JP6727381B2

JP6727381B2 - Ｈｐｖ感染に係わる癌の治療用組成物

Info

Publication number: JP6727381B2
Application number: JP2019126592A
Authority: JP
Inventors: シン・ヨンキ; キム・ヨンドク; ジュン・フンソン; キム・ダクエ
Original assignee: ENHANCEDBIO INC.
Current assignee: ENHANCEDBIO INC.
Priority date: 2012-08-02
Filing date: 2019-07-08
Publication date: 2020-07-22
Anticipated expiration: 2033-08-01
Also published as: EP3699278A1; BR112015002177B1; MX2020002286A; WO2014021667A1; JP2018109058A; RU2015106855A; RU2636003C2; AU2013297196B2; US20170198291A1; UA117563C2; MX2015001428A; CA3075050A1; KR20140018560A; ES2851904T3; US10221418B2; EP3699279A1; CN104884096A; JP6347433B2; EP3178498A3; JP2019194234A

Description

本特許出願は、２０１２年０８月０２日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１２−００８４８２０号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として取り込まれる。

本発明は、子宮頸癌を始めとしたＨＰＶ感染に係わる疾患に対する遺伝子治療用組成物に関する。

高危険性（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ）ヒト乳頭腫ウイルス（ＨｕｍａｎＰａｐｉｌｌｏｍａＶｉｒｕｓ：以下、ＨＰＶ）１６、１８タイプは、子宮頸癌及び子宮頸部異形化の主な原因となる要因であり、他の生殖器癌と頭頚部扁平上皮細胞癌を起こす原因になる。子宮頸癌は、女性にとって悪性腫瘍の最も一般的なタイプの１つである。浸潤性子宮頸癌の発病率は、徐々に減少しているが、開発途上国の女性にとっては、最も頻繁な癌であって、女性癌の２５％を占める。ＨＰＶは、ほぼ８，０００個の塩基配列を有した陽性悪性腫瘍を起こす小さいＤＮＡウイルスである。現在までゲノムの差によって１００個以上のＨＰＶ亜類型が確認されて、ほぼ９０個程度のＨＰＶは、遺伝子型が完全に分析されている。このようなタイプの中で高危険性ＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ−１６、１８、３１、３３、３５、４５、５１、５２、５６）は、子宮頸癌のほぼ９０％に関係している。ＨＰＶに感染された子宮頸癌の５０％以上は、ＨＰＶ−１６タイプが係わっており、次にＨＰＶ−１８（１２％）、ＨＰＶ−４５（８％）、ＨＰＶ−３１（５％）タイプが係わっている。このようなＨＰＶは、二つの発癌性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）タンパク質Ｅ６とＥ７をコード化する。このタンパク質は、全てＨＰＶを媒介とした細胞の不滅化及び細胞形質転換に関係する。発癌性Ｅ６タンパク質は、野生型のｐ５３腫瘍抑制タンパク質に結合し、ユビキチン経路を通じてｐ５３を分解させる。一方、Ｅ７タンパク質は、直接Ｒｂに結合して過リン酸化させる。まずＥ６は、Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｌｉｇａｓｅ）のＥ６−ＡＰ（Ｅ６−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ）と複合体を形成する。その後、Ｅ６／Ｅ６−ＡＰ複合体は、野生型のｐ５３と結合してユビキチン化させることにより、ＤＮＡ損傷に対するｐ５３を媒介とする細胞の反応を妨害する。主に、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質は、Ｍｄｍ２を媒介とするユビキチン化によって調節されるが、ＨＰＶに感染された子宮頸癌細胞では、ｐ５３の分解は、Ｍｄｍ２でＥ６を媒介とするユビキチン化に完全に交替される。したがって、他の多くの癌と違って、ＨＰＶに感染された子宮頸癌は、ほぼ全てが野生型のｐ５３遺伝子を有する。しかし、一貫的にＥ６タンパク質によって分解されるため、ｐ５３タンパク質の発現レベルは、非常に低い。特に、ＨＰＶＥ６タンパク質は、専ら子宮頸癌細胞のみを殺せる特定ターゲットであるため、相当な注目を浴びている。Ｅ６あるいはＥ６／Ｅ６−ＡＰ複合体をターゲットとするこのような戦略は、多様な治療を含んでいる。

細胞毒素薬の使用、ウイルスのＥ６発癌性タンパク質の亜鉛を放出する抑制剤、Ｅ６−ＡＰの模倣のエピトープペプチド（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）、抗−Ｅ６リボザイム、ウイルスのＥ６発癌性タンパク質をターゲットとするペプチドアプタマー、ウイルスのＥ６発癌遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡ及びこれらの併用処理などがある。最近、ｓｉＲＮＡは、動物細胞において選択的に内部遺伝子を沈黙させるだけではなく、ウイルスによって発生された疾病においてもウイルスの遺伝子を選択的に沈黙させることができることが証明された。ｓｉＲＮＡの形質感染によって起こったＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ヒトのウイルス感染を治療するための新しい治療法として登場した。ＨＰＶに感染された子宮頸癌細胞においてＥ６とＥ７の遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡは、ｐ５３とｐＲｂの蓄積を起こし、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）又は細胞老化を起こす。ＨＰＶ−１６に感染された子宮頸癌細胞株とＨＰＶ−１８に感染された細胞株の場合は、ウイルスのＥ６及びＥ７癌遺伝子をターゲットとするＲＮＡｉが選択的にこれらのタンパク質の発現を沈黙させることが明かされた。

一方、多様な核酸に対する変形（例えば、塩基、糖及び／又はホスフェート）を有した核酸は、血清リボヌクレアーゼによる分解が抑制されることにより、効能が増加される。核酸に導入できる糖、塩基及びホスフェート変形を記述する種々の例が当業界に知られている。例えば、オリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼ抵抗性基による変形、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基変形によって安定性を増大させて／増大させるか、生物学的活性を増大させるように変形させる（特許文献１〜８、非特許文献１〜８参照）。類似した変形を、本発明の核酸を変形させるに利用できる。

１９９９年にシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）に基いた化学療法と放射線治療とを併用処理した結果、ローカルに重症の子宮頸癌を有した女性の生存率を著しく改善した。現在シスプラチンは、卵巣、頸部、頭頚部、非小細胞肺癌などを含む癌を利治療するために広く使用されるＤＡＮ損傷薬物である。より最近、プラチナ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ）に基いた薬剤の作用メカニズムが調査された。しかし、細胞上においてシスプラチンの治療による薬物の吸収及び排出調節、ＤＮＡ損傷のシグナリング、細胞周期追跡、ＤＮＡ復旧及び細胞死滅を含む過程は、まだ完全には理解されていない。ＨＰＶ−１８ヘラ（ＨｅＬａ）細胞において、シスプラチン治療後にｐ５３タンパク質は、Ｅ６を媒介とした分解から抜き出し、核仁に優先的に蓄積された。また、ＨＰＶ−１６ＳｉＨａ細胞は、同時的な放射線療法とシスプラチン治療によってｐ５３機能を回復し、放射線感受性が増加された。

