JP5078904B2 - 多標的干渉ｒｎａならびにそれらの使用および設計方法 - Google Patents

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Description

関連出願への交差引用
本出願は、それぞれ２００５年１１月２１日出願の米国仮出願第６０／７３８，４４１号および２００５年１１月２１日出願の同第６０／７３８，６４０号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
本発明は遺伝子発現の調節において有用な方法および試薬に関する。とりわけ、本発明は、１種若しくはそれ以上の予め選択されたＲＮＡ分子上の複数の標的部位を標的とする多標的干渉ＲＮＡ分子を使用して遺伝子発現を調節することに関する。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は真核生物細胞中の多彩な進化的に保存された機構であり、標的遺伝子の転写および翻訳を配列特異的様式で阻害する。一本鎖および二本鎖ＲＮＡが、多数の機構により標的ＲＮＡ分子の発現を調節若しくはそのプロセシングを改変し得ることが今や既知である。数種のこうした機構は調節（すなわち干渉）ＲＮＡと標的ＲＮＡの間に必要とされる配列相補性の量の変動を許容する。ある種のミクロＲＮＡは、該ミクロＲＮＡと約６ヌクレオチドの相補性を有する標的ｍＲＮＡを翻訳的に抑制し得る。例えば疾患関連遺伝子の発現を抑制するために二本鎖ＲＮＡを使用するＲＮＡ干渉剤の開発は現在、熱心な研究活動の一領域である。
長さ１９〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡは、該ＲＮＡのエフェクター鎖（若しくは「ガイド鎖」）が負荷されているＲＮＡ干渉サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）により認識される。このガイド鎖は、トランスクリプトームに存在する高度に相補性の配列の認識および破壊のための鋳型として作用する。あるいは、より低い相補性のＲＮＡ配列の認識および結合により、干渉ＲＮＡはｍＲＮＡ分解を伴わずに翻訳抑制を誘導しうる。こうした翻訳抑制が、内因性ミクロＲＮＡ（分化および発生に関与する短い非コードＲＮＡの一群）の作用機序であると思われる。
干渉ＲＮＡを治療的に実装することにおける試みはこれまで、それぞれ特定の一標的転写物に対する完全な相補性をもつ特異的二本鎖ＲＮＡを製造することに集中していた。こうした二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、単一の適する標的を同定し得る場合に潜在的に有効であり得るが、しかしながら、ｄｓＲＮＡ、とりわけ１標的に対し設計されたものは、少なくとも２つの範疇の、回避若しくは最小化されることが必要である標的を外れた副作用を有しうる。望ましくない副作用は、自然免疫反応経路（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体３、７および８、ならびにいわゆるインターフェロン応答）、ならびに（ＲＮＡ分解、転写抑制若しくは他の機構のいずれかによる）関係する若しくは無関係の転写物からのタンパク質発現の偶然の阻害により生じ得る。数種の生物情報学および／若しくは実験的アプローチが、オフターゲット効果を最小化することを試みるために開発された。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏハイブリダイゼーションのためのアルゴリズムが既知であり、そして、有効性を維持しつつ副作用を排除若しくは最小化するための試みにおいて標的接近可能性および負荷バイアスを予測するための他者が開発された。
ウイルスおよび非ウイルス起源のヒト疾患を潜在的に処置するための数種の二本鎖ＲＮＡ分子が開発の多様な段階にある。該疾患は、加齢性黄斑変性、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびＲＳウイルス（ＲＳＶ）感染症を包含する。これらのＲＮＡ分子は、しかしながらＲＮＡ配列中の単一部位のみを標的とするよう設計されている。ＲＮＡ干渉は、特定の遺伝子産物のノックダウンを得ることにおいて有用かつ強力でありうるとは言え、多
くの疾患は存在論的に無関係の遺伝子産物間の複雑な相互作用を伴う。複数の推定の標的が単一の疾患について同定され得る。これらの標的を１つずつ阻害することが治療的に価値があることを確認するための試みは期待はずれであった。事実、治療的有効性を得ることは、おそらく大部分のシグナル伝達経路の複数のレベルの冗長性のため、極めて困難であることが判明しつつある。例えば、癌、２型糖尿病およびアテローム硬化症のような多くの障害は複数の生化学的異常を特徴とする。加えて、数種の推定の標的は高められた突然変異率にさらされることがあり、それによりいずれかのこうした標的に対する干渉ＲＮＡの効果を無効にする。
例えば、ウイルス感染症に対する治療的アプローチは、農業ならびに動物およびヒトの健康における大きな課題であることを継続している。ウイルスの複製の性質は、それらを治療上非常に可塑性すなわち「動く標的」（構造、感染性および宿主プロファイルを変えることが可能）にする。重症急性呼吸器症候群（「ＳＡＲＳ」）およびトリインフルエンザウイルス（「鳥インフル」）のようなウイルスの最近の出現はこれらの課題を例示する。後天的免疫不全症候群すなわちＡＩＤＳに関与するもの（例えばヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）のような十分に記述されたウイルスでさえ、進行中のウイルス突然変異および進化のため、処置およびワクチン接種での試みを寄せ付けないことを継続する。
さらに、干渉ＲＮＡのような核酸治療薬は、部分的に、現代の迅速な遺伝子シークェンシング技術が、いかなるコードされる機能も評価され得る前でさえウイルスゲノム配列が決定されることを可能にするためにウイルス治療の候補であるとは言え、ウイルス、とりわけＲＮＡウイルスの誤りがちな複製は、感染した集団で実質的なゲノム多様性が迅速に生じ得ることを意味している。これまで、核酸治療薬の開発のための戦略は、ウイルスゲノムの高度に保存された領域のターゲッティングに主として中心を置いていた。これらの構築物が、ウイルス感染の処置若しくは耐性ウイルスクローンの出現の予防で効率的であるかどうかは不明である。
疾患の数種の重要な「駆動体」の制御のための１種の干渉ＲＮＡの設計および使用を伴う治療的アプローチが、従って望ましい。従って、標的の発現を調節するための１種若しくはそれ以上の標的遺伝子内の複数の予め選択された標的配列を標的とし得る干渉ＲＮＡに対する必要性が存在する。こうした治療的多標的干渉ＲＮＡの設計および作成方法もまた必要とされる。新たなウイルス性病原体の単離および同定に際して迅速に開発され得かつ新たな耐性アイソタイプの出現を遅らせる若しくは予防さえするのに役立つように使用し得る抗ウイルス性干渉ＲＮＡもまた必要とされる。
［発明の要約］
異なる遺伝子構成（以下、「異なる遺伝子の情況」ということもある）で１種若しくはそれ以上の予め選択された標的ＲＮＡ分子に存在する複数の結合配列に対する特異性をもつ干渉ＲＮＡ分子が今や設計かつ製造され、そして標的配列の発現を低下させるのに使用される。
第一の態様において、本発明は、式（Ｉ）：
５’−ｐ−ＸＳＹ−３’
式中、ｐは独立に存在若しくは非存在である末端リン酸基よりなり；式中、Ｓは異なる遺伝子の情況で１種若しくはそれ以上の予め選択された標的ＲＮＡ分子に存在する最低２種の結合配列のそれぞれの第一の部分に少なくとも部分的に相補的である約５ないし約２０ヌクレオチドの長さの第一のヌクレオチド配列よりなり；式中、Ｘは非存在であるか若しくは第二のヌクレオチド配列よりなり；式中、Ｙは非存在であるか若しくは第三のヌクレオチド配列よりなるが、但しＸおよびＹは同時に非存在でなく；式中、ＸＳＹはそれらと
の安定な相互作用を可能にするように前記結合配列のそれぞれに少なくとも部分的に相補的である、
のガイド鎖を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子に関する。好ましくは、Ｓは、最低２種の結合配列のそれぞれの第一の部分に完全に相補的であり、そしてまた好ましくは、最低２種の結合配列のそれぞれの第一の部分はシード配列である。Ｘは１若しくは２ヌクレオチドよりなり、また、Ｙは、独立に、結合配列のそれぞれの第二の部分に少なくとも部分的に相補的であり得、前記第二の部分は結合配列の前記第一の部分の５’端に隣接しかつこれと結合されている。また好ましくは、Ｓは約８ないし約１５ヌクレオチドの長さのものである。ＸＳＹは、好ましくは約１７ないし約２５ヌクレオチドの長さのものである。好ましくは、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子は、パッセンジャー鎖とガイド鎖の間の安定な二重鎖の形成を可能にするようにガイド配列に少なくとも部分的に相補的であるパッセンジャー鎖をさらに含んでなり、また、これらのＲＮＡ分子は、好ましくは１個若しくはそれ以上の末端オーバーハングを包含し、そしてこれらのオーバーハングは好ましくは１ないし５ヌクレオチドの間のものである。好ましくは、パッセンジャー鎖およびガイド鎖は相互に完全に相補的である。本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子が、異なる遺伝子の情況で１種、若しくはあるいは最低２種の予め選択された標的ＲＮＡ分子に存在する結合配列を標的とすることが可能である。好ましくは、予め選択された標的ＲＮＡ分子の最低１種は非コードＲＮＡ分子である。あるいは、予め選択された標的ＲＮＡ分子の最低１種はメッセンジャーＲＮＡ分子であり得、そして、好ましくは、該予め選択された標的ＲＮＡ分子の１種若しくはそれ以上が疾患若しくは障害に関与する。好ましくは疾患はヒト疾患である。また好ましくは、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子中で、結合配列の最低１種がメッセンジャーＲＮＡ分子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に存在する。
本態様において、好ましくは、予め選択された標的ＲＮＡ分子の１種若しくはそれ以上は、受容体、サイトカイン、転写因子、調節タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞骨格タンパク質、トランスポーター、酵素、ホルモンおよび抗原よりなる群から選択される分類の１タンパク質をコードする。好ましくは、予め選択された標的ＲＮＡ分子の１種若しくはそれ以上は、ＩＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ−Ａ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＩＧＦ−１、Ｇｌｕｃ６ｐ、Ｉｎｐｐｌ１、ｂＦＧＦ、ＰＩＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、β−カテニン、κ−ｒａｓ−Ｂ、κ−ｒａｓ−Ａ、ＥＧＦＲ、Ｂｃｌ−２、プレセニリン−１、ＢＡＣＥ−１、ＭＡＬＡＴ−１、ＢＩＣ、ＴＧＦβおよびＴＮＦαよりなる群から選択される１タンパク質をコードする。また好ましくは、該多標的干渉ＲＮＡ分子は発現系でのＶＥＧＦ−Ａ、κ−ｒａｓおよびＢｃｌ−２のいずれかの組合せの発現を低下させるか、若しくは、あるいは発現系でのＭＡＬＡＴ−１およびＢＩＣ双方の発現を低下させるか、若しくは、なおあるいは発現系でのＩＣＡＭ−１およびＶＥＧＦ−Ａ双方の発現を低下させる。他の多標的干渉ＲＮＡ分子は、発現系でのＴＧＦβおよびＩＬ−８双方の発現を低下させるか、若しくは、あるいは発現系でのＩＬ−８およびＭＣＰ−１双方の発現を低下させる。本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子は、異なる遺伝子の情況で１種若しくはそれ以上の予め選択された標的ＲＮＡ分子に存在する最低２種の結合配列と安定な相互作用を形成するガイド鎖を含んでなるようにもまたさらに製造し得る。
好ましくは、予め選択された標的ＲＮＡ分子の１種若しくはそれ以上はウイルスＲＮＡである。ウイルスは、好ましくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、ライノウイルスおよび重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスよりなる群から選択される。ウイルスがＨＩＶである場合、予め選択された標的ＲＮＡ分子の１種若しくはそれ以上は、好ましくは、ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＶＩＦ、ＶＰＲ、ＴＡＴ、ＮＥＦ、ＲＥＶ、ＶＰＵおよびＥＮＶよりなる群から選択される必須タンパク質をコードする。ウイルスがＨＣＶである場合、他の予め選択されたＲＮＡ分子の１種若しくはそれ以上は、ＴＮＦαをコードする。
本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子において、該分子は、好ましくは、最低１種の修飾リボヌクレオチド、普遍的塩基、非環式ヌクレオチド、非塩基ヌクレオチド、非リボヌクレオチド若しくはそれらの組合せを含んでなる。本態様の他の局面において、Ｓは、
ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧ（配列番号１）、ＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２）、ＡＣＣＣＣＧＵＣＵＣＵ（配列番号５）、ＡＧＣＵＧＣＡ（配列番号７）、ＡＡＡＣＡＡＵＧＧＡＡＵＧ（配列番号８）、ＧＧＵＡＧＧＵＧＧＧＵＧＧＧ（配列番号１０）、ＣＵＧＣＵＵＧＡＵ（配列番号１２）、ＵＣＣＵＵＵＣＣＡ（配列番号１３）、ＵＵＵＵＵＣＵＵＵ（配列番号１４）、ＵＵＣＵＧＡＵＧＵＵＵ（配列番号１５）、ＵＣＵＵＣＣＵＣＵＡＵ（配列番号１６）、ＵＧＧＵＡＧＣＵＧＡＡ（配列番号１７）、ＣＵＵＵＧＧＵＵＣＣＵ（配列番号１８）、ＣＵＡＣＵＡＡＵＧＣＵ（配列番号１９）、ＵＣＣＵＧＣＵＵＧＡＵ（配列番号２０）、ＡＵＵＣＵＵＵＡＧＵＵ（配列番号２１）、ＣＣＡＵＣＵＵＣＣＵＧ（配列番号２２）、ＣＣＵＣＣＡＡＵＵＣＣ（配列番号２３）、ＣＵＡＡＵＡＣＵＧＵＡ（配列番号２４）、ＵＵＣＵＧＵＵＡＧＵＧ（配列番号２５）、ＧＣＵＧＣＵＵＧＡＵＧ（配列番号２６）、ＡＣＡＵＵＧＵＡＣＵＧ（配列番号２７）、ＵＧＡＵＡＵＵＵＣＵＣ（配列番号２８）、ＡＡＣＡＧＣＡＧＵＵＧ（配列番号２９）、ＧＵＧＣＵＧＡＵＡＵＵ（配列番号３０）、ＣＣＣＡＵＣＵＣＣＡＣ（配列番号３１）、ＵＡＵＵＧＧＵＡＵＵＡ（配列番号３２）、ＣＡＡＡＵＵＧＵＵＣＵ（配列番号３３）、ＵＡＣＵＡＵＵＡＡＡＣ（配列番号３４）、ＧＣＣＵＡＵＣＡＵＡＵ（配列番号５８）、ＵＧＧＵＧＣＣＵＧＣＵ（配列番号５９）、ＡＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＣ（配列番号６０）、ＣＣＣＵＣＵＧＧＧＣＵ（配列番号６１）、ＵＵＣＵＵＣＣＵＣＡＵ（配列番号６２）、ＵＡＵＵＵＡＵＡＣＡＧＡ（配列番号６３）、ＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＣ（配列番号６４）、ＵＧＡＧＵＮＮＧＡＡＣＡＵＵ（配列番号７２）（式中Ｎはいずれかの塩基であり）、ＣＵＣＣＡＧＧ（配列番号７４）、ＵＣＡＧＵＧＧＧ（配列番号７６）、ＵＣＣＵＣＡＣＡＧＧＧ（配列番号７８）、ＧＵＧＣＵＣＡＵＧＧＵＧ（配列番号７９）、ＣＣＵＧＧＡＧＣＣＣＵＧ（配列番号８０）、ＵＣＵＣＡＧＣＵＣＣＡＣ（配列番号８１）、ＡＣＣＣＵＣＧＣＡＣＣ（配列番号８６）、ＧＵＧＵＵＧＡＡＧ（配列番号８８）、ＵＵＣＣＡＣＡＡＣ（配列番号９０）、ＵＣＣＡＣＵＧＵＣ（配列番号９２）、ＣＡＧＡＡＵＡＧ（配列番号９３）、ＡＡＣＵＣＵＣＵＡ（配列番号９４）およびＣＧＵＧＡＡＧＡＣ（配列番号９８）
よりなる群から選択されるヌクレオチド配列より本質的になる。
他の局面において、Ｓは、ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧ（配列番号１）、ＵＣＣＵＣＡＣＡＧＧＧ（配列番号７８）、ＧＵＧＵＵＧＡＡＧ（配列番号８８）、ＵＵＣＣＡＣＡＡＣ（配列番号９０）、ＡＡＣＵＣＵＣＵＡ（配列番号９４）およびＣＧＵＧＡＡＧＡＣ（配列番号９８）よりなる群から選択されるヌクレオチド配列より本質的になる。好ましくは、Ｓは、ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧ（配列番号１）、ＵＣＣＵＣＡＣＡＧＧＧ（配列番号７８）、ＧＵＧＵＵＧＡＡＧ（配列番号８８）、ＵＵＣＣＡＣＡＡＣ（配列番号９０）、ＡＡＣＵＣＵＣＵＡ（配列番号９４）およびＣＧＵＧＡＡＧＡＣ（配列番号９８）よりなる群から選択される配列のいずれか内に含有される６個若しくはそれ以上の連続する塩基のヌクレオチド配列より本質的になる。
なお他の局面において、多標的干渉ＲＮＡ分子は、
Figure 0005078904
より本質的になる。
他の例示的多標的干渉ＲＮＡ分子は、
Figure 0005078904
を包含する。
なお他者は、
Figure 0005078904
を包含する。
好ましくは、上の多標的干渉ＲＮＡ分子は、最低１種の修飾リボヌクレオチド、普遍的塩基、非環式ヌクレオチド、非塩基ヌクレオチドおよび非リボヌクレオチド、オーバーハング変形若しくはそれらの組合せもまた包含する。
本発明の別の局面において、本発明は、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子を含んでなる生物学的系に関し、また、それらの好ましい生物学的系は、ウイルス、微生物、細胞、植物若しくは動物を包含する。本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターもまた企図している。好ましいベクターはウイルスベクターである。好ましいウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスおよびアルファウイルスよりなる群から選択される。本発明は、本発明のベクターを含んでなる細胞にもまた関する。
本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子は低分子ヘアピン型ＲＮＡ分子でもまたあり得る。
本発明はさらに、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子および許容できる担体を含んでなる製薬学的組成物に関する。あるいは、該組成物は、該ＲＮＡ分子を含んでなるベクターおよび許容できる担体を包含し得る。
本発明はさらに、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子の使用方法に関する。本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子の好ましい一使用方法において、該方法は、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子を生物学的系に導入する段階を含んでなる、生物学的系でＲＮＡ干渉を誘導することを包含する。より具体的には、本発明は、（ａ）１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子を選択する段階；（ｂ）異なる遺伝子の情況で１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子の組に存在する最低２種の結合配列と安定な相互作用を形成し得るガイド鎖を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子を設計する段階；（ｃ）多標的干渉ＲＮＡ分子を製造する段階；および（ｄ）該多標的干渉ＲＮＡ分子を生物学的系に投与し、それにより、該多標的干渉ＲＮＡ分子のガイド鎖が異なる遺伝子の情況で標的ＲＮＡ分子に存在する結合配列と安定な相互作用を形成し、かつ、従って該標的ＲＮＡ分子のＲＮＡ干渉を誘導する段階を含んでなる、生物学的系におけるＲＮＡ干渉の誘導方法に関する。好ましくは、生物学的系は、ウイルス、微生物、細胞、植物若しくは動物である。好ましい動物は、ラット、マウス、サルおよびヒトを包含する。また好ましくは、標的ＲＮＡ分子は、生物学的系の疾患若しくは障害に関与するか若しくは生物学的系から選択されるＲＮＡ分子を含んでなる。あるいは、標的ＲＮＡ分子は、生物学的系に対し感染性である第二の生物学的系から選択される１種若しくはそれ以上のＲＮＡ分子を含んでなるか、若しくは、標的ＲＮＡ分子は、第一の生物学的系、および第一の生物学的系に対し感染性である第二の生物学的系の双方から選択される場合。例えば、標的ＲＮＡ分子は、動物若しくは植物から選択される１種若しくはそれ以上のＲＮＡ分子、および該動物若しくは植物に対し感染性である微生物若しくはウイルスから選択される１種若しくはそれ以上のＲＮＡ分子を含み得る。より具体的な一例として、標的ＲＮＡ分子は、ヒトから選択される１種若しくはそれ以上のＲＮＡ分子、ならびに、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、ライノウイルスおよび重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスよりなる群から選択されるウイルスから選択される１種若しくはそれ以上のＲＮＡ分子を含み得る。標的ＲＮＡ分子は、受容体、サイトカイン、転写因子、調節タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞骨格タンパク質、トランスポーター、酵素、ホルモンおよび抗原を制限なしに包含するタンパク質の１分類のタンパク質をコードするＲＮＡ分子でもまたあり得る。例えば、タンパク質の群は、ＩＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ−Ａ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＩＧＦ−１、Ｇｌｕｃ６ｐ、Ｉｎｐｐｌ１、ｂＦＧＦ、ＰＩＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、β−カテニン、κ−ｒａｓ−Ｂ、κ−ｒａｓ−Ａ、ＥＧＦＲ、Ｂｃｌ−２、プレセニリン−１、ＢＡＣＥ−１、ＭＡＬＡＴ−１、ＢＩＣ、ＴＧＦβおよびＴＮＦαを包含し得る。好ましい組合せは、例えば、ＩＣＡＭ−１およびＶＥＧＦ−Ａ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、ライノウイルスおよび重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスのような１種若しくはそれ以上のウイルスＲＮＡ分子、または、ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＶＩＦ、ＶＰＲ、ＴＡＴ、ＮＥＦ、ＲＥＶ、ＶＰＵおよびＥＮＶよりなる群から選択されるＨＩＶの必須タンパク質を包含する。標的ＲＮＡ分子は、例えばＴＮＦα、ＬＥＤＧＦ（ｐ７５）、ＢＡＦ、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、フリン、ＮＦｋＢ、ＳＴＡＴ１を包含するヒトタンパク質からもまた選択し得る。特定の組合せはウイルスタンパク質およびそのウイルスにより引き起こされる疾患と関連するヒトタンパク質を包含する。従って、一例として、予め選択された標的ＲＮＡ分子はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を含み得、また、他の予め選択されたＲＮＡ分子の１種若しくはそれ以上はＴＮＦαをコードする。
本発明はまた被験体における疾患若しくは状態の処置方法にも関し、該方法は、（ａ）１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子を選択する段階（該標的ＲＮＡ分子の発現の調節が疾患若しくは状態の処置に対し潜在的に治療的であり）；（ｂ）異なる遺伝子の情況で１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子に存在する最低２種の結合配列と安定な相互作用を形成し得るガイド鎖を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子を設計する段階；（ｃ）該多標的干渉ＲＮＡ分子を製造する段階；ならびに（ｄ）該多標的干渉ＲＮＡ分子を被験体に投与し、それにより、該多標的干渉ＲＮＡ分子のガイド鎖が異なる遺伝子の情況で１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子に存在する結合配列と安定な相互作用を形成し、かつ、従って、該標的ＲＮＡ分子の発現のＲＮＡ干渉および調節を誘導する段階を含んでなる。
