JPWO2008139938A1

JPWO2008139938A1 - ヒトパピローマウイルス１６型遺伝子を標的とする二本鎖核酸分子及びそれを含む医薬

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Publication number: JPWO2008139938A1
Application number: JP2009514103A
Authority: JP
Inventors: 建嗣大和; 幸和名取; 真人藤野; 健人山田; 光夫吉野内
Original assignee: KABUSHIKIKAISHA RNAI; Okayama University NUC; Keio University; Tokyo Medical and Dental University NUC
Current assignee: KABUSHIKIKAISHA RNAI; Okayama University NUC; Keio University; Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority date: 2007-05-02
Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2010-08-05
Also published as: WO2008139938A1

Abstract

本発明の目的は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型癌遺伝子の発現に対して高い抑制活性と高い特異性を有するｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子、及び、ＨＰＶ１６型感染に起因する疾患（例えば、子宮頸癌）の治療又は予防に好適な医薬等を提供することにある。即ち本発明は、ＨＰＶ１６型のＥ６及びＥ７癌遺伝子における特定の配列を標的とした、該遺伝子の発現に対して高い抑制活性と高い特異性を有する二本鎖核酸分子；並びに、前記二本鎖核酸分子を含む、ＤＮＡ、ベクター、及び医薬に関する。

Description

本発明は、ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ：ＨＰＶ）１６型感染に起因する疾患（例えば、子宮頸癌）の治療又は予防への応用が期待される、ＨＰＶ１６型遺伝子を標的とした二本鎖核酸分子、及び前記二本鎖核酸分子を含む医薬に関する。

子宮頸癌は、２番目に頻度の高い女性の悪性腫瘍で、その罹患率は、１０万人に対して１８．７人におよぶ（非特許文献１参照）。疫学的及び細胞生物学的研究から、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型、１８型、３１型、３３型、４５型などのハイリスクタイプＨＰＶの持続感染が子宮頸癌の原因であることが明らかとなっている（非特許文献２参照）。子宮頸癌におけるハイリスクＨＰＶゲノムの検出率は、９０％を超え、なかでもＨＰＶ１６は、その６０％近くを占める（非特許文献３参照）。これらのウイルスは、Ｅ６及びＥ７と呼ばれるウイルス癌遺伝子を有するが、これらの遺伝子は本来主にウイルスの複製のために用いられる。しかし、これらの癌遺伝子が発現に異常を来すと、宿主細胞の癌化につながる。一度癌化した細胞の「癌」としての性質を維持するためにも、Ｅ６Ｅ７の発現は不可欠である（非特許文献４参照）。

近年の分子生物学的研究によってハイリスクタイプＨＰＶによる発癌機構が明らかとなってきた。Ｅ６癌遺伝子産物は、ｐ５３癌抑制遺伝子産物をユビキチン化によって分解し、その機能を抑制する（非特許文献５〜６参照）。その他、ｐ３００／ＣＢＰコアクチベーター、ｈＤｌｇ癌抑制遺伝子産物などが知られている。Ｅ７タンパク質は、細胞周期を制御する分子群に結合し、その機能を阻害する。その中に、Ｒｂタンパク質ファミリーに属するＲｂ（非特許文献７〜８参照）、ｐ１０７、ｐ１３０（非特許文献９〜１０参照）や、ＣＰＫ阻害分子であるｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}（非特許文献１１〜１２参照）やｐ２７^ＫＩＰ１（非特許文献１３参照）などがあるが、これらの分子の機能抑制の結果、Ｇ１／Ｓ移行の促進とＤＮＡ合成に必要な遺伝子群の発現を誘導する。しかし、こうしたＥ７の効果は、同時に宿主細胞の染色体の数的及び構造的不安定化をもたらし、その結果遺伝子変化を蓄積して宿主細胞の癌化を引き起こす（非特許文献１４〜１６参照）。最近、Ｅ７は、細胞老化をコントロールするＰＭＬ遺伝子産物とも複合体を形成することが報告されている（非特許文献１７〜１９参照）。

以上のようにハイリスクＨＰＶの癌遺伝子発現と子宮頸癌発生には、密接な関係があり、このウイルス癌遺伝子を子宮頸癌の治療標的とすることは極めて合理的であり、またヒトゲノムには存在しない遺伝子であるため特異性の高い標的である。これまでにこのウイルス癌遺伝子を標的としたオリゴヌクレオチドＤＮＡやリボザイムを用いたＨＰＶ関連癌細胞の増殖抑制が報告されているが、その基盤技術そのものの問題より実用化されていない。

最近、ｓｉＲＮＡといわれる約２１〜２３塩基の２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入することによって、その一方に相補的な配列を有するｍＲＮＡの発現を特異的に抑制する技術が導入された（非特許文献２０〜２１参照）。このような現象は、ＲＮＡｉ干渉として広く動植物細胞のなかで生体防御や遺伝子発現制機構として存在することが知られている。現在、このＲＮＡｉ技術は、遺伝子の機能解析や、疾患責任遺伝子を標的とした分子治療に応用されようとしている。これまでハイリスクタイプＨＰＶのＥ６及びＥ７を標的としたｓｉＲＮＡが合成され、ＨＰＶ陽性子宮頸癌細胞の増殖を抑制できることが明らかとなっている（非特許文献２２〜２７参照）。このことからもＲＮＡｉ技術をＨＰＶ陽性子宮頸癌の治療に応用できることが示唆されている。
しかしながら、これまでに報告されているこれらのｓｉＲＮＡについては、ＲＮＡｉ活性と特異性についての十分な検証がなされておらず、実際に子宮頸癌等の治療に応用するには不十分である可能性も高い。

本発明は、前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＨＰＶ１６型のＥ６及びＥ７癌遺伝子の発現に対して高い抑制活性と高い特異性を有するｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子、及び、ＨＰＶ１６型感染に起因する疾患（例えば、子宮頸癌）の治療又は予防に好適な医薬等を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行い、ＨＰＶ１６陽性癌細胞及びＨＰＶ１６陰性癌細胞を用い、これらに対するｓｉＲＮＡの細胞増殖抑制活性を前記細胞間で比較することにより、複数種のｓｉＲＮＡ配列の中から、ＨＰＶ１６型のＥ６及びＥ７癌遺伝子に対する高い抑制活性（ＲＮＡｉ活性）と高い特異性を有するｓｉＲＮＡ配列を効率的に選択し、本発明の完成に至った。

従来から、ＨＰＶ癌遺伝子であるＥ６及びＥ７遺伝子を標的として合成されたｓｉＲＮＡにより、ＨＰＶ陽性子宮頸癌細胞の増殖を抑制できることが報告されていた（例えば、前記非特許文献２２〜２７参照）。
しかしながら、実際にｓｉＲＮＡを子宮頸癌に対する医薬として用いるためには、発現を抑制したい特定の型のＨＰＶ癌遺伝子に対する高いＲＮＡｉ活性と高い特異性を有するｓｉＲＮＡ配列を見つけることが重要となるが、これまで報告されているものについては、ＲＮＡｉ活性と特異性についての十分な検証がなされていない。

そこで、本発明者らは、本発明において、まず、ｓｉＤｉｒｅｃｔコンピュータソフトウエア（Ｎａｉｔｏ，Ｙ．，Ｔ．Ｙａｍａｄａ，ｅｔａｌ．（２００４）．“ｓｉＤｉｒｅｃｔ：ｈｉｇｈｌｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅ，ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｓｉＲＮＡｄｅｓｉｇｎｓｏｆｔｗａｒｅｆｏｒｍａｍｍａｌｉａｎＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．”ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３２（ＷｅｂＳｅｒｖｅｒｉｓｓｕｅ）：Ｗ１２４−９．）を用いて、子宮頸癌原因ウイルスとして最も重要なＨＰＶ１６型のＥ６及びＥ７癌遺伝子に対するｓｉＲＮＡ配列を複数種選択し、次いで、ＨＰＶ１６陽性癌細胞株及びＨＰＶ１６陰性癌細胞株を用いたｓｉＲＮＡ評価システムにより、これらの中からＨＰＶ１６型のＥ６及びＥ７癌遺伝子に対して高いＲＮＡｉ活性と高い特異性を有する配列を選び出した。加えて、種々のオフターゲット作用について検証し、二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄＲＮＡＤＮＡＣｈｉｍｅｒａ、ｄｓＲＤＣ）がこの作用を抑制することを見出した。

本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、配列番号：１のヌクレオチド番号１１７〜１３９、１２８〜１５０、２３３〜２５５、２４３〜２６５、２４４〜２６６、３２４〜３４６、３２６〜３４８、４９３〜５１５、４９７〜５１９、５０１〜５２３、５７３〜５９５、５８３〜６０５、６１５〜６３７、６２５〜６４７、６９８〜７２０、７０７〜７２９、及び、７５２〜７７４からなる群より選択されるいずれかのヌクレオチド配列の領域を標的とすることを特徴とする二本鎖核酸分子である。
＜２＞配列番号：１のヌクレオチド番号４９７〜５１９、５７３〜５９５、及び、７５２〜７７４からなる群より選択されるいずれかのヌクレオチド配列の領域を標的とする前記＜１＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜３＞二本鎖ＲＮＡである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜４＞二本鎖ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡである前記＜３＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜５＞配列番号：２及び３、配列番号：４及び５、配列番号：６及び７、配列番号：８及び９、配列番号：１０及び１１、配列番号：１２及び１３、配列番号：１４及び１５、配列番号：１６及び１７、配列番号：１８及び１９、配列番号：２０及び２１、配列番号：２２及び２３、配列番号：２４及び２５、配列番号：２６及び２７、配列番号：２８及び２９、配列番号：３０及び３１、配列番号：３２及び３３、並びに、配列番号：３４及び３５からなる群より選択されるいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖の組合せからなる前記＜４＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜６＞配列番号：１８及び１９、配列番号：２２及び２３、並びに、配列番号：３４及び３５からなる群より選択されるいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖の組合せからなる前記＜５＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜７＞二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜８＞下記（ａ）又は（ｂ）のセンス鎖及びアンチセンス鎖の組合せからなる、前記＜７＞に記載の二本鎖核酸分子である。
（ａ）配列番号：１８において、３’側の８塩基がＤＮＡであり、それ以外がＲＮＡであるセンス鎖と、配列番号：１９において、５’側の６塩基がＤＮＡであり、それ以外がＲＮＡであるアンチセンス鎖
（ｂ）配列番号：３４において、３’側の８塩基がＤＮＡであり、それ以外がＲＮＡであるセンス鎖と、配列番号３５において、５’側の６塩基がＤＮＡであり、それ以外がＲＮＡであるアンチセンス鎖
＜９＞前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡである。
＜１０＞前記＜９＞に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクターである。
＜１１＞ＨＰＶ１６型感染に起因する疾患を治療又は予防するための医薬であって、前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、前記＜９＞に記載のＤＮＡ、及び、前記＜１０＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする医薬である。

なお、本発明において「二本鎖核酸分子」とは、所望のセンス鎖（パッセンジャー鎖）核酸とアンチセンス鎖（ガイド鎖）核酸の対合により形成された二本鎖の核酸分子を意味する。
本発明において「二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）」とは、前記二本鎖核酸分子のうち、両鎖ともにＲＮＡで構成されるものを意味する。この二本鎖ＲＮＡには、ｄｓＲＮＡ領域のみを有するもののみならず、１８〜２９塩基のｄｓＲＮＡ領域と３〜９塩基のｌｏｏｐ領域を含むｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）が含まれる。前記ｓｈＲＮＡは、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状のｄｓＲＮＡとなる。その後、前記ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的遺伝子の発現抑制に機能することが知られている。
本発明において「二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ」とは、前記二本鎖核酸分子のうち、両鎖それぞれがＲＮＡとＤＮＡのキメラからなる核酸分子から構成されるものを意味する（特許第３８０３３１８号参照）。
本発明において「ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）」とは、前記二本鎖ＲＮＡのうち、２１〜２３塩基長のｄｓＲＮＡを意味する。ｓｉＲＮＡは、二本の鎖が完全に相補的である必要はなく、例えば、各鎖の３’末端が突出した構造を有していてもよい。