本発明者らは、Ｅ６／Ｅ７に特異的なｓｉＲＮＡに化学的な変形を与え、単独又は複合的な組み合わせの抗癌効果又は既存の化学療法又は放射線療法と併用時、上昇効果が期待できる効果的な新しい配列のｓｉＲＮＡを探索するために努力した結果、下記の実施例及び請求項に述べられたヌクレオチド及びこれらの特定組み合わせが、関連タンパク質のＴＰ５３及びＥ７の発現とＨＰＶＥ６ｍＲＮＡを減少させて細胞の死滅を誘導することを確認し、塩基配列残基変形のないＲＮＡより、単独又は抗癌剤との併用投与においてその効能が著しく優れていることを実験的に証明した。

本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照されて、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

国際公開第９２／０７０６５号国際公開第９３／１５１８７号米国特許第５，３３４，７１１号明細書国際公開第９７／２６２７０号米国特許第５，７１６，８２４号明細書米国特許第５，６２７，０５３号明細書国際公開第９８／１３５２６号米国特許出願第６０／０８２，４０４号（１９９８年４月２０日に出願）

Ｐｅｒｒａｕｌｔｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４４：５６５−５６８，１９９０Ｐｉｅｋｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：３１４−３１７，１９９１ＵｓｍａｎａｎｄＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４−３３９，１９９２Ｂｅｉｇｅｌｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：２５７０２，１９９５Ｋａｒｐｅｉｓｋｙｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，３９：１１３１，１９９８ＥａｒｎｓｈａｗａｎｄＧａｉｔ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（ＮｕｃｌｅｉｃａｃｉｄＳｃｉｅｎｃｅｓ）４８：３９−５５，１９９８ＶｅｒｍａａｎｄＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４，１９９８Ｂｕｒｌｉｎａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５：１９９９−２０１０，１９９７

本発明者らは、ＨＰＶの感染を原因として発生する多様な疾患に対する効率的な遺伝子治療剤を開発するために鋭意研究した。その結果、ＨＰＶ１６型又はＨＰＶ１８型ウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子をターゲットとする発現抑制用特定ＲＮＡ又はこれらの塩基の変形されたＲＮＡ配列を利用する場合、ＨＰＶの遺伝子発現が効率的に抑制され、子宮頸癌を始めとしたＨＰＶ感染関連疾患に対して優れた治療活性を示すことを見出し、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）感染関連疾患、より具体的には、ＨＰＶ感染関連癌、さらに具体的には、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ）の予防又は治療用組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）感染関連疾患、より具体的には、ＨＰＶ感染関連癌、さらに具体的には、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ）の予防又は治療方法を提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。

本発明の一様態によると、本発明は、配列番号１６、２２、２８、３４、４０、６６、７２、８４、９０、１０８及びこれらのアンチセンスヌクレオチド配列からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を有効成分として含む、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）感染関連疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

本発明者らは、ＨＰＶの感染を原因として発生する多様な疾患に対する効率的な遺伝子治療剤を開発するために鋭意研究した。その結果、ＨＰＶ１６型又はＨＰＶ１８型ウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子をターゲットとする発現抑制用特定ＲＮＡ又はこれらの塩基の変形されたＲＮＡ配列を利用する場合、ＨＰＶの遺伝子発現が効率的に抑制され、子宮頸癌を始めとしたＨＰＶ感染関連疾患に対して優れた治療活性を示すことを見出した。

本発明によると、配列番号１６、２２、２８、３４及び４０は、ＨＰＶ１６型ウイルスをターゲットにして、配列番号７２、８４、９０及び１０８は、ＨＰＶ１６型ウイルスをターゲットにする発現抑制用ＲＮＡ核酸配列である。

本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のとおりである：
（ａ）本発明は、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）感染関連疾患、より具体的には、ＨＰＶ感染関連癌、さらに具体的には、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ）の予防又は治療用組成物、又は方法を提供する。
（ｂ）本発明のヌクレオチド配列、これらの塩基の変形された配列及びこれらの特定組み合わせを使用する場合、ＨＰＶ１６型又はＨＰＶ１８型ウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子の発現を著しく抑制することにより、効率的なＨＰＶ感染関連疾患の治療用組成物又は方法として有用に利用できる。

図１ａは、ＨＰＶ１６、１８番ｓｉＲＮＡにおいて、塩基配列の残基置換変化による安定性の向上を確認した結果を示す。図１ｂは、ＨＰＶ１６、１８番ｓｉＲＮＡにおいて、タンパク質分子水準での効果上昇を確認した結果を示す。図１ｃは、ＨＰＶ１６、１８番ｓｉＲＮＡにおいて、ｍＲＮＡ分子水準での効果上昇を確認した結果を示す。図２ａは、ＨＰＶ１８番形態のｓｉＲＮＡ塩基配列残基置換の優れた細胞老化誘導効果を確認した結果を示す。図２ｂは、ＨＰＶ１８番形態のｓｉＲＮＡ塩基配列残基置換の優れた細胞死滅効果を確認した結果を示す。図３ａは、ＨＰＶ１８番形態のウイルスに感染されたＨｅＬａ子宮頸癌細胞株において塩基配列が置換された４２６ｓｉＲＮＡと抗癌剤シスプラチンとの併用治療による細胞老化誘導効果を示す。図３ｂは、ＨＰＶ１８番形態のウイルスに感染されたＨｅＬａ子宮頸癌細胞株において塩基配列が置換された４２６ｓｉＲＮＡと抗癌剤シスプラチンとの併用治療による細胞老化誘導効果を顕微鏡で観察した結果を示す。図４ａは、ＨＰＶ１６、１８番形態の塩基配列が置換された優れたｓｉＲＮＡ混合治療効果及びシスプラチンとの併用治療効果による上昇効果を確認した結果を示す（細胞増殖抑制効果）。図４ｂは、ＨＰＶ１６、１８番形態の塩基配列が置換された優れたｓｉＲＮＡ混合治療効果及びシスプラチンとの併用治療効果による上昇効果を確認した結果を示す（細胞死滅効果）。図４ｃは、ＨＰＶ１６、１８番形態の塩基配列が置換された優れたｓｉＲＮＡ混合治療効果及びシスプラチンとの併用治療効果による上昇効果を確認した結果を示す（タンパク質分子水準での効果）。図５ａは、ＨＰＶ１８番形態のｓｉＲＮＡ細胞と動物におけるｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を確認した結果を示す（細胞上におけるＩＬ−６減少効果）。図５ｂは、ＨＰＶ１８番形態のｓｉＲＮＡ細胞と動物におけるｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を確認した結果を示す（動物におけるＩＮＦ−ｇａｍｍａ減少効果）。図６は、ＨＰＶ１８番形態の４２６ｓｉＲＮＡを、Ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲを通じて定量化した結果を示す。図７は、多様な形態のリポソームにおいても、ｓｉＲＮＡが細胞で同一な細胞死滅効果を示すことを確認した結果を示す。図８ａは、動物実験で優れた効果を示した塩基配列置換−ｓｉＲＮＡの混合群と抗癌剤の併用治療による上昇効果を確認した図である（マウス腫瘍の大きさ変化）。図８ｂは、動物実験で優れた効果を示した塩基配列置換−ｓｉＲＮＡの混合群と抗癌剤の併用治療による上昇効果を確認した図である（マウス腫瘍写真）。図８ｃは、動物実験で優れた効果を示した塩基配列置換−ｓｉＲＮＡの混合群と抗癌剤の併用治療による上昇効果を確認した図である（マウス重量の変化数値）。

