, 422b, 432*, 452, 483, 489, 491, 493-5p, 494, 501, 506, 517c, 518b, 518dを生成する分子を導入することにより、40%以上の生細胞率の減少が認められた。癌との関連が知られているhsa-miR-15b, 124aを生成する分子を導入することにより、40%以上の生細胞率の減少が認められた。
リポフェクション法により該分子を導入した3日あるいは5日後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay(Promega社製)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い生細胞率を測定した。miR-negacon#2導入区のDLD-1の生細胞率を1.0として、それぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表7に示したように、hsa-miR-7, 24, 28, 95, 132, 134, 142-3p, 147, 182*, 183, 192, 197, 211, 222, 299-3p, 329, 337, 342, 362, 368, 376a, 376b, 377, 380-5p, 422b, 424, 431, 432*, 452, 452*, 455, 483, 485-5p, 489, 491, 493-5p, 494, 505, 506, 509, 510, 517a, 517cを生成する分子を導入することにより、50%以上の生細胞活性の減少が認められた。また、癌との関連が知られているhsa-miR-34c, 181a, 124aを生成する分子を導入することにより、50%以上の生細胞率の減少が認められた。
リポフェクション法により該アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した3日後、CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay(Promega社製)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い生細胞率を測定した。anti-miR-negacon#1導入区のDLD-1の生細胞率を1.0として、それぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表8に示したように、hsa-miR-197, 483を相補するアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することにより、50%以上の生細胞率の減少が認められた。
マイクロRNAを強制発現させた卵巣癌由来細胞株における生細胞率、アポトーシス活性
Pre-miRTMmiRNA Precursor Molecules(Ambion社製)を卵巣癌由来細胞株に導入し、該分子から生成されるマイクロRNAが生細胞率、アポトーシス活性に及ぼす影響を調べた。
A2780ヒト卵巣癌由来細胞株(Nature, 295, 116-119, (1982); Science, 224, 994-996, (1984); Semin. Oncol., 11, 285-298 (1984); 以下,A2780と称す)は5%FBS(JRH Biosciences社製)を含むRPMI1640培地(Invitrogen社製)で37℃の5%CO2濃度のインキュベーター中で培養した。
Pre-miRTMmiRNA Precursor Molecules(Ambion社製)を卵巣癌由来細胞株に導入し、該分子から生成されるマイクロRNAが生細胞率、アポトーシス活性に及ぼす影響を調べた。
A2780ヒト卵巣癌由来細胞株(Nature, 295, 116-119, (1982); Science, 224, 994-996, (1984); Semin. Oncol., 11, 285-298 (1984); 以下,A2780と称す)は5%FBS(JRH Biosciences社製)を含むRPMI1640培地(Invitrogen社製)で37℃の5%CO2濃度のインキュベーター中で培養した。
A2780を96穴プレートに1穴あたり2500個になるように播種し、10%FBSを含むRPMI培地で一晩培養した。1日後、hsa-miR-1(配列番号1), 7(配列番号3), 15a, 15b, 16, 18a(配列番号5), 18a*(配列番号7), 18b(配列番号6), 28(配列番号17), 34b, 95(配列番号24), 98(配列番号25), 124a, 133a(配列番号31), 133b(配列番号32), 143, 145, 147(配列番号37), 181c(配列番号39), 192(配列番号44), 193a(配列番号46), 193b(配列番号47), 195(配列番号48), 196a(配列番号51), 196b(配列番号52), 197(配列番号53), 199a*(配列番号54), 202(配列番号56), 204(配列番号57), 211(配列番号58), 212(配列番号30), 215(配列番号45), 299-3p(配列番号62), 324-3p(配列番号66), 324-5p(配列番号67), 337(配列番号70), 342(配列番号72), 346(配列番号73), 362(配列番号74), 368(配列番号75), 376a(配列番号77), 376b(配列番号78), 378(配列番号80), 380-5p(配列番号81), 382(配列番号82), 422a(配列番号84), 422b(配列番号85), 424(配列番号49), 432*(配列番号88), 451(配列番号91), 452(配列番号92), 452*(配列番号93), 455(配列番号94), 483(配列番号95), 