本発明によれば、前記従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ＨＰＶ１６型のＥ６及びＥ７癌遺伝子の発現に対して高い抑制活性と高い特異性を有するｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子、及び、ＨＰＶ１６型感染に起因する疾患（例えば、子宮頸癌）の治療又は予防に好適な医薬等を提供することができる。

図１は、ＨＰＶ１６のＥ６及びＥ７遺伝子とｍＲＮＡの構造、各ＰＣＲプライマー、及び各ｓｉＲＮＡの関係を示した図である。図２Ａは、各ＲＬｕｃ−Ｅ６Ｅ７融合遺伝子発現プラスミド（１６ΔＮＥ６／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２、１６Ｅ７／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２、１６ΔＮＥ６Ｅ７／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２）の構造を示した図である。図２Ｂは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡによるＲＬｕｃ−ΔＮＥ６Ｅ７融合ｍＲＮＡの発現抑制を示した図である。図２Ｃは、ＨＰＶ１６Ｅ６ｓｉＲＮＡによるＲＬｕｃ−ΔＮＥ６融合ｍＲＮＡの発現抑制を示した図である。図２Ｄは、ＨＰＶ１６Ｅ７ｓｉＲＮＡによるＲＬｕｃ−Ｅ７融合ｍＲＮＡの発現抑制を示した図である。図３は、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡによる、ＨＰＶ１６陽性細胞（ＳｉＨａ）における内因性Ｅ６Ｅ７発現の抑制を示した図である。図４は、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡの、ＨＰＶ１６陽性細胞（ＦＬ−ＳｉＨａ−２（白））及びＨＰＶ１６陰性細胞（ＦＬ−ＨｅＬａ−１（灰）、ＦＬ−ＳＫＯＶ−５（黒））の増殖に及ぼす効果を示した図である。図５Ａは、ＨＰＶ１６Ｅ６ｓｉＲＮＡ（４９７）及びそのＲＮＡ−ＤＮＡキメラ誘導体（ｄｓＲＤＣ）の、ＲＬｕｃ−ΔＮＥ６融合ｍＲＮＡに対する発現抑制を示した図である。図５Ｂは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（５７３、７０７）とそのＲＮＡ−ＤＮＡキメラ誘導体（ｄｓＲＤＣ）の、ＲＬｕｃ−Ｅ７融合ｍＲＮＡに対する発現抑制を示した図である。図６Ａは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（黒：５ｎＭ、灰：２ｎＭ、白：１ｎＭ）の、ＦＬ−ＨｅＬａ−１細胞増殖に及ぼす効果を示した図である。図６Ｂは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（黒：５ｎＭ、灰：２ｎＭ、白：１ｎＭ）の、ＦＬ−ＳＫＯＶ−５細胞増殖に及ぼす効果を示した図である。図６Ｃは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（黒：５ｎＭ、灰：２ｎＭ、白：１ｎＭ）の、ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞増殖に及ぼす効果を示した図である。図６Ｄは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｄｓＲＤＣ（黒：５ｎＭ、灰：２ｎＭ、白：１ｎＭ）の、ＦＬ−ＨｅＬａ−１細胞増殖に及ぼす効果を示した図である。図６Ｅは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｄｓＲＤＣ（黒：５ｎＭ、灰：２ｎＭ、白：１ｎＭ）の、ＦＬ−ＳＫＯＶ−５細胞増殖に及ぼす効果を示した図である。図６Ｆは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｄｓＲＤＣ（黒：５ｎＭ、灰：２ｎＭ、白：１ｎＭ）の、ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞増殖に及ぼす効果を示した図である。図７Ａは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（７５２、２０３、５３５）による、ＨＰＶ１６陽性細胞（ＦＬ−ＳｉＨａ−２）における内因性Ｅ６Ｅ７発現の抑制を示した図である。図７Ｂは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（１８６、２２２）による、ＨＰＶ１６陽性細胞（ＦＬ−ＳｉＨａ−２）における内因性Ｅ６Ｅ７発現の抑制を示した図である。図７Ｃは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（３７５、７５２、６６０）による、ＨＰＶ１６陽性細胞（ＦＬ−ＳｉＨａ−２）における内因性Ｅ６Ｅ７発現の抑制を示した図である。図８Ａは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（５７３）による、ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞におけるｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現誘導を示した図である。図８Ｂは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（７５２）による、ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞におけるｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現誘導を示した図である。図８Ｃは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（７５２、５７３、１８６、２２２、３７５、６６０）による、ＳｉＨａ細胞におけるｐ５３及びｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現誘導を示した図である。図８Ｄは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（７５２、２０３，５３５）による、ＳｉＨａ細胞におけるｐ５３及びｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現誘導を示した図である。図８Ｅは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（７５２、５７３）による、ＣａＳｋｉ細胞におけるｐ５３及びｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現誘導を示した図である。図９は、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡによるＨＰＶ１６陽性癌細胞（ＦＬ−ＳｉＨａ−２）の細胞老化誘導を示した図である。図１０は、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡによるＨＰＶ１６陽性癌細胞（ＳｉＨａ）のｉｎｖｉｖｏにおける増殖抑制を示した図である。図１１Ａは、ＲＬｕｃ−亜型Ｅ７（７６０ｃ）融合ｍＲＮＡ発現プラスミドの構造を示した図である。図１１Ｂは、７５２ｓｉＲＮＡ及び７５２ｃｓｉＲＮＡの、ＲＬｕｃ−亜型Ｅ７（７６０ｃ）融合ｍＲＮＡに対する発現抑制を示した図である。図１２は、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＤＣによる、ＨＰＶ１６陽性細胞（ＦＬ−ＳｉＨａ−２）における内因性Ｅ６Ｅ７発現の抑制を示した図である。図１３は、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（４９７）による、ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞におけるｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現誘導を示した図である。図１４は、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｄｓＲＤＣ（４９７、５７３、７５２）による、ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞におけるｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現誘導を示した図である。図１５Ａは、ＲＬｕｃ−Ｅ６Ｅ７（＋）鎖ｍＲＮＡ発現プラスミド、及び、ＲＬｕｃ−Ｅ６Ｅ７（−）鎖ｍＲＮＡ発現プラスミドの構造を示した図である。図１５Ｂは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（４９７、５７３、６９８、７０７、７５２）とそれらのｄｓＲＤＣによる、Ｅ６Ｅ７（＋）鎖ｍＲＮＡとＥ６Ｅ７（−）鎖ｍＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性をルシフェラーゼアッセイによって解析した結果を示した図である。図１６Ａは、４９７、５７３、７５２ｓｉＲＮＡ／ｄｓＲＤＣと完全一致配列（４９７ＴＳ、５７３ＴＳ、７５２ＴＳ）、或いは３塩基ミスマッチ配列をウミシイタケルシフェラーゼの３’端に繋いで作製した発現プラスミドの構造を示した図である。図１６Ｂは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（５７３）とそのｄｓＲＤＣのそれぞれのオフターゲット候補配列に対する抑制効果をルシフェラーゼアッセイによって解析した結果を示した図である。図１６Ｃは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（４９７）とそのｄｓＲＤＣのそれぞれのオフターゲット候補配列に対する抑制効果をルシフェラーゼアッセイによって解析した結果を示した図である。図１６Ｄは、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（７５２）とそのｄｓＲＤＣのそれぞれのオフターゲット候補配列に対する抑制効果をルシフェラーゼアッセイによって解析した結果を示した図である。

（二本鎖核酸分子）
本発明の二本鎖核酸分子は、ＨＰＶ１６型のＥ６及びＥ７遺伝子を標的として、前記遺伝子の発現を抑制するものであり、配列番号：１のヌクレオチド番号１１７〜１３９、１２８〜１５０、２３３〜２５５、２４３〜２６５、２４４〜２６６、３２４〜３４６、３２６〜３４８、４９３〜５１５、４９７〜５１９、５０１〜５２３、５７３〜５９５、５８３〜６０５、６１５〜６３７、６２５〜６４７、６９８〜７２０、７０７〜７２９、及び、７５２〜７７４からなる群より選択されるいずれかのヌクレオチド配列の領域を標的とする二本鎖核酸分子である。ここで「ヌクレオチド配列の領域」とは、そのヌクレオチド配列のみならず、自然に生じた変異体における対応するヌクレオチド配列をも含む意である。配列番号：１は、ＨＰＶ１６型（ＨＰＶ１６標準配列（Ｅｕｒｏｐｅａｎｐｒｏｔｏｔｙｐｅに相当）：ＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＫ０２７１８）のＥ６及びＥ７遺伝子配列を含む１位〜８６０位を示す。

また、これらの中でも、ＨＰＶ１６型のＥ６及びＥ７遺伝子発現に対する抑制活性及び特異性が高い点で、配列番号：１のヌクレオチド番号４９７〜５１９、５７３〜５９５、及び、７５２〜７７４からなる群より選択されるいずれかのヌクレオチド配列の領域を標的とする二本鎖核酸分子であることが特に好ましい。

前記二本鎖核酸分子の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラなどが挙げられる。また、前記二本鎖ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）であってもよい。

前記二本鎖核酸分子は、目的に応じて、適宜修飾を有していてもよい。前記修飾としては、例えば、センス鎖（パッセンジャー鎖）の５’端、或いは３’端へのナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチドを結合させたものなどが挙げられる。

前記二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）としては、特にｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）が好ましい。前記ｓｉＲＮＡにおいては、アンチセンス鎖（ガイド鎖）における中央５ヌクレオチド配列が、標的とするＨＰＶ１６型のＥ６及びＥ７遺伝子のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有さないことが好ましく、アンチセンス鎖（ガイド鎖）における全塩基配列が、標的とするＨＰＶ１６型のＥ６及びＥ７遺伝子のヌクレオチド配列の領域に対してミスマッチを有さないことが特に好ましい。また、前記二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラとしては、アンチセンス鎖（ガイド鎖）の５’側６塩基、及び、センス鎖（パッセンジャー鎖）の３’側８塩基がＤＮＡに変換されている２１〜２３塩基長の二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ（ｄｓＲＤＣ）が好ましい。

前記二本鎖核酸分子の入手方法としては、特に制限はなく、例えば、それぞれ従来公知の手法に基づき作製することができる。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、所望のセンス鎖（パッセンジャー鎖）とアンチセンス鎖（ガイド鎖）に相当する２１〜２３塩基長の一本鎖ＲＮＡをそれぞれ合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる。また、所望のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用してｓｉＲＮＡを作製することもできる。また、前記ｄｓＲＤＣは、例えば、キメラ核酸分子であるそれぞれの鎖を化学合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる（特許第３８０３３１８号参照）。

前記二本鎖核酸分子の好ましい態様の具体例としては、例えば、ＨＰＶ１６型のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するためのｓｉＲＮＡであり、配列番号：２及び３、配列番号：４及び５、配列番号：６及び７、配列番号：８及び９、配列番号：１０及び１１、配列番号：１２及び１３、配列番号：１４及び１５、配列番号：１６及び１７、配列番号：１８及び１９、配列番号：２０及び２１、配列番号：２２及び２３、配列番号：２４及び２５、配列番号：２６及び２７、配列番号：２８及び２９、配列番号：３０及び３１、配列番号：３２及び３３、並びに、配列番号：３４及び３５からなる群より選択されるいずれかのセンス鎖（パッセンジャー鎖）及びアンチセンス鎖（ガイド鎖）の組合せからなるｓｉＲＮＡなどが挙げられる。