本発明はまた、ａ）１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子を選択する段階（該標的ＲＮＡ分子の発現の調節が望ましく）；ｂ）該標的ＲＮＡ分子のそれぞれの最低１種のヌクレオチド配列を得る段階；ｃ）６ヌクレオチド若しくはそれ以上のシード配列を選択する段階（前記シード配列は、最低２種の異なる遺伝子の情況で、該標的ＲＮＡ分子についてｂ）で同定されたヌクレオチド配列中に存在し）；ｄ）最低２種の結合配列を選択する段階（結合配列のそれぞれはシード配列を含んでなり、かつ、結合配列は異なる遺伝子の情況で標的分子中に存在し）；およびｅ）それらとの安定な相互作用を可能にする最低２種の結合配列のそれぞれと実質的な程度の相補性を共有するガイド鎖を有する多標的干渉ＲＮＡ分子を設計する段階を含んでなる、多標的干渉ＲＮＡ分子の設計方法にも関する。好ましくは、該方法は、パッセンジャー鎖とガイド鎖の間の安定な二重鎖の形成を可能にするようにガイド鎖に少なくとも部分的に相補的であるパッセンジャー鎖を設計することをさらに含んでなる。
多標的干渉ＲＮＡ分子のなお別の設計方法において、該方法は、ａ）１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子を選択する段階（該標的ＲＮＡ分子の発現の調節が望ましく）；ｂ）該標的ＲＮＡ分子のそれぞれの最低１種のヌクレオチド配列を同定する段階；ｃ）シード配列の長さｎ（ヌクレオチド）（式中ｎ＝約６若しくはそれ以上）を選択する段階；ｄ）段階ｂ）で同定された各ヌクレオチド配列から長さｎの候補シード配列の集合物を生成する段階（各候補シード配列は段階ｂ）で得られたヌクレオチド配列中に最低１回は存在し）；ｅ）候補シード配列の各存在について、所望の量の５’および３’隣接配列を収集することにより、段階ｂ）で得られた各ヌクレオチド配列中の候補シード配列のそれぞれの遺伝子の情況を決定する段階；ｆ）候補シード配列から長さｎのシード配列を選択する段階（該シード配列は、少なくとも２種の異なる遺伝子の情況で、段階ｂ）で同定されたヌクレオチド配列に存在し）；ｇ）コンセンサス標的配列を選択する段階（前記コンセンサス標的配列は、シード配列、ならびに該シードの５’および３’端の一方若しくは双方いずれかに隣接する配列の所望のコンセンサス配列を含んでなり）；ならびにｈ）それらとの安定な相互作用を可能にするようにコンセンサス標的配列と実質的な程度の相補性を共有するガイド鎖を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子を設計する段階を含んでなる。好ましくは、候補シード配列の集合物を生成する段階は、末端で開始して、ｎのウィンドウサイズを使用しかつ１のステップサイズで該ヌクレオチド配列に沿ってステッピングしてヌクレオチド配列を連続的に観察する段階を含んでなる。また好ましくは、シード配列を選択する段階は、ｉ）５個若しくはそれ以上の同一の単一ヌクレオチドの連続する列から構成されるか；ｉｉ）アデノシンおよびウラシルのみから構成されるか；ｉｉｉ）目的の非標的トランスクリプトームの許容できない高頻度を伴い存在することが予測されるか；ｉｖ）１種若しくはそれ以上の細胞成分の発現若しくは活性を望ましくなく調節する傾向を有することが予測されるか；またはｖ）ｉ）ないしｉｖ）のいずれかの組合せである、長さｎのいかなる配列も廃棄する段階を含んでなる。場合によっては、段階ｃ）ないしｇ）はｎの新たな値で反復し得る。多標的干渉ＲＮＡ分子は、一旦設計されれば、その後発現系で試験し得る。
多標的干渉ＲＮＡ分子の好ましい設計方法において、コンセンサス標的配列を選択する段階は、単一塩基のみから構成されるか、ＡおよびＵからのみ構成されるか、Ｃである５個若しくはそれ以上の塩基の連続する列を有するか、３’端でＧ／Ｃ豊富であるか、目的の非標的トランスクリプトームの許容できない頻度を伴い存在することが予測されるか；またはそれらのいずれかの組合せであるいかなる配列も廃棄する段階をさらに含んでなる。また好ましくは、パッセンジャー鎖とガイド鎖の間の安定な二重鎖の形成を可能にするようにガイド鎖にそれが少なくとも部分的に相補的であるようにパッセンジャー鎖を設計する。多標的干渉ＲＮＡ分子が一旦設計されれば、それを改変し得ることを企図している。こうした改変方法もまた本発明の範囲内で企図しており、そして、好ましい一方法は、単独若しくは組合せのｉ）多標的干渉ＲＮＡ分子のガイド鎖のＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）への取り込みを向上させる段階；ｉｉ）最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現の調節を増大若しくは減少させる段階；ｉｉｉ）該多標的干渉ＲＮＡ分子が被験体に投与される場合のストレス若しくは炎症応答を低下させる段階；ｉｖ）発現系中の該多標的ＲＮＡ分子の半減期を変える段階を含んでなる、多標的干渉ＲＮＡ分子を改変することを含んでなる。
本発明はさらに、ａ）シード配列の完全な相補物の配列を推定する段階；ｂ）シード配列の完全な相補物の所望の長さｎまでの伸長のため順列を生成する段階；ｃ）推定のガイド鎖配列の集合物を創製する段階（それらのそれぞれはシード配列の完全な相補物の配列および段階ｂ）で生成された順列の１種を含んでなり）；ｄ）ＲＮＡｈｙｂｒｉｄを使用して、段階ｃ）で創製された推定のガイド鎖配列の結合パターンおよび最小自由エネルギー（ｍｆｅ）を、シード配列を含んでなる全部の標的配列に対して決定する段階；ｅ）ｉ）５個若しくはそれ以上のＧ残基の連続的一続きが存在し；かつｉｉ）負荷バイアスが＜１．２である場合に推定のガイド鎖配列を廃棄する段階；ならびにｆ）残存する推定のガイド鎖配列の一覧から、それらの相対活性スコアに基づき、多標的干渉ＲＮＡ配列の長さｎのガイド鎖配列を選択する段階を含んでなる、シード配列からの完全長の多標的干渉ＲＮＡの設計方法に関する。該方法は、好ましくは、ガイド鎖配列を含んでなる多標的干渉ＲＮＡを製造する段階、および該多標的干渉ＲＮＡを発現系で試験する段階を付加的に含み得る。
なお別の局面において、本発明は、ｉ）異なる遺伝子の情況で一組の予め選択された標的ＲＮＡ分子に存在する最低２種の結合配列と安定な相互作用を形成し得るガイド鎖を有する多標的干渉ＲＮＡ分子を設計する段階；およびｉｉ）該多標的干渉ＲＮＡ分子を製造する段階を含んでなる、多標的干渉ＲＮＡ分子の作成方法に関する。
本発明が、製薬学的に許容できる担体と一緒に治療上有効な量の１種若しくはそれ以上の多標的干渉ＲＮＡ分子を含んでなる製薬学的組成物をさらに含んでなることもまた、本発明の範囲内で企図している。
本発明の他の局面、特徴および利点は、本発明の詳細な記述およびその好ましい態様ならびに付随する請求の範囲を包含する以下の開示から明らかであろう。
［発明の詳細な記述］
多様な刊行物、論文および特許が背景におよび本明細を通して引用若しくは記述され；これらの参考文献のそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。本明細に包含された文書、行為、物質、装置、物品などの論考は、本発明の情況を提供するという目的上である。こうした論考は、これらの事柄のいずれか若しくは全部が、開示若しくは特許請求されるいずれかの発明に関して従来技術の部分を形成することの承認ではない。
別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されると同一の意味を有する。本発明ではある種の用語を頻繁に使用し、それらは後に続くとおり示される意味を有する。これらの用語はまた、本明細で後により詳細に説明もされうる。
以下は本明細で時折使用される略語である。
ｂｐ＝塩基対
ｃＤＮＡ＝相補ＤＮＡ
ＣＯＤＥＭＩＲ＝コンピュータ設計多標的干渉ＲＮＡ（ＣＯｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ−ＤＥｓｉｇｎｅｄ，Ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）
ｋｂ＝キロベース、１０００塩基対
ｋＤａ＝キロダルトン；１０００ダルトン
ｍＲＮＡ＝メッセンジャーＲＮＡ
ｍｉＲＮＡ＝ミクロＲＮＡ
ｎｃＲＮＡ＝非コードＲＮＡ
ｎｔ＝ヌクレオチド
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＩＳＣ＝ＲＮＡ干渉サイレンシング複合体
ＲＮＡｉ＝ＲＮＡ干渉
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ｓｉＲＮＡ＝低分子干渉ＲＮＡ
ｓｈＲＮＡ＝低分子ヘアピン型ＲＮＡ
ＳＮＰ＝一塩基多形
ＵＴＲ＝非翻訳領域
ＶＩＲＯＭＩＲ＝ウイルス標的を優先的に標的とする多標的干渉ＲＮＡ
本明細書および付随する請求の範囲で使用されるところの単数形の形態「ある（「ａ」、「ａｎ」）」および「該（ｔｈｅ）」は、別の方法で文脈が明瞭に規定しない限り複数の参照を包含することに注目されなければならない。従って、例えば「ある細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は１個若しくはそれ以上の細胞への言及であり、そして当業者に既知のその同等物を包含する、など。
ポリペプチド若しくは核酸の「活性」、「生物学的活性」若しくは「機能的活性」は、標準的技術に従ってｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されるところのポリペプチド若しくは核酸分子により発揮される活性を指す。こうした活性は、第二のタンパク質との会合若しくはそれに対する酵素活性のような直接的活性、または第二のタンパク質とのタンパク質の相互作用により媒介される細胞シグナル伝達活性のような間接的活性であり得る。
「生物学的系」は、限定されるものでないがヒト、動物、植物、昆虫、微生物、ウイルス若しくは他の供給源を挙げることができる生物学的供給源からの精製若しくは未精製の形態の物質を意味しており、該系は生物学的活性（例えば遺伝子発現の阻害）に必要とされる成分を含んでなる。「生物学的系」という用語は、例えば細胞、ウイルス、微生物、生物体、動物若しくは植物を包含する。
「細胞」は、生物体を構成しうる（単細胞生物体の場合）か、または個々の細胞が特定の機能に特化かつ／もしくは分化されうる多細胞生物体のサブユニットでありうる、自律的自己複製単位を意味している。細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、酵母のような真菌細胞、トリ細胞、ヒト、ウシ、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、サル、ヒツジ、類人猿、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、イヌ、ネコおよびげっ歯類起源の細胞株のような哺乳動物細胞、ならびにショウジョウバエおよびカイコ由来細胞株のような昆虫細胞、若しくは植物細胞を包含する原核生物若しくは真核生物であり得る。細胞は、体細胞若しくは生殖細胞系列起源、分化全能性若しくはハイブリッド、分裂若しくは非分裂のものであり得る。細胞はまた、配偶子若しくは胚、幹細胞、または完全に分化した細胞にも由来し得るか若しくはそれらも含み得る。「細胞」という用語は特定の主題の細胞のみならずしかしまたこうした細胞の子孫若しくは潜在的子孫も指すことがさらに理解される。ある種の改変が突然変異若しくは環境の影響いずれかにより後に続く世代で発生し得るため、こうした子孫は実際は親細胞に同一でないかも知れないが、しかし本明細書で使用されるところの該用語の範囲内になお包含される。
ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド（これらの用語は本明細書で互換性に使用される）に関して本明細書で使用されるところの「相補的な」若しくは「相補性」という用語は、こうしたポリ若しくはオリゴヌクレオチドの個々の鎖の相互と会合する能力の尺度を指す。ＲＮＡ中の２種の主要な基礎的相互作用はスタッキングおよび水素結合形成である。双方はオリゴヌクレオチドの会合のための自由エネルギー変化に寄与する。ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用は、標準的なワトソン−クリック対形成（ＡがＵに対しかつＧがＣに対する）およびワトソン−クリック以外の対形成（限定されるものでないがフーグスティーン縁（ｅｄｇｅ）および／若しくは糖縁による相互作用を挙げることができる）を包含する（例えば、Ｌｅｏｎｔｉｓら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０：３４９７−３５３１を参照されたい）。
核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間の会合の効率および強さに対する有意の影響を有する。２本の核酸鎖配列間の「相補性」はらせん形成のための自由エネルギー変化に対応する。従って、核酸分子の結合自由エネルギーの測定は、ＲＮＡの三次元構造およびＲＮＡ−ＲＮＡ会合の解釈、例えばＲＮＡｉ活性、または二本鎖オリゴヌクレオチドの遺伝子発現若しくは形成の阻害を予測するのに有用である。こうした測定は当該技術分野で既知
の方法を使用して行い得る（例えば、Ｔｕｒｎｅｒら、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ．５２：１２３−３３；Ｆｒｉｅｒら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒら、１９８７、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：２７８３−３７８５を参照されたい）。
当業者が認識するであろうとおり、相補性は、存在する場合、例えば鎖間の最低１個若しくはそれ以上の核酸塩基が基準の塩基対形成規則に従って対形成し得る場合に部分的であり得る。例えば、配列５’−ＣＴＧＡＣＡＡＴＣＧ−３’、５’−ＣＧＡＡＡＧＴＣＡＧ−３’は相互と部分的に相補的である（本明細書で「不完全に相補的」ともまた称される）。本明細書で使用されるところの「部分的相補性」若しくは「部分的に相補的」は、核酸配列の連続する残基のある比率のみが、第二の核酸配列中の同一数の連続する残基と反平行様式でワトソン−クリック塩基対を形成し得ることを示す。例えば、１０ヌクレオチドを有する第二の核酸配列とワトソン−クリック塩基対形成を形成する第一のオリゴヌクレオチド中の合計１０ヌクレオチドの５、６、７、８、９若しくは１０ヌクレオチドは、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％の相補性を表す。
相補性はまた、一方の鎖の各およびすべての核酸塩基が、基準の塩基対形成規則に従って、別の反平行鎖中の対応する塩基と水素結合を形成することが可能である場合に全体的であり得る。例えば、配列５’−ＣＴＧＡＣＡＡＴＣＧ−３’および５’−ＣＧＡＴＴＧＴＣＡＧ−３’は相互に完全に相補的（本明細書で「完全に相補的」ともまた称される）である。本明細書で使用されるところの「完全な相補性」若しくは「完全に相補的」は、核酸配列の全部の連続する残基が、第二の核酸配列中の同一数の連続する残基と反平行様式でワトソン−クリック塩基対形成を形成し得ることを示す。
当業者は、反平行鎖中の対応する連続する塩基と十分に塩基対形成し得る塩基が存在しない場合に、該２鎖が相補性を有しないとみなすことができることを認識するであろう。本明細書のある態様において、２本の反平行鎖の少なくとも部分が相補性を有しないことができる。ある態様において、こうした部分は該２鎖の長さの大多数さえ含みうる。
前述に加え、当業者は、完全に相補的である等しい長さの鎖ではそれらの鎖の全部の区分が相互に完全に相補的であることを認識するであろう。等しい長さのものでない、すなわち平滑でない一方若しくは双方の端を有するヌクレオチド二重鎖に存在する鎖は、完全に相補的であると当業者によりみなされうるが、しかしながら、塩基対形成する相対する鎖中に対応する塩基を有しないオーバーハング端（１個若しくは複数）（「オーバーハング」）中に１個若しくはそれ以上の塩基が存在することができる。不完全にすなわち部分的に相補的である鎖の場合、相互に完全に相補的である数個若しくはなお多くの連続する塩基が存在する鎖の部分若しくは区分、および完全な相補性未満を有する不完全に相補的な鎖の他の部分が存在しうる、すなわちそれらの区分が相互に部分的にのみ相補的であることが理解されるべきである。
第一のヌクレオチド配列と第二のヌクレオチド配列の間の相補性の比率は、第一のヌクレオチド配列と第二のヌクレオチド配列の相補物の間の配列同一性若しくは類似性により評価し得る。第二のヌクレオチド配列にＸ％相補的であるヌクレオチド配列は、該第二のヌクレオチド配列の相補物にＸ％同一である。「ヌクレオチド配列の相補物」はヌクレオチド配列に完全に相補的であり、その配列はワトソン−クリック塩基対形成の規則を使用してヌクレオチド配列から容易に推定可能である。
当該技術分野で既知のところの「配列同一性若しくは類似性」は、配列を比較することにより決定されるところの２種若しくはそれ以上のポリペプチド配列または２種若しくは
それ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、同一性は、場合によっては、こうした配列の列間の一致により決定されるところのポリペプチド若しくはポリヌクレオチド配列間の配列の関係性の程度もまた意味している。２種のアミノ酸配列若しくは２種の核酸の同一性若しくは類似性パーセントを決定するため、配列を至適の比較の目的上整列する（例えば、第二のアミノ若しくは核酸配列との至適のアライメントのため、第一のアミノ酸若しくは核酸配列の配列中にギャップを導入し得る）。対応するアミノ酸位置若しくはヌクレオチド位置のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドをその後比較する。第一の配列中の１位置が、第二の配列中の対応する位置と同一若しくは類似のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドにより占有される場合には、該分子はその位置で同一若しくは類似である。２配列間の同一性若しくは類似性パーセントは、該配列により共有される同一若しくは類似の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数（例えば重なる位置）×１００）。一態様において、該２配列は同一長さである。
同一性および類似性の双方は容易に計算し得る。配列間の同一性若しくは類似性を決定するのに一般に使用される方法は、限定されるものでないがＣａｒｉｌｌｏら、（１９８８）、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８、１０７３に開示されるものを挙げることができる。同一性の好ましい決定方法は試験される配列間の最大の一致を与えるよう設計される。同一性および類似性の決定方法はコンピュータプログラムに体系化されている。
２配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの制限しない一例は、Ｋａｒｌｉｎら、（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７でのとおり改変されたＫａｒｌｉｎら、（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。比較の目的上ギャップを付けたアライメントを得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記述されるところのＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用し得る。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の離れた関係を検出する反復検索を実施し得る。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用し得る。加えて、ＦＡＳＴＡ法（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３）もまた使用し得る。
配列の比較に有用な数学的アルゴリズムの別の制限しない例は、Ｍｙｅｒｓら、（１９８８）、ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムはＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。
一態様において、２配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して決定する。ＣＧＣ ＧＡＰプログラムは、一致の数を最大にしかつギャップの数を最少にするように２個の完全な配列を整列する。
別の態様において、２配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＢｅｓｔＦｉｔプログラムに組み込まれているＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８１、１４７（１）：１９５−７）の局所相同性アルゴリズムを使用して決定する。ＢｅｓｔＦｉｔプログラムは２配列間の類似性の最良のセグメントの至適
のアライメントを行う。至適のアライメントは一致の数を最大にするようにギャップを挿入することにより見出される。
実質的な程度の相補性を共有するヌクレオチド配列は相互と安定な相互作用を形成することができる。本明細書で使用されるところの２ヌクレオチド配列に関しての「安定な相互作用」という用語は、該２ヌクレオチド配列が二本鎖分子を形成するように相互と相互作用する天然の傾向を有することを示す。２ヌクレオチド配列は広範な配列相補性内で相互と安定な相互作用を形成し得る。一般に、相補性が高くなるほど相互作用はより強く若しくはより安定になる。相互作用の異なる強さは異なる過程に必要とされうる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで安定なヌクレオチド配列二重鎖を形成するという目的上の相互作用の強さは、ｉｎ ｖｉｖｏでｉＲＮＡと結合配列の間で安定な相互作用を形成するという目的上のものと異なりうる。相互作用の強さは、適切なソフトウェアを用いて当業者により容易に実験的に決定若しくは予測され得る。
ハイブリダイゼーションを使用して、２種のポリヌクレオチドが相互に対し実質的に相補的であるかどうかを試験しかつ該相互作用がどのくらい安定であるかを評価し得る。十分な程度の相補性を共有するポリヌクレオチドは、多様なハイブリダイゼーション条件下で相互にハイブリダイズすることができる。一態様において、高程度の相補性を共有するポリヌクレオチドは、従って強い安定な相互作用を形成し、そして緊縮性ハイブリダイゼーション条件下で相互にハイブリダイズすることができる。「緊縮性ハイブリダイゼーション条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に記述されるところの当該技術分野で既知の意味を有する。例示的一緊縮性ハイブリダイゼーション条件は、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、次いで５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中の１回若しくはそれ以上の洗浄を含んでなる。
本明細書で使用されるところの「不適正」という用語は、対応する鎖上に対応するヌクレオチドを有しない２本の相互作用する鎖のいずれかの鎖のヌクレオチド、若しくは相補的でない対応する鎖上に対応するヌクレオチドを有する２本の相互作用する鎖のいずれかの鎖のヌクレオチドを指す。
本明細書で使用されるところの「一致」はヌクレオチドの相補対形成を指す。
本明細書で使用されるところの「発現系」という用語は、標的ＲＮＡ分子の発現および若しくは本発明の多標的ＲＮＡ分子のＲＮＡｉ活性を評価するのに使用し得るいずれかのｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏの系を指す。特定の態様において、「発現系」は、１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子、該１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子を標的とする多標的干渉ＲＮＡ分子、ならびに標的ＲＮＡ分子およびＲＮＡｉの発現を可能にする当業者に既知の細胞若しくはいずれかの型のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を含んでなる。
本明細書で使用されるところの「ＲＮＡ」という用語は、以下の塩基、すなわちアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシル（それぞれＡ、Ｃ、ＧおよびＵと略記される）の１種若しくはそれ以上の天然のヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、普遍的塩基、非環式ヌクレオチド、非塩基ヌクレオチドならびに非リボヌクレオチドを有するものを包含する最低１個のリボヌクレオチド残基を含んでなるいかなる分子も包含する。「リボヌクレオチド」はｐ−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基をもつヌクレオチドを意味している。