本明細書において、用語‘ヌクレオチド’は、一本鎖又は二本鎖の形態で存在するリボヌクレオチドを意味し、特に言及しない限り、天然のヌクレオチドの類似体を含む（Ｓｃｈｅｉｔ，ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＡｎａｌｏｇｓ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０））。

本明細書において、用語‘発現抑制’は、標的遺伝子の機能低下を引き起こすことを意味し、好ましくは、これにより標的遺伝子発現が探知不可になるか、無意味な水準で存在するようになることを意味する。

本発明の好ましい具現例によると、本発明のヌクレオチド配列は、ＨＰＶ１８型又はＨＰＶ１６型ウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子に対する遺伝子沈黙（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）能力を有するＲＮＡ配列であり、より好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

本明細書において、用語‘ｓｉＲＮＡ’は、特定ｍＲＮＡの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）を通じてＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）現象が誘導できる短い二本鎖ＲＮＡを意味する。ターゲット遺伝子のｍＲＮＡと相同の配列を有するセンスＲＮＡ鎖と、これと相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖とから構成される。ｓｉＲＮＡは、ターゲット遺伝子の発現を抑制することができるため、効率的な遺伝子ノックダウン方法として、又は遺伝子治療（ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ）の方法として提供される。

ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ同士対をなす二本鎖ＲＮＡ部分が完全に対をなすものに限定されず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的ではない）、バルジ（ｂｕｌｇｅ）（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより対を成さない部分も含まれる。全長は、１０乃至１００塩基、好ましくは１５乃至８０塩基、最も好ましくは、１７乃至２３塩基である。ｓｉＲＮＡ末端構造は、ターゲット遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果によって抑制できるものであれば、平滑（ｂｌｕｎｔ）末端あるいは粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のいずれも可能である。粘着末端構造は、３末端側が突出した構造と５末端側が突出した構造のいずれも可能である。突出する塩基数は、限定されない。例えば、塩基数は、１〜８塩基、好ましくは、２〜６塩基が好ましい。また、ｓｉＲＮＡは、ターゲット遺伝子の発現抑制効果が維持できる範囲で、例えば、一側末端の突出部分に低分子ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスＲＮＡのような天然のＲＮＡ分子又は人工のＲＮＡ分子）を含むことができる。ｓｉＲＮＡ末端構造は、両側とも切断構造を有する必要はなく、二本鎖ＲＮＡの一方の末端部位がリンカーＲＮＡによって接続されたステムループ型構造であってもよい。リンカーの長さは、ステム部分の対をなすに支障のない長さであれば、特に限定されない。

本明細書において用語‘ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）’は、一本鎖で５０〜７０個で構成されたヌクレオチドを意味し、ｉｎｖｉｖｏ上でステム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造をなしている。即ち、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を通じて遺伝子発現を抑制するためのタイトなヘアピン構造を作るＲＮＡ配列である。５〜１０個のヌクレオチドのループ部位両側に相補的に１５〜３０個のヌクレオチドの長いＲＮＡが塩基対をなして二本鎖のステムを形成する。ｓｈＲＮＡは、常に発現されるようにするために、Ｕ６プロモーターを含むベクターを通じて細胞内に形質導入されて、大抵娘細胞に伝達され遺伝子発現抑制が遺伝されるようにする。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞内メカニズムによって切断されてｓｉＲＮＡになった後、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ）に結合する。これらＲＩＳＣは、ｍＲＮＡに結合して、これを切断する。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写される。本発明によると、本発明のヌクレオチド配列がループ部位両側に存在する二本鎖のステム配列をなすｓｈＲＮＡ構造を構成することができる。

本明細書において用語‘ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）’は、遺伝子発現を調節し、全長１０〜５０個ヌクレオチド、好ましくは、１５〜４０個ヌクレオチド、より好ましくは、１７〜２５個ヌクレオチドで構成された一本鎖ＲＮＡ分子を意味する。ｍｉＲＮＡは、細胞内で発現されないオリゴヌクレオチドであって、短いステム−ループ構造を有する。ｍｉＲＮＡは、１又は２以上のｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡ）と全体又は部分的に相同性を有し、前記ｍＲＮＡと相補的な結合を通じてターゲット遺伝子発現を抑制させる。

本明細書において用語‘アンチセンスオリゴヌクレオチド’とは、特定ｍＲＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含有しているＲＮＡ又はこれらの誘導体を意味し、ｍＲＮＡ内の相補的な配列に結合し、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する。本発明のアンチセンスヌクレオチド配列は、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡに相補的で、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡに結合できるＲＮＡ配列を意味し、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡの翻訳、細胞質内への転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）、成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）又は他の全ての全体的な生物学的機能に対する必須的な活性を阻害することができる。

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、効能を増進させるために１つ以上の塩基、糖又は骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）の位置で変形できる（ＤｅＭｅｓｍａｅｋｅｒｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＯｐｉｎＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ．，５（３）：３４３−５５，１９９５）。オリゴヌクレオチド骨格は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、単鎖アルキル、シクロアルキル、単鎖ヘテロアトミック、ヘテロシクリック糖スルホネートなどに変形できる。また、アンチセンス核酸は、１つ以上の置換された糖残基（ｓｕｇａｒｍｏｉｅｔｙ）を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、変形された塩基を含むことができる。変形された塩基には、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−メチルピリミジン（特に、５−メチルシトシン）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、ゲントビオシルＨＭＣ、２−アミノアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、２，６−ジアミノプリン、２−Ｏ−メチルウラシル、２−Ｏ−メチルグアニン及び２−フルオロシトシンなどがある。