489(配列番号98), 491(配列番号99), 493-5p(配列番号100), 494(配列番号101), 497(配列番号50), 501(配列番号102), 504(配列番号103), 506(配列番号105), 511(配列番号109), 512-5p(配列番号111), 517a(配列番号115), 517c(配列番号116), 518b(配列番号118), 518c(配列番号119), 518c*(配列番号121), 518d(配列番号120), 527(配列番号129), let-7a, let-7b, let-7d, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g, let-7iを生成するPre-miRTM miRNA Precursor Moleculesを、リポフェクション法、具体的には、Lipofectamine2000(Invitrogen社製)を用いて、終濃度が5nMあるいは25nMとなるようA2780に導入した。また、miR-negacon#2(Ambion社製)もA2780に導入し、陰性コントロールとした。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
リポフェクション法により該分子を導入した3日後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay(Promega社製)を用いて製品に添付された説明書に記載された方法に従い生細胞率を測定した。対照区(Lipofectamine2000のみ)のA2780の生細胞率を1.0として、それぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表9(表9−1および表9−2)に示したように、hsa-miR-1, 7, 18a, 18a*, 18b, 28, 95, 98, 133a, 133b, 147, 181c, 192, 193a, 193b, 195, 196a, 196b, 197, 199a*, 202, 204, 211, 212, 215, 299-3p, 324-3p, 324-5p, 342, 346, 362, 368, 376a, 376b, 378, 380-5p, 382, 422a, 422b, 424, 432*, 451, 452, 452*, 455, 483, 489, 491, 493-5p, 494, 497, 501, 504, 506, 511, 512-5p, 517a, 517c, 518b, 518c, 518c*, 518d, 527を生成する分子を導入することにより、40%以上の生細胞活性の減少が認められた。また、癌との関連が知られているhsa-miR-15a, 15b, 16, 34b, 124a, 143, 145, let-7a, let-7b, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g, let-7iを生成する分子を導入することにり、40%以上の生細胞率の減少が認められた。
リポフェクション法により該分子を導入した3日あるいは5日後、CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay(Promega社製)を用いて製品に添付された説明書に記載された方法に従い生細胞率を測定した。miR-negacon#2導入区のA2780の生細胞率を1.0として、それぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表11(表11−1および表11−2)に示したように、hsa-miR-7, 18a*, 24, 26a, 26b, 134, 147, 192, 193a, 193b, 196a, 196b, 197, 199a*, 204, 206, 211, 212, 215, 346, 368, 371, 376b, 378, 422a, 424, 431, 432*, 433, 449, 452, 483, 485-5p, 488, 489, 491, 493-5p, 497, 504, 505, 506, 507, 510, 511, 512-5p, 513, 517a, 517c, 518b, 518c, 518d, 526a, 527を生成する分子を導入することにより、50%以上の生細胞率の減少が認められた。また、癌との関連が知られているhsa-miR-15a, 15b, 34a, 34b, 34c, 124a, let-7b, let-7c, let-7iのマイクロRNA前駆体を導入することにより、50%以上の生細胞率の減少が認められた。逆に、hsa-miR-130a, 130b, 301を生成する分子を導入することにより、生細胞率の増加が認められた。
リポフェクション法により該アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した3日後、CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay(Promega社製)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い生細胞率を測定した。anti-miR-negacon#1導入区のA2780の生細胞率を1.0として、それぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表12に示したように、hsa-miR-10a, 20b, 25, 27b, 29a, 29c, 30b, 30c, 32, 93, 106a, 106b, 137, 146a, 149, 191, 195, 200a, 204, 205, 208, 212, 215, 301, 302a*, 302b*, 302d, 324-3p, 331, 340, 362, 412, 423, 451, 452, 483, 516-5p, 518e, 518f, 520h, 524*, 525を相補するアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することにより、40%以上の生細胞率の減少が認められた。