修飾リボヌクレオチドは、例えば、２’デオキシ、２’デオキシ−２’−フルオロ、２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−メトキシエチル、４’チオ若しくはロック（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）リボヌクレオチドを包含する。多様な型のリボヌクレオチドアナログおよびヌクレオチド間結合（バックボーン）の修飾を伴うＲＮＡの使用もまた本明細書で企図している。修飾ヌクレオチド間結合は、例えばホスホロチオエート修飾およびなお逆位結合（すなわち３’−３’若しくは５’−５’）を包含する。好ましいリボヌクレオチドアナログは、糖修飾および核酸塩基修飾リボヌクレオチド、ならびにそれらの組合せを包含する。好ましい糖修飾リボヌクレオチドにおいて、２’−ＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２若しくはＯＮ（式中、ＲはＣ１−Ｃ６アルキル、アルケニル若しくはアルキニルであり、およびハロはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ若しくはＩである）から選択される置換基により置換されている。好ましいバックボーン修飾リボヌクレオチドにおいて、隣接するリボヌクレオチドに結合するリン酸エステル基が、修飾基、例えばホスホロチオエート基により置換されている。上の修飾のいずれか若しくは全部を組合せうる。加えて、５’末端はＯＨ、リン酸、二リン酸若しくは三リン酸であり得る。核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基が、代わりに天然に存在しない核酸塩基、例えばＳ位で修飾されたウリジン若しくはシチジン（例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジンおよび５−ブロモウリジン）；８位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン（例えば８−ブロモグアノシン）；デアザヌクレオチド（例えば７−デアザアデノシン）；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド（例えばＮ６−メチルアデノシン）で置換されているリボヌクレオチドもまた、本明細書での使用に企図している。
本明細書で使用されるところの「普遍的塩基」という用語は、それらの間の区別をほとんど伴わない天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれと塩基対を形成するヌクレオチド塩基アナログを指す。普遍的塩基の制限しない例は、当該技術分野で既知のところの、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチルおよび他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびに３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドールおよび６−ニトロインドールのようなニトロアゾール誘導体を包含する（例えばＬｏａｋｅｓ、２００１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９、２４３７−２４４７を参照されたい）。
本明細書で使用されるところの「非環式ヌクレオチド」という用語は、例えばリボース炭素のいずれか（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４若しくはＣ５）が独立に若しくは組合せでヌクレオチドに存在しない非環式リボース糖を有するいかなるヌクレオチドも指す。
ＲＮＡ配列の列挙に関して本明細書で使用されるところの、塩基チミジン（「Ｔ」）およびウリジン（「Ｕ」）は、配列情報の供給源（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）に依存して頻繁に互換性である。従って、標的配列、シード配列、候補シード、コンセンサス標的配列、標的ＲＮＡ結合部位などの開示において、塩基「Ｔ」は塩基「Ｕ」と完全に互換性である。しかしながら、本発明の干渉ＲＮＡ分子の特定の開示に関して、こうした配列について塩基「Ｕ」の使用が機能的様式で「Ｔ」で一般に置換され得ないことが理解されるべきである。しかしながら、ＲＮＡ分子中の塩基「Ｕ」のある種の存在は、官能性に対する実質的な有害な影響なく「Ｔ」で置換され得ることが当該技術分野で既知である。例えば、３’端のＵＵオーバーハングのようなオーバーハング中のＵの代わりのＴの使用はサイレントであるかもしくは少なくとも許容できることが知られており、そして従って本明細書に提供される干渉ＲＮＡ配列で許容できる。従って、当業者が、本発明および付随する請求の範囲の範囲内にある他の構造的に関連しかつ機能上同等な構造に到達するために、本明細書に開示される特定の干渉ＲＮＡ配列でさえ変動させる方法を認識するであろうことを企図している。
本明細書で使用されるところの「標的ＲＮＡ分子」若しくは「予め選択された標的ＲＮＡ分子」は、その発現若しくは活性が、発現系で本発明の干渉ＲＮＡ分子により調節、例えば低下されることが望ましい、いかなるＲＮＡ分子も指す。「標的ＲＮＡ分子」は目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子であり得る。メッセンジャーＲＮＡ分子は、典型的に、コーディング領域ならびにコーディング領域に先行（「５’ＵＴＲ」）および後続する（「３’ＵＴＲ」）非コーディング領域を包含する。「標的ＲＮＡ分子」は、一過性低分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核小体小分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびそれらの前駆体ＲＮＡのような非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）でもまたあり得る。ｎｃＲＮＡは機能的若しくは調節性の細胞過程に関与するため、こうした非コードＲＮＡもまた標的ＲＮＡ分子としてはたらき得る。疾患に至る異常なｎｃＲＮＡ活性は、従って、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子により調節され得る。標的ＲＮＡは、さらに、ウイルス、例えばＲＮＡウイルスのゲノム、若しくはいずれかの段階のいずれかのウイルスの複製中間体、ならびにこれらのいずれかの組合せであり得る。
「標的ＲＮＡ分子」は、生物学的系に対し内因性であるＲＮＡ分子、若しくは、その感染後に細胞中に存在する病原体、例えばウイルスのＲＮＡ分子のような、生物学的系に対し外因性であるＲＮＡ分子であり得る。標的ＲＮＡを含有する細胞はいかなる生物体、例えば植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌若しくは真菌にも由来し得るか若しくは含有され得る。植物の制限しない例は単子葉類、双子葉類若しくは裸子植物を包含する。動物の制限しない例は脊椎動物若しくは無脊椎動物を包含する。真菌の制限しない例はカビ若しくは酵母を包含する。
本明細書で使用されるところの「標的ＲＮＡ分子」は所望のＲＮＡ分子のいかなるバリアント若しくは多形も包含しうる。大部分の遺伝子は、低いがしかしにもかかわらず有意の率の配列変動性が同一種の個体間である遺伝子で起こるために多形である。従って、ＲＮＡ分子は複数の配列エントリと相関することがあり、それらのそれぞれはＲＮＡ分子のバリアント若しくは多形を表す。いずれかの遺伝子抑制ツールの設計において、コンピュータ支援設計で使用される選択された結合配列（１種若しくは複数）が比較的多くないアレルを含有しうるという危険が存在する。結果として、設計される活性の配列は、小さい比率の個体でのみ、必要とされる利益を提供することが期待されうる。大部分のバリアント（しばしば一塩基多形（ＳＮＰ）と称される）の頻度、性質および位置は、当業者に容易に到達可能である。この点に関して、高度に多形であることが既知である標的分子内の配列を、生物情報学的スクリーニングの間の結合配列の選択で回避し得る。あるいは、いずれかの特定の標的に利用可能な無制限の数の配列を、アレルバリアントのターゲッティングが望ましい状況（すなわちアレルバリアントそれ自身が目的の疾患に関与する場合）を除き、標的とされる結合配列がアレルバリアントの大多数に存在することを確実にするために、本発明の干渉ＲＮＡの設計段階で使用しうる。
「標的ＲＮＡ分子」は、結合配列のガイド配列との安定な相互作用を可能にするように本発明の干渉ＲＮＡ分子のガイド配列に十分に相補的である最低１種の標的とされる結合配列を含んでなる。該標的とされる結合配列は、所望の効果に基づき、転写物配列のいずれかの部分（例えば５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、３’ＵＴＲ）を包含するよう改良し得る。例えば転写抑制は３’ＵＴＲで作動する頻繁な機構である（例えばミクロＲＮＡに関して）。従って、標的とされる結合配列は効果的な翻訳抑制のため３’ＵＴＲ中の配列を包含し得る。
「標的とされる結合配列」、「結合配列」若しくは「標的配列」は、全部、シード配列、およびシードの一方若しくは双方いずれかの端に隣接する配列を含んでなる標的ＲＮＡ分子配列の一部分を意味しており、前記結合配列は、ガイド鎖と結合配列の間の相補性に基づき本発明の多標的干渉ＲＮＡのガイド鎖と安定な相互作用を形成することが予測される。
本明細書で使用されるところの「非標的トランスクリプトーム」若しくは「標的とされないトランスクリプトーム」という用語は、標的とされるＲＮＡ分子以外のトランスクリプトームを示す。例えば、多標的干渉ＲＮＡがウイルスＲＮＡを標的とするよう設計される場合、標的とされないトランスクリプトームは宿主のものである。多標的干渉ＲＮＡが生物学的系中の所定のＲＮＡを標的とするよう設計される場合は、標的とされないトランスクリプトームは、標的とされる所定のＲＮＡ以外の該生物学的系のトランスクリプトームである。
本明細書で使用されるところの「シード」若しくは「シード配列」若しくは「シード領域配列」という用語は、干渉ＲＮＡのガイド鎖の一部分に完全に相補的である標的ＲＮＡに存在する最低約６個の連続するヌクレオチドの配列を指す。６個若しくはそれ以上の連続する塩基が好ましいとは言え、「約６」という表現は、最低５個若しくはそれ以上の連続する塩基またはそれ以上のウィンドウがいくつかの場合に有用な候補を提供し得、かつ、有用な干渉ＲＮＡの設計に究極的につながり得るという事実を指す。従って、全部のこうしたシード配列を本発明の範囲内で企図している。
「保存若しくは保存された」は、シード配列のような特定の配列が、該特定の配列の遺伝子の情況に関係なく、関係する標的配列の一群で表れることが見出される程度を示す。
「遺伝子の情況」は、特定の同定された配列を取り囲み、かつ、一般的な使用において当業者が配列の注釈若しくは他のマーカーに関してゲノム若しくはＲＮＡ分子内のその位置を決定することを可能にするのに十分に長い、隣接配列を指す。
本明細書で使用されるところの「干渉ＲＮＡ」という用語は、例えばＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）を配列特異的様式で媒介することにより標的ＲＮＡ分子の存在、プロセシング、転写、翻訳若しくは半減期を調節する一若しくは二本鎖ＲＮＡ分子を示すのに使用する。本明細書で使用されるところの「ＲＮＡ干渉」若しくは「ＲＮＡｉ」という用語は、翻訳後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害若しくはエピジェネティクスのような配列特異的ＲＮＡ干渉を記述するのに使用される他の用語と同等であること意味している。これは、例えば、ＲＩＳＣに媒介される分解若しくは翻訳抑制、ならびに転写サイレンシング、変えられたＲＮＡエディティング、調節タンパク質への結合についての競合、およびｍＲＮＡスプライシングの変化を包含する。それはまた、限定されるものでないがナンセンス媒介型崩壊およびＰ体（Ｐ ｂｏｄｙ）への転位置を挙げることができる、当該技術分野で既知の他の過程による標的ＲＮＡの分解および／若しくは不活性化も包含する。従って、本明細書で提供される干渉ＲＮＡ（例えばＣＯＤＥＭＩＲおよびＶＩＲＯＭＩＲ）は、単独で、または当該技術分野で既知のＲＮＡ調節の１種若しくはそれ以上の他の手段と組合せで、前述の機構のいずれかを介してそれらの機能的効果を発揮しうる。本明細書で提供される干渉ＲＮＡは、遺伝子刷り込み、転写、翻訳若しくは核酸プロセシング（例えばアミノ基転移、メチル化など）のような細胞過程に介入することにより、生物体若しくは細胞の遺伝子型若しくは表現型を操作する若しくは変えるのに使用し得る。
「干渉ＲＮＡ」という用語は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介することが可能である核酸分子、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、翻訳後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）および他者を記述するのに使用される
他の用語に同等であること意味している。
「干渉ＲＮＡ」は、例えば、自己相補性センスおよびアンチセンス鎖を含んでなる二本鎖ポリヌクレオチド分子であり得る。「パッセンジャー」ともまた命名される「センス」は、「ガイド」、「ガイディング」若しくは「標的相補性」鎖ともまた命名される「アンチセンス」のＲＩＳＣへの提示に必要とされる。ガイド鎖は活性のＲＩＳＣ複合体に保持され、そして相補的塩基対形成によって標的ヌクレオチド配列にＲＩＳＣを誘導し、それが順にＲＮＡｉをもたらす。二本鎖干渉ＲＮＡの２本の鎖の５’末端の相対的熱力学的特徴が、どちらの鎖がＲＮＡｉの間にパッセンジャー若しくはガイド鎖の機能を供することができるかを決定する。事実、非対称ＲＩＳＣ形成は、最近隣内挿法により計算される干渉ＲＮＡの５’末端の最初の４ヌクレオチド対の相対的熱力学的強さにより定義し得る。Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ（２００５）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５７９：５８５０−５８５７。従って、本発明の干渉ＲＮＡの設計において、ガイド鎖は５’末端の熱力学的特徴により予め決定し得る。
本発明の干渉ＲＮＡ中で、ガイド鎖は、１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子に存在する１種若しくはそれ以上のしかし全部ではない結合配列に完全に相補的な配列を有し得る。それはまた、相補性が標的分子上のガイド鎖と結合配列の間の安定な相互作用の形成に十分である限りは、標的ＲＮＡ分子に存在する１個の結合配列にも部分的に相補的であり得る。「パッセンジャー鎖」は、相補性がガイド鎖とパッセンジャー鎖の間の安定な相互作用の形成に十分である限りは、ガイド鎖に完全に若しくは部分的に相補的であり得る。従って、パッセンジャー鎖は標的分子上の結合配列に完全に若しくは部分的に同一であり得る。パッセンジャー鎖およびガイド鎖双方は、本発明の干渉ＲＮＡ分子の機能のいくつかの局面を高めるように改変および改良し得る。例えば、多様なファルマコフォア、色素、マーカー、リガンド、複合物、抗体、抗原、ポリマー、ペプチドおよび他の分子を、本発明の分子に便宜的に連結し得る。干渉ＲＮＡは、５’−リン酸若しくは５’，３’−二リン酸のような末端リン酸基をさらに含み得る。これらは細胞取り込み、安定性、組織ターゲッティング若しくはそれらのいずれかの組合せを改良するために有用でありうる。
「干渉ＲＮＡ」は、一方のオリゴヌクレオチドがセンス鎖でありかつ他方がアンチセンス鎖である２本の別個のオリゴヌクレオチドから集成し得る。「干渉ＲＮＡ」は、干渉ＲＮＡの自己相補的センスおよびアンチセンス領域が核酸に基づく若しくは核酸に基づかないリンカー（１種若しくは複数）によって連結されている単一オリゴヌクレオチドからもまた集成し得る。「干渉ＲＮＡ」は、自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有する二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン若しくは非対称ヘアピン二次構造をもつポリヌクレオチドであり得る。「干渉ＲＮＡ」は、１個若しくはそれ以上のループ構造、および自己相補的領域を含んでなるステムを有する一本鎖ポリヌクレオチド（例えば低分子ヘアピン型ＲＮＡすなわちｓｈＲＮＡ）でもまたあり得、該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ不活性化を媒介することが可能な１種若しくはそれ以上の二本鎖干渉ＲＮＡを生成するためにｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏいずれでもプロセシングされ得る。二本鎖ＲＮＡを生成するための一本鎖ＲＮＡの自己対形成領域（１個若しくは複数）の切断はｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで発生し得、それらの双方を本明細書での使用に企図している。
「干渉ＲＮＡ」は、標的核酸分子若しくはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドでもまたあり得（すなわちガイド鎖）、例えば、ここでこうした干渉ＲＮＡ分子は、標的核酸配列若しくはその一部分に対応するヌクレオチド配列（すなわちパッセンジャー鎖）の分子内の存在を必要としない。
本明細書で使用されるところの「干渉ＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡのみを含有する分
子に制限される必要はないが、しかし、上述されたもののような１種若しくはそれ以上の修飾リボヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを有するものをさらに包含する。
「干渉ＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え製造したＲＮＡのような単離されたＲＮＡ、ならびに、１個若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／若しくは変更により天然に存在するＲＮＡと異なる変えられたＲＮＡを包含する。こうした変更は、多標的干渉ＲＮＡの端（一方若しくは複数）への、または内的に、例えばＲＮＡの１個若しくはそれ以上のヌクレオチドでのような、ヌクレオチド以外の物質の付加を包含し得る。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学合成ヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのような標準的でないヌクレオチドもまた含み得る。これらの変えられたＲＮＡは天然に存在するＲＮＡのアナログ（１種若しくは複数）と称し得る。
「多標的干渉ＲＮＡ」ともまた称される本発明の干渉ＲＮＡは、異なる遺伝子の情況で１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子上に存在する最低２種の結合部位と安定な相互作用を形成し得るガイド鎖を有する干渉ＲＮＡである。多標的干渉ＲＮＡの例は、ＣＯＤＥＭＩＲすなわちコンピュータ設計多標的干渉ＲＮＡ（ＣＯｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ−ＤＥｓｉｇｎｅｄ，Ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、および、これらの多標的干渉ＲＮＡ分子がウイルス標的を優先的に標的とするＶＩＲＯＭＩＲを包含する。
「配列」は、単量体がポリマー中に存在する直線的順序、例えばポリペプチド中のアミノ酸の順序若しくはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序を意味している。
本明細書で使用されるところの「被験体」は、本発明の核酸分子を投与し得る生物体を指す。被験体は、処置、観察若しくは実験の対象であった動物若しくは植物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト、またはそのいかなる細胞でもあり得る。
本明細書で使用されるところの「治療上有効な量」という用語は、処置されている疾患若しくは障害を予防、改善若しくはその症状を軽減することを包含する、研究者、獣医師、医師若しくは他の臨床家により探求されている被験体での生物学的若しくは医学的応答を導き出す有効成分若しくは製薬学的剤の量を意味している。本製薬学的組成物の治療上有効な用量の決定方法は当該技術分野で既知である。
「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。１つの型のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントを挿入し得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の型のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントを挿入し得るウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに組込まれ、そしてそれにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターすなわち発現ベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指図することが可能である。
本明細書で使用されるところの「ＲＮＡ分子の発現を調節する（若しくは、その調節）」は、ＲＮＡ分子のレベルおよび／若しくは生物学的活性のいかなるＲＮＡ干渉に媒介される調節も意味している。それは、標的ＲＮＡ分子を切断すること、不安定化すること、若しくはＲＮＡ翻訳を予防することによるような、いかなるＲＮＡｉ関連の転写若しくは翻訳後遺伝子サイレンシングも包含する。一態様において、「調節する」という用語は「阻害する」を意味し得るが、しかし、「調節する」という語の使用はこの定義に制限されない。標的ＲＮＡ分子の調節は、適する発現系で、例えばｉｎ ｖｉｖｏで、１個若しくはそれ以上の適する細胞で、または当該技術分野で既知であるような無細胞すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系で測定する。転写、翻訳、若しくはＲＮＡ分子に関連する発現の他の局面のパラメータの慣例の測定方法は当該技術分野で既知であり、そしていかなるこうした測定も本明細書の使用に適する。
標的ＲＮＡ若しくはその発現に関してのところの「阻害する」、「下方制御する」、「低下する」若しくは「減少する」により、標的ＲＮＡ分子の遺伝子の発現またはレベルおよび／若しくは生物学的活性が、本発明の核酸分子（例えば多標的干渉ＲＮＡ）の非存在下で観察されるものより下に低下されることを意味している。一態様において、多標的干渉ＲＮＡ分子での阻害、下方制御若しくは低下は、不活性若しくは減弱された分子の存在下で観察されるものより大きい。別の態様において、多標的干渉ＲＮＡ分子での阻害、下方制御若しくは低下は、例えばスクランブル配列若しくは不適正をもつ多標的干渉ＲＮＡ分子の存在下で観察されるものより大きい。別の態様において、本発明の核酸分子での遺伝子発現の阻害、下方制御若しくは低下は、該核酸分子の存在下でその非存在下でより大きい。
標的ＲＮＡ若しくはその発現に関してのところの「阻害する」、「下方制御する」、「低下する」若しくは「減少する」は、例えば、選択された発現系での標的ＲＮＡの転写若しくは翻訳の量若しくは速度の低下、標的ＲＮＡの活性の量若しくは速度の低下、および／または前述の組合せを包含する。当業者は、コードされる遺伝子産物の転写の総量、転写の速度、翻訳の総量、若しくは翻訳の速度、またはなお活性の減少がこうした減少を暗示することを認識するであろう。ＲＮＡの「活性」は、例えばそれ自身若しくは別のＲＮＡ分子の転写を高めること若しくは抑制することのような転写に対するいかなる影響も包含する、細胞若しくは発現系で該ＲＮＡが有しうるいかなる検出可能な影響も指す。所定のＲＮＡの活性の発現若しくは測定の「減少」の測定は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで、こうした目的上既知の若しくは開発された、またはそれに適応可能ないずれの系でも実施し得る。好ましくは、特定の干渉ＲＮＡによる発現の「減少」の測定は、例えば干渉ＲＮＡを使用しない対照に関して行う。いくつかの比較の態様において、こうした測定は、何らかの他の干渉ＲＮＡ若しくは干渉ＲＮＡの組合せを使用する対照に関して行う。最も好ましくは、減少のような変化は、統計学的有意性の一般に許容される検定に基づき統計学的に有意である。しかしながら、可能な尺度の多数、および候補干渉ＲＮＡを迅速にスクリーニングする能力に対する必要性のため、所定のＲＮＡは、本明細書で使用されるところの「発現の減少」を示すとみなされるために１種のこうしたｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏアッセイで算術的減少を示すことのみを必要とすることを、本明細書で企図している。