これらの中でも、ＨＰＶ１６型のＥ６及びＥ７遺伝子発現に対する抑制活性及び特異性が高い点で、配列番号：１８及び１９、配列番号：２２及び２３、並びに、配列番号：３４及び３５からなる群より選択されるいずれかのセンス鎖（パッセンジャー鎖）及びアンチセンス鎖（ガイド鎖）の組合せからなるｓｉＲＮＡが特に好ましい。

また、前記ｓｉＲＮＡから変換されてなるｄｓＲＤＣ（二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ）は、血中安定性、低い合成コスト、インターフェロンの誘導がない、修飾を要しない、などの観点において、有利である。
好ましいｄｓＲＤＣは、配列番号：１８及び１９、配列番号：２２及び２３、並びに、配列番号：３４及び３５からなる群より選択されるいずれかのセンス鎖（パッセンジャー鎖）及びアンチセンス鎖（ガイド鎖）の組合せにおいて、センス鎖の３’側の８塩基をＤＮＡとし、かつ、アンチセンス鎖の５’側の６塩基をＤＮＡとしたものである。
その中でも、下記の点で、配列番号：１８において、３’側の８塩基がＤＮＡであり、それ以外がＲＮＡであるセンス鎖と、配列番号：１９において、５’側の６塩基がＤＮＡであり、それ以外がＲＮＡであるアンチセンス鎖、の組合せからなるｄｓＲＤＣ、及び配列番号：３４において、３’側の８塩基がＤＮＡであり、それ以外がＲＮＡであるセンス鎖と、配列番号：３５において、５’側の６塩基がＤＮＡであり、それ以外がＲＮＡであるアンチセンス鎖、の組合せからなるｄｓＲＤＣが最も好ましい。
（１）標的遺伝子（ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子）以外への二本鎖核酸分子センス鎖に由来する発現抑制作用が、キメラ化することによって顕著に減少している。
（２）標的遺伝子と相同性を有する他の遺伝子発現に対する抑制作用が、キメラ化することによって顕著に抑制されている。
これらオフターゲット作用を抑制する効果は、薬剤にした場合における副作用の抑制につながるが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子を標的とした従来の二本鎖核酸では、示されていない格別の効果である。

（ＤＮＡ、ベクター）
また、本発明は、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡにも関し、更に、本発明は、前記ＤＮＡを含むベクターにも関する。

＜ＤＮＡ＞
前記ＤＮＡとしては、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。中でも、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の上流（５’側）に、前記二本鎖核酸分子の転写を制御するためのプロモーター配列が連結されていることが好ましい。前記プロモーター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＭＶプロモーター等のｐｏｌＩＩ系プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター等のｐｏｌＩＩＩ系プロモーターなどが挙げられる。また、更に、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の下流（３’側）に、前記二本鎖核酸分子の転写を終結させるためのターミネーター配列が連結されていることがより好ましい。前記ターミネーター配列としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記プロモーター配列、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列、及び、前記ターミネーター配列を含む転写ユニットは、前記ＤＮＡにおける好ましい一態様である。なお、前記転写ユニットは、従来公知の手法を用いて構築することができる。

＜ベクター＞
前記ベクターは、前記ＤＮＡを含むものであれば特に制限はなく、その種類としては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。前記ベクターは、従来公知の手法を用いて構築することができ、例えば、前記ＤＮＡを、予め制限酵素で切断したベクターの切断部位に連結（ライゲーション）することにより構築することができる。また、前記ベクターによる前記二本鎖核酸分子の発現様式としても、特に制限はなく、例えばｓｉＲＮＡを発現させる方法として、短い一本鎖ＲＮＡを二本発現させる方法や、ｓｈＲＮＡとしての一本鎖ＲＮＡを発現させる方法等を選択することができる。

前記ＤＮＡ又は前記ベクターを細胞に導入（トランスフェクト）することにより、プロモーターが活性化され、前記二本鎖核酸分子を生成することができる。

（医薬）
本発明の医薬は、ＨＰＶ１６型感染に起因する疾患を治療又は予防するための医薬であり、前記した本発明の二本鎖核酸分子を含み、更に必要に応じてその他の成分を含んでなる。また、前記医薬は、生体内で前記二本鎖核酸分子を発現可能な、前記本発明のＤＮＡ又は前記本発明のベクターを含むものであってもよい。

＜二本鎖核酸分子＞
前記二本鎖核酸分子の詳細としては、前記した本発明の二本鎖核酸分子の項目に記載した通りである。前記二本鎖核酸分子は、標的とするＨＰＶ１６型のＥ６及びＥ７遺伝子の発現を効果的かつ特異的に抑制することができるので、前記医薬の有効成分として好適である。
前記医薬中の前記二本鎖核酸分子の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

なお、前記医薬中の前記二本鎖核酸分子としては、非修飾の状態の二本鎖核酸分子そのものを用いてもよいが、適切に治療又は予防効果が得られるよう、生体への投与に適した形態の二本鎖核酸分子を用いることがより好ましい。

例えば、前記二本鎖核酸分子は、生体内における二本鎖核酸分子の安定性や、細胞への導入効率を高めることができる点で、化学修飾が施されていることが好ましい。前記化学修飾の種類としては、例えば、センス鎖（パッセンジャー鎖）の５’端、或いは３’端へのナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチドを結合させたものなどが挙げられ、また、前記二本鎖核酸分子に前記化学修飾を施す方法としては、従来公知の手法を適宜利用することができる。
また、前記二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子の細胞への導入効率を高めることができる点で、リポソームや高分子マトリックス等と複合体を形成していることも好ましい。前記複合体を形成する方法としては、従来公知の手法を適宜利用することができる。特に、ｏｎｃｏｓｉＦＥＣＴｐｌｕｓ^ＴＭは高いガン組織蓄積性を有する点で、好ましい。
また、前記二本鎖核酸分子は、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター（本発明のベクター）の状態であってもよい。この場合、前記二本鎖核酸分子は、生体内において発現する。前記発現ベクターを用いることにより、二本鎖核酸の細胞への導入効率を高めることができる場合がある。前記発現ベクターの種類としては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどが挙げられ、また、前記発現ベクターを構築する方法としては、従来公知の手法を適宜利用することができる。

＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

＜剤型＞
前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。

前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。

前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。

前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。

前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。

前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。

＜投与＞
前記医薬は、ＨＰＶ１６型感染に起因する疾患の治療又は予防に好適である。前記ＨＰＶ１６型感染に起因する疾患としては、例えば、子宮頸癌とＣＩＮ（子宮頸部上皮内腫瘍）及びＡＩＳ（上皮内腺がん）、肛門癌とその前癌病変、外陰癌とＶＩＮ（外陰部上皮内腫瘍）、膣癌とＶａＩＮ（膣部上皮内腫瘍）、尿道癌、中咽頭癌、口腔癌、喉頭癌、などの癌と前癌病変でＨＰＶ１６が陽性のもの、またこれら以外のＨＰＶ１６持続感染状態などが挙げられる。

前記医薬の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられる。

前記医薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬の剤型、疾患の種類、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与においては、前記医薬の有効成分（二本鎖核酸分子）を、所望の部位（例えば、腫瘍部位）に直接注入することにより投与することができる。また、所望の部位に近い皮膚への局所的な塗布により投与することもできる。所望の部位へ直接的に投与を行わない場合においては、前記医薬の有効成分（二本鎖核酸分子）が所望の部位（例えば、腫瘍部位）まで安定に、かつ効率良く送達されるよう、従来公知の薬剤送達技術を適宜応用することが好ましい。

前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与形態や、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたりの有効成分（二本鎖核酸分子）の量としては、標的部位における二本鎖核酸分子の濃度が、次の濃度となるような量とすることができる。即ち、徐放効果や標的部位での細胞内への導入効率が低い（例えば、裸のオリゴヌクレオチドの導入を目的とした場合）ＤＤＳ（例えば、アテロコラーゲン）を用いた場合には、通常、０．５〜５，０００ｎＭであり、標的部位での細胞内への導入効率のよいＤＤＳ（例えば、非ウイルスベクター）を用いた場合は、通常、０．１〜１００ｎＭである。

前記医薬の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
また、前記医薬の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。

［効果］
本発明の二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、ベクター、及び医薬は、標的とするＨＰＶ１６型のＥ６及びＥ７癌遺伝子の発現を効果的かつ特異的に抑制することができるので、高い治療効果又は予防効果を有し、かつ副作用の少ない、優れたＨＰＶ１６型感染に起因する疾患用医薬としての利用が期待される。

以下に本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

（実施例：ＨＰＶ１６のＥ６及びＥ７遺伝子に対するｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＤＣの評価）
本実施例では、まず、子宮頸癌原因ウイルスとして最も重要なヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のＥ６及びＥ７遺伝子に対するｓｉＲＮＡを複数種設計・作製し、次いで、ＨＰＶ１６陽性細胞及びＨＰＶ１６陰性細胞を用いたｓｉＲＮＡ評価システムを用いて、ＨＰＶ１６のＥ６及びＥ７遺伝子の発現に対して高い抑制活性（ＲＮＡｉ活性）と高い特異性を有する配列を選び出した。更に、前記高い特異性を有する配列を二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄＲＮＡＤＮＡＣｈｉｍｅｒａ、ｄｓＲＤＣ）に変換し、種々のオフターゲット作用を検証した。
以下に、本実施例で用いた各手法を説明し、次いで、＜実験１＞〜＜実験１６＞として、本実施例の詳細（ＨＰＶ１６のＥ６及びＥ７遺伝子に対するｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＤＣの設計、作製、評価、及びそれらの結果）を記す。

[細胞株]
ＨＰＶ１６陽性子宮頸癌細胞株（ＳｉＨａ、ＣａＳｋｉ）、ＨＰＶ１８陽性子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）、ＨＰＶ陰性卵巣癌細胞株（ＳＫ−ＯＶ−３）は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ＳＫ−ＯＶ−３細胞は、１０％仔牛血清加ＲＰＭＩ１６４０で、それ以外の細胞は、１０％仔牛血清加ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養した。

[プラスミドトランスフェクション]
トランスフェクション前日に細胞をシャーレに播き、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてプラスミドのトランスフェクションを行った。

[ｓｉＲＮＡ作製とトランスフェクション]
ＨＰＶ１６標準配列（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＫ０２７１８）のＥ６及びＥ７コード領域（配列番号：１のヌクレオチド１０４−８５５）を標的とするｓｉＲＮＡの配列は、ｓｉＤｉｒｅｃｔソフトウエアシステム（ｈｔｔｐ：／／ｄｅｓｉｇｎ．ＲＮＡｉ．ｊｐ／）（Ｎａｉｔｏ，Ｙ．，Ｔ．Ｙａｍａｄａ，ｅｔａｌ．（２００４）．“ｓｉＤｉｒｅｃｔ：ｈｉｇｈｌｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅ，ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｓｉＲＮＡｄｅｓｉｇｎｓｏｆｔｗａｒｅｆｏｒｍａｍｍａｌｉａｎＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．”ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３２（ＷｅｂＳｅｒｖｅｒｉｓｓｕｅ）：Ｗ１２４−９．）を用いて選択された（表２、後述）。２１塩基リボヌクレオチドを合成し、バッファー内（１００ｍＭｐｏｔａｓｓｉｕｍａｃｅｔａｔｅ，３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ７．４，２ｍＭｍａｇｎｅｓｉｕｍａｃｅｔａｔｅ）でアニーリングし、さらにカラム精製を行った（Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）。
オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、添付書通りに行った（使用は、図１と図８Ｅの実験にのみ）。また、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｓｉＲＮＡのトランスフェクションも、添付書通りにおこなった（使用は、図１２の実験にのみ）。それ以外の実験では、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。トランスフェクション前日、ＳｉＨａ細胞は、６ウエルプレートに、１ウエル当たり２ｍｌの１０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭ培地に１００，０００細胞で播いた。様々な量のｓｉＲＮＡを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて稀釈し５０μＬとした。リポフェクタミン２０００は、ＨｅＬａ細胞に対して０．４μＬを、ＳｉＨａ細胞とＳＫ−ＯＶ−３細胞に対しては１．６μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭＩによって５０μＬになるように稀釈した。稀釈したｓｉＲＮＡとリポフェクタミン２０００を一緒にして室温で１０〜２０分インキュベーションし、それから培養液に加えた。全ての実験においてリポフェクタミン２０００の量は、培地体積に比例させた。