マイクロRNAを強制発現させた前立腺癌由来細胞株における生細胞率、アポトーシス活性
Pre-miRTM miRNA Precursor Molecules(Ambion社製)を前立腺癌由来細胞株に導入し、該分子から生成されるマイクロRNAが生細胞率、アポトーシス活性に及ぼす影響を調べた。
Pre-miRTM miRNA Precursor Molecules(Ambion社製)を前立腺癌由来細胞株に導入し、該分子から生成されるマイクロRNAが生細胞率、アポトーシス活性に及ぼす影響を調べた。
PC-3ヒト前立腺癌由来細胞株(以下、PC-3と称す)はATCCより入手し、10%ウシ胎児血清(FBS)(JRH Biosciences社製)を含むF-12 Kaighn’s培地(Invitrogen社製)で37℃の5%CO2濃度のインキュベーター中で培養した。
PC-3を96穴プレートに1穴あたり3000個になるように播種し、10% FBSを含むF-12 Kaighn’s培地で一晩培養した。1日後、hsa-miR-15a, 15b, 16, 18a*(配列番号7), 34b, 124a, 133b(配列番号32), 181b, 192(配列番号44), 195(配列番号48), 196b(配列番号52), 324-3p(配列番号66), 337(配列番号70), 362(配列番号74), 368(配列番号75), 376b(配列番号78), 380-5p(配列番号81), 432*(配列番号88), 452(配列番号92), 452*(配列番号93), 489(配列番号98), 491(配列番号99), 493-5p(配列番号100), 494(配列番号101) を生成するPre-miRTM miRNA Precursor Moleculesを、リポフェクション法、具体的には、Lipofectamine2000(Invitrogen社製)を用いて、終濃度が25nMとなるようPC-3に導入した。また、miR-negacon#2(Ambion社製)もPC-3に導入し、陰性コントロールとした。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
PC-3を96穴プレートに1穴あたり3000個になるように播種し、10% FBSを含むF-12 Kaighn’s培地で一晩培養した。1日後、hsa-miR-15a, 15b, 16, 18a*(配列番号7), 34b, 124a, 133b(配列番号32), 181b, 192(配列番号44), 195(配列番号48), 196b(配列番号52), 324-3p(配列番号66), 337(配列番号70), 362(配列番号74), 368(配列番号75), 376b(配列番号78), 380-5p(配列番号81), 432*(配列番号88), 452(配列番号92), 452*(配列番号93), 489(配列番号98), 491(配列番号99), 493-5p(配列番号100), 494(配列番号101) を生成するPre-miRTM miRNA Precursor Moleculesを、リポフェクション法、具体的には、Lipofectamine2000(Invitrogen社製)を用いて、終濃度が25nMとなるようPC-3に導入した。また、miR-negacon#2(Ambion社製)もPC-3に導入し、陰性コントロールとした。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
リポフェクション法により該分子を導入した3日後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay(Promega社製)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い生細胞率を測定した。対照区(Lipofectamine2000のみ)のPC-3の生細胞率を1.0として、それぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表13に示したように、hsa-miR-18a*, 133b, 192, 195, 196b, 324-3p, 337, 362, 368, 376b, 380-5p, 432*, 452, 452*, 489, 491, 493-5p, 494を生成する分子を導入することにより、40%以上の生細胞率の減少が認められた。また、癌との関連が知られているhsa-miR-15a, 15b, 16, 34b, 124a, 181bを生成する分子を導入することにより、40%以上の生細胞率の減少が認められた。
マイクロRNAを強制発現させた大腸癌由来細胞株(DLD-1)におけるBrdU取り込み活性
Pre-miRTMmiRNA Precursor Molecules(Ambion社製)をDLD-1に導入し、該分子から生成されるマイクロRNAがBrdU取り込み活性に及ぼす影響を調べた。
DLD-1を96穴プレートに1穴あたり2500個になるように播種し、10% FBSを含むRPMI培地で一晩培養した。1日後、hsa-miR-147(配列番号37), 342(配列番号72), 362(配列番号74), 376b(配列番号78), 483(配列番号95), 494(配列番号101)を生成するPre-miRTM miRNA Precursor Moleculesを、リポフェクション法、具体的には、Lipofectamine2000(Invitrogen社製)を用いて、終濃度が25nMとなるようDLD-1に導入した。また、miR-negacon#2(Ambion社製)もDLD-1に導入し、陰性コントロールとした。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