より具体的には、多標的干渉ＲＮＡの生物学的調節活性は、それぞれｓｉＲＮＡおよびミクロＲＮＡ遺伝子サイレンシングに関与する慣習的ＲＩＳＣタンパク質複合体による分解若しくは翻訳抑制に制限されないか、若しくは必ずしも頼らない。事実、低分子の二本鎖および一本鎖ＲＮＡは代替の機構を介して他の可能な配列特異的役割を有することが示された。例えば、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）種は、おそらく調節タンパク質への結合により分化／細胞活性の調節エフェクターとして作用しうる（Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｔ．ら、（２００４）、Ｃｅｌｌ、１１６：７７９−９３）。あるいは、ｄｓＲＮＡは、ＡＵ豊富なエレメント（ＡＲＥ）結合タンパク質の関与によりｍＲＮＡの分解につながりうる（Ｊｉｎｇ，Ｑ．ら、（２００５）、Ｃｅｌｌ、１２０：６２３−３４）。さらに、ｄｓＲＮＡはエピジェネティックな転写サイレンシングもまた誘導しうる（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｋ．Ｖ．ら、（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５：１２８９−８９）。ｍＲＮＡのプロセシングはＡからＩへのエディティングおよび改変スプライシングによってもまた変えることができる。
本明細書で使用されるところの「パリンドローム」若しくは「パリンドローム配列」は、ある核酸配列に同一である第二のヌクレオチド配列に完全に相補的である核酸配列、例えばＵＧＧＣＣＡを意味している。該用語は、パリンドローム配列である２種のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子もまた包含する。
本明細書で使用されるところの「表現型変化」は、本発明の核酸分子との接触若しくはそれでの処理に応答して発生する細胞若しくは生物体に対するいかなる検出可能な変化も指す。こうした検出可能な変化は、限定されるものでないが、当該技術分野で既知の方法によりアッセイし得るところの形状、大きさ、増殖、移動性、タンパク質発現若しくはＲＮＡ発現の変化、または他の物理的若しくは化学的変化を挙げることができる。検出可能な変化は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなレポーター遺伝子／分子、または、アッセイし得る発現されるタンパク質若しくはいずれかの他の細胞成分を同定するのに使用し得る多様な標識の発現もまた包含し得る。
本発明は、異なる遺伝子の情況で１種若しくはそれ以上の予め選択された標的ＲＮＡ分子に存在する最低２種の結合配列と安定な相互作用を形成するガイド鎖を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子を提供する。一般的な一局面において、本発明は、式（Ｉ）：
５’−ｐ−ＸＳＹ−３’（式Ｉ）
のガイド鎖を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子を提供する。
式（Ｉ）中で、ｐはガイド鎖の５’端に存在若しくは非存在であり得る末端リン酸基よりなる。当業者に既知のいかなる末端リン酸基も使用し得る。こうしたリン酸基は、限定されるものでないが、一リン酸、二リン酸、三リン酸、環状リン酸、若しくはリン酸エステル結合のようなリン酸の化学的誘導体を挙げることができる。
式（Ｉ）中で、Ｓは、異なる遺伝子の情況で１種若しくはそれ以上の予め選択された標的ＲＮＡ分子に存在する最低２種の結合配列のそれぞれの第一の部分に少なくとも部分的に、好ましくは完全に相補的である約５ないし約２０ヌクレオチドの長さの第一のヌクレオチド配列よりなる。特定の態様において、Ｓは、最低２種の結合配列の第一の部分に少なくとも部分的に、好ましくは完全に相補的である、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５ヌクレオチドの長さのような約６ないし約１５ヌクレオチドの長さを有する。一態様において、Ｓは、異なる遺伝子の情況で１種若しくはそれ以上の予め選択された標的ＲＮＡ分子に存在する１、２、３、４、５種若しくはそれ以上の異なる結合配列のそれぞれのシード配列に完全に相補的である。当業者は、最低２種の異なる結合配列が同一の標的ＲＮＡ分子上にありうるか、若しくはそれらが異なるＲＮＡ分子上にあり得ることを認識するであろう。
ある態様において、Ｓは、
５’ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧ（配列番号１）３’、ＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２）、ＡＣＣＣＣＧＵＣＵＣＵ（配列番号５）、ＡＧＣＵＧＣＡ（配列番号７）、ＡＡＡＣＡＡＵＧＧＡＡＵＧ（配列番号８）、ＧＧＵＡＧＧＵＧＧＧＵＧＧＧ（配列番号１０）、ＣＵＧＣＵＵＧＡＵ（配列番号１２）、ＵＣＣＵＵＵＣＣＡ（配列番号１３）、ＵＵＵＵＵＣＵＵＵ（配列番号１４）、ＵＵＣＵＧＡＵＧＵＵＵ（配列番号１５）、ＵＣＵＵＣＣＵＣＵＡＵ（配列番号１６）、ＵＧＧＵＡＧＣＵＧＡＡ（配列番号１７）、ＣＵＵＵＧＧＵＵＣＣＵ（配列番号１８）、ＣＵＡＣＵＡＡＵＧＣＵ（配列番号１９）、ＵＣＣＵＧＣＵＵＧＡＵ（配列番号２０）、ＡＵＵＣＵＵＵＡＧＵＵ（配列番号２１）、ＣＣＡＵＣＵＵＣＣＵＧ（配列番号２２）、ＣＣＵＣＣＡＡＵＵＣＣ（配列番号２３）、ＣＵＡＡＵＡＣＵＧＵＡ（配列番号２４）、ＵＵＣＵＧＵＵＡＧＵＧ（配列番号２５）、ＧＣＵＧＣＵＵＧＡ
ＵＧ（配列番号２６）、ＡＣＡＵＵＧＵＡＣＵＧ（配列番号２７）、ＵＧＡＵＡＵＵＵＣＵＣ（配列番号２８）、ＡＡＣＡＧＣＡＧＵＵＧ（配列番号２９）、ＧＵＧＣＵＧＡＵＡＵＵ（配列番号３０）、ＣＣＣＡＵＣＵＣＣＡＣ（配列番号３１）、ＵＡＵＵＧＧＵＡＵＵＡ（配列番号３２）、ＣＡＡＡＵＵＧＵＵＣＵ（配列番号３３）、ＵＡＣＵＡＵＵＡＡＡＣ（配列番号３４）、ＧＣＣＵＡＵＣＡＵＡＵ（配列番号５８）、ＵＧＧＵＧＣＣＵＧＣＵ（配列番号５９）、ＡＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＣ（配列番号６０）、ＣＣＣＵＣＵＧＧＧＣＵ（配列番号６１）、ＵＵＣＵＵＣＣＵＣＡＵ（配列番号６２）、ＵＡＵＵＵＡＵＡＣＡＧＡ（配列番号６３）、ＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＣ（配列番号６４）、ＵＧＡＧＵＮＮＧＡＡＣＡＵＵ（配列番号７２）（式中Ｎはいずれかの塩基であり）、ＣＵＣＣＡＧＧ（配列番号７４）、ＵＣＡＧＵＧＧＧ（配列番号７６）、ＵＣＣＵＣＡＣＡＧＧＧ（配列番号７８）、ＧＵＧＣＵＣＡＵＧＧＵＧ（配列番号７９）、ＣＣＵＧＧＡＧＣＣＣＵＧ（配列番号８０）、ＵＣＵＣＡＧＣＵＣＣＡＣ（配列番号８１）、ＡＣＣＣＵＣＧＣＡＣＣ（配列番号８６）、ＧＵＧＵＵＧＡＡＧ（配列番号８８）、ＵＵＣＣＡＣＡＡＣ（配列番号９０）、ＵＣＣＡＣＵＧＵＣ（配列番号９２）、ＣＡＧＡＡＵＡＧ（配列番号９３）、ＡＡＣＵＣＵＣＵＡ（配列番号９４）およびＣＧＵＧＡＡＧＡＣ（配列番号９８）
よりなる群から選択されるヌクレオチド配列より本質的になる。
ある好ましい態様において、Ｓは、ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧ（配列番号１）、ＵＣＣＵＣＡＣＡＧＧＧ（配列番号７８）、ＧＵＧＵＵＧＡＡＧ（配列番号８８）、ＵＵＣＣＡＣＡＡＣ（配列番号９０）、ＡＡＣＵＣＵＣＵＡ（配列番号９４）およびＣＧＵＧＡＡＧＡＣ（配列番号９８）よりなる群から選択されるヌクレオチド配列より本質的になる。
他の態様において、Ｓは、
ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧ（配列番号１）、ＵＣＣＵＣＡＣＡＧＧＧ（配列番号７８）、ＧＵＧＵＵＧＡＡＧ（配列番号８８）、ＵＵＣＣＡＣＡＡＣ（配列番号９０）、ＡＡＣＵＣＵＣＵＡ（配列番号９４）およびＣＧＵＧＡＡＧＡＣ（配列番号９８）
よりなる群から選択される配列のいずれか内に含有される６個若しくはそれ以上の連続する塩基のヌクレオチド配列より本質的になる。
ある態様において、Ｓは、異なる遺伝子の情況で１種若しくはそれ以上の予め選択された標的ＲＮＡ分子に存在する最低２種の異なる結合配列の第一の部分に部分的に相補的であり、Ｓの７個の連続するヌクレオチドのうち６個、８個のうち７個、９個のうち８個、１０個のうち９個、１１個のうち１０個、１２個のうち１１個、１３個のうち１２個、１４個のうち１３個、１５個のうち１４個若しくは１６個のうち１５個のようなが、最低２種の標的ＲＮＡ結合配列の第一の部分に完全に相補的である。他の態様において、Ｓ、および異なる結合配列の第一の部分は、完全に相補的な１２ヌクレオチドのうち１０、１３のうち１１、１４のうち１２、１５のうち１３若しくは１６のうち１４のようなより少ない全体的相補性を有する。
式（Ｉ）中で、Ｘは非存在であるか若しくは第二のヌクレオチド配列よりなる。特定の態様において、Ｘは１若しくは２ヌクレオチドよりなる。
式（Ｉ）中で、Ｙは非存在であるか若しくは第三のヌクレオチド配列よりなるが、但しＸおよびＹは同時に非存在でない。Ｙは、最低２種の異なる結合配列のそれぞれの第二の部分に関して完全から非存在までの範囲にわたる相補性を有し、該第二の部分は結合配列の第一の部分の５’端に隣接しかつそれに結合されている。一態様において、Ｙは最低１種の結合配列の第二の部分に少なくとも部分的に相補的であり、従ってガイド鎖が該最低１種の結合配列と改良された相互作用を有することを可能にする。好ましくは、Ｙは、これらの第二の部分が結合し得るコンセンサス様配列を含んでなることにより、異なる結合配列の第二の部分のそれぞれに至適の若しくは所望の結合を提供する。ガイド鎖に完全未
満の相補的領域を有するというこの局面は、例えば異なる結合配列間に何らかのコンセンサスの領域を提供することにより、ある態様においてとりわけ有用である。
本発明の特定の態様において、ガイド鎖で、各結合配列のシード部分に対する完全な相補性をもつＳ、および各結合配列の第二の部分に不完全に相補的であるＹを組合せることにより、ＸＳＹの全体的ヌクレオチド配列は、結合配列のそれぞれとの安定な相互作用を可能にして従って結合配列を含んでなるいずれかの標的分子の多標的干渉ＲＮＡを提供するように、異なる結合配列のそれぞれに対しそれが少なくとも部分的に相補的であるようである。いくつかの態様において、ＸＳＹは異なる結合配列の最低１種に完全に相補的でありうる。他の態様において、ＸＳＹは双方の異なる結合配列に部分的に相補的である。
多標的干渉ＲＮＡは、上述される式（Ｉ）のガイド鎖、およびパッセンジャー鎖とガイド鎖の間の安定な二重鎖の形成を可能にするようにガイド鎖に少なくとも部分的に相補的であるパッセンジャー鎖の双方を含み得る。パッセンジャー鎖およびガイド鎖は相互に完全に相補的であり得る。パッセンジャー鎖およびガイド鎖は同一若しくは異なる長さを有し得る。本発明の一態様において、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子の各鎖は、長さが独立に約１７ないし約２５ヌクレオチド、特定の態様において、長さが約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５ヌクレオチドである。ＤｉｃｅｒおよびＲＮアーゼＩＩＩのような酵素によるＲＮＡのプロセシングによる複数の活性鎖の生成に対する必要性を伴わないより短い長さの干渉ＲＮＡ分子を使用することは、例えば費用、製造およびオフターゲット効果の機会の低減における利点を提供する。
パッセンジャー鎖とガイド鎖の間の相互作用は、細胞ＲＩＳＣ複合体へのガイド鎖の負荷を改良するように（Ｋｈｖｏｒｏｖａら（２００３）Ｃｅｌｌ、１１５：２０９−１６；Ｓｃｈｗａｒｚら（２００３）Ｃｅｌｌ、１１５：１９９−２０８）、若しくは多標的干渉ＲＮＡの機能的局面を別の方法で改良するように調節し得る。当業者は、合成二重鎖のいずれかの鎖での１個若しくはそれ以上の塩基の付加、欠失若しくは置換による塩基対形成した鎖の強さおよび他の特性の慣例の変更方法が存在することを認識するであろう。とりわけ、一例として、これらの戦略は、二重鎖の予測される熱力学が所望の鎖の負荷に対し伝導性であることを確実にするように、二重鎖の末端の設計に適用し得る。これらの戦略は当業者に公知である。
実質的に二本鎖のＲＮＡ分子が、例えば、該分子が式（Ｉ）のガイド鎖を含んでなる二本鎖核酸の少なくとも一領域を形成するように自己対形成することを可能にするヘアピンループ若しくは類似の二次構造をもつ一本鎖ＲＮＡ分子を含んでなることもまた、本明細書で企図している。
当業者は、該二本鎖ＲＮＡ分子が治療的応用での使用にある種の利点を提供することを認識するであろう。平滑端分子をある態様について本明細書で開示するとは言え、多様な他の態様において、例えば１〜５ヌクレオチドのオーバーハングがいずれか若しくは双方の末端に存在する。いくつかの態様において、オーバーハングは長さが２若しくは３塩基である。現在好ましいオーバーハングは、ある態様における３’−ＵＵオーバーハングを包含する。本明細書での使用のため例示される他のオーバーハングは、限定されるものでないが３’−ＡＡ、３’−ＣＡ、３’−ＡＵ、３’−ＵＣ、３’−ＣＵ、３’−ＵＧ、３’−ＣＣ、３’−ＵＡ、３’−Ｕおよび３’−Ａを挙げることができる。多様な長さおよび組成のなお他の５’若しくはより好ましくは３’いずれかのオーバーハングを、本明細書での使用のため、提供されるＲＮＡ分子上で企図している。
ある態様において、最低１種の標的ＲＮＡ分子はｍＲＮＡである。より具体的には、いくつかの態様において、最低１種の標的は、受容体、サイトカイン、転写因子、調節タン
パク質、シグナル伝達タンパク質、細胞骨格タンパク質、トランスポーター、酵素、ホルモン若しくは抗原をコードする。であるから、細胞中のタンパク質標的の潜在的範囲は制限されないが、しかしながら、当業者は、ある種の標的が特定の疾患状態若しくは過程で価値があることがよりありそうであることを認識するであろう。加えて、当業者は、病原体（例えばウイルス）から発する標的ＲＮＡ分子が、コーディングであれ調節であれ、本明細書に提供される多標的ＲＮＡおよび方法で有用であることを認識するであろう。
一態様において、結合配列の最低１種はｍＲＮＡの３’ＵＴＲにある。多様なＲＮＡ分子のマルチターゲッティングを特徴とする態様において、好ましくは、標的ＲＮＡは、単に単一遺伝子のスプライスバリアントでなく、単に相互のアイソフォームでもない。数種若しくは全部のこうしたスプライスバリアント若しくはアイソフォームを調節することが不可欠であるか若しくは好ましい他の態様において、複数の標的がこうした配列を包含しうる。
１種の標的若しくはそれ以上の標的の包含は、別の選択された標的を標的とする特定の干渉ＲＮＡの使用若しくはそれに対する意図を排除しない。いずれかの付加的なＲＮＡ標的分子のこうしたターゲッティングは、発現系でより少ない、等しい若しくはより大きい効果をもたらしうる。前述にもかかわらず、本発明の多標的干渉ＲＮＡを、好ましくはオフターゲット効果、とりわけありそうであるものについてスクリーニングする。例えば、トランスクリプトーム全体への、若しくはその時点で既知であるところのそれの同じ程度の潜在的結合を精査することは、こうしたスクリーニングへの有用なアプローチを提供する。例えば、ゲノムを完全にシークェンシングする場合、当業者は、トランスクリプトーム全体をありそうなオフターゲット効果について便宜的にスクリーニングし得ることを認識するであろう。多標的干渉ＲＮＡの局所送達が予期される場合、完全なトランスクリプトームから生物情報学のアプローチにより同定される非標的転写物が、多標的干渉ＲＮＡを適用する組織に実際に存在しないことがあるため、特化した組織特異的トランスクリプトーム（例えば眼の応用について網膜）がより適切でありうる。
一態様において、本発明の多標的干渉ＲＮＡのガイド鎖は、異なる遺伝子の情況で単一の標的ＲＮＡ分子上に存在する最低２種の標的とされる結合配列と安定な相互作用を形成し、従って該ＲＮＡ分子の発現若しくは活性を調節する。単一標的ＲＮＡ分子上の複数の結合部位を単一のガイド鎖で標的とすることは、該標的ＲＮＡ分子のより効果的なＲＮＡｉを提供し得る。このアプローチは、突然変異率が高いウイルス遺伝子発現の調節にとりわけ有用である。
別の態様において、本発明の多標的干渉ＲＮＡのガイド鎖は、異なる遺伝子の情況で複数の予め選択された標的ＲＮＡ分子上に存在する最低２種の異なる結合配列と安定な相互作用を形成して、従って複数の予め選択された標的ＲＮＡ分子の発現若しくは活性を調節する。複数の標的ＲＮＡ分子を単一のガイド鎖で標的とすることは、原型の１薬物、１標的のアプローチに対する一代替を表す。生物学的系の複雑さの考慮において、複数の標的に対し選択的な薬物を設計することは、多様な疾患および障害のための新たなかつより効果的な医薬品につながることができる。
特定の態様において、生物学的系の疾患若しくは障害に関与するＲＮＡ分子は、予め選択され、かつ、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子により標的とされる。生物学的系は、例えば植物、若しくはラット、マウス、イヌ、ブタ、サルおよびヒトのような動物であり得る。予め選択された標的ＲＮＡ分子は、例えば、受容体、サイトカイン、転写因子、調節タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞骨格タンパク質、トランスポーター、酵素、ホルモンおよび抗原よりなる群から選択される１分類のタンパク質をコードする。予め選択される標的ＲＮＡ分子は、例えば、ＩＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ−Ａ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＩＧＦ−１、Ｇｌｕｃ６ｐ、Ｉｎｐｐｌ１、ｂＦＧＦ、ＰＩＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、β−カテニン、κ−ｒａｓ−Ｂ、κ−ｒａｓ−Ａ、ＥＧＦＲ、Ｂｃｌ−２、プレセニリン−１、ＢＡＣＥ−１、ＭＡＬＡＴ−１、ＢＩＣ、ＴＧＦβおよびＴＮＦαよりなる群から選択される１タンパク質をコードし得る。従って、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子は、動物のような生物学的系において、例えば、ＩＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＩＬ−８、ｂＦＧＦ、ＰＩＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＧＦ−１のいずれかの組合せ、ＩＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＧＦ−１のいずれかの組合せ、β−カテニン、κ−ｒａｓおよびＥＧＦＲのいずれかの組合せ、ＩＣＡＭ−１およびＶＥＧＦ−Ａの双方、プレセニリン−１およびＢＡＣＥ−１の１種若しくはそれ以上のアイソフォームの双方、ＶＥＧＦ−ＡおよびｂＦＧＦの双方、ＶＥＧＦ−Ａ、ＩＣＡＭ−１、ＰＩＧＦおよびＩＧＦ−１のいずれかの組合せ、ＶＥＧＦ−Ａ、κ−ｒａｓ、ＥＧＦＲおよびＢｃｌ−２のいずれかの組合せ、ＭＡＬＡＴ−１およびＢＩＣの双方、ＴＧＦβおよびＩＬ−８の双方、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の双方、ＶＥＧＦ−Ａ、Ｂｃｌ−２およびκ−ｒａｓのいずれかの組合せ、またはＧｌｕｃ６ｐおよびＩｎｐｐｌ１の双方の発現を低下させ得る。
予め選択される標的ＲＮＡ分子は、ウイルスの必須タンパク質を包含するタンパク質もまたコードし得る。こうした必須タンパク質は、例えば該ウイルスの複製、転写、翻訳若しくはパッケージング活性に関与するタンパク質であり得る。ＨＩＶウイルスの例示的必須タンパク質は、ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＶＩＦ、ＶＰＲ、ＴＡＴ、ＮＥＦ、ＲＥＶ、ＶＰＵおよびＥＮＶであり、それらの全部は本発明の予め選択される標的分子となり得る。本発明の多標的干渉ＲＮＡは、限定されるものでないがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、および重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス若しくはそれらの組合せを挙げることができるウイルス中のＲＮＡ発現を調節するのに使用し得る。
いくつかの態様において、本発明の多標的干渉ＲＮＡは、第一の生物学的系の１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子、および第一の生物学的系に感染性である第二の生物学的系の１種若しくはそれ以上の標的分子を標的とするように設計する。特定の態様において、本発明の多標的干渉ＲＮＡは、１種若しくはそれ以上の宿主ＲＮＡ分子、およびウイルスすなわち宿主の病原体の１種若しくはそれ以上のＲＮＡ分子を標的とするよう設計する。従って、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子は、例えばＴＮＦαの発現を減少させかつＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の発現を調節し得る。
本発明の特定の態様において、特定の標的に対し機能的である特異的多標的干渉ＲＮＡ分子が提供される。これらの多標的干渉ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ、例えばそれらの意図される標的ＲＮＡ分子の発現を調節するのに有用であり、そして活性を裏付けるデータもまた、本明細書で作業実施例に提供される。
一態様において、配列ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧ（配列番号１）若しくはＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２）を含んでなる合成多標的干渉ＲＮＡ分子が提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。好ましくは、該分子は１発現系でのＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１双方の発現を減少させる。別の態様において、該多標的干渉ＲＮＡ分子は、配列ＣＣＣＡＣＣＣＡＣＡＵＡ（配列番号３）若しくはＣＡＡＡＡＣＡ（配列番号４）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現を減少させる。より好ましくは、それらは２種若しくはそれ以上のＲＮＡの複数の部位を標的とする。
配列ＡＣＣＣＣＧＵＣＵＣＵ（配列番号５）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子もまた本明細書で提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含ん
でなる領域で二本鎖である。好ましくは、該多標的干渉ＲＮＡは、１発現系でのＩＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＧＦ−１のいずれかの組合せの発現を減少させる。別の態様において、１発現系で、該多標的干渉ＲＮＡ分子は、配列ＡＧＡＧＡＣＧＧＧＧＵ（配列番号６）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現を減少させる。より好ましくは、それらは２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位を標的とする。
配列ＡＧＣＵＧＣＡ（配列番号７）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子もまた本明細書で提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。該多標的干渉ＲＮＡは、好ましくは、１発現系でのＩＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＩＬ−８、ｂＦＧＦ、ＰＩＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＧＦ−１のいずれかの組合せの発現を減少させる。一態様において、１発現系で、該多標的干渉ＲＮＡ分子は、配列ＵＧＣＡＧＣＵを含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現を調節する。より好ましくは、それらは２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位を標的とする。
別の態様において、配列ＡＡＡＣＡＡＵＧＧＡＡＵＧ（配列番号８）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子が提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。該多標的干渉ＲＮＡは、好ましくは、１発現系でのκ−ｒａｓ、ＥＧＦＲおよびβ−カテニンのいずれかの組合せの発現を調節する。好ましくは、１発現系で、該多標的干渉ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＵＣＣＡＵＵＧＵＵＵ（配列番号９）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現を調節する。より好ましくは、それらは２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位を標的とする。