[プラスミド作製]
（ｉ）ｈＬｕｃ／ｐｃＤＮＡ３
ｈＬｕｃｃＤＮＡフラグメントをｐｓｉＣｈｅｃｋ−２から制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切り出し、ｐｃＤＮＡ３のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩサイトに繋いだ。
（ｉｉ）１６ΔＮＥ６Ｅ７／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２、１６ΔＮＥ６／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２、１６Ｅ７／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２
ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７領域（ヌクレオチド２３１−８５８）は、ｐＳＶ２−Ｅ６Ｅ７（国立感染症研究所、神田博士から譲渡された）を鋳型としてｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたＰＣＲ増幅によって得られた。Ｅ６センスとＥ７アンチセンスプライマーには、制限酵素ＮｏｔＩサイトが５’端に付加されており、ＰＣＲ後ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサイトに平滑端で挿入した。クローニングされたＥ６Ｅ７（２３１−８５８）フラグメントは、制限酵素ＮｏｔＩによって切り出した後、ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮｏｔＩサイトに繋ぎ、出来上がったプラスミドは、１６ＮΔＥ６Ｅ７／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２と名付けた。
ΔＮＥ６領域（２３１−５５９）とＥ７領域（５６２−８５８）を、ｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ、鋳型としてｐＳＶ２−Ｅ６Ｅ７、５’端にそれぞれＮｏｔＩサイトとＸｈｏＩサイトを有するＥ６プライマーペア或いはＥ７プライマーペアによって増幅後、ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサイトに平滑端で挿入した。ΔＮＥ６フラグメント（２３１−５５９）とＥ７フラグメント（５６２−８５８）は、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、それぞれｐｓｉＣｈｅｃｋ−２のＮｏｔＩ／ＸｈｏＩサイトに繋いだ（１６ΔＮＥ６／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２，１６Ｅ７ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２）。
１６Ｅ７／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２のヌクレオチド７６０の塩基チミンは、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｓｉｓｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてシトシンに変更したが、このプラスミドを、１６Ｅ７（７６０Ｃ）／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２と命名した。
ＤＮＡフラグメントは、熱変成９２℃、２分、続いて（熱変成９４℃、３０秒、アニーリング６１℃、３０秒、エクステンション７２℃、２分）ｘ２５サイクルの条件で、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ増幅された。
プラスミド作製に用いられたプライマー（下線はＮｏｔＩサイトとＸｈｏＩサイト）は以下の通り：
Ｎｏｔ−ＨＰＶ１６＿２３１ｓ，ｇｃｇｇｃｃｇｃａｔｇａｃｔｔｔｇｃｔｔｔｔｃｇｇｇａｔ（配列番号：４８）
Ｘｈｏ−ＨＰＶ１６＿２３１ｓ，ｃｔｃｇａｇａｔｇａｃｔｔｔｇｃｔｔｔｔｃｇｇｇａｔ（配列番号：４９）
Ｎｏｔ−ＨＰＶ１６＿Ｅ６ａｓ，ｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｃａｇｃｔｇｇｇｔｔｔｃｔｃｔａｃ（配列番号：５０）
Ｘｈｏ−ＨＰＶ１６＿Ｅ７ｓ，ｃｔｃｇａｇａｔｇｃａｔｇｇａｇａｔａｃａｃｃｔａｃ（配列番号：５１）
Ｎｏｔ−ＨＰＶ１６＿Ｅ７ａｓ，ｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｔｇｇｔｔｔｃｔｇａｇａａｃａｇａ（配列番号：５２）
（ｉｉｉ）ｈＲＬ−１６ΔＮＥ６／ｐＺｅｏＳＶ２、ｈＲＬ−１６Ｅ７／ｐＺｅｏＳＶ２
ｈＲＬ−１６ΔＮＥ６フラグメントとｈＲＬ−１６Ｅ７フラグメントを、それぞれｈＲＬ−１６ΔＮＥ６／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２及びｈＲＬ−１６Ｅ７／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２から制限酵素ＮｈｅＩとＮｏｔＩで切り出し、ｐＺｅｏＳＶ２のＮｈｅＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入した。出来上がったプラスミドは、それぞれｈＲＬ−１６ΔＮＥ６／ｐＺｅｏＳＶ２及びｈＲＬ−１６Ｅ７／ｐＺｅｏＳＶ２と命名された。
（ｉｖ）１６Ｅ６Ｅ７（＋）／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−１、１６Ｅ６Ｅ７（−）／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−１
Ｅ６Ｅ７領域（９７−８５８）を、ｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ、鋳型としてｐＳＶ２−Ｅ６Ｅ７、５’端にそれぞれＮｏｔＩサイトを有するＥ６センスプライマー（Ｎｏｔ−ＨＰＶ１６＿Ｅ６＿９７ｓ）及びＥ７アンチプライマー（Ｎｏｔ−ＨＰＶ１６＿Ｅ７ａｓ）によって増幅後、ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサイトに平滑端で挿入した。Ｅ６Ｅ７フラグメント（９７−８５８）は、制限酵素ＮｏｔＩによって切り出し、ｐｓｉＣｈｅｃｋ−１のＮｏｔＩサイトに繋ぎ、ＲＬｕｃ−Ｅ６Ｅ７（＋）及びＲＬｕｃ−Ｅ６Ｅ７（−）ｍＲＮＡ発現プラスミドを分離し、それぞれ１６Ｅ６Ｅ７（＋）／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−１、１６Ｅ６Ｅ７（−）／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−１と命名した。
プラスミド作製に用いられたプライマー（下線はＮｏｔＩサイト）は以下の通り：
Ｎｏｔ−ＨＰＶ１６＿Ｅ６＿９７ｓ，ｇｃｇｇｃｃｇｃａａｃｔｇｃａａｔｇｔｔｔｃａｇｇａｃｃ（配列番号：６０）
（ｖ）４９７ＴＳ／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２、５７３ＴＳ／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２、７５２ＴＳ／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２、及び、ミスマッチ配列を有するその他のプラスミド
Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡの標的配列２３塩基（４９７ＴＳ，５７３ＴＳ，７５２ＴＳ）のセンス鎖の５’端にＮｏｔＩサイトを付けたオリゴＤＮＡと、アンチセンス鎖の５’端にＸｈｏＩサイトを付けたものを合成し、アニーリング後、ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２のＮｏｔＩ／ＸｈｏＩサイトに繋いだ。これらのプラスミドはそれぞれ４９７ＴＳ／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２、５７３ＴＳ／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２、及び７５２ＴＳ／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２と命名した。
またｓｉＤｉｒｅｃｔソフトウエアによって検出されたＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（４９７，５７３，７５２）の３塩基ミスマッチを有するオフターゲット候補配列についても同様にセンス鎖の５’端にＮｏｔＩサイトを、アンチセンス鎖にＸｈｏＩサイトを付けアニーリングした２本鎖ＤＮＡを、ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２のＮｏｔＩ／ＸｈｏＩサイトに繋いだ。３塩基ミスマッチを有する４９７ｓｉＲＮＡのオフターゲット候補配列は２つあり、それぞれ４９７ＯＴ１と４９７ＯＴ２と命名された。５７３ｓｉＲＮＡのオフターゲット候補配列は７種類ありそのうち６種類のプラスミドを作成した（５７３ＯＴ１，２，３，５，７，８）。また、５７３ＯＴ２との比較のためにガイド鎖の５’端から１０番目と１１番目の２つのミスマッチを有する標的配列５７３（１０，１１）のプラスミドを作成した。７５２ｓｉＲＮＡのオフターゲット候補は１種類（７５２ＯＴ１）であった。
プラスミド作製に用いられたオリゴＤＮＡ（下線はＮｏｔＩサイトとＸｈｏＩサイト）は以下の通り：
４９７ＴＳ
ＴＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＧＣ（配列番号：６１）
ＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＧＡＣＣＧＧＴＣＣＡＣ（配列番号：６２）
５７３ＴＳ
ＴＣＧＡＧＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＡＡＴＡＴＡＧＣ（配列番号：６３）
ＧＧＣＣＧＣＴＡＴＡＴＴＣＡＴＧＣＡＡＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＣ（配列番号：６４）
７５２ＴＳ
ＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧＣＧＣ（配列番号：６５）
ＧＧＣＣＧＣＧＣＴＴＴＧＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＣ（配列番号：６６）
４９７ＯＴ１
ＴＣＧＡＧａｇｇａｔｃｔｇｔｃｇａｔｇｔａｔｇｔｔｔｔｃＧＣ（配列番号：６７）
ＧＧＣＣＧＣｇａａａａｃａｔａｃａｔｃｇａｃａｇａｔｃｃｔＣ（配列番号：６８）
４９７ＯＴ２
ＴＣＧＡＧｔｃｔａｃｃｔｇｔｃｃａｔｇｔａｔｇｔｃｔｇｃＧＣ（配列番号：６９）
ＧＧＣＣＧＣｇｃａｇａｃａｔａｃａｔｇｇａｃａｇｇｔａｇａＣ（配列番号：７０）
５７３ＯＴ１
ＴＣＧＡＧｇａｃａｃａｔａｃａｔｔｇａａｔａａａｔａａｔＧＣ（配列番号：７１）
ＧＧＣＣＧＣａｔｔａｔｔｔａｔｔｃａａｔｇｔａｔｇｔｇｔｃＣ（配列番号：７２）
５７３ＯＴ２
ＴＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＧＣ（配列番号：７３）
ＧＧＣＣＧＣＡＴＡＡＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＧＴＡＧＧＴＧＧＴＣ（配列番号：７４）
５７３ＯＴ３
ＴＣＧＡＧｔａｃａｃｃｔａｃａａｔｇｃａｇｇａａｔｃｔｇＧＣ（配列番号：７５）
ＧＧＣＣＧＣｃａｇａｔｔｃｃｔｇｃａｔｔｇｔａｇｇｔｇｔａＣ（配列番号：７６）
５７３ＯＴ５
ＴＣＧＡＧｃａｃａａｃｔａｃａｔｔａｃａｔｔａａｔａｔｇＧＣ（配列番号：７７）
ＧＧＣＣＧＣｃａｔａｔｔａａｔｇｔａａｔｇｔａｇｔｔｇｔｇＣ（配列番号：７８）
５７３ＯＴ７
ＴＣＧＡＧｇａｃａａｃｔｔｃａｔｃｇｃａｔｇａａｔａｇａＧＣ（配列番号：７９）
ＧＧＣＣＧＣｔｃｔａｔｔｃａｔｇｃｇａｔｇａａｇｔｔｇｔｃＣ（配列番号：８０）
５７３ＯＴ８
ＴＣＧＡＧＧＣＣＴＣＣＴＡＣＡＴＴＧＴＡＧＧＡＡＴＡＣＴＧＣ（配列番号：８１）
ＧＧＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＴＧＴＡＧＧＡＧＧＣＣ（配列番号：８２）
５７３（１０，１１）
ＴＣＧＡＧＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＡＡＧＣＡＴＧＡＡＴＡＴＡＧＣ（配列番号：８３）
ＧＧＣＣＧＣＴＡＴＡＴＴＣＡＴＧＣＴＴＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＣ（配列番号：８４）
７５２ＯＴ１
ＴＣＧＡＧＧＴＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＡＡＡＣＴＧＣ（配列番号：８５）
ＧＧＣＣＧＣＡＧＴＴＴＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣ（配列番号：８６）
なお、ＴＳ配列と異なる塩基の部分についても下線で示した。