Pre-miRTMmiRNA Precursor Molecules(Ambion社製)をDLD-1に導入し、該分子から生成されるマイクロRNAがBrdU取り込み活性に及ぼす影響を調べた。
DLD-1を96穴プレートに1穴あたり2500個になるように播種し、10% FBSを含むRPMI培地で一晩培養した。1日後、hsa-miR-147(配列番号37), 342(配列番号72), 362(配列番号74), 376b(配列番号78), 483(配列番号95), 494(配列番号101)を生成するPre-miRTM miRNA Precursor Moleculesを、リポフェクション法、具体的には、Lipofectamine2000(Invitrogen社製)を用いて、終濃度が25nMとなるようDLD-1に導入した。また、miR-negacon#2(Ambion社製)もDLD-1に導入し、陰性コントロールとした。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
リポフェクション法により該分子を導入した1日後、BrdUラベリング&ディテクションキットIII(Roche社製)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従いBrdU取り込み活性を測定した。miR-negacon#2導入区のDLD-1のBrdU取り込み活性を1.0として、それぞれの相対BrdU取り込み活性を計算した。その結果、表15に示したように、hsa-miR-147, 342, 362, 376b, 483, 494を生成する分子を導入することにより、40%以上のBrdU取り込み活性の減少が認められた。
Pre-miRTMmiRNA Precursor Molecules(Ambion社製)をA2780に導入し、該分子から生成されるマイクロRNAがBrdU取り込み活性に及ぼす影響を調べた。
A2780を96穴プレートに1穴あたり4000個になるように播種し、10% FBSを含むRPMI培地で一晩培養した。1日後、hsa-miR-15a, 16, 124a, 147(配列番号37), 192(配列番号44), 193a(配列番号46), 193b(配列番号47), 215(配列番号45), 378(配列番号80), 432*(配列番号88), 506(配列番号105), 518c(配列番号119)のPre-miRTM miRNA Precursor Moleculesを、リポフェクション法、具体的には、Lipofectamine2000(Invitrogen社製)を用いて、終濃度が25nMとなるようA2780に導入した。また、miR-negacon#2(Ambion社製)もA2780に導入し、陰性コントロールとした。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
リポフェクション法により該分子を導入した1日後、BrdUラベリング&ディテクションキットIII(Roche社製)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従いBrdU取り込み活性を測定した。miR-negacon#2導入区のA2780のBrdU取り込み活性を1.0として、それぞれの相対BrdU取り込み活性を計算した。その結果、表16に示したように、hsa-miR-hsa-miR-147, 192, 193a, 193b, 215, 378, 432*, 506, 518cを生成する分子を導入することにより、40%以上のBrdU取り込み活性の減少が認められた。また、癌との関連が知られているhsa-miR-15a, 16, 124aを生成する分子を導入することにより、40%以上のBrdU取り込み活性の減少が認められた。
hsa-miR-337, 342, 432*, 491, 518bの標的遺伝子がコードする蛋白質の発現量解析
実施例1でDLD-1の増殖抑制やカスパーゼ活性を示したhsa-miR-337, 342, 432*, 491, 518bを生成する分子をDLD-1へ導入し、該標的遺伝子がコードする蛋白質量の変化を調べた。
hsa-miR-16, 147, 337, 342, 432*, 491, 518bを生成する Pre-miRTMmiRNA Precursor Molecules(Ambion社製)を、終濃度25nMとなるようにLipofectamine2000を用いて予め播種していた1x105個のDLD-1に導入した。miR-negacon#2も導入し、陰性コントロールとした。また、si-Bcl2l1, si-Birc5, si-Bcl9l(QIAGEN社製)を終濃度25nMにて導入し、陽性コントロールとした。導入2日後に、細胞をRIPA buffer[50mM Tris-HCL(pH8.0)、150mM NaCl、1% Nonident P-40、0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 1% Protease Inhibitor Cocktail SetIII(Calbiochem社製)]に溶解して回収した。定法によりSDS-PAGE法で分離した後、ウェスタンブロッティング法で、Bcl2l1, Birc5およびBcl9lの蛋白質量を検出した。Bcl2l1の検出には、抗Bcl2l1抗体(BD Biosciences社製)を、Birc5の検出には、抗Birc5抗体(R&D Systems社製)を、Bcl9lの検出には抗Bcl9l抗体(Abnova社製)を用いた。また、alpha-tubulinの蛋白量を検出し、供試サンプル量のコントロールとした。alpha-tubulinの検出には抗alpha-tubulin抗体(Sigma社製)を用いた。