配列ＧＧＵＡＧＧＵＧＧＧＵＧＧＧ（配列番号１０）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子もまた本明細書で提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。該多標的干渉ＲＮＡは、好ましくは、１発現系でのｇｌｕｃ６ｐおよびＩｎｐｐｌ１の発現を調節する。発現系において、該多標的干渉分子は、好ましくは、配列ＣＣＣＡＣＣＣＡＣＣＵＡＣＣ（配列番号１１）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現を調節する。より好ましくは、それらは単一ＲＮＡ上の複数の部位または２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位のいずれも標的とする。
配列ＣＵＧＣＵＵＧＡＵ（配列番号１２）、ＵＣＣＵＵＵＣＣＡ（配列番号１３）、ＵＵＵＵＵＣＵＵＵ（配列番号１４）、ＵＵＣＵＧＡＵＧＵＵＵ（配列番号１５）、ＵＣＵＵＣＣＵＣＵＡＵ（配列番号１６）、ＵＧＧＵＡＧＣＵＧＡＡ（配列番号１７）、ＣＵＵＵＧＧＵＵＣＣＵ（配列番号１８）、ＣＵＡＣＵＡＡＵＧＣＵ（配列番号１９）、ＵＣＣＵＧＣＵＵＧＡＵ（配列番号２０）、ＡＵＵＣＵＵＵＡＧＵＵ（配列番号２１）、ＣＣＡＵＣＵＵＣＣＵＧ（配列番号２２）、ＣＣＵＣＣＡＡＵＵＣＣ（配列番号２３）、ＣＵＡＡＵＡＣＵＧＵＡ（配列番号２４）、ＵＵＣＵＧＵＵＡＧＵＧ（配列番号２５）、ＧＣＵＧＣＵＵＧＡＵＧ（配列番号２６）、ＡＣＡＵＵＧＵＡＣＵＧ（配列番号２７）、ＵＧＡＵＡＵＵＵＣＵＣ（配列番号２８）、ＡＡＣＡＧＣＡＧＵＵＧ（配列番号２９）、ＧＵＧＣＵＧＡＵＡＵＵ（配列番号３０）、ＣＣＣＡＵＣＵＣＣＡＣ（配列番号３１）、ＵＡＵＵＧＧＵＡＵＵＡ（配列番号３２）、ＣＡＡＡＵＵＧＵＵＣＵ（配列番号３３）若しくはＵＡＣＵＡＵＵＡＡＡＣ（配列番号３４）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子もまた本明細書で提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。１発現系で、該多標的干渉ＲＮＡは、好ましくはＨＩＶゲノムによりコードされる最低１種のＲＮＡの発現を調節する。より好ましくは、該多標的干渉分子はそのようにコードされる最低２種のＲＮＡの発現を調節する。別の態様において、多標的干渉ＲＮＡ分子は、最低３若しくはなお４種のＨＩＶ ＲＮＡの発現を調節する。好ましくは、該多標的干渉ＲＮＡ分子は、選択された発現系で測定される場合に、配列ＡＵＣＡＡＧＣＡＧ（配列番号３５）、ＵＧＧＡＡＡＧＧＡ（配列番号３６）、ＡＡＡＧＡＡ
ＡＡＡ（配列番号３７）、ＡＡＡＣＡＵＣＡＧＡＡ（配列番号３８）、ＡＵＡＧＡＧＧＡＡＧＡ（配列番号３９）、ＵＵＣＡＧＣＵＡＣＣＡ（配列番号４０）、ＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＧ（配列番号４１）、ＡＧＣＡＵＵＡＧＵＡＧ（配列番号４２）、ＡＵＣＡＡＧＣＡＧＧＡ（配列番号４３）、ＡＡＣＵＡＡＡＧＡＡＵ（配列番号４４）、ＣＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧ（配列番号４５）、ＧＧＡＡＵＵＧＧＡＧＧ（配列番号４６）、ＵＡＣＡＧＵＡＵＵＡＧ（配列番号４７）、ＣＡＣＵＡＡＣＡＧＡＡ（配列番号４８）、ＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣ（配列番号４９）、ＣＡＧＵＡＣＡＡＵＧＵ（配列番号５０）、ＧＡＧＡＡＡＵＡＵＣＡ（配列番号５１）、ＣＡＡＣＵＧＣＵＧＵＵ（配列番号５２）、ＡＡＵＡＵＣＡＧＣＡＣ（配列番号５３）、ＧＵＧＧＡＧＡＵＧＧＧ（配列番号５４）、ＵＡＡＵＡＣＣＡＡＵＡ（配列番号５５）、ＡＧＡＡＣＡＡＵＵＵＧ（配列番号５６）若しくはＧＵＵＵＡＡＵＡＧＵＡ（配列番号５７）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現を減少させる。より好ましくは、それらは２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位を標的とする。
別の態様において、配列ＧＣＣＵＡＵＣＡＵＡＵ（配列番号５８）、ＵＧＧＵＧＣＣＵＧＣＵ（配列番号５９）、ＡＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＣ（配列番号６０）、ＣＣＣＵＣＵＧＧＧＣＵ（配列番号６１）、ＵＵＣＵＵＣＣＵＣＡＵ（配列番号６２）、ＵＡＵＵＵＡＵＡＣＡＧＡ（配列番号６３）若しくはＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＣ（配列番号６４）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子が提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。好ましくは、該多標的干渉ＲＮＡは、１発現系でのプレセニリン−１およびＢＡＣＥ−１の１種若しくはそれ以上のアイソフォームの発現を調節する。１発現系で配列ＡＵＡＵＧＡＵＡＧＧＣ（配列番号６５）、ＡＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡ（配列番号６６）、ＧＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＵ（配列番号６７）、ＡＧＣＣＣＡＧＡＧＧＧ（配列番号６８）、ＡＵＧＡＧＧＡＡＧＡＡ（配列番号６９）、ＵＣＵＧＵＡＵＡＡＡＵＡ（配列番号７０）若しくはＧＡＡＵＵＵＵＧＧＵＧ（配列番号７１）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現を調節するこうした多標的干渉ＲＮＡ分子もまた好ましい。より好ましくは、それらは２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位を標的とする。
配列ＵＧＡＧＵＮＮＧＡＡＣＡＵＵ（配列番号７２）（式中Ｎはいずれかの塩基である）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子もまた本明細書で提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。好ましい一態様において、該多標的干渉ＲＮＡは１発現系でのＶＥＧＦ−ＡおよびｂＦＧＦの発現を調節する。該多標的干渉ＲＮＡ分子は、好ましくは、配列ＡＡＵＧＵＵＣＶＶＡＣＵＣＡ（配列番号７３）（式中ＶＶはＣＣ若しくはＡＧである）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の１発現系での発現を調節する。より好ましくは、それらは２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位を標的とする。
配列ＣＵＣＣＡＧＧ（配列番号７４）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子もまた本明細書で提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。これらの多標的干渉ＲＮＡは、一態様において、１発現系でのＶＥＧＦ−Ａ、ＩＣＡＭ−１、ＰＩＧＦおよびＩＧＦ−１のいずれかの組合せの発現を調節する。該多標的干渉ＲＮＡ分子は、好ましくは、配列ＣＣＵＧＧＡＧ（配列番号７５）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の１発現系での発現を調節する。より好ましくは、それらは２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位を標的とする。
別の態様において、配列ＵＣＡＧＵＧＧＧ（配列番号７６）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子が本明細書で提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。好ましくは、該多標的干渉ＲＮＡは、１発現系でのＶＥＧＦ−Ａ、κ−ｒａｓ、ＥＧＦＲおよびｂｃｌ ２のいずれかの組合せの発現を調
節する。こうした発現系での、配列ＣＣＣＡＣＵＧＡ（配列番号７７）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現を調節する多標的干渉ＲＮＡ分子もまた好ましい。より好ましくは、それらは２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位を標的とする。
なお別の態様において、配列ＵＣＣＵＣＡＣＡＧＧＧ（配列番号７８）、ＧＵＧＣＵＣＡＵＧＧＵＧ（配列番号７９）、ＣＣＵＧＧＡＧＣＣＣＵＧ（配列番号８０）若しくはＵＣＵＣＡＧＣＵＣＣＡＣ（配列番号８１）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子が提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。該多標的干渉ＲＮＡは、好ましくは、１発現系でのＴＮＦα、およびＨＣＶゲノムによりコードされる最低１種のＲＮＡの発現を減少させる。該多標的干渉ＲＮＡ分子は、好ましくは、１発現系での配列ＣＣＣＵＧＵＧＡＧＧＡ（配列番号８２）、ＣＡＣＣＡＵＧＡＧＣＡＣ（配列番号８３）、ＣＡＧＧＧＣＵＣＣＡＧＧ（配列番号８４）若しくはＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡ（配列番号８５）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現を減少させる。より好ましくは、それらは２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位を標的とする。
配列ＡＣＣＣＵＣＧＣＡＣＣ（配列番号８６）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子もまた本明細書で提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。該多標的干渉ＲＮＡは、好ましくは、１発現系でのＭＡＬＡＴ−１およびＢＩＣの発現を調節する。１発現系で、該多標的干渉分子は、好ましくは、配列ＧＧＵＧＣＧＡＧＧＧＵ（配列番号８７）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現を調節する。より好ましくは、それらは、単一ＲＮＡ上の複数の部位または２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位のいずれも標的とする。
なお別の態様において、配列ＧＵＧＵＵＧＡＡＧ（配列番号８８）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子が提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。該多標的干渉ＲＮＡは、好ましくは、１発現系でのＴＧＦβおよびＩＬ−８の発現を調節する。１発現系で、該多標的干渉分子は、好ましくは配列ＣＵＵＣＡＡＣＡＣ（配列番号８９）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現を調節する。より好ましくは、それらは、単一ＲＮＡ上の複数の部位または２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位のいずれも標的とする。
別の態様において、配列ＵＵＣＣＡＣＡＡＣ（配列番号９０）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子が提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。該多標的干渉ＲＮＡは、好ましくは、１発現系でのＩＬ−８およびＭＣＰ−１の発現を調節する。１発現系で、該多標的干渉分子は、好ましくは配列ＧＵＵＧＵＧＧＡＡ（配列番号９１）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現を調節する。より好ましくは、それらは単一ＲＮＡ上の複数の部位または２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位のいずれも標的とする。
配列ＵＣＣＡＣＵＧＵＣ（配列番号９２）、ＣＡＧＡＡＵＡＧ（配列番号９３）若しくはＡＡＣＵＣＵＣＵＡ（配列番号９４）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子もまた本明細書で提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。これらの多標的干渉ＲＮＡは、一態様において、１発現系でのＶＥＧＦ−Ａ、Ｂｃｌ−２およびκ−Ｒａｓのいずれかの組合せの発現を調節する。該多標的干渉ＲＮＡ分子は、好ましくは、配列ＧＡＣＡＧＵＧＧＡ（配列番号９５）、ＣＵＡＵＵＣＵＧ（配列番号９６）若しくはＵＡＧＡＧＡＧＵＵ（配列番号９７）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の１発現系での発現を調節する。より好ましくは、それらは２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位を標的とする。
別の態様において、配列ＣＧＵＧＡＡＧＡＣ（配列番号９８）を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子が提供される。一態様において、該分子は、少なくとも、列挙される配列を含んでなる領域で二本鎖である。該多標的干渉ＲＮＡは、好ましくは、１発現系でのＨＣＶの発現を調節する。１発現系で、該多標的干渉分子は、好ましくは、配列ＧＵＣＵＵＣＡＣＧ（配列番号９９）を含んでなる最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現を調節する。より好ましくは、それらは単一ＲＮＡ上の複数の部位または２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位いずれも標的とする。
これらの例示的シードおよびそれらの完全な相補物が、それぞれいずれかの数のより短いシードおよびそれらの完全な相補物もまた含めること、ならびにこれらが本発明の一部として予見されることが、当業者により理解されるであろう。例えば、１２塩基のシード：ＣＣＣＡＣＣＣＡＣＡＵＡ（配列番号３）は、さらなる２種の１１塩基、３種の１０塩基、４種の９塩基、５種の８塩基、６種の７塩基および７種の６塩基のシードを含んでなり、それらの全部を有用な多標的干渉ＲＮＡの設計で使用し得る。
Figure 0005078904
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より本質的になる多標的ＲＮＡ二重鎖もまた本明細書で提供される。
こうした分子は、単一ＲＮＡ上の複数の部位または２種若しくはそれ以上のＲＮＡ上の複数の部位を標的とし得、そして、１発現系でのこうした１種または好ましくは２種若しくはそれ以上のこうした標的とされるＲＮＡの発現を減少させるのに有用であることを、当業者は認識するであろう。
いくつかの態様において、所定の多標的干渉ＲＮＡは、数種の標的ＲＮＡの１種の発現の調節で別のものより有効であることができる。他の場合に、該多標的干渉ＲＮＡは、１種若しくはそれ以上の発現系で全部の標的に同様に影響を及ぼすことができる。多様な因子がサイレンシングすなわちＲＮＡｉの効率の変動を引き起こす原因となり得る。すなわち（ｉ）パッセンジャー鎖をＲＩＳＣにガイド鎖より効率的に進入させるＲＩＳＣの集成の非対称；（ｉｉ）標的ＲＮＡ分子上の標的とされるセグメントの到達不可能性；（ｉｉｉ）干渉ＲＮＡによる高程度のオフターゲット活性；（ｉｖ）ＲＮＡの天然のプロセシングの配列依存性の変動、および（ｖ）（ｉ）ないし（ｉｖ）に記述される構造的および動的影響の均衡。Ｈｏｓｓｂａｃｈら（２００６）、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：８２−８９を参照されたい。本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子の設計において、特別の注意が、所定の標的ＲＮＡ分子でのＲＮＡｉ効率を増大若しくは低下させるための列挙される因子のそれぞれに払われ得る。
本発明の別の一般的局面は多標的干渉ＲＮＡの設計方法である。本発明の方法は、異なる遺伝子の情況で１種若しくはそれ以上の予め選択された標的ＲＮＡ分子に存在する異なる結合配列を効果的に標的とする多標的干渉ＲＮＡに至る多様な手段を包含する。一態様において、多標的干渉ＲＮＡを、例えば標的配列を比較することおよび１種若しくはそれ
以上の標的配列に存在する長さｎの配列を同定することによる、標的分子の配列の視覚的若しくはコンピュータの検査により設計し得る。あるいは、予め選択された長さｎの全部の可能な配列を、所定の長さまでの各ヌクレオチド位置に可能な各順列（４ｎ）、およびその後標的配列中のそれらの存在について検査することによって生成し得る。
好ましい態様において、本明細書に提供される方法は、異なる結合配列の第一の部分（シード）に完全に相補的な最低１領域（Ｓ）を有する、性質が一本鎖若しくは二重鎖のいずれかの干渉ＲＮＡ分子を設計し、そして、ある態様において、１種若しくはそれ以上の異なる結合配列の第二の部分への少なくとも部分的に相補的な第二の領域（Ｙ）をさらに含んでなる。他の態様において、領域Ｙは、１種若しくはそれ以上の異なる結合配列の第二の部分に対する完全な相補性を有し得、そして、なお他者において、Ｙと、１種若しくはそれ以上の異なる結合配列の第二の部分の間に相補性が存在しなくてもよい。
一態様において、多標的干渉ＲＮＡの設計方法は、ａ）１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子を選択する段階（該１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子の発現の調節が望ましく）；ｂ）該１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子のそれぞれの最低１種のヌクレオチド配列を得る段階；ｃ）６ヌクレオチド若しくはそれ以上のシード配列を選択する段階（前記シード配列は異なる遺伝子の情況で標的ＲＮＡ分子中に存在し）；ｄ）最低２種の異なる結合配列を選択する段階（それらのそれぞれはシード配列を含んでなり、かつ異なる遺伝子の情況で標的分子に存在し）；ｅ）それらとの安定な相互作用を可能にする最低２種の結合配列のそれぞれと実質的な程度の相補性を共有するガイド鎖を有する多標的干渉ＲＮＡ分子を設計する段階を含んでなる。
一態様において、該方法は、パッセンジャー鎖とガイド鎖の間の安定な二重鎖の形成を可能にするようにガイド鎖に少なくとも部分的に相補的であるパッセンジャー鎖を設計することを含んでなる。
別の態様において、本発明の方法は、ａ）１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子を選択する段階（該標的ＲＮＡ分子の発現の調節が望ましく）；ｂ）該標的ＲＮＡ分子のそれぞれの最低１種のヌクレオチド配列を得る段階；ｃ）シード配列の長さｎ（ヌクレオチド）（式中ｎ＝約６若しくはそれ以上）を選択する段階；ｄ）段階ｂ）で得られたヌクレオチド配列のそれぞれから長さｎの候補シード配列の集合物を生成する段階（各候補シード配列は段階ｂ）で得られたヌクレオチド配列中に最低１回は存在し）；ｅ）候補シード配列の各存在について、所望の量の５’および３’隣接配列を収集することにより、段階ｂ）で得られたヌクレオチド配列中の候補シード配列のそれぞれの遺伝子の情況を決定する段階；ｆ）候補シード配列から長さｎのシード配列を選択する段階（該シード配列は、最低２種の異なる遺伝子の情況で、段階ｂ）で得られたヌクレオチド配列中に存在し）；ｇ）コンセンサス標的配列を選択する段階（前記コンセンサス標的配列は、シード配列、ならびに該シードの５’および３’端の一方若しくは双方いずれかに隣接する配列の所望のコンセンサス配列を含んでなり）；ならびにｈ）それらとの安定な相互作用を可能にするようにコンセンサス標的配列と実質的な程度の相補性を共有するガイド鎖を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子を設計する段階を含んでなる。
一態様において、該方法は、パッセンジャー鎖とガイド鎖の間の安定な二重鎖の形成を可能にするようにガイド鎖に対し少なくとも部分的に相補的であるパッセンジャー鎖を設計することを含んでなる。
当業者は、該方法の多様な段階の数回の反復を実施し得ることを認識するであろう。例えば、いくつかの態様において、該方法は、ｎの異なる値で段階ｃ）ないしｈ）を反復することをさらに含んでなる。他の態様において、該方法は、異なるシード配列について段
階ｆ）ないしｈ）を反復することを含みうる。なお他の態様において、該方法は、特定のシードおよび隣接配列の周囲を基礎とする異なるコンセンサス標的配列を選択することを含みうる。当業者は、上の多様な組合せもまた予見されることを認識するであろう。
他の態様において、本発明の方法は、多標的干渉ＲＮＡ分子を作成する段階およびそれを発現系で試験する段階をさらに含んでなる。
好ましい標的ＲＮＡ分子は、戦略的に選択された分子、例えば、疾患過程に関与するウイルス若しくは宿主ＲＮＡ、ウイルスゲノム、とりわけ臨床上重要なものなどである。標的ＲＮＡの詳細な論考は上に提供され、そしてそっくりそのままここに明示されるかのように、本発明の本および他の局面に等しく当てはまる。標的ＲＮＡ分子の選択の基礎は当業者により認識されるであろう。好ましい標的ＲＮＡは、該多標的干渉ＲＮＡの投与により制御することを願う疾患若しくは障害に関与するものである。
選択された標的の配列を得る段階は、ワールドワイドウェブで利用可能な、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）（米国の国立保健研究所（ＮＩＨ）を通じて）、欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（欧州全域で欧州生物情報学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を通じて）により提供されるデータベースのような公的に利用可能な供給源、若しくは有料データベースなどのような専有の供給源から配列を得ることにより実施する。配列は直接決定によってもまた得ることができる。これは、臨床単離物若しくは未知の遺伝子が例えば疾患の過程に関与しているか目的のものである場合に望ましいかもしれない。標的ＲＮＡ分子の完全若しくは不完全いずれの配列も、本発明の多標的干渉ＲＮＡの設計に使用し得る。
段階ａ）で選択された１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡ分子のそれぞれについて、複数の独立の標的ヌクレオチド配列を段階ｂ）で得る方法もまた本発明で提供される。上述されたデータベースは、頻繁に、特定の標的に利用可能な複数の配列を有する。これは、遺伝的変異が自然により高い場合、例えばウイルス配列でとりわけ真実である。多様な態様において、複数の標的ヌクレオチド配列は、株の変異、アレルの変異、突然変異若しくは複数の種を表す。こうした複数の配列の数は、所定の標的について数種若しくは少ない倍数から多数、例えば数ダースまたはなお数百若しくは数千の配列までの範囲にわたることがある。ウイルス配列で作業する場合にこうした数の配列を有することがとりわけ可能である。
選ばれた配列は、付加的な所望の、あるいは低い配列の複雑さ、乏しい配列の質の領域、またはベクター関連配列の包含のようなクローニング若しくはシークェンシングに関するアーチファクトを含有するもののような望ましくない特徴に基づきさらに制限し得る。さらに、広範囲に到達不可能な二次構造をもつ領域をこの段階で除去し得る。事実、ＬｕｏとＣｈａｎｇは、ループのようなｍＲＮＡ構造のｓｉＲＮＡターゲッティング到達可能な領域が、ステムと整列されるものより効果的であることがよりありそうであったことを示した（ＬｕｏとＣｈａｎｇ、（２００４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１８：３０３−３１０）。選ばれた配列は、しかしながら、（特定の実施例のいくつかで具体的に説明されるところの）３’ＵＴＲ配列若しくは低い二次構造の領域に制限される必要はない。
シード配列のｎヌクレオチド塩基の長さを選択する段階は、好ましくは、一見していずれかの特定の基礎若しくは理論を必要としない反復過程である。すなわち、出発シードの長さは約５より上の塩基のいずれの数でもありうる。シードに選ばれる長さが長いほど、
それが標的ＲＮＡの一部分、例えば標的ＲＮＡ結合配列中に出現することができることがより少なくありそうである。シード配列長さが短いほど、それが期待されるであろうとおりより頻繁に出現することができる。好ましくは、下述されるとおり候補シードの好ましい配列を見出すのに反復過程を使用する。従って、ｎの特定の値を使用して長さｎの候補シードを同定した後に、別の値（例えばｎ＋１、ｎ−１）を使用することができ、そして該過程を反復して長さｎ＋１、ｎ−１などの候補シード配列を同定し得る。一態様において、標的配列の第一の走査は、いずれのシード長さ（例えばｎ＝９）で開始することもでき、そして、検索のその後の回は、（例えば以前の走査で戻されたシードの数に基づき）シード長さを増大若しくは減少のいずれもすることができる。当業者は、該シードの長さを減少させる際に候補シードの数が増大することができることを認識するであろう。