本発明のより好ましい具現例によると、本発明のヌクレオチド配列は、ｓｉＲＮＡ配列である。

本発明の他の様態によると、本発明は、変形された骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）又は１つ以上の変形された塩基を含む配列番号１、７、１２、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５１、５６、６２、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８及びこれらのアンチセンスヌクレオチド配列からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を有効成分として含む、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）感染関連疾患の予防又は治療用組成物を提供する。即ち、前記述べられたヌクレオチド配列から骨格が変形されるか塩基が変形されたヌクレオチドが、本願発明のＨＰＶ感染関連疾患の予防又は治療用組成物になりえる。

本願発明のヌクレオチドに適用される骨格又は塩基の変形は、安定性又は目的とする活性を増加させるために、当業界で通常的に加えられる如何なる変形も含むことができる。

好ましくは、本発明の変形された骨格は、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホロチオエート、ホスホアミダイト、ホスフェートエステル、カルバメート、アセトアミダイト、カルボキシメチルエステル、カーボネート及びホスフェートトリエステルからなる群から選択される１つ以上の変形を含む。

好ましくは、本発明の変形された塩基は、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）及びハロゲン化（ｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ）からなる群から選択される１つ以上の変形を含む。より好ましくは、本発明の変形された塩基は、２’−Ｏメチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）されるか、２’−フルオロ化（ｆｌｕｏｒｉｎａｔｉｏｎ）された塩基である。

本発明によると、本発明者らは、ＨＰＶ１６型又はＨＰＶ１８型ウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子をターゲットとする発現抑制用ＲＮＡの特定位置に２’−Ｏメチル化又は２’−フルオロ化の変形を加える場合、変形前核酸分子に比べ、ターゲット遺伝子の発現抑制効率が大きく上昇し、ヒトの血漿などにおいて安定性が増加して、動物における薬物動態学実験でも半減期が２倍以上著しく増加されたことを確認した。

２’−Ｏメチル化は、ＲＮＡ分子のリボース（ｒｉｂｏｓｅ）の２番炭素に結合したヒドロキシ基にメチル化が進行され２’−メトキシ基に変形されることを意味し、２’−フルオロ化は、ＲＮＡ分子のリボースの２番炭素に結合したヒドロキシ基がフルオロ基で置換され、２’−フルオロ基に変形されることを意味する。

本発明の好ましい具現例によると、本発明のヌクレオチドにおいて２’−Ｏメチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）された塩基は、Ｕ又はＧである。

本発明の好ましい具現例によると、本発明のヌクレオチドにおいて２’−フルオロ化（ｆｌｕｏｒｉｎａｔｉｏｎ）された塩基は、Ｃである。

本発明の好ましい具現例によると、本発明で１つ以上の塩基が２’−Ｏメチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）されるか、２’−フルオロ化（ｆｌｕｏｒｉｎａｔｉｏｎ）されたヌクレオチド配列は、配列番号２、３、５、６、８、１０、１１、１３、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４４、４５、４７、４９、５０、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６３、６５、６７、６８、７０、７１、７３、７４、７６、７７、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９７、９８、１００、１０１、１０３、１０４、１０６、１０７、１０９、１１０、１１２及び１１３のヌクレオチド配列からなる群から選択される。

本発明のまた他の様態によると、本発明は、配列番号２、４、８、９、１２及び１５のヌクレオチド配列からなる混合群、配列番号１８、２１、２９及び３２のヌクレオチド配列からなる混合群、配列番号４２、４５、５２及び５５のヌクレオチド配列からなる混合群、配列番号５８、５９、６３及び６５のヌクレオチド配列からなる混合群、配列番号６８、７１、９１及び９４のヌクレオチド配列からなる混合群、並びに配列番号９８、１００、１０９及び１１２のヌクレオチド配列からなる混合群から構成された群から選択されるヌクレオチド混合群を有効成分として含む、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）感染関連疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

本発明によると、本発明者らは、本発明のヌクレオチド配列が特定組み合わせをなす混合群として使用される場合、単一配列のＲＮＡを使用する場合に比べ、ターゲット遺伝子の抑制効率が大きく増加することにより、ＨＰＶ感染関連疾患に対してより優れた治療活性を有することを見出した。

本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物で治療されるＨＰＶ感染関連疾患は、性器疣贅（ｇｅｎｉｔａｌｗａｒｔｓ）、膣炎（ｖａｇｉｎａｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、骨盤炎（ｐｅｌｖｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）及び癌からなる群から選択されて、より好ましくは、本発明の組成物で治療される癌は、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ）、膣癌（ｖａｇｉｎａｃａｎｃｅｒ）、外陰癌（ｖｕｌｖａｃａｎｃｅｒ）、肛門癌（ａｎａｌｃａｎｃｅｒ）、陰茎癌（ｐｅｎｉｓｃａｎｃｅｒ）、扁桃癌（ｔｏｎｓｉｌｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｘｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｘｃａｎｃｅｒ）、頭頚部癌（ｈｅａｄ＆ｎｅｃｋｃａｎｃｅｒ）、肺腺癌（ｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）からなる群から選択される。最も好ましくは、本発明の組成物で治療される癌は、子宮頸癌である。

本発明の組成物は、本発明の核酸分子の薬剤学的有効量が含まれた薬剤学的組成物に製造できる。

本明細書において用語‘薬剤学的有効量’は、上述した本発明の関節炎予防、軽減又は治療効能又は活性を達成するに十分な量を意味する。

本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、シクロデキストリンとその共重合体及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口、好ましくは、非経口で投与でき、非経口投与である場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与、関節腔投与などで投与できる。

本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、重量、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方することができる。一方、本発明の薬剤学的組成物の好ましい投与量は、１日当り０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇである。

本発明の薬剤学的組成物が抗癌剤として使用される場合、当業界で通常的に使用される抗癌組成物と併用して使用でき、より具体的には、シスプラチン又はパクリタキセルなどの抗癌剤と併用投与できる。

本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造する。この際、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エリキシル剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態でもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

本発明のより好ましい具現例によると、本発明の核酸分子は、遺伝子伝達体（ｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｔｅｍ）に含まれている。