実施例1でDLD-1の増殖抑制やカスパーゼ活性を示したhsa-miR-337, 342, 432*, 491, 518bを生成する分子をDLD-1へ導入し、該標的遺伝子がコードする蛋白質量の変化を調べた。
hsa-miR-16, 147, 337, 342, 432*, 491, 518bを生成する Pre-miRTMmiRNA Precursor Molecules(Ambion社製)を、終濃度25nMとなるようにLipofectamine2000を用いて予め播種していた1x105個のDLD-1に導入した。miR-negacon#2も導入し、陰性コントロールとした。また、si-Bcl2l1, si-Birc5, si-Bcl9l(QIAGEN社製)を終濃度25nMにて導入し、陽性コントロールとした。導入2日後に、細胞をRIPA buffer[50mM Tris-HCL(pH8.0)、150mM NaCl、1% Nonident P-40、0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 1% Protease Inhibitor Cocktail SetIII(Calbiochem社製)]に溶解して回収した。定法によりSDS-PAGE法で分離した後、ウェスタンブロッティング法で、Bcl2l1, Birc5およびBcl9lの蛋白質量を検出した。Bcl2l1の検出には、抗Bcl2l1抗体(BD Biosciences社製)を、Birc5の検出には、抗Birc5抗体(R&D Systems社製)を、Bcl9lの検出には抗Bcl9l抗体(Abnova社製)を用いた。また、alpha-tubulinの蛋白量を検出し、供試サンプル量のコントロールとした。alpha-tubulinの検出には抗alpha-tubulin抗体(Sigma社製)を用いた。
その結果、図1に示す通り、hsa-miR-337, 342, 491を強制発現したDLD-1は、陰性コントロールのDLD-1と比較してBcl2l1の蛋白量が減少したので、Bcl2l1遺伝子は、hsa-miR-337, 342, 491の標的遺伝子であり、発現が調節されていることが示された。また、図2に示す通り、hsa-miR-337を強制発現したDLD-1は、陰性コントロールのDLD-1と比較してBirc5の蛋白量が減少したので、Birc5遺伝子は、hsa-miR-337の標的遺伝子であり、発現が調節されていることが示された。さらに図3に示す通り、hsa-miR-432*, 518bを強制発現したDLD-1は、陰性コントロールのDLD-1と比較してBcl9lの蛋白量が減少したので、Bcl9l遺伝子は、hsa-miR-432*, 518bの標的遺伝子であり、発現が調節されていることが示された。
マイクロRNAを強制発現させた大腸癌由来細胞株における生細胞率、アポトーシス活性
DLD-1を96穴プレートに1穴あたり2500個になるように播種し、10% FBSを含むRPMI培地で一晩培養した。1日後、hsa-miR-493-3p(配列番号2061), 542-3p(配列番号2063), 571(配列番号2076), 579(配列番号2077), 625(配列番号2099), 630(配列番号2101), 634(配列番号2103), 650(配列番号2108), 653(配列番号2110) を生成するPre-miRTMmiRNA Precursor Moleculesを、リポフェクション法、具体的には、Lipofectamine2000(Invitrogen社製)を用いて、終濃度が50nMとなるようDLD-1に導入した。また、miR-negacon#2(Ambion社製)もDLD-1に導入し、陰性コントロールとした。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
DLD-1を96穴プレートに1穴あたり2500個になるように播種し、10% FBSを含むRPMI培地で一晩培養した。1日後、hsa-miR-493-3p(配列番号2061), 542-3p(配列番号2063), 571(配列番号2076), 579(配列番号2077), 625(配列番号2099), 630(配列番号2101), 634(配列番号2103), 650(配列番号2108), 653(配列番号2110) を生成するPre-miRTMmiRNA Precursor Moleculesを、リポフェクション法、具体的には、Lipofectamine2000(Invitrogen社製)を用いて、終濃度が50nMとなるようDLD-1に導入した。また、miR-negacon#2(Ambion社製)もDLD-1に導入し、陰性コントロールとした。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
リポフェクション法により該マイクロRNA前駆体を導入した3日後、CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay(Promega社製)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い生細胞率を測定した。miR-negacon#2導入区のDLD-1の生細胞率を1.0として、それぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表17に示したように、hsa-miR-493-3p, 542-3p, 571, 579, 625, 630, 634, 650, 653を生成する分子を導入することにより、50%以上の生細胞率の減少が認められた。