複数の配列が特定の標的ＲＮＡ分子（例えばウイルス単離物）に利用可能である状況で、配列の完全性を候補シードについて検索し得ることが当業者により認識されるであろう。しかしながら、候補シードは、いくつかの場合に、該ＲＮＡ分子の配列の比率でのみ見出されうる。これらの状況において、より多い比率の配列に存在するシードを優先することが望ましいことがある。
シードは、本明細書で「シード候補」ともまた称される「候補シード」のプールから選択し得る。シード候補は、標的分子のそれぞれに最低１回存在する、とりわけ望ましい若しくは選択された長さの配列を包含する。候補シードは、好ましくは、例えば所望の若しくは選択されたシード長さの「ウィンドウ」（固定された数の連続するヌクレオチドに関して表現される）で標的配列に沿って段階的に動かすことによりコンピュータにより生成する。好ましくは各段階は単一塩基の進行であり、従って標的配列を連続的に見る選択された長さの「移動ウィンドウ」を生成する。他のステップ距離を企図しているが、しかしながら、当業者は、１ヌクレオチドのステップのみが全部の可能なシード配列の生成を可能にすることができることを認識するであろう。
唯一の標的ＲＮＡ分子が存在する場合、候補シードのプールは、該標的ＲＮＡ分子の「移動ウィンドウ」走査からの選択された長さのいかなる配列も包含する。複数の標的ＲＮＡ分子が存在する場合、候補シードのプールは、該標的ＲＮＡ分子のそれぞれに最低１回存在する、該標的ＲＮＡ分子の「移動ウィンドウ」走査からの選択された長さの配列を包含する。従って、複数の標的ＲＮＡ分子が存在する場合、上の段階（ｄ）は、２つの下位段階、すなわち（ｉ）選択された長さｎのヌクレオチド配列の集合物を段階ｂ）で得られた各ヌクレオチド配列から生成する段階；および（ｉｉ）ヌクレオチド配列の該集合物から長さｎの候補シード配列を選択する段階（各候補シード配列は段階ｂ）で得られたヌクレオチド配列に最低１回存在する）を含んでなる。
本明細書で使用されるところの、シード若しくは候補シードの情況での「分布」という用語は、目的のヌクレオチド配列内のシード若しくは候補シードの全体平均頻度すなわち出現数を意味している。例えば、実施例１３（下）は、遺伝子型１ａ／１ｂのＨＣＶゲノム中で見られる９塩基の存在の以下のパターンを有する：
ゲノム中４回：５／１５５単離物
ゲノム中３回：６８／１５５単離物
ゲノム中２回：５０／１５５単離物
ゲノム中１回：３１／１５５単離物
ゲノム中０回：１／１５５単離物
これは２．２９の「分布」と同等とみなす。比較して、「保存」（下を参照されたい）は１５４／１５５（＝９９％）であるとみられる。
一態様において、該方法は、少なくとも、標的ＲＮＡ分子について得られた配列内の予め決定された最低平均存在率で存在しない候補シード配列を廃棄する段階をさらに含んでなる。この段階は、該方法が、同一標的ＲＮＡの配列内の候補シード配列の平均分布を考慮に入れることを可能にする。
別の態様において、該方法は、少なくとも、標的ヌクレオチド分子について得られた標的ヌクレオチド配列の予め決定された最低比率（すなわち保存の程度）内で存在しない候補シード配列を廃棄する段階をさらに含んでなる。この段階は、該方法が、標的ＲＮＡについて得られた複数の標的配列にわたり特定の１候補シードが存在する頻度をより完全に考慮に入れることを可能にする。本明細書に提供される方法により作成される好ましいＲＮＡのマルチターゲッティング機能は、標的配列のこうした組内および全体双方での候補シード配列のより多い表示により高められる。
好ましくは、最終的に選ばれる方法は、これらの段階の１個若しくはそれ以上またはそれらの全部を必要とされるとおり包含することができる。例えば、一態様において、該方法は、単一塩基のみから構成される、ＡおよびＵからのみ構成される、Ｃである５個若しくはそれ以上の塩基の連続する列を有する、１種若しくはそれ以上の細胞成分の発現若しくは活性を望ましくなく調節する傾向を有すると予測される、目的の非標的トランスクリプトームに許容できない頻度で存在することが予測される；またはそれらのいずれかの組合せであるいかなる候補シード配列も廃棄する段階をさらに含んでなる。二本鎖の多標的干渉ＲＮＡを設計すべきである状況で、候補シード配列は、それらが外来核酸の細胞センサーを活性化する傾向を有する、Ｇである５個若しくはそれ以上の塩基の連続する列を有する、またはそれらの組合せであることが予測される配列を含有する場合もまた廃棄しうる。
シードをその後、２種の異なる遺伝子の情況で１種若しくはそれ以上の標的配列に存在するものとして、候補配列のプールから選択する。遺伝子の情況は、候補シード配列の各存在について所望の量の５’および３’隣接配列を収集することにより決定する。
本発明の多標的干渉ＲＮＡの例示的一作成方法において、シード配列を使用して、シード配列、ならびに該シードの５’および３’端の一方若しくは双方いずれかに隣接する配列の所望のコンセンサス配列を含んでなる１種若しくはそれ以上の「コンセンサス標的配列を生成する。「コンセンサス標的配列」という用語は、標的分子（１種若しくは複数）上の複数の結合配列を模倣する唯一の最良の配列が存在することを示唆せず、むしろ、１種若しくはそれ以上の代替配列の一集団が全部コンセンサス標的配列でありうる。「シードの５’および３’端の一方若しくは双方いずれかで隣接する配列のコンセンサス配列」は、視覚的検査、または生物情報学的ツール若しくは計算の使用により、標的分子のそれぞれのシード配列の遺伝子の情況の検査に容易に由来する。コンセンサス標的配列のシード配列部分は、通常、標的とされる結合部位のそれぞれの対応する一部分に対する完全な同一性を有することができる一方、シードの５’および３’端の一方若しくは双方いずれかに隣接する配列のコンセンサス配列は、標的分子の配列のいくつかのしかし全部でないシードの５’および３’端に隣接する配列に完全に同一である必要はない。しかしながら、それは、該配列のいくつか、全部に同一でありうるか、若しくはいずれに同一でなくてもよい。
好ましくは、二本鎖分子を設計すべきである場合、コンセンサス標的配列は、１種若しくはそれ以上の細胞成分の発現若しくは活性を望ましくなく調節する傾向を有することが予測されるいかなる配列も包含しない。
コンセンサス標的配列は眼若しくはアルゴリズムにより決定しうる。例えば、コンピュ
ータアルゴリズムを使用して、該配列が最低２標的間で異なる位置の対形成ヌクレオチドの全部の可能な順列を評価し得る。これは、標的がシードを超えて何らかの同一性を有するがしかし眼によるアライメントが困難と判明している場合にとりわけ有用である。この方法は、コンセンサス標的配列、若しくは、あるいは、候補多標的干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖を直接決定するのに使用し得る。アンチセンス鎖を直接設計する場合、アルゴリズムは、ゆらぎ（Ｇ：Ｕ、Ｕ：Ｇ）、他の非正準対（例えばＡ：Ｃ、Ｃ：Ａ）およびますます大きい負のペナルティ項を伴う残存する不適正をそれぞれ評価する。これらのペナルティ項を、多標的干渉ＲＮＡ内のそれらの位置について調節し、３’末端に配置されるものはより低いわずかなペナルティを受ける。ペナルティは、複数の連続する不適正若しくはゆらぎの存在下でもまた調節する。全標的について最低の総計ペナルティスコアをもつ提案された多標的干渉ＲＮＡを将来の評価に優先する。
シード配列の外側で標的配列間に同一性がほとんど存在しない場合、若しくは多数の標的配列を考慮することが必要である場合（例えば、ウイルス単離物の多数のヌクレオチド配列をスクリーニングする場合）にとりわけ有用であるさらなる代替の一アプローチは、シードの相補物から３’の方向への必要とされる長さまでの伸長の全部の可能な順列を生成して、それにより、式（Ｉ）の推定のＳＹを生成し、ならびに、標的へのハイブリダイゼーションおよび優先的鎖負荷に関して最も好都合な特性を示すものを決定するためｉｎ
ｓｉｌｉｃｏで目的の標的配列に対し各推定のＳＹをハイブリダイズすることである。
二重鎖分子を設計している大部分の場合は、オーバーハング（必要とされる場合）をハイブリダイゼーション過程の一部とみなす。ハイブリダイゼーションは、典型的に、ＲＮＡｈｙｂｒｉｄソフトウェア（Ｒｅｈｍｓｍｅｉｅｒら、２００４、ＲＮＡ、１０：１５０７−１７）若しくは類似のアルゴリズムを使用して、熱力学的観点から検査する。
一態様において、本発明は、シード配列を含んでなる多標的干渉ＲＮＡの長さｎのガイド鎖の決定のためのアルゴリズムを提供する。
１）用語の定義
ａ．負荷バイアス：各候補ガイド鎖中のＡ若しくはＵを「１」として、およびＧ若しくはＣを「２」として点数を付ける：
ｉ．Ａ−Ｕ／Ｇ−Ｃスコアを、下表の適切な換算係数により乗算する
ｉｉ．位置１〜５の残基の積を総和する。
ｉｉｉ．位置ｎないしｎ−４の位置の残基の積を総和する。
ｉｖ．（ｉｉｉ）の合計を（ｉｉ）の合計により除算する
Figure 0005078904
ｂ．活性スコア：各標的Ｔ１．．．．Ｔｎについて、ガイド鎖の結合の最小自由エネルギー（ｍｆｅ）およびガイド鎖の５’端の標的に相補的な連続する塩基の数（ｒ−５’）の積を計算する。これらのスコアの積が活性スコアである。
Ｔ１（ｍｆｅ＊ｒ−５’）＊Ｔ２（ｍｆｅ＊ｒ−５’）＊．．．．Ｔｎ（ｍｆｅ＊ｒ−５’）
ｃ．最大活性スコア：各標的Ｔ１．．．．Ｔｎについて、標的に完全に相補的であるガイド鎖の結合のｍｆｅおよびガイド鎖の長さ（例えば、下に示されるところの２１塩基）の積を計算する。これらのスコアの積が最大活性スコアである。
Ｔ１（ｍｆｅ＊２１）＊Ｔ２（ｍｆｅ＊２１）＊．．．．Ｔｎ（ｍｆｅ＊２１）
ｄ．相対活性スコア：標的の最大活性スコアにより除算した干渉ＲＮＡの活性スコア。
２）シード配列の相補物で出発して、シードの相補物のｎの長さ、例えば２１塩基までの伸長の全部の可能な順列を生成し、従って推定のガイド鎖の完全な一覧を創製する
３）ＲＮＡｈｙｂｒｉｄを使用して、該シード配列を含有する全部の標的配列に対する全部の推定のガイド鎖の結合パターンおよび最小自由エネルギーを決定する
４）ａ．５若しくはそれ以上のＧ残基の連続する一続きが存在する
ｂ．負荷バイアスが＜１．２である
場合に全部の推定のガイド鎖を廃棄する
５）それらの相対活性スコアにより、残存する推定ガイド鎖を等級付けし、そしてそれらの相対活性スコアに基づき、残存する推定ガイド鎖配列の一覧から、多標的干渉ＲＮＡ配列の長さｎのガイド鎖配列を選択する。
推定のガイド鎖のある数若しくは一部分（例えば上位１％）を、オーバーハング、化学修飾など、合成および生物学的活性の測定のような付加的な段階に考慮する。
特定の一態様において、完全に相補的な二重鎖の場合に有用でありうる単純なアルゴリズムは、以下：
ガイド鎖中のＡ若しくはＵを「１」、およびＧ若しくはＣを「２」と評価する：
ｉ．Ａ−Ｕ／Ｇ−Ｃスコアを下の表Ａの適切な換算係数により乗算し；
ｉｉ．位置１〜５の残基の積を総和し；
ｉｉｉ．位置ｎ−４ないしｎ（存在する場合はオーバーハングを除く）の残基の積を総和し；
ｉｖ．（ｉｉｉ）の合計を（ｉｉ）の合計により除算し；および
ｖ．ガイド鎖について１．２以上のスコアはその鎖のありそうな好都合な負荷を示す
である。
Figure 0005078904
二本鎖多標的干渉ＲＮＡの場合に、所望のガイド鎖の最大鎖負荷を確実にすることは、該分子の抗力に関して有益であるのみならず、しかしまたＲＩＳＣへのパッセンジャー鎖の組み込みから生じる偶然のオフターゲット効果を大きく低下させることもできることが、当業者により認識されるであろう。
強い結合（典型的には＜−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの平均自由エネルギーを有する）を示す配列は、多標的干渉ＲＮＡにとりわけ興味深い。前のとおり、当業者は、活性の多標的干渉ＲＮＡを設計するのに使用される本方法を、わずかな改変を伴い、その後推定のＳＹ配列に転化される適するコンセンサス標的配列を設計するのに使用し得ることを認識するであろう。設計の流路に関係なく、候補ＳＹ配列をその後、これに基づき試験するためのみならずしかしまた多標的干渉ＲＮＡの機能性に重要でありうる他の特徴も考慮に入れるために（例えば適切なペナルティ項の使用により）優先する。これは、単一塩基のみから構成される、ＡおよびＵからのみ構成される、実質的に分子内塩基対形成に関与することが予測される、Ｇである５個若しくはそれ以上の塩基の連続する列を有する、目的の非標的トランスクリプトームに反平行の向きで許容できない頻度で存在することが予測される；外来核酸の細胞センサーを活性化する傾向を有することが予測される、またはそれらのいずれかの組合せの推定のＳＹ配列を廃棄することを伴いうる。いくつかの場合には、推定のＳＹの５’端への１若しくは２ヌクレオチドの付加（すなわちＸ）を考慮する。これは、それ以外は有用なＳＹ配列が５’端でＧ／Ｃ豊富である場合にとりわけ適切であり、そして、これは二本鎖多標的干渉ＲＮＡの場合に負荷を嫌うことが予測される。推定のＳＹ配列の５’末端への１若しくは２個のＡ／Ｕヌクレオチドの付加は、最もありそうには負荷を改良することができる。この付加を必要とする別の状況は、限定されるものでないが、二本鎖多標的干渉ＲＮＡが標的切断を支援することが可能であることの必要性が存在する場合を挙げることができる。大部分の場合、切断は、活性鎖が１０および１１番目のヌクレオチドにより結合される部位にわたる標的に相補的であることを必要とする。シードが不十分な長さ（例えばｎ＝９）のものである場合、ＳＹの５’端への２個の付加的なヌクレオチドの付加は、この要件を満たすのに十分に一緒にＳを移動することができる。大部分の場合の多標的干渉ＲＮＡは位置１および２の不適正を許容するため、最低２種の標的配列に相補的である必要のないこの付加的な領域Ｘの付加は、設計の柔軟性をさらに増大する。
本発明の二本鎖多標的干渉ＲＮＡの場合、さらなる一態様は、それらの３’末端で極めてＧ／Ｃ豊富であるシードを廃棄する段階を含んでなる。シードのＧ／Ｃ豊富な３’末端は、生じる一致するガイド鎖が、該ガイド鎖の３’端（オーバーハングを除外する）のＧ／Ｃ含量に依存して負荷の観点から不利であり得るため、望ましくないかも知れない。これは好ましくないかもしれない一方、シードがそれらの３’端でＧ／Ｃ豊富である場合に予測される乏しい負荷バイアスを克服するための戦略を使用し得る。これらは、限定されるものでないが、ガイド鎖の５’端、すなわち式（Ｉ）の「Ｘ」のＡ／Ｕ豊富な伸長の使用、若しくはガイド鎖の３’端すなわち式（Ｉ）の「Ｙ」の設計でのＧ／Ｃ豊富な末端の選択を挙げることができる。また、ゆらぎ塩基対形成によっての対応するパッセンジャー鎖中のＣのＵでの代用は、ガイド鎖の５’末端近くにＧが存在する場合に鎖負荷を少なくとも部分的に修正することができる。最後に、当業者は、所望の鎖の負荷をさらに高めるために、鎖負荷を嫌う改変をパッセンジャー鎖で使用し得ることを認識するであろう。こうした改変はオーバーハングの長さおよび組成の操作もまた包含する。あるいは、ＬＮＡ、２’−Ｏ−メチルおよび２’−メトキシエチルのようなＲＮＡ二重鎖の結合エネルギーを増大させる化学修飾を、ガイド鎖の負荷に味方するようにパッセンジャー鎖の５’端に配置される塩基に使用し得る。
多様な段階を、場合によっては個別に若しくは組合せで追加し得る。こうした段階は、意図される目的上作用する、ＲＮＡの有効性を増大させる、オフターゲット効果を低下させることなどがありそうにない配列の数を低下するためのような、多標的干渉ＲＮＡを設計することの合理的過程を促進するのに使用する。これらの段階の多くは自動化し得るか、若しくは操作者からの制限された量の入力、しかし当業者が認識するであろうとおり該方法を容易にすることができる生物情報学的コンピュータシステムの使用のみを必要とし得る。
外来ＤＮＡの細胞センサーを活性化する高い傾向を有する特定の配列が存在することが今や認識されているアンチセンスの状況と同様、他の受容体は特定のＲＮＡ配列を検出しかつストレス応答を生じうる（例えば、Ｓｉｏｕｄ，Ｍ．（２００５）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４８、１０７９−１０９０を参照されたい。増大された炎症応答と関連する特異的「モチーフ」（Ｈｏｒｎｕｎｇ，Ｖ．ら（２００５）Ｎａｔ Ｍｅｄ １１、２６３−２７０；Ｊｕｄｇｅ，Ａ．Ｄ．ら（２００５）Ｎａｔ Ｍｅｄ １１、２６３−２７０）は容易に除外し得る。
連続するグアノシンの伸長をもつＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡのターゲッティングに関係しない付加的な効果を生じさせることが既知である。ＲＮＡの場合の状況はより少なく明瞭であるとは言え、大部分の製造者は、グアノシン（Ｇ）の長い一続きを含有するｄｓＲＮＡ二重鎖を彼らの実験に選択しないことを推奨する。４個以上の連続するＧは対応するＣＯＤＥＭＩＲの活性を大きく低下したことが本発明で見出された（実施例１７を参照されたい）。従って、多くのシードは、５個若しくはそれ以上の連続するＣをそれらが含有する場合に排除し得る。当業者は、シード中の５個若しくはそれ以上のＣが本発明のＲＮＡ分子の活性部分の５個若しくはそれ以上のＧに対応することができることを認識するであろう。しかしながら、パッセンジャー鎖が二本鎖である場合に該分子中の５個若しくはそれ以上のＧの存在をさらに除外することが望ましいこともまたわれわれは考慮し、従って、コンセンサス標的配列と組合せのシード中の５個若しくはそれ以上の連続するＧの存在もまた、二重鎖分子を構築すべきである場合に望ましくないｋ央慮される。
本発明の二重鎖分子に特異的に関するシードを除外することに対するさらなる一態様は、３’端のＧ／Ｃ豊富な領域の存在、およびシード若しくはコンセンサス標的配列（シードを包含する）中の５個若しくはそれ以上の連続するＧの存在に当てはまる。
別の態様において、該方法は、単一塩基のみから構成される、ＡおよびＵからのみ構成される、Ｃである５個若しくはそれ以上の塩基の連続する列を有する、３’端でＧ／Ｃ豊富である、目的の非標的トランスクリプトーム中に許容できない頻度で存在することが予測される；またはそれらのいずれかの組合せのいかなるコンセンサス標的配列も廃棄する段階をさらに含んでなる。二本鎖多標的干渉ＲＮＡを設計するべきである状況で、コンセンサス標的配列は、それらが外来核酸の細胞センサーを活性化する傾向を有することが予測される配列を含有する場合、それらが分子内塩基対形成に関与する、Ｇである５個若しくはそれ以上の塩基の連続する列を有することが予測される、またはそれらの組合せの場合にもまた廃棄しうる。
候補シードおよびシードと同様、コンセンサス標的配列は、本発明の多標的干渉ＲＮＡの設計で中間体として使用し得る。とりわけ、該コンセンサス標的配列は、対応する多標的干渉ＲＮＡの鎖を設計するのに使用する。コンセンサス標的配列は、少なくとも実質的に、候補多標的干渉ＲＮＡの「ガイド鎖」の相補物である。好ましくは、それらは、候補多標的干渉ＲＮＡの「ガイド鎖」の完全な相補物である。コンセンサス標的配列は、少なくともおそらく、しかし必ずではなく、これらが二本鎖である場合に対応する候補多標的干渉ＲＮＡの「パッセンジャー鎖」に同一である。「パッセンジャー鎖」は、ＲＩＳＣ負荷、および配列の改変、例えばオーバーハング（非平滑端、例えば３’−ＵＵ）の包含のような端修飾の使用、ならびに不適正およびゆらぎ塩基の組み込みにより他の機能性を至適化するように頻繁にさらに改良されるために、それらは同一でないことがある。こうした改変は当業者により理解されるであろう。
オフターゲット効果の予測のため目的の非標的トランスクリプトームに対しコンセンサ
ス標的配列を走査すること、および目的の非標的トランスクリプトームに対する許容できないオフターゲット効果を有することが予測されるいかなる配列も除外することもまた、コンセンサス標的配列の数を減少させる有用な方法であり、そして前述のいずれも該方法に一段階として追加しうる。これは、例えばＢＬＡＳＴソフトウェアを使用して類似の配列について検索することにより実施する。代替のしかし必ずしも同等でない一手順は、例えばＲＮＡｈｙｂｒｉｄ若しくは同等のソフトウェアを使用するトランスクリプトームに対するコンセンサス標的配列の相補物のｉｎ ｓｉｌｉｃｏハイブリダイゼーションを包含する。実務において、特異的な設計した多標的干渉ＲＮＡ、例えばＣＯＤＥＭＩＲ、ＶＩＲＯＭＩＲなどを、予見されないがしかし問題のオフターゲット効果による細胞傷害性について慣例にスクリーニングすることが良識的である。
こうした治療的ＲＮＡのいかなる望ましくない特性も、当業者に理解されるであろうとおり、どの候補シード配列、コンセンサス結合部位、若しくは提案された多標的干渉ＲＮＡを廃棄するかの基礎として使用し得る。
上で概説した基本的方法から得られるＲＮＡ分子を改変し得、そしてしばしばそれらの特性を改良すべきであることができる。該方法はその場合、ＲＩＳＣ複合体への実際の若しくは予測される負荷を改良するため、最低１種の標的ＲＮＡ分子に対する活性を改良するため、宿主細胞に投与される場合のストレス若しくは炎症応答を低下させるため；発現系での半減期を変えるため、またはそれらのいずれかの組合せのために、段階ｈ）で設計された多標的干渉ＲＮＡ二重鎖を改変する段階をさらに含み得る。
ある態様において、設計された多標的干渉ＲＮＡ分子は、例えば、ｉ）ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）への多標的干渉ＲＮＡ分子のガイド鎖の取り込みを向上させるため；ｉｉ）最低１種の標的ＲＮＡ分子の発現の調節を増大若しくは減少させるため；ｉｉｉ）多標的干渉ＲＮＡ分子を被験体に投与する場合のストレス若しくは炎症応答を低下させるため；またはｉｖ）ｉ）ないしｉｉｉ）のいずれかの組合せのため改変し得る。
当業者は、実験室で、若しくは好ましくはｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのいずれかでＲＮＡ分子を改変する方法を理解するであろう。好ましい態様において、該改変段階は、最低１個の不適正塩基対、ゆらぎ塩基対、若しくは末端オーバーハングを創製するため、またはＲＩＳＣに媒介されるプロセシングを増大させるために、１個若しくはそれ以上のヌクレオチド塩基を変更、欠失若しくは導入することの１つ若しくはそれ以上を含んでなる。それを行うための技術は当該技術分野で既知である。好ましくは、該改変は少なくても最初はｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施し、そして、こうした改変の影響は、干渉ＲＮＡ生成物の改良された特性をどれが提供するかを決定するために、実験的パラメータに対し容易に試験し得る。
現在好ましい一態様において、該方法は、ＲＮＡを実際に作成する段階により、完全にｉｎ ｓｉｌｉｃｏで若しくは視覚的検査および測定により実施する。一態様において、該方法は、シード長さｎについて新たな値を選ぶ段階、および残存する段階のそれぞれを反復する段階をさらに含んでなる。該方法が革新的であり得ることが明瞭であり、そしてこうした目的上のコンピュータの利益は公知である。最低１種の設計された干渉ＲＮＡを適する細胞発現系で実際に作成かつ試験する段階をさらに含んでなる方法もまた本明細書で提供される。これは、標的ＲＮＡ分子に対する必要とされる若しくは十分な活性を有する、またはモデル系（例えば癌細胞の死、血管新生の阻害、病変形成の抑制、加速された創傷治癒など）で必要とされる表現型を生じる干渉ＲＮＡを同定するように必要であることができる。
認識されるであろうとおり、多数のシードおよびそれにより潜在的多標的干渉ＲＮＡを、上の方法論を使用して生成し得る。上の規則は望ましくない特性に基づき潜在的候補を取り除くのに使用し得る一方、当業者は、ハイスループットスクリーニングの方法論への到達、ならびにＲＮＡ合成への忠実度、費用および到達の最近の改良で、活性の多標的干渉ＲＮＡの開発でさらに補助するために何百ないし何千の候補の試験を容易に実施し得ることを認識するであろう。従って、アルゴリズム設計に単に基づくいくつかの候補を優先することと対照的に、かなりの数の候補をスクリーニングすることが時折好ましい。候補の生物学的試験と一緒の慎重なｉｎ ｓｉｌｉｃｏ設計の組合せを使用して、優れた活性をもつ候補を効率的様式で同定し得る。
候補のハイスループット評価に考慮し得るスクリーニングは、レポーターアッセイ、多重ＥＬＩＳＡ、ウイルスレプリコン系、ドットブロットアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲなどを包含する。
候補の多標的干渉ＲＮＡは、１９ｂｐの相補性および３’の２ヌクレオチドのオーバーハングを伴う二本鎖ＲＮＡ分子として慣例に合成する。ガイド鎖（標的ＲＮＡに対する相補性をもちかつＲＩＳＣに組み込まれることが予測される鎖）について、２ヌクレオチドのオーバーハングを標的ＲＮＡに相補的であるように慣例に設計するとはいえ、ｄＴｄＴ若しくはＵＵオーバーハングもまた適しうる。パッセンジャー鎖（ガイド鎖に相補的）は、通常、３’の２ヌクレオチドＵＵのオーバーハングを包含するように設計し得る。しかしながら、二重鎖を「平滑端」にし得るような、他の型および長さのオーバーハングを考慮し得る。候補の多標的干渉ＲＮＡは一本鎖分子でもまたあり得る。
ベクター若しくはプラスミドのような発現系により産生される場合、複数の多標的干渉ＲＮＡを単一の治療的生成物に集成することが可能である。当業者は、複数の多標的干渉ＲＮＡを、限定されるものでないが複数の発現ベクター（プラスミド若しくはウイルス）からの個別の多標的干渉ＲＮＡの発現、単一ベクター内に含有される複数の発現カセット（各発現カセットがプロモーター、単一の多標的干渉ＲＮＡおよびターミネーターを含有する）からの発現を挙げることができる数種の戦略により共発現し得ることを理解するであろう。複数の多標的干渉ＲＮＡは、一連の多標的干渉ＲＮＡを含有する単一のポリシストロン性転写物によってもまた生成し得る。