[ホタルルシフェラーゼ発現ＨＰＶ１６陽性及び陰性癌培養細胞の作製、並びにｓｉＲＮＡ導入効率の確認]
ＨＰＶ１６陽性癌細胞（ＳｉＨａ）とＨＰＶ１６陰性癌細胞（ＳＫ−ＯＶ−３、ＨｅＬａ）に、リポフェクタミン２０００を用いてホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）発現プラスミド（ｈＬｕｃ／ｐｃＤＮＡ３）をトランスフェクションした後に、Ｇ４１８存在下で培養し、ＦＬｕｃを安定的に発現するＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞、ＦＬ−ＳＫＯＶ−５細胞及びＦＬ−ＨｅＬａ−１細胞をそれぞれ分離した。ＦＬｕｃを標的とするｓｉＲＮＡ配列をｓｉＤｉｒｅｃｔソフトウエアを用いて選択し、ｓｉＲＮＡを合成した。
作製した、ＦＬｕｃを恒常的に発現するＳｉＨａ細胞（ＦＬ−ＳｉＨａ−２）、ＨｅＬａ細胞（ＦＬ−ＨｅＬａ−１）及びＳＫ−ＯＶ−３細胞（ＦＬ−ＳＫＯＶ−５）について、ｓｉＲＮＡ導入効率を比較した。これらの細胞に５ｎＭのコントロールｓｉＲＮＡ或いはＦＬｕｃｓｉＲＮＡをリポフェクタミン２０００を用いてトランスフェクションし、４８時間後にＦＬｕｃ活性を測定した。実験は、トリプリケートで測定し、平均値±標準偏差を示した。結果を下記の表１に示す。
トランスフェクションを行った条件では、これらの細胞におけるＦＬｕｃ活性の抑制率（％Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）は、９０％以上でほぼ同等と考えられた。

[ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）−ΔＮＥ６融合ｍＲＮＡ或いはＲＬｕｃ−Ｅ７融合ｍＲＮＡとＦＬｕｃを同時に発現するＳｉＨａ細胞の作製]
ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞にｈＲＬ−１６ΔＮＥ６／ｐＺｅｏＳＶ２或いはｈＲＬ−１６Ｅ７／ｐＺｅｏＳＶ２をトランスフェクション後、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）とＺｅｏｃｉｎ（１ｍｇ／ｍｌ）存在下で培養し、ＦＬｕｃとＲＬｕｃ−ΔＮＥ６（ＲＬＥ６−ＦＬ−ＳｉＨａ−１０）或いはＦＬｕｃとＲＬｕｃ−Ｅ７（ＲＬＥ７−ＦＬ−ＳｉＨａ−２）を同時に発現するＳｉＨａ細胞を分離した。

［イムノブロット法］
細胞（２−５ｘ１０^５）をＰＢＳで洗った後、直接１００μＬのＳＤＳゲルローディングバッファーに解かし、９５℃で５ｍｉｎ加熱した。そのうち１０μＬのサンプルを０．１％ＳＤＳ加プリアクリルアミドゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。３％ウシアルブミン加Ｔ−ＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１３７ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．６）で室温１時間ブロッキング後、１次抗体と４℃で一昼夜反応させ、一度Ｔ−ＴＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）と室温で３０分反応させた。室温で多量のＴ−ＴＢＳを用いて３０分の洗浄を３回繰り返した後、基質としてＥＣＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を加えた蛍光発色反応を行い、蛍光シグナルを蛍光イメージアナライザ（富士フィルム）によって検出した。抗体は、抗ｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}モノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗ｐ５３モノクローナル抗体（ＤＯ−１）（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）、及び抗ｌａｍｉｎＡ／Ｃモノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。

［ＲＴ−ＰＣＲ反応］
ＤＮＡフリー総ＲＮＡを培養細胞からＨｉｇｈｐｕｒｅＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）で精製分離し、一本鎖ｃＤＮＡを５００ｎｇのＲＮＡからＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて合成した。ＰＣＲ反応は、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、βアクチン、或いは１８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ特異的センス・アンチセンスプライマーペアとＥｘＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いて行った。各反応において、未処理ＳｉＨａ細胞ｃＤＮＡを段階稀釈したものを検量線用スタンダードとして用いた。ＰＣＲは、熱変成９４℃ ５分間に続いて（熱変成９４℃ ３０秒間、アニーリング５８℃ ３０秒間、エクステンション７２℃ ３０秒間）ｘ２２−２６サイクルを行った。
ＰＣＲ産物は、２．５％アガロースゲル内で電気泳動によって分離し、ＳＹＢＲＧＯＬＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ）で染色後、ＦＬＡ−２０００フルオロイメージアナライザ（富士フィルム）で解析した。バンドシグナル強度は、ＩｍａｇｅＧａｕｇｅソフトウエア（富士フィルム）で定量し、βアクチン或いは１８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡを内部コントロールとして使用し補正後、各サンプルの比較を行った。ＨＰＶ１６Ｅ６ｃＤＮＡ、Ｅ７ｃＤＮＡ、及びβアクチンのプライマーは、以下の通りである：
ＨＰＶ１６Ｅ６センスプライマー（１６Ｅ６ｓ１０４），５’−ＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡ−３’（配列番号：５３）；
ＨＰＶ１６Ｅ６アンチセンスプライマー（１６Ｅ６ａｓ５５８），５’−ＴＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＣＴＣＴＡＣＧ−３’（配列番号：５４）；
ＨＰＶ１６Ｅ６センスプライマー（１６Ｅ６ａｓ３７５），５’−ＴＧＣＴＧＴＴＣＴＡＡＴＧＴＴＧＴＴＣＣ−３’（配列番号：５５）；
ＨＰＶ１６Ｅ７センスプライマー（１６Ｅ７ｓ５６２），５’−ＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号：５６）；
ＨＰＶ１６Ｅ７アンチセンスプライマー（１６Ｅ７ａｓ８５５），５’−ＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡ−３’（配列番号：５７）；
βアクチンセンスプライマー（β−ａｃｔｉｎ−ｓ），５’−ＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴ−３’（配列番号：５８）；及び
βアクチンアンチセンスプライマー（β−ａｃｔｉｎ−ａｓ），５’−ＴＧＧＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＧＣＧＧＴＴ−３’（配列番号：５９）。
１８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ用のプライマーは，Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．より購入した。

［ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ腫瘍細胞増殖］
ｉｎｖｉｔｒｏにおけるｓｉＲＮＡの腫瘍細胞の増殖におよぼす効果は、ＷＳＴ−８（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ８，同仁化学研究所）を用いた発色反応による生存細胞数の比較によって行った。また、ｓｉＲＮＡのｉｎｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の増殖におよぼす効果の解析のために、ＳｉＨａ細胞（２ｘ１０^７ｃｅｌｌｓ）をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（６週齢）の皮下に接種した。接種６週間後、接種部位に形成された皮下腫瘍にアテロコラーゲン（アテロジーン、高研）と複合体を形成させたｓｉＲＮＡ（５００ｐｍｏｌｅ）を直接腫瘍内に注射投与した。７日毎にｓｉＲＮＡの投与を繰り返し、初回投与３０日後に、マウスをＵＫＣＣＣＲガイドラインにそって安楽死させ、腫瘍を切り出して重量（ｇ）を計測した。実験結果の有意差は、スチューデントｔ検定を行い、Ｐ＜０．０５の場合に統計学的に有為差があると判断した。

［細胞老化関連β−ガラクトシダーゼ染色］
培養細胞をＳｅｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＳｔａｉｎｉｎｇＫｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いて固定・細胞老化関連β−ガラクトシダーゼ染色後、倒立顕微鏡で観察・写真撮影を行った。

［ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ誘導体（ｄｓＲＤＣ）の作製］
ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖の３’端より８塩基のＲＮＡとガイド鎖の５’端より６塩基のＲＮＡをＤＮＡに置換した２１塩基ＲＮＡ−ＤＮＡキメラを合成し、バッファー内（１００ｍＭｐｏｔａｓｓｉｕｍａｃｅｔａｔｅ，３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ７．４，２ｍＭｍａｇｎｅｓｉｕｍａｃｅｔａｔｅ）でアニーリングし、さらにカラム精製を行った（Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）。

＜実験１．ＨＰＶ１６のＥ６及びＥ７遺伝子に対するｓｉＲＮＡの作製＞
ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のＥ６及びＥ７遺伝子に対するｓｉＲＮＡ配列を、ＨＰＶ１６標準配列（Ｅｕｒｏｐｅａｎｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＫ０２７１８）（配列番号：１）をもとにして、ｓｉＤｉｒｅｃｔソフトウエア（Ｎａｉｔｏ，Ｙａｍａｄａｅｔａｌ．２００４、前述）を用いて選択した。選択した各ｓｉＲＮＡ配列の詳細を、下記の表２に示す。また、各配列のｓｉＲＮＡは、前記した手法に沿い、ガイド鎖（アンチセンス鎖）とパッセンジャー鎖（センス鎖）をそれぞれ合成し、アニーリングすることにより作製した。
表２中、各ｓｉＲＮＡは、ガイド鎖３’端のＨＰＶ１６標準配列におけるヌクレオチド番号で命名した。ヌクレオタイドの位置は、ガイド鎖３’端のヌクレオチド番号からパッセンジャー鎖３’端のヌクレオチド番号までとして表記した。ミスマッチトレランス（Ｍｉｓｍａｔｃｈｔｏｌｅｒａｎｃｅ）は、ガイド鎖或いはパッセンジャー鎖とヒト遺伝子の非重複配列データベースとの間にあるミスマッチ塩基の数で、おもにミスマッチトレランス３以上のものを選んだ。また、ＨＰＶ１６クラス及びサブクラスでｓｉＲＮＡガイド鎖とミスマッチが一つ以上あるものを列挙し、その位置を示した。ＥＧ（１３１）は、ＥｕｒｏｐｅａｎＧｅｒｍａｎ１３１；Ａｆ１は、Ａｆｒｉｃａｎ１；Ａｆ２は、Ａｆｒｉｃａｎ２；ＮＡ１は、ＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎ１；ＡＡは、ＡｓｉａｎＡｍｅｒｉｃａｎ；Ａｓは、ＥａｓｔＥｓｉａｎを表す。
また、表２中の４９７及び５０１の５’−ＵＧＵＣＵ−３’は、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）活性化配列である（ＪｕｄｇｅＡＤ，ＳｏｏｄＶ，ＳｈａｗＪＲ，ＦａｎｇＤ，ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋＫ，ＭａｃＬａｃｈｌａｎＩ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍａｍｍａｌｉａｎｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｂｙｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓｉＲＮＡ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２００５；２３：４５７−６２．）。