別の試験として、リポフェクション法によりhsa-miR-634を生成するPre-miRTM miRNA Precursor Moleculesを導入した2日後に、Caspase-GloR 3/7 assay(Promega社製)を用いて製品に添付された説明書に記載された方法に従いカスパーゼ3/7活性を測定した。miR-negacon#2導入区のDLD-1のカスパーゼ活性を1.0として、相対カスパーゼ活性を計算した。その結果、hsa-miR-634を生成する分子を導入することにより、50%以上のカスパーゼ活性の増加が認められた。
リポフェクション法により該アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した3日後、CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay(Promega社製)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い生細胞率を測定した。anti-miR-negacon#1導入区のDLD-1の生細胞率を1.0として、それぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表18に示したように、hsa-miR-411, 425-5p, 449b, 532, 548b, 558, 589, 593, 599, 615, 637, 657, 769-5p, 92bを相補するアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することにより、40%以上の生細胞率の減少が認められた。
マイクロRNAを強制発現させた卵巣癌由来細胞株における生細胞率
A2780を96穴プレートに1穴あたり2500個になるように播種し、10%FBSを含むRPMI培地で一晩培養した。1日後、hsa-miR-421(配列番号2058), 454-5p(配列番号2060), 542-3p(配列番号2063), 545(配列番号2064), 548a(配列番号2065), 548d(配列番号2067), 550(配列番号2068), 551b(配列番号2069), 552(配列番号2070), 553(配列番号2071), 557(配列番号925), 561(配列番号2073), 563(配列番号916), 565(配列番号2074), 570(配列番号2075), 571(配列番号2076), 584(配列番号2078), 591(配列番号2080), 595(配列番号2082), 600(配列番号2084), 601(配列番号2085), 604(配列番号2086), 605(配列番号2087), 606(配列番号2088), 609(配列番号2089), 610(配列番号2090), 611(配列番号2091), 613(配列番号803), 614(配列番号2092), 618(配列番号2096), 621(配列番号2097), 624(配列番号2098), 625(配列番号2099), 627(配列番号2100), 630(配列番号2101), 631(配列番号2102), 634(配列番号2103), 637(配列番号2104), 646(配列番号2105), 647(配列番号2106), 648(配列番号2107), 653(配列番号2110), 654(配列番号2111), 661(配列番号2113)を生成するPre-miRTM miRNA Precursor Moleculesを、リポフェクション法、具体的には、Lipofectamine2000(Invitrogen社製)を用いて、終濃度が50nMとなるようA2780の中に導入した。また、miR-negacon#2(Ambion社製)もA2780に導入し、陰性コントロールとした。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
A2780を96穴プレートに1穴あたり2500個になるように播種し、10%FBSを含むRPMI培地で一晩培養した。1日後、hsa-miR-421(配列番号2058), 454-5p(配列番号2060), 542-3p(配列番号2063), 545(配列番号2064), 548a(配列番号2065), 548d(配列番号2067), 550(配列番号2068), 551b(配列番号2069), 552(配列番号2070), 553(配列番号2071), 557(配列番号925), 561(配列番号2073), 563(配列番号916), 565(配列番号2074), 570(配列番号2075), 571(配列番号2076), 584(配列番号2078), 591(配列番号2080), 595(配列番号2082), 600(配列番号2084), 601(配列番号2085), 604(配列番号2086), 605(配列番号2087), 606(配列番号2088), 609(配列番号2089), 610(配列番号2090), 611(配列番号2091), 613(配列番号803), 614(配列番号2092), 618(配列番号2096), 621(配列番号2097), 624(配列番号2098), 625(配列番号2099), 627(配列番号2100), 630(配列番号2101), 631(配列番号2102), 634(配列番号2103), 637(配列番号2104), 646(配列番号2105), 647(配列番号2106), 648(配列番号2107), 653(配列番号2110), 654(配列番号2111), 661(配列番号2113)を生成するPre-miRTM miRNA Precursor Moleculesを、リポフェクション法、具体的には、Lipofectamine2000(Invitrogen社製)を用いて、終濃度が50nMとなるようA2780の中に導入した。また、miR-negacon#2(Ambion社製)もA2780に導入し、陰性コントロールとした。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