複数の多標的干渉ＲＮＡは、連続して（センス／介在ループ／アンチセンス）発現し得るか、あるいは、直接にまたは介在ループ／スペーサー配列で結合された、５’から３’に連続に連結された各多標的干渉ＲＮＡのセンス配列、次いで５’から３’に連続に連結された各多標的干渉ＲＮＡのアンチセンス配列を伴い発現し得る。
第一の例において、多標的干渉ＲＮＡは、典型的に、標的とされる組織を代表する適切な細胞株を使用して細胞培養物中で試験する。使用される数種の制限しない特定の条件を特定の実施例に概説する。標的ＲＮＡの発現若しくは活性を調節する多標的干渉ＲＮＡをその後さらに研究し得る。とりわけ、抑制がＲＮＡ分解により媒介されることがありそうであるかどうかを確立するために標的ＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施しうる。一般に、細胞は、培地中の５〜４０ｎＭの濃度の多標的干渉ＲＮＡでトランスフェクトし、そして４８時間後に洗浄し、トリプシン処理し、そしてＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡについて収集する。ＲＴ−ＰＣＲをその後、標的ＲＮＡに特異的なプライマー組を使用して実施する。
オフターゲット効果を評価するためにプロテオミックおよびマイクロアレイ実験を使用しうる。同様に、自然免疫応答の活性化の傾向をほとんど伴わない活性の多標的干渉ＲＮＡを選択するために、ＩＦＮ応答のマーカー（例えばＳＴＡＴ１、ＩＦＮｂ、ＩＬ−８、
ホスホＥＩＦなど）の分析を、処理した細胞で実施し得る。
好ましくは、候補の多標的干渉ＲＮＡを、例えば細胞毒性の直接アッセイにより非特異的毒性効果について試験する。あるいは、癌のようないくつかの場合には、細胞傷害性は望ましい結果であり、そして重要な発癌シグナル伝達経路の成功裏の抑制を反映しうる。多標的干渉ＲＮＡは、加えて、特異的標的タンパク質の産生を抑制するそれらの能力について評価する。この点に関して有効性を示す多標的干渉ＲＮＡをその後、非標的タンパク質産生の停止およびプロテインキナーゼＲ媒介性応答の活性化を包含するオフターゲット効果の付加的な証拠について評価する。
該ＲＮＡ分子はベクターに挿入された転写ユニットから発現しうる。ベクターは組換えＤＮＡ若しくはＲＮＡベクターであることができ、また、ＤＮＡプラスミド若しくはウイルスベクターを包含する。多標的干渉ＲＮＡ分子を発現するウイルスベクターは、限定されるものでないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス若しくはアルファウイルスに基づき構築し得る。
好ましくは、ベクターは哺乳動物細胞中での発現に適する発現ベクターである。当業者に公知である方法を使用して、複数の標的ＲＮＡ分子をコードする配列を含有する発現ベクターを構築し得る。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびｉｎ ｖｉｖｏ組換え若しくは遺伝子組換えを包含する。こうした技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｏｔｙ
ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州プレインビュー、およびＡｓｕｂｅｌ Ｆ Ｍら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨークに記述されている。本発明の製薬学的組成物の適する投与経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜若しくは腸投与；筋肉内、静脈内および皮下注入を包含する非経口送達を包含しうる。
あるいは、製薬学的組成物は、例えば、しばしばデポー若しくは徐放製剤で、髄内、くも膜下、直接脳室内、腹腔内若しくは眼内注入のような直接に標的器官若しくは組織への製薬学的組成物の注入を介して、全身よりはむしろ局所の様式で投与しうる。膀胱内滴注および鼻内／吸入送達が、皮膚若しくは冒された領域への直接塗布がそうであるように局所投与の他の可能な手段である。ｅｘ ｖｉｖｏ適用もまた予見される。さらに、本発明の製薬学的組成物は、標的を定めた送達系で、例えば標的細胞特異的抗体で被覆したリポソーム中で送達しうる。該リポソームは標的細胞を標的としかつそれにより選択的に取り込まれることができる。他の送達戦略は、限定されるものでないが、ＲＮＡのデンドリマー、ポリマー、ナノ粒子およびリガンド複合物を挙げることができる。
本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子は、標的細胞若しくは組織に直接添加し得るか、または陽イオン性脂質と複合体形成、リポソーム内に充填、若しくは別の方法で送達し得る。核酸若しくは核酸複合体は、生体高分子へのそれらの取り込みを伴う若しくは伴わない注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）ポンプ若しくはステントにより、適切な組織にｅｘ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで局所投与し得る。
別の局面において、本発明は、本発明の１種若しくはそれ以上の多標的干渉ＲＮＡ分子を含有する生物学的系を提供する。該生物学的系は、例えばウイルス、微生物、植物、動物若しくは細胞であり得る。本発明は、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターもまた提供する。特定の態様において、該ベクターはウイルス、例えばアデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスおよびアルファウイルスよりなる群から選択されるウイルス由来である。多標的干渉Ｒ
ＮＡは、本発明のベクターから発現させ得る低分子ヘアピン型ＲＮＡ分子であり得る。本発明はさらに、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子および許容できる担体を含んでなる製薬学的組成物を提供する。特定の態様において、該製薬学的組成物は、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子のベクターを含んでなる。
別の一般的局面において、本発明は、本発明の多標的干渉ＲＮＡ分子を生物学的系に導入する段階を含んでなる、生物学的系でのＲＮＡ干渉の誘導方法を提供する。
特定の一態様において、本発明は、（ａ）一組の標的ＲＮＡ分子を選択する段階；（ｂ）異なる遺伝子の情況で一組の標的ＲＮＡ分子に存在する最低２種の結合配列と安定な相互作用を形成し得るガイド鎖を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子を設計する段階；（ｃ）多標的干渉ＲＮＡ分子を製造する段階；および（ｄ）該多標的干渉ＲＮＡ分子を生物学的系に投与し、それにより、該多標的干渉ＲＮＡ分子のガイド鎖が異なる遺伝子の情況で標的ＲＮＡ分子の組に存在する結合配列と安定な相互作用を形成し、かつ、従って該標的ＲＮＡ分子のＲＮＡ干渉を誘導する段階を含んでなる、生物学的系におけるＲＮＡ干渉の誘導方法を提供する。
別の特定の態様において、本発明は被験体における疾患若しくは状態の処置方法を提供し、該方法は、（ａ）一組の標的ＲＮＡ分子を選択する段階（該標的ＲＮＡ分子の発現の調節が疾患若しくは状態の処置に対し潜在的に治療的であり）；（ｂ）異なる遺伝子の情況で標的ＲＮＡ分子の組に存在する最低２種の結合配列と安定な相互作用を形成し得るガイド鎖を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子を設計する段階；（ｃ）該多標的干渉ＲＮＡ分子を製造する段階；（ｄ）該多標的干渉ＲＮＡ分子を被験体に投与し、それにより、該多標的干渉ＲＮＡ分子のガイド鎖が異なる遺伝子の情況で標的ＲＮＡ分子の組に存在する結合配列と安定な相互作用を形成し、かつ、従って該標的ＲＮＡ分子の発現の調節を誘導する段階を含んでなる。
当業者は、これらの設計段階は、同等な最終生成物を製造するために異なる順序で実施し得ることを認識するであろう。また、当業者は、いくつかの段階が、広範に同等である代替手順で置換され得ることを認識するであろう。
標的ＲＮＡ分子（１種若しくは複数）は、例えば細胞若しくはウイルス中のいかなるＲＮＡからも選択し得る。１ウイルスゲノム、若しくはなお複数のウイルスゲノム、例えば２種若しくはそれ以上の関係する若しくは無関係のウイルスもまた便宜的に標的とし得る。いずれかの疾患若しくは関係する過程の有用な若しくは所望の標的は、例えば、特許文献を包含する文献若しくは標的発見方法からの考案若しくは検証された薬物標的を包含する１種若しくはそれ以上の手段のいずれによっても同定しうる。当業者は、有用若しくは所望の標的を選択する方法を理解かつ認識するであろう。該標的遺伝子は、その後、目的の疾患過程でのそれらの生成物の重要な役割を裏付ける証拠に基づき優先順位を付ける。
いくつかの場合には、配列の正確さおよび／若しくは目的の疾患に対する関連性に特段の注意を払うことが必要であるかもしれない。例えば、癌のターゲッティングにおいて突然変異の「ホットスポット」を回避することが適切である。使用される配列は完全な配列である必要はないこともまた注意されるべきである。また、特異的スプライスバリアント若しくはアイソフォームの選択的ターゲッティングが望ましいことがあり、また、多標的干渉ＲＮＡの設計で使用される標的配列は、本発明の多標的干渉ＲＮＡにより標的とされる病的な組織にのみ主として存在するものに制限されることが必要でありうる。
ウイルスゲノム内の複数の部位、例えばウイルスＲＮＡ標的を標的とし得る一若しくは二本鎖ＲＮＡ化合物の使用もまた本明細書で提供される。ウイルスの１種若しくは複数の
単離物のゲノム中の複数の部位を標的とする多標的干渉ＲＮＡ分子はときに「ＶＩＲＯＭＩＲ」と本明細書で称される。ウイルスゲノム中の反復配列要素を標的とすることはウイルス治療の魅力的な一アプローチである。こうしたマルチターゲッティングは、複数の同時の突然変異を必要とするとみられる耐性クローンの出現に対する困難な障害を創製することが推定される。また、ある範囲のウイルス単離物全体の配列変異の包括を最大とするように複数の部位を選ぶことができる。既知の単離物の大多数若しくはなお全体のような単離物の予め選択された比率に存在する要素をコンピュータで同定して、それにより最大の治療的有益性を確実にし得る。あるいは、最大の実際の若しくは予測される臨床的重要性の単離物を優先的に標的とし得る。該設計過程は、治療的化合物の開発、製造、および究極的には投与もまた容易にし得る。ウイルス性疾患の病因に関与する経路の１種若しくはそれ以上の宿主タンパク質または他の中間体の付加的なターゲッティングもまた設計し得る。細菌感染症および病原体により引き起こされるいずれかの他の疾患を類似のアプローチにより標的とし得る。
本発明のＲＮＡ化合物は、植物、動物およびとりわけヒトで疾患を処置若しくは予防するのに使用し得る。該ＲＮＡ化合物は、必要とされる効果を導出するために関連する植物、動物若しくはヒト細胞中で細胞発現し得るか、または化学合成した化合物として送達分子若しくは装置によって直接若しくは間接的に投与し得るかのいずれかである。本発明のＲＮＡ化合物は植物および動物への有害生物の攻撃を処置若しくは最小化するのに使用し得る。有害生物は脊椎動物若しくは無脊椎動物でありうる。
本発明は、標的遺伝子の発現から生じる疾患状態の処置若しくは予防に使用し得る。疾患状態は、限定されるものでないが、自己免疫疾患、遺伝病、癌若しくは病原体による感染を挙げることができる。処置は、該疾患と関連するいずれかの症状若しくは臨床適応症の予防若しくは改善を包含するとみられる。好ましい一態様において、疾患状態は、癌（例えば結腸直腸腺癌）、糖尿病、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、乾癬、ＨＩＶ感染症、ＨＣＶ感染症若しくはアルツハイマー病である。本発明は、従って、限定されるものでないが多標的干渉ＲＮＡでこれらの疾患を治療するという概念を挙げることができる。容易に認識され得るとおり、同一の原理を全部の他の複雑な疾患の処置に応用し得る。
多標的干渉ＲＮＡの標的配列の選択は、治療が望ましい疾患（１種若しくは複数）により決定することができる。標的ＲＮＡ配列はｍＲＮＡおよび非コードＲＮＡを包含することができ、そして宿主若しくは感染性病原体または双方いずれかによりコードされうる。いずれか１種の多標的干渉ＲＮＡに設定される標的ＲＮＡはこれらの型のいずれからも選択し得、そして、限定されるものでないが受容体、サイトカイン、転写因子、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、植物遺伝子、昆虫遺伝子、酵母および真菌遺伝子、調節および／若しくはシグナル伝達タンパク質、非コードＲＮＡ、細胞骨格タンパク質、トランスポーター、酵素、ホルモン、抗原、仮想的タンパク質、ならびに未知の機能のタンパク質を挙げることができる遺伝子若しくは遺伝子産物のいずれかの組合せを表しうる。
加えて、病原体の多様な単離物のターゲッティングが予見される。複数の標的部位をその後、広範な単離物にわたる配列の変異の包括を最大にするように選ぶことができる。
標的ＲＮＡ分子の調節は、当該技術分野で既知であるような、適する表現型、例えばｉｎ ｖｉｖｏ、１個若しくはそれ以上の適する細胞、または無細胞すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系で測定する。転写、翻訳、若しくはＲＮＡ分子に関する発現の他の局面のパラメータの慣例の測定方法が当該技術分野で既知であり、そしていかなるこうした測定も本明細書の使用に適する。
本発明の多様な局面の多標的ＲＮＡは、１発現系での１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡの発現を調節するのに有用である。より好ましくは、それらを１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡの発現を減少させるのに使用する。こうした減少は、ＲＮＡにより本明細書で定義されるところのＲＮＡ発現の減少のための当該技術分野で既知の若しくは未だ発見されるべきであるいずれかの機構により直接若しくは間接的に起こり得る。いくつかの態様において、それらは１種若しくはそれ以上のＲＮＡ標的の発現を完全に排除する。いくつかの態様において、所定のＲＮＡは、数種の標的ＲＮＡの１種の発現の調節で別のものより有効であることができる。他の場合には、ＲＮＡは１種若しくはそれ以上の発現系の全標的に同様に影響を及ぼしうる。
本明細書で提供される多標的ＲＮＡは、単一遺伝子特異的治療薬が病態生理学的経路中の複数の冗長性により不利な立場にありうる複雑な多遺伝子性疾患の処置でとりわけ貴重である。本発明は、大きく増大された治療能力を生成するために、シグナル伝達経路若しくは分子のような複数の若しくは重要なタンパク質若しくは経路を単一の剤で標的とし得る意識的かつ計算されたアプローチを可能にする。
いくつかの場合には、目的の標的は、共通の「マスター調節因子」、例えば上流の多面的因子により少なくとも部分的に制御されうる。こうした共通の調節因子はしばしば転写因子である。例えば、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１は、理論上、核因子ＮＦκβを標的とすることにより下方制御し得る。しかしながら、例として、ＮＦκＢは、とりわけストレスの時に網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）の生存に関与する因子でもまたある。従って、こうした細胞生存因子の無差別的下方制御は、疾患に罹った眼のＲＰＥ細胞の増大された死という望ましくない結果に至ることがありそうであるとみられる。上流の多面的制御因子を、所望の経路若しくは過程に負に影響するという付随する危険を伴う潜在的標的と同定することよりもむしろ、本明細書に開示される新規アプローチは、共通の上流の因子を無差別に調節することを必要とせず、目的の複数の特定の標的の調節の影響を受けやすい。
本明細書に提供される多標的干渉ＲＮＡの付加的な一局面は、細胞の不均一性を特徴とする疾患の処置に応用可能である。例えば、充実性腫瘍において、変異された遺伝子および活性化された経路の存在は、同一腫瘍内で、同一患者の腫瘍間で、ならびに異なる患者の類似の組織学の腫瘍間で広範に変動し得る。数種の重要な経路に対し活性のＲＮＡ分子の開発は、これらの標的とされた経路のいくつかに依存する細胞に対する相乗的活性を派生しうる。しかしながら、腫瘍細胞のより大きな比率に対する活性はまた、ＲＮＡ分子の「多標的」の性質によることがありそうであることができる。さらに、数種の重要な経路のターゲッティングは、患者集団のより多くの処置を「包括する」すなわち可能にするであろう。これゆえに、本明細書に提供されるＲＮＡ分子を用いる処置で、改良された臨床転帰がありそうである。
ある態様、例えばＲＩＳＣが作用機序に関与する態様において、単一の多標的干渉ＲＮＡでの複数の疾患関連転写物のターゲッティングは、利用可能な細胞内機構を飽和させ得る複数のｓｉＲＮＡ分子の投与と対照的に、利用可能なＲＩＳＣを最適に利用する。
同一ＲＮＡ標的配列内の複数の部位を標的とすることは、本明細書に提供される干渉ＲＮＡについてもまた予見される。すなわち、マルチターゲッティングの局面は複数の標的ＲＮＡ分子内の複数の標的に制限されない。癌およびウイルス感染症を包含する多くのヒト疾患は高変異率を表すＲＮＡ標的を特徴とする。これは、標的ＲＮＡの突然変異によりこれらの疾患で生じる核酸治療薬に対する耐性の見込みを増大させる。最低２個の同時の突然変異が耐性に必要とされるとみられるため、標的ＲＮＡ内の複数の部位を標的とすることは、生じるこうした耐性の見込みを低下させる。従って、ある態様において、多標的干渉ＲＮＡとともに使用されるマルチターゲッティングのアプローチは、例えばエスケー
プ変異体を予防するために、単一の標的ＲＮＡ分子に対する複数のヒットの生成に向けることができる。同一転写物内の（例えばＲＮＡウイルスでの）複数の部位のターゲッティングは、ウイルス増殖の阻害に対する相乗効果もまた生じうる。さらに、標的ＲＮＡ分子との部分的相補性のみを必要とする機構（１種若しくは複数）を使用することは、単一点突然変異により耐性を発生させる可能性を低下させ得る。
本発明は、後に続く実施例を参照してより良好に理解されるであろう。当業者は、これらの実施例は本発明を具体的に説明するのみでありかつ制限しないことを容易に認識するであろう。
［実施例］
糖尿病性網膜症（ＤＲ）のためのＣＯＤＥＭＩＲの選択
ＤＲの治療に適するＣＯＤＥＭＩＲを探索した。該疾患状態では、ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１が血液−網膜関門の完全性の喪失の駆動体であるようであり、この喪失は例えば糖尿病性黄斑浮腫（血管新生およびＤＲへの序章）につながる。従って、ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１をＣＯＤＥＭＩＲの設計の標的として選択した。こうしたＣＯＤＥＭＩＲはまた、単核細胞浸潤および血管新生を特徴とする乾癬および他の状態の処置に対する治療目的のものでもあった。
ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に対応する転写物配列を、データベースと組合せた検索アルゴリズムを使用して最低６個の連続する塩基の適するシードについて検索するのに使用した。Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースから得たＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１に関する公的に利用可能な配列を使用して、初期解析を実施した（表１−１を参照されたい）。（Ｅｎｓｅｍｂｌは、欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（ＥＭＢＬ）／欧州生物情報学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＥＢＩ）およびＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＷＴＳＩ）間の共同プロジェクトである）。該データベースおよび関連ツールは、ワールドワイドウェブ上のＥｎｓｅｍｂｌウェブサイトで公的に入手可能である。
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長さ６若しくはそれ以上の全部の可能な候補シードのプールを、ウィンドウとして指定された長さを使用すること、およびウィンドウを一時に１塩基前進させることによる段階的様式で配列に沿って連続的に動かして生成した。低い複雑さのシードを除外した。候補シード配列のプールを、最低３個の連続する塩基が至適のおよび至適に及ばないフォールディングした構造の最低５０％の対形成しない領域に結合することが予測されたものにさらに制限した。至適のおよび至適に及ばない（最適フォールディングエネルギーの−１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内）フォールディングした構造は、Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡパッケージ（Ｈｏｆａｃｋｅｒ、（２００３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１：３４２９−３１）を使用して決定した。
選択基準を至適に満たした２種の異なるシードを選択した。第一のシードは１２ヌクレオチドのその長さに基づき選択した。数種のより小さいシードもまた記録された。１種の７ｎｔのシードは、シード近くの２種の標的配列間のさらなる同一性の付加的なではあるが不連続の領域によってコンセンサス標的配列の設計に好都合であった遺伝子の情況にあった。該２種のシードを使用して２組のコンセンサス標的配列を生成した。第一のシードのコンセンサス標的配列は、該２標的配列の至適のアライメント、および多様な塩基変化が双方の標的ＲＮＡへの相補配列の結合に対し有したとみられるありそうな影響を決定することにより決定した。第二のシードの場合、順列解析が好都合であった。この場合、該２標的配列は、シードに対し５’である１４塩基にわたる７位置のみで異なる。多標的干渉ＲＮＡの末端尾部が相補性に対するより少ない要件を有するため、２個の可能な末端トリプレットすなわちＴＡＴおよびＧＴＣのみをコンセンサス標的配列の５’端に考慮した。これは可能な順列の数を４減少させた。全部の残存する３２種の可能なコンセンサス標的配列（３２＝２５）の系統的生成の後に、該２標的に対する２１塩基の相補配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏハイブリダイゼーションが続いた。該２標的に対する最良の全体的ハイブリダイゼーションを提供する配列をＣＯＤＥＭＩＲ−２と称した。該２種のシードのそれぞれについて同定されたコンセンサス標的配列を表１−２に列挙する。
表１−２：多標的干渉ＲＮＡ、例えばＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１を標的とするＣＯＤＥＭＩＲの設計のための例示的シード配列およびコンセンサス標的配列（全部５’から３’）。＊１，２これらのコンセンサス標的配列を使用してそれぞれＣＯＤＥＭＩＲ１およびＣＯＤＥＭＩＲ２を設計した。
Figure 0005078904
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上で挙げられたとおり、ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１に対する部分的同一性をもつ付加的なコンセンサス標的配列が、とりわけ第二のより短いシードについて容易に生成された可能性があったため、わずか数種の例示的配列を表１−２に列挙する。図１に１２ｎｔのシードの５種のコンセンサス標的配列を示す。標的のＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１転写物へのＣＯＤＥＭＩＲガイド鎖の予測されるハイブリダイゼーションもまた示す。ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１を標的とするＣＯＤＥＭＩＲは提供される方法を使用して設計した。コンセンサス標的配列（ＶＡＩＣ１−０１ないし−０５）は、シード領域の５’の標的ｍＲＮＡ配列を整列して長さ２１ヌクレオチドの部位を生成することにより派生させた。これらのコンセンサス標的配列に相補的な候補ＣＯＤＥＭＩＲガイド鎖配列を決定し、そしてＣＯＤＥＭＩＲガイド配列と標的の間のハイブリダイゼーションをｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデル化により予測した。該結果に基づき、コンセンサス標的配列ＶＡＩＣ１−０４を、ＣＯＤＥＭＩＲ １を生成するのに使用した（図２および３）。