また、ＨＰＶ１６クラス・サブクラスの亜型Ｅ６及びＥ７遺伝子の塩基配列を下記の表３に示す。
表３中、ＨＰＶ１６標準配列（Ｅｕｒｏｐｅａｎｐｒｏｔｏｔｙｐｅに相当）とＨＰＶ１６クラス・サブクラスの間でＥ６Ｅ７領域の塩基配列を比較し、配列の異なるヌクレオチドの位置とその塩基を示した。−は、ＨＰＶ１６標準配列と同一であった部位；ヌクレオチドの違いでアミノ酸変化をともなう場合は、そのヌクレオチドを大文字で；アミノ酸置換を伴わない場合は、小文字で示した。尚、ＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎＩのＥ７塩基配列は、報告されていない。

また、ＨＰＶ１６のＥ６及びＥ７遺伝子とｍＲＮＡの構造、各ＰＣＲプライマー、及び各ｓｉＲＮＡの関係を図１に示した。
図１中、上段の極太線は、ＨＰＶ１６標準配列（Ｅｕｒｏｐｅａｎｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＫ０２７１８）におけるＥ６とＥ７癌遺伝子コード領域を示す。中段は、主なＥ６Ｅ７ｍＲＮＡ（太線）の種類を示す。数字は、転写開始部位とスプライシング結合部を示す（Ｓｍｏｔｋｉｎ，Ｄ．，Ｈ．Ｐｒｏｋｏｐｈ，ｅｔａｌ．（１９８９）．“ＯｎｃｏｇｅｎｉｃａｎｄｎｏｎｏｎｃｏｇｅｎｉｃｈｕｍａｎｇｅｎｉｔａｌｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓｇｅｎｅｒａｔｅｔｈｅＥ７ｍＲＮＡｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．”ＪＶｉｒｏｌ６３（３）：１４４１−７．）。ＲＴ−ＰＣＲで用いられたＰＣＲプライマーを矢印で示す。また、前記で作製した、Ｅ６及びＥ７を標的とした主なｓｉＲＮＡの位置を短線で下段に示す。

なお、参考として、これまでに論文で報告されているＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡを下記の表４に示す。

また、前記した各ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ配列のオフターゲット傾向を下記の表５に示す。表５は、ｓｉＤｅｓｉｇｎソフトウエアによる解析結果を表にしたものである。表５中、例えば、ＭＴ（ミスマッチトレランス）＝２＊２は、ｓｉＲＮＡ配列と２塩基ミスマッチを有する相補的配列がヒト遺伝子或いはヒトゲノム配列が２つ存在することを意味する。ｍｉＲＮＡ−ｌｉｋｅオフターゲットには、ｍｉＲＮＡと同等の翻訳抑制が予測されるヒト遺伝子の数を示した。オフターゲットの面からは、２０３と４９７が優れることがわかる。

＜実験２．Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡのウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）−Ｅ６Ｅ７融合ｍＲＮＡの一過性発現に及ぼす効果＞
ＨＰＶ１６のＥ６及びＥ７遺伝子に対する各ｓｉＲＮＡについて、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）−Ｅ６Ｅ７融合ｍＲＮＡの一過性発現に及ぼす効果を以下のようにして検討した。
まず、前記した手法に沿い、各ＲＬｕｃ−Ｅ６Ｅ７融合遺伝子発現プラスミド（１６ΔＮＥ６／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２、１６Ｅ７／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２、１６ΔＮＥ６Ｅ７／ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２）をそれぞれ作製した。図２Ａに、各プラスミドの構造を示す。
ＨＰＶ１６ΔＮＥ６（２３１−５５６）、Ｅ７（５６２−８５５）、或いはΔＮＥ６Ｅ７（２３１−８５５）フラグメントは、ｐｓｉＣｈｅｃｋ−２上のＲＬｕｃｃＤＮＡの停止コドン下流にあるマルチクローニング部位に挿入されている。

−Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡによるＲＬｕｃ−ΔＮＥ６Ｅ７融合ｍＲＮＡの発現抑制−
ＳｉＨａ細胞に、ＲＬｕｃ−ΔＮＥ６Ｅ７融合ｍＲＮＡ発現プラスミドと様々な濃度のＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡとを続けてトランスフェクションし、４８時間後にホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）とＲＬｕｃ活性の計測を行った。ＦＬｕｃ活性を内部コントロールとしてＲＬｕｃ活性を補正後比較した。結果を図２Ｂに示す。

−Ｅ６ｓｉＲＮＡによるＲＬｕｃ−ΔＮＥ６融合ｍＲＮＡの発現抑制−
ＳｉＨａ細胞に、ＲＬｕｃ−ΔＮＥ６融合ｍＲＮＡ発現プラスミドと様々な濃度のＥ６ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、前記同様にＦＬｕｃ活性とＲＬｕｃ活性を計測した。結果を図２Ｃに示す。

−Ｅ７ｓｉＲＮＡによるＲＬｕｃ−Ｅ７融合ｍＲＮＡの発現抑制−
ＳｉＨａ細胞に、ＲＬｕｃ−Ｅ７融合ｍＲＮＡ発現プラスミドと様々な濃度のＥ７ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、前記同様にＦＬｕｃ活性とＲＬｕｃ活性を計測した。結果を図２Ｄに示す。

なお、図２Ｂ〜図２Ｄ中、▲は２３３；■は２４３；●は２４４；△は６９８；□は７０７；○は７５２；◇は４９３；及び◆は５７３、の番号が付与されたｓｉＲＮＡを示す。実験は、トリプリケートで行い、平均値と標準偏差を示す。

下記の表６に、図２Ｂ〜図２Ｄの結果より算出された各ｓｉＲＮＡのＩＣ_５０を示す。
表６中、単位は「ｎＭ」であり、「ＮＤ」は未計測を示す。

＜実験３．ＨＰＶ１６陽性ＳｉＨａ子宮頸癌細胞におけるＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡによる内因性Ｅ６Ｅ７発現の抑制＞
ＨＰＶ１６のＥ６及びＥ７遺伝子に対する各ｓｉＲＮＡについて、ＨＰＶ１６陽性ＳｉＨａ細胞の内因性Ｅ６及びＥ７発現に及ぼす効果を以下のようにして検討した。
ＳｉＨａ細胞に、５０ｎＭのコントロールｓｉＲＮＡ或いはＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡをオリゴフェクタミンを用いてトランスフェクションし、４８時間後にＲＴ−ＰＣＲによってＥ６Ｅ７ｍＲＮＡの発現を解析した。バッファーのみをトランスフェクションした細胞のｃＤＮＡを段階稀釈してスタンダードとした。βアクチンのバンド輝度を内部コントロールとしてＥ６及びＥ７バンド輝度を補正後、比較した。結果を図３に示す。なお、図３中、コントロールｓｉＲＮＡ処理した細胞の発現レベルを１００％として、各ｓｉＲＮＡ処理した細胞における相対的Ｅ６或いはＥ７ｍＲＮＡレベル（％）を示した。
図３の結果から、特に４９７、５７３、６９８、７０７及び７５２のｓｉＲＮＡで処理したＳｉＨａ細胞では、Ｅ６或いはＥ７発現レベルのいずれかが１／４以下に減少していることがわかる。

＜実験４．ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡのＨＰＶ１６陽性細胞（ＦＬ−ＳｉＨａ−２）と陰性細胞（ＦＬ−ＨｅＬａ−１、ＦＬ−ＳＫＯＶ−５）の増殖に及ぼす効果＞
ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡの、ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞、ＦＬ−ＨｅＬａ−１細胞、及びＦＬ−ＳＫＯＶ−５細胞の増殖に及ぼす効果を以下のようにして検討した。
トランスフェクション前日、ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞、ＦＬ−ＨｅＬａ−１細胞、及びＦＬ−ＳＫＯＶ−５細胞は、それぞれ１ウエル当たり５ｘ１０^３細胞、３ｘ１０^３細胞、３ｘ１０^３細胞ずつ２４−ウエルプレートに播き、バッファーのみ、コントロールｓｉＲＮＡ（５ｎＭ）、或いはＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（５ｎＭ）をリポフェクタミン２０００を用いてトランスフェクションした。培地交換とｓｉＲＮＡトランスフェクションは、３〜４日毎に繰り返した。最初のトランスフェクションから８〜１２日後、ＷＳＴ−８アッセイによって細胞生存率を測定した。結果を図４に示す（縦軸：細胞生存率（％）、横軸：使用したｓｉＲＮＡ）。なお、図４中、バッファーをトランスフェクションした細胞の生存率を１００％として比較した。実験は、トリプリケートし、平均値の標準偏差を示した。ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞の細胞生存率を白色バーで、ＦＬ−ＨｅＬａ−１細胞の細胞生存率を灰色バーで、及びＦＬ−ＳＫＯＶ−５細胞の細胞生存率を黒色バーで示した。
図４の結果から、解析したＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡの中で４９７、５７３、７０７、７５２及び２０３は、５ｎＭの濃度でＨＰＶ１６陰性細胞への増殖抑制効果が少なく、ＨＰＶ１６陽性細胞への強い増殖抑制効果が認められた。即ち、これらのｓｉＲＮＡは、ＨＰＶ１６のＥ６及びＥ７癌遺伝子に対して高い特異性を有していると評価することができる。
また、６９８、１８６及び５３５は、ＨＰＶ１６陰性細胞に対する強い増殖抑制効果がみられ、特異性にやや問題があると考えられた。

＜実験５．ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡｓ（４９７、５７３、７０７）とこれらのＲＮＡ−ＤＮＡキメラ誘導体（ｄｓＲＤＣ）のＲＮＡｉ活性＞

−４９７ｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＤＣ−
４９７ｓｉＲＮＡとその短２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ（４９７ｄｓＲＤＣ）のＲＬｕｃ−ΔＮＥ６融合ｍＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を、ＦＬｕｃ及びＲＬｕｃ−ΔＮＥ６発現ＳｉＨａ細胞（ＲＬＥ６−ＦＬ−ＳｉＨａ−１０）を用いて解析した。ＲＬＥ６−ＦＬ−ＳｉＨａ−１０細胞にｓｉＲＮＡ或いはｄｓＲＤＣをトランスフェクションし、４８時間後、ＦＬｕｃ活性の内因性コントロールとして４９７ｓｉＲＮＡ（●）と４９７ｄｓＲＤＣ（○）のＲＬｕｃ活性抑制効率を解析した。結果を図５Ａに示す（縦軸：相対的ＲＬｕｃ活性（％）、横軸：ｓｉＲＮＡ／ｄｓＲＤＣ濃度（ｎＭ））。実験はトリプリケートで行い、平均値と標準偏差を示す。

−５７３、７０７ｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＤＣ−
５７３ｓｉＲＮＡ（■）と５７３ｄｓＲＤＣ（□）、７０７ｓｉＲＮＡｓ（▲）と７０７ｄｓＲＤＣ（△）のＲＬｕｃ−Ｅ７融合ｍＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を、ＦＬｕｃ及びＲＬｕｃ−Ｅ７発現ＳｉＨａ細胞（ＲＬＥ７−ＦＬ−ＳｉＨａ−２）を用いて前記と同様にして解析した。結果を図５Ｂに示す（縦軸：相対的ＲＬｕｃ活性（％）、横軸：ｓｉＲＮＡ／ｄｓＲＤＣ濃度（ｎＭ））。

図５Ａ〜図５Ｂの結果から、ｓｉＲＮＡをｄｓＲＤＣに変換した場合、１ｎＭ以下でのＲＮＡｉ活性の低下が顕著となるが、１ｎＭ以上であれば比較的強いＲＮＡｉ活性が保たれていることがわかる。