本明細書において用語‘遺伝子伝達体’は、所望のターゲット遺伝子を対象細胞に導入して発現させるための媒介体を意味する。理想的な遺伝子伝達体は、人体に無害で大量生産が容易であり、遺伝子を効率的に伝達することができなければならない。

本明細書において、用語‘遺伝子伝達’は、遺伝子が細胞内に運搬されることを意味し、遺伝子の細胞内浸透（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）と同一な意味を有する。組織水準で、前記用語‘遺伝子伝達’は、遺伝子の拡散（ｓｐｒｅａｄ）と同一な意味を有する。したがって、本発明の遺伝子伝達体は、遺伝子浸透システム及び遺伝子拡散システムと記載できる。

本発明の遺伝子伝達体を製造するために、本発明のヌクレオチド配列は、適した発現コンストラクト（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）内に存在することが好ましい。前記発現コンストラクトにおいて、本発明のヌクレオチド配列は、プロモーターに作動的に結合されることが好ましい。本明細書において、用語‘作動的に結合された’は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これにより前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。本発明において、本発明のヌクレオチド配列に結合されたプロモーターは、好ましくは動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞で作動し、リラクシン遺伝子の転写を調節できるものであって、哺乳動物ウイルス由来のプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターを含み、例えば、ＣＭＶ（哺乳動物ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター及びヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、Ｕ６プロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の遺伝子伝達体は、多様な形態に製作することができるが、これは、（ｉ）ネーキッド（ｎａｋｅｄ）組換えＤＮＡ分子、（ｉｉ）プラスミド、（ｉｉｉ）ウイルスベクター、そして（ｉｖ）前記ネーキッド組換えＤＮＡ分子又はプラスミドを内包するリポソーム又はネオソームの形態に製作することができる。

本発明のヌクレオチド配列は、通常的な遺伝子治療に利用されるあらゆる遺伝子伝達システムに適用できて、好ましくは、プラスミド、アデノウイルス（ＬｏｃｋｅｔｔＬＪ，ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．３：２０７５−２０８０（１９９７））、アデノ−関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ，ＬａｓｈｆｏｒｄＬＳ．，ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｓＥｄ．Ａ．Ｍｅａｇｅｒ，１９９９）、レトロウイルス（ＧｕｎｚｂｕｒｇＷＨ，ｅｔａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｓＥｄ．Ａ．Ｍｅａｇｅｒ，１９９９）、レンチウイルス（ＷａｎｇＧ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：Ｒ５５−６２（１９９９））、単純ヘルペスウイルス（ＣｈａｍｂｅｒＲ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ９２：１４１１−１４１５（１９９５））、ワクシニアウイルス（ＰｕｈｌｍａｎｎＭ．ｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１０：６４９−６５７（１９９９））、リポソーム（ＭｅｔｈｏｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ１９９，Ｓ．Ｃ．ＢａｓｕａｎｄＭ．Ｂａｓｕ（Ｅｄｓ．），ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ２００２）又はネオソームに適用できる。

最も好ましくは、本発明のヌクレオチド配列は、陽イオン性リポソーム（ｃａｔｉｏｎｉｃｌｉｐｏｓｏｍｅ）を利用して伝達される。

本発明のまた他の様態によると、本発明は、（ａ）配列番号１６、２２、２８、３４、４０、６６、７２、８４、９０、１０８及びこれらのアンチセンスヌクレオチド配列からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列の薬剤学的有効量、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）感染関連疾患の予防又は治療方法を提供する。

本発明のまた他の様態によると、本発明は、（ａ）変形された骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）又は１つ以上の変形された塩基を含む配列番号１、７、１２、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５１、５６、６２、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８及びこれらのアンチセンスヌクレオチド配列からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列の薬剤学的有効量、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）感染関連疾患の予防又は治療方法を提供する。

本発明のまた他の様態によると、本発明は、（ａ）配列番号２、４、８、９、１２及び１５のヌクレオチド配列からなる混合群、配列番号１８、２１、２９及び３２のヌクレオチド配列からなる混合群、配列番号４２、４５、５２及び５５のヌクレオチド配列からなる混合群、配列番号５８、５９、６３及び６５のヌクレオチド配列からなる混合群、配列番号６８、７１、９１及び９４のヌクレオチド配列からなる混合群、並びに配列番号９８、１００、１０９及び１１２のヌクレオチド配列からなる混合群から構成された群から選択されるヌクレオチド混合群の薬剤学的有効量、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）感染関連疾患の予防又は治療方法を提供する。

本発明の方法は、上述の本組成物を利用するため、その共通した内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明なことであろう。

実験方法
ＨＰＶ１６、１８番形態のｓｉＲＮＡ製作
下記表１−１〜１−４、２−１〜２−４のｓｉＲＮＡは、（株）バイオニア（ｋｏｒｅａ）に注文制作して収得した。下記表において、下線で表示したｓｉＲＮＡ配列は、塩基残基にメチル基を結合させた２’−Ｏ−Ｍｅ変形ヌクレオチドで置換された塩基を示し、太イタリック体で示した配列は、塩基残基のヒドロキシ基をフルオロで置換した２’−Ｆ変形ヌクレオチドで置換された塩基を示す。

ｓｉＲＮＡの安定性確認
ｓｉＲＮＡを１０％牛血清又は１０％ヒト血清に混ぜた後、３７℃に入れて時間別にサンプルを取った後、急速冷却させて−７０℃に保管した。集まったサンプルを１２％ポリアクリルアミドゲルに５０Ｖで１時間３０分間電気泳動し、Ｅｔ−Ｂｒで染色後、ＵＶで測定した。

細胞培養及びｓｉＲＮＡ形質導入
子宮頸癌細胞とＨＰＶ１８番形態のウイルスに感染されたＨｅＬａ子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ；ＡＴＣＣＣＣＬ−２）又はＨＰＶ１６番形態のウイルスに感染されたＳｉＨａ（ＳｉＨａ；ＡＴＣＣＨＴＢ−３５）又はＣａＳｋｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５５０）子宮頸癌細胞株を６−ウェルプレートに２×１０^５又は１．５×１０^５の細胞数で分株した後、３７℃、二酸化炭素５％条件下で１０％の牛血清の入ったＲＰＭＩ１６４０又はＤＭＥＭ培地でそれぞれ２４時間培養した。２４時間培地で培養して、細胞が培養容器表面に吸着されると、対照群として非変形ｓｉＲＮＡと、実験群として上述の方法で変形させたｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをそれぞれ２０ｎＭずつＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，ＵＳＡ）を使用して形質導入した後、２４時間培養した。