リポフェクション法により該分子を導入した3日後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay(Promega社製)を用いて製品に添付された説明書に記載された方法に従い生細胞率を測定した。miR-negacon#2導入区のA2780の生細胞率を1.0として、それぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表19に示したように、hsa-miR-421, 454-5p, 542-3p, 545, 548a, 548d, 550, 551b, 552, 553, 557, 561, 563, 565, 570, 571, 584, 591, 595, 600, 601, 604, 605, 606, 609, 610, 611, 613, 614, 618, 621, 624, 625, 627, 630, 631, 634, 637, 646, 647, 648, 653, 654, 661を生成する分子を導入することにより、50%以上の生細胞率の減少が認められた。
リポフェクション法により該アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した3日後、CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay(Promega社製)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い生細胞率を測定した。anti-miR-negacon#1導入区のA2780の生細胞率を1.0として、それぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表20に示したように、hsa-miR-611, 616, 617, 651, 657を相補するアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することにより、40%以上の生細胞率の減少が認められた。
マイクロRNAを強制発現させた大腸癌来細胞株のヌードマウス移植による腫瘍形成
実施例1でDLD-1の増殖抑制やカスパーゼ活性を示したhsa-miR-147, 342, 491を生成する分子を導入したDLD-1をヌードマウスに移植し、腫瘍形成におけるマイクロRNAの影響を調べた。
hsa-miR-147, 342, 491を生成するPre-miRTM miRNA Precursor Molecules(Ambion社製)を、終濃度50nMとなるようにLipofectoamine2000を用いて予め播種していた1×106個のDLD-1に導入した。miR-negacon#2も導入し、陰性コントロールとした。導入1日後に、0.05%トリプシン溶液(Gibco社製)にて細胞を剥離した。剥離した細胞とマトリゲル(BD Bioscience社製)を混合し、2.5×105個の細胞を6週令のヌードマウス側方の皮下に移植した。移植7、10、13、16日後に形成された腫瘍の長径と短径を測定した。腫瘍のサイズを長径×(短径)2×0.5により計算した。図4に示すようにhsa-miR-147, 342を強制発現したDLD-1の移植では、陰性コントロールに比べて腫瘍形成が抑制することが示された。
実施例1でDLD-1の増殖抑制やカスパーゼ活性を示したhsa-miR-147, 342, 491を生成する分子を導入したDLD-1をヌードマウスに移植し、腫瘍形成におけるマイクロRNAの影響を調べた。
hsa-miR-147, 342, 491を生成するPre-miRTM miRNA Precursor Molecules(Ambion社製)を、終濃度50nMとなるようにLipofectoamine2000を用いて予め播種していた1×106個のDLD-1に導入した。miR-negacon#2も導入し、陰性コントロールとした。導入1日後に、0.05%トリプシン溶液(Gibco社製)にて細胞を剥離した。剥離した細胞とマトリゲル(BD Bioscience社製)を混合し、2.5×105個の細胞を6週令のヌードマウス側方の皮下に移植した。移植7、10、13、16日後に形成された腫瘍の長径と短径を測定した。腫瘍のサイズを長径×(短径)2×0.5により計算した。図4に示すようにhsa-miR-147, 342を強制発現したDLD-1の移植では、陰性コントロールに比べて腫瘍形成が抑制することが示された。
また、図5に示すようにhsa-miR-491を強制発現したDLD-1の移植では、陰性コントロールに比べて腫瘍形成が抑制することが示された。
細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬、アポトーシス誘導剤、マイクロRNAなどの核酸の標的遺伝子の発現抑制剤または発現促進剤、細胞の増殖抑制方法または増殖促進方法を提供することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号1399−nは、a、c、gまたはu
配列表フリーテキスト
配列番号1399−nは、a、c、gまたはu
Claims (32)
- 以下の(a)〜(h)のいずれかの核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤:
(a)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(b)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含有する、17〜28塩基の核酸
(c)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(d)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