＜実験６．ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＤＣのＨＰＶ１６陰性細胞及び陽性細胞の細胞増殖に及ぼす効果＞
ＨＰＶ１６陰性細胞としてＦＬ−ＨｅＬａ−１（図６Ａ、図６Ｄ）及びＦＬ−ＳＫＯＶ−５（図６Ｂ、図６Ｅ）を、ＨＰＶ１６陽性細胞としてＦＬ−ＳｉＨａ−２（図６Ｃ、図６Ｆ）を用いた。細胞は、９６ウエルプレートに播き、ｓｉＲＮＡｓ（コントロール、４９７、５７３、７０７、７５２、２０３、２２２）（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ）或いはｄｓＲＤＣ（コントロール、４９７、５７３、７０７、７５２）（図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ）を５ｎＭ（黒色）、２ｎＭ（灰色）、或いは１ｎＭ（白色）の濃度でトランスフェクションした。トランスフェクションは、３〜４日毎に繰り返し、ＷＳＴ−８アッセイは、トランスフェクション開始後７〜１１日後に行った。バッファーをトランスフェクションした細胞の生存率を１００％として相対的生存細胞数を算出した。それぞれトリプリケートし、平均値と標準偏差を示した。結果を図６Ａ〜図６Ｆに示す（縦軸：細胞生存率（％）、横軸：使用したｓｉＲＮＡ／ｄｓＲＤＣ）。

Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡの濃度を１ｎＭにまで低下させることで、ＨＰＶ１６陽性細胞に対する高い増殖抑制効果を保ちながら、ＨＰＶ１６陰性細胞における非特異的な増殖抑制効果を最小にすることが可能であった。１ｎＭでは、４９７、５７３、７５２及び２０３が、特に良好な結果を示した（図６Ａ〜図６Ｃ）。
ｄｓＲＤＣに変換した場合、７０７においてＨＰＶ１６陽性細胞に対する増殖抑制活性が低下したが、他の配列では１〜５ｎＭの濃度でＨＰＶ１６陽性細胞特異的な増殖抑制活性が認められた（図６Ｄ〜図６Ｆ）。

＜実験７．ＨＰＶ１６陽性癌細胞における内因性Ｅ６Ｅ７発現のＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡによる抑制＞
ＦＬｕｃ発現ＳｉＨａ細胞（ＦＬ−ＳｉＨａ−２）を用いて、ｓｉＲＮＡ導入効率をモニターしながらＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性を調べた。ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞にコントロールｓｉＲＮＡ或いはＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡを２５ｎＭ、５ｎＭ、或いは１ｎＭの濃度でリポフェクタミン２０００を用いてトランスフェクションし、７２時間後、Ｅ６及びＥ７発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで解析した。ｓｉＲＮＡ導入効率は、ＦＬｕｃｓｉＲＮＡによるＦＬｕｃ活性抑制効率で調べた。結果を図７Ａ〜図７Ｃに示す。図７Ａ〜図７Ｃにおいては、１８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡを内部コントロールとして用いて発現レベルの補正を行った。コントロールｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ）処理細胞のｍＲＮＡレベルに対する相対的発現量（％）を示した。２５ｎＭ、５ｎＭ、及び１ｎＭのＦＬｕｃｓｉＲＮＡのトランスフェクションによってＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞のＦＬｕｃ活性は、それぞれ９６％、９７％、及び９５％抑制され、ｓｉＲＮＡ導入効率もこの値に準ずると考えられた。

図７Ａは、７５２ｓｉＲＮＡ、２０３ｓｉＲＮＡ、及び５３５ｓｉＲＮＡの効果を示す。図７Ｂは、１８６ｓｉＲＮＡ及び２２２ｓｉＲＮＡの効果を示す。図７Ｃは、３７５ｓｉＲＮＡ、７５２ｓｉＲＮＡ、及び６６０ｓｉＲＮＡの効果を示す。
７５２ｓｉＲＮＡは、Ｅ６及びＥ７に対して良好な抑制効果を示した。過去に論文で報告されている２０３ｓｉＲＮＡ、５３５ｓｉＲＮＡ及び１８６ｓｉＲＮＡは、７５２ｓｉＲＮＡと同等の活性を示した。３７５ｓｉＲＮＡと６６０ｓｉＲＮＡは、有為な活性が見られなかった。２２２ｓｉＲＮＡは、Ｅ６に対してのみ中等度の活性が見られた。

＜実験８．ＨＰＶ１６陽性癌細胞におけるｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}のＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡによる発現誘導＞
各ｓｉＲＮＡについて、癌抑制遺伝子であるｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現誘導効果を以下のようにして検討した。

−ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞におけるｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の５７３ｓｉＲＮＡと７５２ｓｉＲＮＡによる発現誘導−
ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞にｍｏｃｋ、コントロールｓｉＲＮＡ、或いは種々の濃度のＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（５７３、７５２）をトランスフェクションし、７２時間後、ｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現をイムノブロット法で解析した。内部コントロールとしてｌａｍｉｎＡ／Ｃを用い、ｐ５３レベルを補正した。結果を図８Ａ及び図８Ｂに示す。

−ＳｉＨａ細胞におけるｐ５３及びｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}のＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡによる発現誘導−
ＳｉＨａ細胞にｍｏｃｋ、コントロールｓｉＲＮＡ、或いは、Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡを２５ｎＭの濃度でトランスフェクションし、７２時間後、ｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現をイムノブロット法で解析した。結果を図８Ｃ及び図８Ｄに示す。

−ＣａＳｋｉ細胞におけるｐ５３及びｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}のＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡによる発現誘導−
ＣａＳｋｉ細胞にｍｏｃｋ、ｌａｍｉｎ／ＣｓｉＲＮＡ、コントロールｓｉＲＮＡ、或いは、Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（５７３、７５２）を５０ｎＭの濃度でオリゴフェクタミンを用いてトランスフェクションし、７２時間後、ｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現をイムノブロット法で解析した。結果を図８Ｅに示す。

５７３ｓｉＲＮＡと７５２ｓｉＲＮＡは、ＳｉＨａ細胞とＣａＳｋｉ細胞で強いｐ５３誘導活性がみられ、Ｅ６発現抑制が観察されたことと一致した。２０３ｓｉＲＮＡ、５３５ｓｉＲＮＡ、１８６ｓｉＲＮＡ、２２２ｓｉＲＮＡについてもＳｉＨａ細胞でｐ５３誘導性が確認されたが、３７５ｓｉＲＮＡと６６０ｓｉＲＮＡは、ｐ５３誘導活性がなくＥ６発現抑制が見られなかったことと一致した。

＜実験９．ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡによるＨＰＶ１６陽性癌細胞の細胞老化誘導＞
各ｓｉＲＮＡについて、ＨＰＶ１６陽性癌細胞の細胞老化誘導効果を以下のようにして検討した。
ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞に、ｍｏｃｋ（図９（Ａ））、コントロールｓｉＲＮＡ（図９（Ｂ））、５７３ｓｉＲＮＡ（図９（Ｃ））、或いは７５２ｓｉＲＮＡ（図９（Ｄ））を、５ｎＭの濃度でリポフェクタミン２０００を用いて３日毎にトランスフェクションし、１４日後、細胞老化関連βガラクトシダーゼ染色を行った。代表的な顕微鏡写真を図９（Ａ）〜（Ｄ）に示す。

５７３ｓｉＲＮＡ或いは７５２ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞は、細胞が扁平で細胞質が拡張し一部突起上にのびていた。核周囲を中心に細胞老化関連βガラクトシダーゼ活性がみられ、細胞老化よる変化と一致した。

＜実験１０．ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡによるＨＰＶ１６陽性癌細胞のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内での増殖抑制＞
前記までの実験において、ＨＰＶ１６Ｅ６及びＥ７遺伝子に対するＲＮＡｉ活性及び特異性が高かった７５２ｓｉＲＮＡについて、ｉｎｖｉｖｏにおけるＨＰＶ陽性癌細胞の増殖抑制効果を検討した。
ＳｉＨａ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス皮下に接種したところ、６週間後に触知可能な腫瘍形成が見られた。アテロコラーゲンと複合体形成させたコントロールｓｉＲＮＡ或いは７５２ｓｉＲＮＡ（５００ｐｍｏｌｅ）を、直接腫瘍内（ｎ＝６）に７日毎に注射投与した。最初のｓｉＲＮＡ投与から３０日後、全ての腫瘍を取り出し重量計測を行った。結果を図１０に示す。バーは、平均値を示す（ｎ＝６）。
７５２ｓｉＲＮＡ処理腫瘍は、コントロールｓｉＲＮＡ処理したものにくらべ、ｐ＜０．００１で有為に小さく、７５２ｓｉＲＮＡによるＨＰＶ１６陽性癌細胞に対する増殖抑制効果は、動物実験でも確認された。

＜実験１１．ＲＬｕｃ−亜型Ｅ７（７６０ｃ）融合ｍＲＮＡに対する７５２ｓｉＲＮＡ及び７５２ｃｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性＞
香港のＨＰＶ１６陽性癌患者の約３％を占める亜型Ｅ７（７６０ｃ）をＲＬｕｃ−Ｅ７融合ｍＲＮＡとして発現させるプラスミドを作製した。前記ＲＬｕｃ−Ｅ７（７６０ｃ）融合ｍＲＮＡ発現プラスミドの構造を図１１Ａに示す。

−７５２ｓｉＲＮＡ及び７５２ｃｓｉＲＮＡのＲＬｕｃ−Ｅ７（７６０ｃ）融合ｍＲＮＡに対する濃度効果の解析−
ＳｉＨａ細胞に、連続してＲＬｕｃ−Ｅ７（７６０ｃ）融合ｍＲＮＡ発現プラスミドと様々な濃度の７５２ｓｉＲＮＡ又は７５２ｃｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、４８時間後、ＦＬｕｃ活性とＲＬｕｃ活性を計測した。ＦＬｕｃ活性を内部コントロールとしてＲＬｕｃ活性を補正した。結果を図１１Ｂに示す（縦軸：相対的ＲＬｕｃ活性（％）、横軸：ｓｉＲＮＡ濃度（ｎＭ））。実験はトリプリケートで行い、平均値と標準偏差を示す。
７５２ｃｓｉＲＮＡは、７５２ｓｉＲＮＡと同じ部位を標的とするが、亜型Ｅ７（７６０ｃ）に対して７５２ｓｉＲＮＡが１塩基ミスマッチを有するのに対して、７５２ｃｓｉＲＮＡはミスマッチがない。７５２ｃｓｉＲＮＡ及び７５２ｓｉＲＮＡは、いずれもＲＬｕｃ−Ｅ７（７６０ｃ）融合ｍＲＮＡ発現を濃度依存性に抑制したが、７５２ｃｓｉＲＮＡ（○）のＩＣ_５０は、７５２ｓｉＲＮＡ（●）のＩＣ_５０より５倍低くなっており、ｓｉＲＮＡ中央部の１塩基のミスマッチの影響の大きさを反映している。

＜実験１２．ＨＰＶ１６陽性癌細胞における内因性Ｅ６Ｅ７発現のＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＤＣによる抑制＞
ＦＬｕｃ発現ＳｉＨａ細胞（ＦＬ−ＳｉＨａ−２）を用いて、Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＤＣのＲＮＡｉ活性を調べた。ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞にｍｏｃｋ、コントロールｓｉＲＮＡ、Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（４９７、５７３、７５２）、コントロールｄｓＲＤＣ、Ｅ６Ｅ７ｄｓＲＤＣ（４９７、５７３、７５２）を５ｎＭの濃度でリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン）を用いてトランスフェクションし、７２時間後、Ｅ６及びＥ７発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで解析した。結果を図１２に示す。１８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡを内部コントロールとして用いて発現レベルの補正を行った。ｍｏｃｋ処理細胞のｍＲＮＡレベルに対する相対的発現量（％）を示した。