抗癌剤処理
上述の方法で６−ウェルプレートに２×１０^５又は１．５×１０^５細胞で分株し、１日間培養されたＨｅＬａ又はＣａｓｋｉ細胞株にｓｉＲＮＡを形質導入させた後、シスプラチン（ＣＤＤＰ）最終濃度それぞれ２．５μＭで処理して培養した。

細胞老化に係わるβガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）活性測定
上述の方法でＨｅＬａ又はＣａｓｋｉ細胞株にｓｉＲＮＡを単独で形質導入するか、あるいは抗癌剤と併用投与した後、一日間培養した。細胞老化測定キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，ＵＳＡ）を利用してＰＢＳで洗浄し、ＳＡ−β−ｇａｌ染色溶液に３７℃で１２時間処理した。一般光学顕微鏡を利用し、１００〜２００倍の倍率で、青色に染色された細胞を観察した。

フローサイトメトリーを利用した細胞死滅測定
上述の方法でＨｅＬａ又はＣａｓｋｉ細胞株にｓｉＲＮＡを単独で形質導入するか、あるいは抗癌剤と併用投与した後、一日間培養した。細胞死滅キット（ＢＤ，ＵＳＡ）を利用してＡｎｎｅｘｉｎＶとＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ）試薬で染色し、常温で３０分間反応した後、フローサイトメトリーを利用して細胞の死滅を確認した。

ｓｉＲＮＡの治療影響調査
上述の方法でＨｅＬａ又はＣａｓｋｉ細胞株にｓｉＲＮＡを単独で形質導入するか、あるいは抗癌剤と併用投与した後、一日間培養した。タンパク質の変化を観察するために、細胞をＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液ＲＩＰＡｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ：１５０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），５ｍＭＥＤＴＡ，０．１％ＳＤＳ，０．５％デオキシコレート及び１％ＮＰ−４０］を添加して破砕し、一般的なウェスタンブロット方法によりタンパク質変化量を観察した。抗−ＴＰ５３、抗−Ｅ７、抗−Ａｃｔｉｎマウス抗体は、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社（ＵＳＡ）で購入し、１：１０００で希釈して使用した。ヤギ−抗−マウスＩｇＧＨＲＰ接合抗体（Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧＨＲＰｃｏｎｊｕｇａｔｅａｎｔｉｂｏｄｙ）は、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ＵＳＡ）から購入し、１：３０００で希釈して使用した。

また、ｍＲＮＡの変化量を観察するために、細胞をトリゾール溶液（Ｔｒｉｚｏｌｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を利用して破砕し、エタノール精製を通じてＲＮＡを検出し、一般的なＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ（実時間重合酵素連鎖反応）方法によりｍＲＮＡ変化量を観察した。

ｓｉＲＮＡのｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果の影響調査
ＨｅＬａ又はＣａｓｋｉ細胞株を６−ウェルプレートに分株した後、３７℃、二酸化炭素５％条件下で、１０％牛血清の入ったＲＰＭＩ１６４０又はＤＭＥＭ培地でそれぞれ２４時間培養した。陽性対照群β−ｇａｌｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡを形質導入して培養した後、培地を取って一般的なＩＬ−６（ＢＤ，ＵＳＡ）ＥＬＩＳＡ方法を行った。

６週齢のマウスに陽性対照群β−ｇａｌｓｉＲＮＡと陰性対照群ｓｉＲＮＡ，ｓｉＲＮＡを静脈注射して、６時間反応した後、マウスの血液を採取して血清分離後、ＩＮＦ−ｇａｍｍａ（ＢＤ，ＵＳＡ）ＥＬＩＳＡを行った。

ｓｉＲＮＡの定量化のためのステム−ループ（Ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ
２６０〜３００ｇ程度の４週齢ラットに、ｓｉＲＮＡを静脈内注射で投与して、時間別にラット血液を採取し、血漿を分離した。分離された血漿を０．２５％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００緩衝液に希釈させ、ＴａｑｍａｎｍｉｃｒｏＲＮＡＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｋｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ）でｃＤＮＡを合成した後、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ方法で定量化し、ｓｉＲＮＡを検出した。

ｓｉＲＮＡの動物実験
雌性ヌードマウスにＨＰＶ１８ｔｙｐｅのＨｅＬａ細胞株５×１０^６を異種移植して、１０日後に癌細胞が生成されたことを確認した後、使用されたｓｉＲＮＡは、３ｍｇ／ｋｇで２〜３日間隔で尻尾に静脈注射し、シスプラチン（２ｍｇ／ｋｇ）とパクリタキセル（４ｍｇ／ｋｇ）を３〜４日間隔で腹腔注射し、９回繰り返して注射して、２〜３日間隔で腫瘍の大きさを測定した。

実験結果
ｓｉＲＮＡ処理濃度及び治療回数の変化
ＨＰＶ１６、１８番形態のウイルスに感染させたＣａｓｋｉあるいはＨｅＬａ細胞株に、ｓｉＲＮＡの形質導入と抗癌剤単独あるいは併用治療時、従来の技術では、長期間高濃度（１００ｎＭ）で連続処理した場合にのみｓｉＲＮＡの効能を確認することができたが、本発明の変形ｓｉＲＮＡを利用する場合、短期間、低濃度（２０ｎＭ以下）で１回処理しても優れた効能を奏した。

残基置換されたｓｉＲＮＡ安定性評価
上述の方法で収得した組み合わせ５１乃至組み合わせ５４のｓｉＲＮＡを１０％ヒト血清と混ぜた後、３７℃温度でそれぞれのｓｉＲＮＡを時間別に取って、−７０℃に保管した後、１２％ポリアクリルアミドゲルに電気泳動し、Ｅｔ−Ｂｒで染色後、ＵＶで測定した。その結果、図１ａに示したように、塩基配列の残基置換のない組み合わせ５１の場合、２時間以内にｓｉＲＮＡがなくなるが、塩基配列の残基を置換させた組み合わせ５２乃至５４の場合、ｓｉＲＮＡが４時間以上残存し、安定性が大きく増加されることを確認した。特に、組み合わせ５４の場合、２４時間が経っても残存する、最も優れた安定性を示した。

残基置換されたｓｉＲＮＡの分子水準での効果
上述の方法でＨＰＶ１８番形態のｓｉＲＮＡ組み合わせ４４乃至組み合わせ５０のｓｉＲＮＡと対照群Ｍｏｃｋ、ＧＦＰｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞株に形質導入して、ＴＰ５３、Ｅ７タンパク質の変化量を確認し、アクチンをハウスキーピング遺伝子として使用した。図１ｂに示したように、塩基配列の残基置換のない組み合わせ４４と塩基配列の残基を置換させた組み合わせ４５乃至組み合わせ５０のＴＰ５３とＥ７のタンパク質変化量を比較した。この際、組み合わせ４８において、ＴＰ５３タンパク質発現の増加とＥ７タンパク質発現の減少は、他の配列に比べ、優れた効能を有することを確認した。