(e)配列番号1〜939、2057〜2132、2212〜2261および2315〜2321のいずれかで表される塩基配列の2〜8番目の塩基配列を含む核酸
(f)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
(g)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
(h)配列番号940〜2056、2133〜2211、2262〜2314および2322〜2328のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸 - 核酸がマイクロRNAまたはマイクロRNA前駆体である、請求項1に記載の細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
- 請求項1に記載の核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
- 請求項1または3に記載の核酸を発現するベクターを有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
- 請求項1に記載の核酸の標的塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞の増抑制剤または増殖促進剤。
- 請求項1に記載の核酸の標的塩基配列を有する遺伝子の発現を促進する物質を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
- 発現を抑制または促進する物質が核酸である、請求項5または6に記載の細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
- 核酸がsiRNAである、請求項7に記載の細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
- 請求項7に記載の核酸を発現するベクターを有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の治療薬。
- 請求項1、3および7のいずれか1項に記載の核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の治療薬。
- 請求項1に記載の核酸の発現量、該核酸の変異、該核酸をコードするゲノムの変異を検出する試薬を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬。
- 細胞の増殖異常に起因する疾患が癌である、請求項10〜12のいずれか1項に記載の治療薬または診断薬。
- 請求項1、3および7のいずれか1項に記載の核酸を有効量投与することを特徴とする、細胞の増殖異常に起因する疾患の治療方法。
- 請求項1に記載の核酸の発現量、該核酸の変異、該核酸をコードするゲノムの変異を検出することを特徴とする、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断方法。
- 細胞の増殖異常に起因する疾患が癌である、請求項14または15に記載の治療または診断方法。
- 細胞の増殖異常に起因する疾患の治療薬の製造のための、請求項1、3および7のいずれか1項に記載の核酸の使用。
- 細胞の増殖異常に起因する疾患が癌である、請求項17に記載の使用。
- 請求項1に記載の核酸を有効成分として含有する、該核酸の標的遺伝子の発現抑制剤。
- 請求項3に記載の核酸を有効成分として含有する、請求項1に記載の核酸の標的遺伝子の発現促進剤。
- 請求項4に記載のベクターを有効成分として含有する、請求項1に記載の核酸の標的遺伝子の発現抑制剤または発現促進剤。
- 請求項1または3に記載の核酸を用いることを特徴とする、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
- 請求項4に記載のベクターを用いることを特徴とする、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
- 請求項1に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制する物質を用いることを特徴とする、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
- 請求項1に記載の核酸の標的遺伝子の発現を促進する物質を用いることを特徴とする、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
- 発現を抑制または促進する物質が核酸である、請求項24または25に記載の細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
- 核酸がsiRNAである、請求項26に記載の細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
- 請求項26に記載の核酸を発現するベクターを用いる、細胞の増殖促進方法または増殖抑制方法。
- 請求項1に記載の核酸を用いることを特徴とする、該核酸の標的遺伝子の発現抑制方法。
- 請求項3に記載の核酸を用いることを特徴とする、請求項1に記載の核酸の標的遺伝子の発現促進方法。
- 請求項4に記載のベクターを用いることを特徴とする、請求項1に記載の核酸の標的遺伝子の発現抑制方法または発現促進方法。
- 請求項1に記載の核酸の発現または機能を促進または抑制させることを指標とする、細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤のスクリーニング方法。
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