図１２の結果から、４９７、５７３、及び７５２ｓｉＲＮＡは、いずれも５ｎＭでＥ６及びＥ６＊ＩｍＲＮＡ発現レベルをｍｏｃｋ処理細胞に比較して１／４以下に減少させた。また、４９７、５７３、及び７５２ｄｓＲＤＣは、いずれも５ｎＭでＥ６＊ＩｍＲＮＡ（Ｅ７をコードする）発現レベルをｍｏｃｋ処理細胞に比較して１／３以下に減少させた。また５７３及び７５２ｄｓＲＤＣは、Ｅ６ｍＲＮＡレベルも１／３以下に減少させた。４９７ｄｓＲＤＣによるＥ６ｍＲＮＡレベルの抑制は５５％にとどまっていたが、この条件でｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現誘導が見られるため（図１４に示す）４９７ｄｓＲＤＣによるＥ６発現抑制は機能的には十分であると考えられた。

＜実験１３．ＨＰＶ１６陽性癌細胞におけるｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}のＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡによる発現誘導＞
Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（４９７）について、癌抑制遺伝子であるｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現誘導効果を以下のようにして検討した。
ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞にｍｏｃｋ、コントロールｓｉＲＮＡ、或いは種々の濃度のＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（４９７）をトランスフェクションし、７２時間後、ｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現をイムノブロット法で解析した。内部コントロールとしてｌａｍｉｎＡ／Ｃを用い、ｐ５３レベルを補正した。結果を図１３に示す。
４９７ｓｉＲＮＡでは強いｐ５３誘導活性がみられ、Ｅ６発現抑制が観察されたことと一致した。

＜実験１４．ＨＰＶ１６陽性癌細胞におけるｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}のＥ６Ｅ７ｄｓＲＤＣによる発現誘導＞
Ｅ６Ｅ７ｄｓＲＤＣ（４９７、５７３、７５２）について、癌抑制遺伝子であるｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現誘導効果を以下のようにして検討した。
ＦＬ−ＳｉＨａ−２細胞にｍｏｃｋ、コントロールｄｓＲＤＣ、或いは種々の濃度のＥ６Ｅ７ｄｓＲＤＣ（４９７、５７３、７５２）を２５ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭでトランスフェクションし、７２時間後、ｐ５３とｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の発現をイムノブロット法で解析した。内部コントロールとしてｌａｍｉｎＡ／Ｃを用い、ｐ５３レベルを補正した。結果を図１４に示す。
４９７ｄｓＲＤＣ、５７３ｄｓＲＤＣ、及び７５２ｄｓＲＤＣではいずれも強いｐ５３誘導活性がみられた。

＜実験１５．ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＤＣのガイド鎖及びパッセンジャー鎖を介したＲＮＡｉ誘導＞
ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＤＣのガイド鎖及びパッセンジャー鎖を介したＲＮＡｉ誘導を以下のようにして検討した。
ガイド鎖によるＲＮＡｉ誘導は、ＨｅＬａ細胞にＲＬｕｃ−Ｅ６Ｅ７（＋）鎖ｍＲＮＡ発現プラスミドと、ｍｏｃｋ、コントロールｓｉＲＮＡ、Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（４９７、５７３、６９８、７０７、７５２）或いはそれぞれのｄｓＲＤＣを導入し、４８時間後にルシフェラーゼアッセイをおこなった。パッセンジャー鎖によるＲＮＡｉ誘導の解析にはＲＬｕｃ−Ｅ６Ｅ７（−）鎖ｍＲＮＡ発現プラスミドを用いた。図１５ＡにＲＬｕｃ−Ｅ６Ｅ７（＋）鎖ｍＲＮＡ発現プラスミドとＲＬｕｃ−Ｅ６Ｅ７（−）鎖ｍＲＮＡ発現プラスミドのマップを示す。図１５Ｂにｍｏｃｋ導入細胞に対する相対的ルシフェラーゼ活性を示す。

多くのＲＮＡｉ活性の高いｓｉＲＮＡは、熱力学的非対称性を有し、それによってガイド鎖が選択的にＲＩＳＣに取り込まれると信じられている。この実験でも熱力学的非対称性を有するＥ６Ｅ７ｓｉＲＮＡの５配列はすべてガイド鎖による強力なＲＮＡｉが観察されたが、５配列のうち４配列はパッセンジャー鎖を介するＲＮＡｉも観察された。これにより、熱力学的非対称性はガイド鎖の効率よいＲＩＳＣへの取り込みを促進しうるが、パッセンジャー鎖のＲＩＳＣへの取り込みを完全には抑制しないことが示唆された。ところがｄｓＲＤＣではガイド鎖によるＲＮＡｉのみ観察され、パッセンジャー鎖によるＲＮＡｉはみられなかった。以上からｄｓＲＤＣでは、パッセンジャー鎖の３’側８塩基及びガイド鎖５’側６塩基がＤＮＡとなっていることによってパッセンジャー鎖のＲＩＳＣへの取り込みが抑制されていることが示唆された。また、このことからｓｉＲＮＡでみられるパッセンジャー鎖を介したオフターゲット効果はｄｓＲＤＣを用いることによって回避できることが示唆された。

＜実験１６．ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＤＣによるオフターゲット効果の解析＞
ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＤＣのｓｉＤｉｒｅｃｔソフトウエアによって選出されたオフターゲット候補配列に対する抑制効果を以下のようにして検討した。
ｓｉＤｉｒｅｃｔソフトウエアによってガイド鎖と３塩基ミスマッチを有するオフターゲット候補は４９７について２遺伝子、５７３について９遺伝子（配列として７種類）、７５２について１遺伝子（表７）選出された。なお、表７には、ｓｉＤｉｒｅｃｔソフトウエアによって選出された３塩基及び４塩基のミスマッチを有するオフターゲット候補配列数を示す。ｓｉＲＮＡ／ｄｓＲＤＣと完全一致配列（４９７ＴＳ、５７３ＴＳ、７５２ＴＳ）或いは３塩基ミスマッチ配列（４９７ＯＴ、５７３ＯＴ、７５２ＯＴ）をウミシイタケルシフェラーゼの３’端に繋いだ発現プラスミドを作成し（図１６Ａ）、ルシフェラーゼアッセイによってそれぞれのｓｉＲＮＡとｄｓＲＤＣによるオフターゲット効果を解析した。
ＨｅＬａ細胞にＲＬｕｃ−完全一致配列或いはＲＬｕｃ−３塩基ミスマッチ配列融合ｍＲＮＡ発現プラスミドと、ｍｏｃｋ、コントロールｓｉＲＮＡ、Ｅ６Ｅ７ｓｉＲＮＡ（４９７、５７３、７５２）或いはそれぞれのｄｓＲＤＣを導入し、４８時間後にルシフェラーゼアッセイをおこなった。ｍｏｃｋ導入細胞に対する相対的ルシフェラーゼ活性を示す（図１６Ｂ〜図１６Ｄ）。ｓｉＲＮＡ／ｄｓＲＤＣのガイド鎖の５’端を１番とし、それぞれのミスマッチの部位を（）内に表記した。

表７は３塩基或いは４塩基のミスマッチで相補性を有し、オフターゲット候補となるヒト遺伝子数を示す。なお、各ｓｉＲＮＡについてガイド鎖或いはパッセンジャー鎖と２塩基以下のミスマッチでハイブリダイズするヒトの配列は存在しない。表７中、＊は、９配列中、重複する配列が２配列あり、配列の種類としては７種類である。

３塩基のミスマッチを有する９種類の配列についてｓｉＲＮＡとｄｓＲＤＣのオフターゲット効果を検討したところ、９配列中１配列（５７３ＯＴ２）で約８０％の抑制を呈したが、残りの８配列では抑制は４０％以下であった。これはオフターゲット効果回避の観点からｓｉＤｉｒｅｃｔソフトウエアによるｓｉＲＮＡ配列選択の妥当性を示すとともに、選択された配列においても３塩基ミスマッチのオフターゲット候補の数の少ないものがより配列特異性が高いことを示している。またｓｉＲＮＡをｄｓＲＤＣに変換することにより３塩基のミスマッチを有するオフターゲット候補配列を介した抑制効果の減少傾向が見られた。

前記実施例の各実験結果から、本発明において新たに作製されたＨＰＶ１６のＥ６及びＥ７遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（表２）は、いずれも標的に対する高いＲＮＡｉ活性及び高い特異性を有することが示された。中でも、４９７、５７３、７５２のｓｉＲＮＡ、特にｄｓＲＤＣに変換したものは、標的に対する高いＲＮＡｉ活性及び高い特異性を有しており、ＨＰＶ１６感染に起因する疾患（例えば、子宮頸癌）の治療又は予防に好適に応用できる可能性が示唆された。

本発明によれば、子宮頸癌等のＨＰＶ１６型感染に起因する疾患に対して、高い治療効果又は予防効果を有し、かつ副作用の少ない、優れた医薬の開発が期待される。

Claims

ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、配列番号：１のヌクレオチド番号１１７〜１３９、１２８〜１５０、２３３〜２５５、２４３〜２６５、２４４〜２６６、３２４〜３４６、３２６〜３４８、４９３〜５１５、４９７〜５１９、５０１〜５２３、５７３〜５９５、５８３〜６０５、６１５〜６３７、６２５〜６４７、６９８〜７２０、７０７〜７２９、及び、７５２〜７７４からなる群より選択されるいずれかのヌクレオチド配列の領域を標的とすることを特徴とする二本鎖核酸分子。
配列番号：１のヌクレオチド番号４９７〜５１９、５７３〜５９５、及び、７５２〜７７４からなる群より選択されるいずれかのヌクレオチド配列の領域を標的とする請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
二本鎖ＲＮＡである請求項１から２のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
二本鎖ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡである請求項３に記載の二本鎖核酸分子。
配列番号：２及び３、配列番号：４及び５、配列番号：６及び７、配列番号：８及び９、配列番号：１０及び１１、配列番号：１２及び１３、配列番号：１４及び１５、配列番号：１６及び１７、配列番号：１８及び１９、配列番号：２０及び２１、配列番号：２２及び２３、配列番号：２４及び２５、配列番号：２６及び２７、配列番号：２８及び２９、配列番号：３０及び３１、配列番号：３２及び３３、並びに、配列番号：３４及び３５からなる群より選択されるいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖の組合せからなる請求項４に記載の二本鎖核酸分子。
配列番号：１８及び１９、配列番号：２２及び２３、並びに、配列番号：３４及び３５からなる群より選択されるいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖の組合せからなる請求項５に記載の二本鎖核酸分子。
二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラである請求項１から２のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
下記（ａ）又は（ｂ）のセンス鎖及びアンチセンス鎖の組合せからなる、請求項７に記載の二本鎖核酸分子。
（ａ）配列番号：１８において、３’側の８塩基がＤＮＡであり、それ以外がＲＮＡであるセンス鎖と、配列番号：１９において、５’側の６塩基がＤＮＡであり、それ以外がＲＮＡであるアンチセンス鎖
（ｂ）配列番号：３４において、３’側の８塩基がＤＮＡであり、それ以外がＲＮＡであるセンス鎖と、配列番号３５において、５’側の６塩基がＤＮＡであり、それ以外がＲＮＡであるアンチセンス鎖
請求項１から６のいずれかに記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡ。
請求項９に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
ＨＰＶ１６型感染に起因する疾患を治療又は予防するための医薬であって、請求項１から８のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、請求項９に記載のＤＮＡ、及び、請求項１０に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする医薬。