また、ＨＰＶ１６番形態のｓｉＲＮＡ４９７の場合、上述の方法で組み合わせ１２乃至組み合わせ１５をＣａｓｋｉ細胞株に形質導入した後、ｍＲＮＡを抽出し、Ｅ６ｍＲＮＡとｐ２１ｍＲＮＡ発現量を確認した。その結果、図１ｃにおいて、塩基配列の残基を置換させた組み合わせ１３が対照群に比べＥ６ｍＲＮＡが６０％以上減少し、ｐ２１ｍＲＮＡは、１１００％以上増加することを確認した。塩基配列の残基置換のない組み合わせ１２と比較しても、組み合わせ１３が他の配列に比べ優れていることを確認した。

残基置換されたｓｉＲＮＡの細胞老化誘導効果
上述の方法で処理されたＨｅＬａ又はＣａｓｋｉ細胞株のＳＡ β−Ｇａｌ活性を測定した。その結果、図２ａでは、既存発明に使用されたＨＰＶ１８Ｅ６／Ｅ７ｓｉＲＮＡ群と４５０ｓｉＲＮＡの塩基配列残基置換のない組み合わせ５１を形質導入した場合、対照群ｓｉＲＮＡに比べ、１０〜２０倍程度増加されたＳＡ β−Ｇａｌ活性を示す反面、ｓｉＲＡＮ塩基配列を残基置換させた組み合わせ５４では、５０倍以上高いＳＡ β−Ｇａｌ活性を示している。これは、塩基配列を置換させた組み合わせ５４が、塩基配列を置換させなかった組み合わせ５１に比べ、細胞老化効果が著しく優れていることを示している。

残基置換されたｓｉＲＮＡの細胞死滅効果
上述の方法でフローサイトメトリーを使用して細胞死滅効果を測定した。ＨＰＶ１８Ｅ６／Ｅ７，１８Ｅ６ｓｉＲＮＡ群と塩基配列残基を置換させた組み合わせ４８、組み合わせ５４群を対照群と比較して細胞死滅効果を確認した結果、対照群に比べ、ＨＰＶ１８Ｅ６／Ｅ７，１８Ｅ６ｓｉＲＮＡ群は、１５〜２０％に過ぎない細胞死滅効果を示している反面、残基置換させたｓｉＲＮＡ群では、約６０％以上の細胞死滅効果を示すことを確認した（図２ｂ）。これは、既存のｓｉＲＮＡに比べ、塩基配列を置換させたｓｉＲＮＡ配列が、癌細胞死滅効果がさらに著しく増大されたことを示す。

残基置換されたｓｉＲＮＡとシスプラチンとの併用治療効果
上述の方法でＨｅＬａ細胞株にシスプラチンと塩基配列残基を置換させた組み合わせ４８を処理して、ＳＡ β−Ｇａｌ活性を測定した結果、図３ａ及び図３ｂに示されたように、シスプラチンと組み合わせ４８をそれぞれ単独処理した細胞株においても細胞が青色に染色されてＳＡ β−Ｇａｌの活性を示すが、組み合わせ４８とシスプラチンの併用処理群では、ほぼ全ての細胞が濃い青色に染色され、強いＳＡ β−Ｇａｌの活性を示している。このような結果は、ｓｉＲＮＡとシスプラチンの単独治療群より併用治療群の細胞老化効果が著しく優れていることを示している。

ｓｉＲＮＡ混合物の単独治療及び併用治療による細胞増殖抑制効果
上述の方法でＨＰＶ１６番Ｃａｓｋｉ細胞株にＨＰＶ１６番形態の塩基配列を置換させたｓｉＲＮＡ組み合わせ２、組み合わせ９、及び組み合わせ１３を単独群でそれぞれ２０ｎＭずつ処理し、組み合わせ２と組み合わせ９とを１０ｎＭずつ処理した混合群、組み合わせ２と組み合わせ１３とを１０ｎＭずつ処理した混合群、組み合わせ９と組み合わせ１３とを１０ｎＭずつ処理した混合群、組み合わせ９と組み合わせ１３とを１０ｎＭずつ処理した混合群、そして組み合わせ２、組み合わせ９、組み合わせ１３を７ｎＭずつ処理した混合群を形質導入させた後、２４時間後細胞数を測定した。その結果、図４ａに示されたように、塩基配列を置換させた各ｓｉＲＮＡ単独処理群とｓｉＲＮＡ混合物処理群において、類似した形態で細胞増殖が減少した。特に、ｓｉＲＮＡ三つの混合物処理群では、それぞれのｓｉＲＮＡが７ｎＭしか処理されていないにもかかわらず、効果は、単独でｓｉＲＮＡを２０ｎＭ処理した時と同じ効果を示している。

本発明で使用されたｓｉＲＮＡ混合群の組み合わせは、下記の表３−１〜３−５に示し、これらの組み合わせのうち、特に高い細胞増殖抑制効果を有する組み合わせを２つ以上混合したｓｉＲＮＡ混合群（ｓｉＲＮＡＰｏｏｌ）は、下記の表４に示した。

上述の方法でＨＰＶ１８番ＨｅＬａ細胞株にＨＰＶ１８番形態の塩基配列を置換させたｓｉＲＮＡ組み合わせ４８番２０ｎｍと組み合わせ５４番２０ｎＭ処理と、ｓｉＲＮＡ組み合わせの混合群であるＳＰ４（組み合わせ４８（５ｎＭ）と組み合わせ５４（５ｎＭ））を１０ｎＭ処理した混合群を形質導入させた後、２４時間後ＡｎｎｅｘｉｎＶとプロピジウムイオダイドで染色させた後、フローサイトメトリーを使用して細胞の死滅効果を確認した。その結果、図４ｂに示されたように、塩基配列が置換されたｓｉＲＮＡ単独処理群とｓｉＲＮＡ混合群（ＳＰ４）の両方とも細胞が８０％以上死滅される効果を示した。この結果は、ｓｉＲＮＡ単独群を２０ｎＭ処理した場合とｓｉＲＮＡ混合群で１０ｎＭずつ処理した場合、細胞死滅効果が類似であることから、ｓｉＲＮＡ混合群がさらに優れていることを確認することができる。

ｓｉＲＮＡ混合物の単独治療及び併用治療による分子水準での効果
上述の方法でＨＰＶ１６番形態のＣａｓｋｉ細胞株に塩基配列を置換させた組み合わせ２、９、１３とシスプラチンの併用治療群、シスプラチン単独治療群、組み合わせ２と組み合わせ９の混合群とシスプラチンの併用治療群、組み合わせ２と組み合わせ１３の混合群とシスプラチンの併用治療群、組み合わせ９と組み合わせ１３の混合群とシスプラチンの併用治療群、混合群ＳＰ１（組み合わせ２、組み合わせ９及び組み合わせ１３の混合群）とシスプラチンの併用治療群においてＴＰ５３タンパク質発現量を比較するために、ウェスタンブロット方法を使用した。その結果、図４ｃに示されたように、ｓｉＲＮＡ混合群とシスプラチンとの併用治療群のうち、７ｎＭの低い濃度で処理した混合群ＳＰ１においてＴＰ５３タンパク質発現量が最も多く増加した。

これは、天然に存在するｓｉＲＮＡ混合群の特徴を模倣しながら有能で効率的なｓｉＲＮＡのみを選択的に混合物として構成したため、既存の処理濃度より低い濃度で混合して使用することができ、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果も減らすことができることを示す。

ｓｉＲＮＡのｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果
上述の方法でＨＰＶ１８番形態のＨｅＬａ細胞株に陽性対照群β−ｇａｌｓｉＲＮＡと残基置換のない組み合わせ４４と塩基配列残基を置換させた組み合わせ４８を形質導入し、ＩＬ−６の免疫反応実験を行った。その結果、図５ａに示したように、陽性対照群と組み合わせ４４では、ＩＬ−６の免疫反応が増加されたが、塩基配列の残基が置換された組み合わせ４８では、ＩＬ−６免疫反応が陽性対照群の１／２水準に減少した。

また、６週齢のマウスに免疫反応を誘発させるβ−ｇａｌｓｉＲＮＡとＨＰＶ１８番形態のｓｉＲＮＡ組み合わせ４４と４８を静脈注射して６時間反応した後、ＩＮＦ−ｇａｍｍａの免疫反応実験を行った（図５ｂ）。陽性対照群β−ｇａｌｓｉＲＮＡと組み合わせ４４では、ＩＮＦ−ｇａｍｍａの水準が増加されて免疫反応が観察されたが、組み合わせ４８では、ＩＮＦ−ｇａｍｍａが陰性対照群水準に増加されず、免疫反応が観察されなかった。

これにより、残基を置換させたｓｉＲＮＡの処理群が、残基を置換させなかったｓｉＲＮＡに比べ、免疫反応が減少されることが分かった。

残基置換されたｓｉＲＮＡの薬物動態学実験
上述の方法でラットにＨＰＶ１８番形態のｓｉＲＮＡ組み合わせ４４と組み合わせ４８を静脈内注射で投与し、時間別に血液を採取して、血漿を分離し、ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ方法でｓｉＲＮＡを定量化した。その結果、図６ａに示したように、組み合わせ４８が組み合わせ４４より半減期が２倍以上長くあらわれて、これにより、体内で塩基配列の残基置換された組み合わせ４８がさらに安定的であることが分かった。

多様な形態のＬｉｐｏｓｏｍｅにおけるｓｉＲＮＡ効果
上述の方法でＨＰＶ１８番形態のＨｅＬａ細胞株に商業的に販売されているＤｈａｒｍａｃｏｎ社のＤｈａｒｍａｆｅｃｔ、Ｉｎｖｉｔｒｇｅｎ社のＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００薬物伝達システムと本発明者らが製造した陽イオン性リポソームを使用し、ｓｉＲＮＡを形質導入させて、２４時間後細胞数を測定し、増殖抑制効果を確認した。その結果、図７ａに示したように、多様な薬物伝達システムで効果的にＨＰＶに感染された細胞株にｓｉＲＮＡを伝達させることができることを確認した。

ｓｉＲＮＡ混合群と抗癌剤の併用治療効果
上述の方法でマウスに癌細胞を異種移植して、１０日後に癌細胞が生成されたことを確認した後、ｓｉＲＮＡと抗癌剤を９回繰り返して注射し、２〜３日間隔で腫瘍の大きさを測定した。その結果、図８ａに示したように、ＳＰ４（組み合わせ４８と５４混合群）と抗癌剤の併用治療群が、有意に組み合わせ４４と５１混合群と抗癌剤の併用治療群より優れた治療効果を示している。これは、塩基配列の残基が置換されたＳＰ４が、塩基配列の残基置換のないｓｉＲＮＡ組み合わせ４４と５１の混合群より効能効果が優れていることを示す。また、図８ｂのように、１７日目シスプラチンとパクリタキセル抗癌剤投与群と、抗癌剤とＳＰ４混合併用投与群のマウス腫瘍を比較してみると、その大きさと状態に非常に差があることを確認することができた。そして、図８ｃに示したように、薬物投与後９日目と２８日目にマウス重量の変化量を観察した結果、毒性による重量減少が現れなかった。これにより、ｓｉＲＮＡの毒性による副作用がないことを確認することができた。

以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。

Claims

配列番号５８及び５９のヌクレオチド組み合わせ、並びに配列番号６３及び６５のヌクレオチド組み合わせからなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド組み合わせを有効成分として含むことを特徴とするＨＰＶ（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）感染関連疾患の予防又は治療用組成物。
配列番号５８、５９、６３及び６５のヌクレオチドからなるヌクレオチド混合群を有効成分として含むことを特徴とするＨＰＶ（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）感染関連疾患の予防又は治療用組成物。
前記ＨＰＶ（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）感染関連疾患は、性器疣贅（ｇｅｎｉｔａｌｗａｒｔｓ）、膣炎（ｖａｇｉｎａｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、骨盤炎（ｐｅｌｖｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）及び癌からなる群から選択される請求項１から２のいずれかに記載の組成物。
前記癌は、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ）、膣癌（ｖａｇｉｎａｃａｎｃｅｒ）、外陰癌（ｖｕｌｖａｃａｎｃｅｒ）、肛門癌（ａｎａｌｃａｎｃｅｒ）、陰茎癌（ｐｅｎｉｓｃａｎｃｅｒ）、扁桃癌（ｔｏｎｓｉｌｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｘｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｘｃａｎｃｅｒ）、頭頚部癌（ｈｅａｄ＆ｎｅｃｋｃａｎｃｅｒ）及び肺腺癌（ｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）からなる群から選択される請求項３に記載の組成物。