候補ＣＯＤＥＭＩＲを、相補的な１９ｂｐおよび長さ２ヌクレオチドの３’オーバーハングをもつ二本鎖ＲＮＡ分子として合成した。ガイド鎖の２ヌクレオチドオーバーハングは該コンセンサス標的配列に相補的であるように設計した。相補的パッセンジャー鎖は２ヌクレオチドの３’−ＵＵオーバーハングを包含するよう設計した。
２種のＣＯＤＥＭＩＲ（１２ｎｔのシードおよび７ｎｔのシードからそれぞれ設計したもの）をより広範な試験のため選択した。ガイド鎖の配列、ならびに標的とされるＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１の３’ＵＴＲへのそれらの予測されるハイブリダイゼーションを表１−３に示す。長さわずか７ｎｔのシード配列ででさえ、本明細書に提供されるアプローチを使用して、最低２種の異なる標的と有意のハイブリダイゼーションを達成するようにＣＯＤＥＭＩＲ（例えばＣＯＤＥＭＩＲ２、表１−３）を設計し得ることを見ることができる。意図される標的との該ＣＯＤＥＭＩＲが有する３’同一性の程度は明らかである。
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ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１を産生するヒト細胞培養系でのＣＯＤＥＭＩＲの試験
細胞および培養：培養物中のＲＰＥ（網膜色素上皮）細胞を使用して、上述されるとおり設計した抗血管新生ＣＯＤＥＭＩＲをスクリーニングした。ヒト細胞株ＡＰＲＥ−１９を使用した。ＡＲＰＥ−１９細胞を、１０％ウシ胎児血清および１０ｍＭグルタミンを補
充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。目的の分泌型タンパク質のＥＬＩＳＡ検出、若しくはｉｎ ｓｉｔｕ細胞表面抗原免疫染色のため、ＡＲＰＥ細胞をウェルあたり４×１０３細胞で９６ウェル組織培養プレートに播種した。ＦＡＣＳ分析のためには、ＡＲＰＥ−１９細胞をウェルあたり２．５×１０４細胞で２４ウェル組織培養プレートに播種した。細胞は、２０ｐｍｏｌのＣＯＤＥＭＩＲ ＲＮＡ二重鎖若しくは対照ｓｉＲＮＡあたり１μｌのリポフェクタミンの比でリポフェクタミン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、播種２４時間後にトランスフェクトした。大部分の研究で、培地をトランスフェクション２４時間後に交換し、その時点で、デフェロキサミン（１３０μＭ）若しくはＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１実験に添加した。実験は三重で実施しかつ最低２回反復した。
ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１のアッセイ：ＡＲＰＥ−１９細胞をアッセイしてＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１双方の産生を確認した。ＶＥＧＦ−Ａは、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造元の説明書に従って使用して上清でアッセイした。細胞表面ＩＣＡＭ−１は、免疫染色、次いで蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、比色検出を使用する９６ウェルプレートでの細胞表面ＩＣＡＭ−１のｉｎ ｓｉｔｕ免疫染色、若しくは、あるいは商業的ＩＣＡＭ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する細胞ライセートのＥＬＩＳＡのいずれかによりアッセイした。
細胞毒性およびオフターゲット効果：血管新生促進因子の供給源であることを別にして、ＲＰＥ細胞は神経感覚光受容体細胞の生存に決定的に重要である。これゆえに、該ＣＯＤＥＭＩＲを、有意の細胞傷害性を伴わないＣＯＤＥＭＩＲの選択を可能にするＡＥＰＲ−１９細胞中での細胞傷害効果についてスクリーニングした。ＣＯＤＥＭＩＲを、典型的には培地中１〜１００ｎＭの最終濃度でＡＲＰＥ−１９細胞にトランスフェクトした。細胞生存を、トランスフェクション４８時間後に、細胞呼吸を測定するＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して測定した。
複数のＲＮＡ標的に対するＣＯＤＥＭＩＲの活性：ＣＯＤＥＭＩＲを、標的タンパク質のそれぞれの産生を抑制するそれらの能力について評価した。ＶＥＧＦ−Ａ若しくはＩＣＡＭ−１いずれかを個別に標的とする特異的ｓｉＲＮＡを単一標的比較対照として使用した。（例えば表１−４を参照されたい）。
ＶＥＧＦもＩＣＡＭもいずれも標的としないｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ対照）を非ターゲッティング対照として使用した（表１−４）
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結果：ＣＯＤＥＭＩＲ−１およびＣＯＤＥＭＩＲ−２、ならびに比較および非ターゲッティング対照ｓｉＲＮＡを、細胞傷害性についてＡＲＰＥ−１９細胞で評価した。全部が、４８〜７２時間にわたりトランスフェクトした場合に、０〜４０ｎＭの濃度範囲（図２）にわたり無視できる毒性を有することが見出された。試験したＣＯＤＥＭＩＲのいずれも、約５０ｎＭ未満の濃度でいかなる認識できる毒性も示さなかった。個々の設計したＣＯＤＥＭＩＲを、オフターゲット効果による潜在的細胞傷害性について慣例にスクリーニングした。
培地（ＶＥＧＦ−Ａの場合デフェロキサミンおよびＩＣＡＭ−１についてＩＬ−１βを加える）の変更４８時間後の細胞培養物からの上清を、ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１についてアッセイし、そして細胞を収集した。図３は、ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１双方をマルチターゲッティングするＣＯＤＥＭＩＲによるタンパク質抑制を示す。ＡＲＰＥ−１９細胞を、それぞれ４０ｎＭの濃度の、ＶＥＧＦ若しくはＩＣＡＭいずれも標的としないｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ対照）、あるいは、ＶＥＧＦ−Ａ（ｓｉＶＥＧＦ）、ＩＣＡＭ−１（ｓｉＩＣＡＭ）、またはＣＯＤＥＭＩＲ−１若しくは−２で処理した。（ＥＬＩＳＡにより測定されるところの）ＶＥＧＦ−Ａおよび（ＦＡＣＳにより測定されるところの）細胞表面ＩＣＡＭ−１タンパク質を処理４８時間後にアッセイし、そして未トランスフェクト対照細胞からのもののパーセントとして表した。ＶＥＧＦ−Ａ分泌を測定する実験では、細胞をトランスフェクション２４時間後に低酸素状態模倣デフェロキサミン（１３０μＭ）で刺激した一方、ＩＣＡＭ−１の対応する実験ではＩＬ−１βを１ｎｇ／ｍＬで添加した。未刺激および刺激したがしかしトランスフェクトされない細胞からのデータを比較のため示す。描かれた結果は数回の実験からの混成データである。比較対照は、それぞれ、それらのそれぞれの標的の発現を、他の標的とされないタンパク質を減少させることなく有意に減少した（対照ｓｉＲＮＡに対するＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。事実、増大されたＩＣＡＭ−１発現がｓｉＶＥＧＦで観察された（対照ｓｉＲＮＡに対するＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。
ＣＯＤＥＭＩＲ−１は、同一濃度の比較ｓｉＲＮＡ対照を超えた程度までＶＥＧＦ−Ａ分泌を顕著に抑制した。同一のＣＯＤＥＭＩＲはまた、ＩＣＡＭ−１比較対照に匹敵する様式でＩＣＡＭ−１発現も抑制した。ＣＯＤＥＭＩＲ−２もまた、ＩＣＡＭ−１およびＶＥＧＦ−Ａ双方をより少ないがしかしにもかかわらず有意の程度まで抑制した（対照ｓｉＲＮＡに対するＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。ＶＥＧＦ−Ａ中の正確なＣＯＤＥＭＩＲ１部位を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖はＶＥＧＦ−Ａ分泌のわずかにより大きいノックダウンのみを生じた（データは示されない）。従って、本明細書で提供される干渉ＲＮＡ分子の全体的相補性の欠如は有意に有害でなく、そして、個々のＣＯＤＥＭＩＲ（それらのそれぞれが複数のＲＮＡを標的とする）の本明細書に提供される設計方法を、こうした干渉分子を生成するのに使用し得る。
ＣＯＤＥＭＩＲ−１およびＣＯＤＥＭＩＲ−２の活性を、ＲＴ−ＰＣＲによりＶＥＧＦ
ｍＲＮＡ発現に関して評価した。比較対照すなわちｓｉＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ中の異なる部位を標的とする比較対照ｓｉＲＮＡ）およびｓｉＣＯＮＴＲＯＬ（非ターゲッティング対照ｓｉＲＮＡ）、そして最後にＤＮＡを含有しないサンプル（水対照）を一緒に分析した。ＶＡＩＣすなわちＣＯＤＥＭＩＲ−１の標的結合配列に完全に相補的であるように設計した多標的干渉ＲＮＡもまた検査した。２回のＲＴ−ＰＣＲ反応をＡＲＰＥ−１９細胞から調製したＲＮＡのサンプルで実施した。具体的には、ＡＲＰＥ−１９細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００および４０ｎＭのそれぞれのＲＮＡ処理でトランスフェクトし、２４時間インキュベートし、その後、ＲＮＡの収集および抽出前に１３０μＭデフェロキサミンで追加の２４時間処理した。一反応で、ＰＣＲ産物は、ＶＥＧＦのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部からの２６６ｎｔのＰＣＲアンプリコンであった。第二の反応で、増幅されたアンプリコン（２４３ｎｔ）はＶＥＧＦの３’ＵＴＲに位置を突き止められる。負荷について制御するため、ＧＡＰＤＨ「ハウスキーピング」転写物のＰＣＲ増幅もまた測定した。ＧＡＰＤＨバンドの相対強度は全処理レーンで等しかった。双方のＶＥＧＦアンプリコンは、ＣＯＤＥＭＩＲ−１若しくはｓｉＶＡＩＣいずれかでトランスフェクトしたＡＲＰＥ−１９細胞について強度が有意に低下された。比較ｓｉＶＥＧＦ対照は、ＯＲＦアンプリコンについて視覚的に低下された強度を有したが、しか
し３’ＵＴＲアンプリコンについては有しなかった。全体として、これらの結果は、ＣＯＤＥＭＩＲ−１が実質的ｍＲＮＡ分解を誘導した一方、ＣＯＤＥＭＩＲ−２がより少ないＶＥＧＦ ｍＲＮＡ分解をもたらしたことを示す。本発明の局面を操作のいずれかの特定の論理に制限することなく、ＣＯＤＥＭＩＲ−１が、ＲＩＳＣ切断部位に隣接する中央の塩基対を包含するＶＥＧＦ ｍＲＮＡ標的に対する比較的高程度の相補性を有する一方、ＣＯＤＥＭＩＲ２はＶＥＧＦ標的ｍＲＮＡと中央の不適正を有することが、少なくとも注目に値する。従って、所定の標的ＲＮＡ配列に対する完全未満の相補性をもつＣＯＤＥＭＩＲは、例えば、調節の付加的な手段として、若しくは標的の翻訳を抑制することのような他の機構に対する一代替としてのＲＩＳＣプロセシングによるｍＲＮＡ分解を誘導しうる。
多標的干渉ＲＮＡ分子（ＣＯＤＥＭＩＲ）はシードの相補物に対応する配列を含んでなることができることが当業者により認識されるであろう。ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１の発現を変えるためのＲＮＡ分子の本実施例において、相補配列は、ＣＯＤＥＭＩＲ １および２についてそれぞれＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧ（配列番号１）およびＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２）である。
ＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ双方を標的とする付加的なＣＯＤＥＭＩＲを、図１に示されるコンセンサス標的配列のそれぞれに基づき設計した。そのように設計したＣＯＤＥＭＩＲのそれぞれは標的ＲＮＡの調節においてもまた有意に活性であった（ＣＯＤＥＭＩＲ１はすでに記述され、他のデータは示されない）。活性のＣＯＤＥＭＩＲは後に続くとおりである：
Figure 0005078904
変えられたオーバーハング長さをもつＣＯＤＥＭＩＲ−１のバリアントもまたＡＲＰＥ系で試験し、そして有意の活性を有することが見出されたとは言え、ＣＯＤＥＭＩＲ−２５はＩＣＡＭ−１に対する無視できる活性を有した（データは示されない）。これら２種のＣＯＤＥＭＩＲの配列は後に続くとおりである：
Figure 0005078904
何らかの相同性をもつ天然に存在するミクロＲＮＡの活性とのＣＯＤＥＭＩＲ−１の活性の比較
ＣＯＤＥＭＩＲ−１を、本明細書に提供される方法（例えば実施例１を参照されたい）に従って、ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１双方の標的のマルチターゲッティングのため設計した後、ＣＯＤＥＭＩＲ−１が天然に存在するヒトミクロＲＮＡ、ｍｉＲ−２９９と何らかの相同性を有することが示された。
ｍｉＲ−２９９のプロセシングは、２本の活性鎖ｍｉＲ−２９９−５ｐおよびｍｉＲ−２９９−３ｐを生じることが予測される。下で見られ得るとおり、ｍｉＲ−２９９−３ｐはＣＯＤＥＭＩＲ−１のガイド鎖と同一塩基の１５個のうち１２個を含む領域を有し、そしてそれらの塩基の最初の８個が同一である。ＣＯＤＥＭＩＲ−１のその領域は、その設計で使用されるシード配列の相補物に対応する。該２配列はこの相同性を共有するとは言え、それらは異なる中央および３’尾部領域を有する（下を参照されたい）。
Figure 0005078904
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ｍｉＲ−２９９の活性についてはほとんど知られていない。ｍｉＲ−２９９−３ｐ若しくはｍｉＲ−２９９−５ｐの標的は、ｄｉａｎａ．ｐｃｂｉ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｔａｒｂａｓｅ．ｈｔｍｌで、ペンシルバニア大学ＤＮＡおよびタンパク質分析研究室（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉａ’ｓ ＤＮＡ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｌａｂ）（ＤＩＡＮＡ Ｌａｂ）のワールドワイドウェブサイトでワールドワイドウェブで利用可能な、ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡの間の検証された相互作用の中心的寄託所、Ｔａｒｂａｓｅデータベースで報告されていない。さらなる検討後に、ｍｉＲ−２９９−３ｐの活性の公表された研究は位置を突き止め得なかった。従って、発現系での標的すなわちＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１のそれぞれに対するＣＯＤＥＭＩＲ−１およびｍｉＲ−２９９の活性の比較を行った。
図４に見ることができるとおり、試験された標的に特異的でないＲＮＡ二重鎖陰性対照に比較した場合、ｍｉＲ−２９９の予測される成熟鎖を含んでなるＲＮＡ二重鎖は、ＣＯＤＥＭＩＲ−１で得られたもの未満とは言え何らかのＶＥＧＦ抑制活性を示した。ｍｉＲ−２９９はＩＣＡＭ−１に対する有意の活性を有しなかった（データは示されない）。ＣＯＤＥＭＩＲ−１は、従って、天然に存在するｍｉＲ−２９９と顕著に異なる活性プロファイルを有する。ＣＯＤＥＭＩＲ−１に対する構造の若干の類似性にもかかわらず、ｍｉＲ−２９９は、ＣＯＤＥＭＩＲ−１が標的に特異的に設計された第二のＲＮＡ（ＩＣＡＭ−１）に関していかなる実証できる活性も有しなかった。これは、機能的多標的干渉ＲＮＡを得るための合理的設計方法を使用することの有効性、および該設計方法で使用されるシード領域に対する相同性を有する天然に存在する配列をなお上回る獲得し得る利点を示す。
血管新生因子のマルチターゲッティングのさらなる例示
糖尿病性網膜症より複雑な血管新生表現型が進行癌および加齢性黄斑変性で見出される。加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）層の中および下の部分的に貪食されたレムナントの蓄積が、ＲＰＥ細胞による血管新生性のサイトカイン若しくはケモカイン（例えばＶＥＧＦ−Ａ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１）の産生に至る細胞ストレスを引き起こすと現在考えられている。ＲＰＥ細胞の膜表面上で発現される付加的なタンパク質がこの過程をさらに駆動しうる（例えばＩＣＡＭ−１）。全体として、ＡＭＤに関与する血管新生因子は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＩＧＦ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＣＡＭ−１、ｂＦＧＦおよびＰＩＧＦを包含する。事実、組合せで作用する血管新生促進性サイトカインのこの数の多さは、進行癌で見られる血管新生に類似である。ＣＯＤＥＭＩＲにより包括し得る血管新生因子の数を増大させるため、ＶＥＧＦ−Ａ、ＩＣＡＭ−１およびＩＧＦ−１についてＥｎｓｅｍｂｌデータベース由来の完全なｍＲＮＡ転写物（表１−１を参照されたい）を、前に概説されたところの適するシードの検索で使用した。全３種の転写物に存在する１１ｂｐよりなるシードを同定した（表３−１）。コンセンサス標的配列は上述されたとおり派生させた（表３−１）。これらの部位を標的とするＣＯＤＥＭＩＲのガイド鎖配列を決定し、そして、該３標的配列へのこれらのＣＯＤＥＭＩＲの予測される結合を、ＲＮＡｈｙｂｒｉｄソフトウェアを使用して評価した。３’シード領域は４個の連続するＧ塩基を含有するため、負荷バイアスは好都合であることがありそうでない。表３−２に示されるとおり、ガイド鎖の５’端の高い二重鎖結合エネルギーは、パッセンジャー鎖の改変により不適正塩基対形成の賢明な導入により低下させ得る。
Figure 0005078904
あるいは、血管新生因子のより広範な包括を派生し得る。例えば、７ｎｔのシードＴＧＣＡＧＣＴ（配列番号２１０）を使用して、ＶＥＧＦ−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、ＩＬ−８、ｂＦＧＦ、ＰＩＧＦ、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１およびＩＧＦ−１を同時に標的とするＣＯＤＥＭＩＲを構築し得る。
多標的干渉ＲＮＡ分子（ＣＯＤＥＭＩＲ）がシードの相補物に対応する配列を含んでなることができることが当業者により認識されるであろう。従って、ＩＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ−ＡおよびＩＧＦ−１のいずれかの組合せの発現を変えるためのＲＮＡ分子の例において、表３−１のシード（ＡＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴ）（配列番号２１１）に対する相補配列はＡＣＣＣＣＧＵＣＵＣＵ（配列番号５）である。
ＩＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＩＬ−８、ｂＦＧＦ、ＰＩＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＧＦ−１のいずれかの組合せの発現を変えるためのＲＮＡ分子の例において、上のシード（ＴＧＣＡＧＣＴ）（配列番号２１０）に対する相補配列はＡＧＣＵＧＣＡ（配列番号７）である。
代謝障害のためのＣＯＤＥＭＩＲ
ＣＯＤＥＭＩＲは２型糖尿病のような複雑な代謝性疾患の処置にもまた適しうる。この疾患の処置のための２種の潜在的遺伝子標的はグルコース−６−ホスファターゼおよびＩｎｐｐｌ１である。完全な転写物の配列を共通の候補シードの存在について検査した。この場合は、１４ｎｔ同一のシード（ＣＣＣＡＣＣＣＡＣＣＴＡＣＣ）（配列番号２１２）を同定した（表４−１の一番上）。候補ＣＯＤＥＭＩＲをその後、表４−１に示されるコンセンサス標的部位の中間体を介して設計した。
多標的干渉ＲＮＡ分子（ＣＯＤＥＭＩＲ）がシードの相補物に対応する配列を含んでなることができることが当業者により認識されるであろう。この例において、これらの相補配列はＧＧＵＡＧＧＵＧＧＧＵＧＧＧ（配列番号１０）を含んでなることができる。
Figure 0005078904
癌関連遺伝子産物のマルチターゲッティング
ＣＯＤＥＭＩＲは、腫瘍表現型をより十分に制御するために、複数の無関係の癌遺伝子を標的とするようにもまた応用し得る。例として、β−カテニン、Ｋ−ＲａｓおよびＥＧＦＲの不適切な活性化が多くの進行結腸直腸腺腫で見出されている。これら３遺伝子の同時ターゲッティングをＣＯＤＥＭＩＲで探索した。全３種の遺伝子の完全長転写物を候補シードの検索で使用した。Ｋ−ｒａｓの場合、双方の代替転写物（ａおよびｂ）を包含した。１３ｂｐのシード（ＣＡＵＵＣＣＡＡＵＵＧＵＵＵ）（配列番号９）が見出され、そして適切な候補ＣＯＤＥＭＩＲを同定した。数種の代替ＣＯＤＥＭＩＲコンセンサス標的配列を表５−１に列挙する。
このシードを標的としかつこのシードに対する相補物を含んでなるＣＯＤＥＭＩＲは、結腸直腸および他の癌、とりわけ、変えられたβ−カテニン、Ｋ−ｒａｓおよび／若しくはＥＧＦＲシグナル伝達が悪性表現型に寄与するものの処置に興味深いと思われる。
多標的干渉ＲＮＡ分子（ＣＯＤＥＭＩＲ）はシードの相補物に対応する配列を含んでなることができることが当業者により認識されるであろう。本実施例において、該相補配列はＡＡＡＣＡＡＵＧＧＡＡＵＧ（配列番号８）である。
Figure 0005078904
ＨＩＶゲノム内の複数の部位のターゲッティング
ＣＯＤＥＭＩＲのアプローチは、慢性の形態の疾患で変異されることがありそうである目的のタンパク質を標的とするのに使用し得る。突然変異は、薬剤耐性の形態がしばしば進化する癌およびウイルス性疾患でとりわけ優勢でありうる。本実施例では、ＶＩＲＯＭＩＲをヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複数の部位を標的とするよう設計した。こうしたＶＩＲＯＭＩＲの効果を克服するためのいくつかの部位での同時の突然変異に対する要件は、耐性のウイルスクローン若しくは擬似種の出現に対する高い遺伝子の障害物を提供することがありそうである。ＨＩＶ Ｉ血清型Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｋ０３４５５）のＨＸＢ２株のゲノムを目的の主配列として使用し、そして、１以上の場所に存在するシードを見出すためのこの応用で、別の場所に詳述される生物情報学的方法を用いて検査した。ＧＡＧ、ＥＮＶ、ＰＯＬ、ＴＡＴ、ＶＩＦ、ＶＰＲ、ＶＰＵおよびＮＥＦ遺伝子のいずれかの完全な配列を含有する、２００５年８月１日時点のＬＡＮＬデータベース中の全ＨＩＶ ＩクレードＢ単離物をこれらの分析で使用した。
３種の９塩基シードがこの参照配列中に４種の遺伝子の情況で存在することが見出された。これらは、ＡＴＣＡＡＧＣＡＧ（配列番号２４６）、ＴＧＧＡＡＡＧＧＡ（配列番号２４７）およびＡＡＡＧＡＡＡＡＡ（配列番号３７）であった。
上述されたクレードＢ単離物の集団で、そのより大きな塩基の複雑さのためより興味深い第一のシード（ＡＴＣＡＡＧＣＡＧ）（配列番号２４６）は、このシードのＧＡＧ、ＰＯＬ、ＶＩＦおよびＥＮＶの遺伝子の情況に関して単離物のそれぞれ９１％、７６％、７８％および７４％に存在することが見出された。これを各部位の遺伝子の情況により隣接されたシードとして下に示す。
Figure 0005078904
太字の領域はシードの独立した存在に対応する。これらの領域は遺伝子ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＶＩＦおよびＥＮＶに注釈されている。
付加的な２０種の１１塩基シードが参照ＨＩＶゲノム内の２部位に存在した。１１塩基シードに含まれなかった１０塩基の長さのシードは存在しなかった。これらのシードを、それぞれその遺伝子の情況、それが存在するＨＩＶ遺伝子およびその遺伝子の情況でのその存在率とともに下に列挙する。
Figure 0005078904
Figure 0005078904
Figure 0005078904
究極的には、本発明の有効なＲＮＡ治療薬は、冒された集団の広範な包括を提供するはずであり、そして、この患者集団で高度に表される配列を標的とすることが明らかに望ましい。従って、上で提示されたシードのうち、以前に定義されたところのＬＡＮＬデータベースから入手可能なクレードＢ単離物中のそれらの特定の遺伝子の情況での望ましくな
く低い存在率を伴うものを本考慮から除去した。本実施例の目的上、それらの特定の遺伝子の情況での望ましくなく低い存在率は、クレードＢ単離物の＜５０％と定義した。
候補ＶＩＲＯＭＩＲに優先順位を付けかつそれらを検査するためには、意図している標的配列と適合性であるスクリーニング方法を有することが重要である。ｐＮＬ４．３アッセイは、ＨＩＶで活性の薬物の貴重な検証されたスクリーニングとしてＨＩＶ研究の分野で広範に使用され、そして候補ＶＩＲＯＭＩＲを試験するためにわれわれにより使用された。しかしながら、ｐＮＬ４．３プラスミドのＨＩＶ成分の配列と、該ＶＩＲＯＭＩＲの設計で使用した参照ＨＩＶ株（Ｋ０３４５５）のものの間に若干の差違が存在する。従って、参照株の配列およびｐＮＬ４．３プラスミドの配列の比較を実施し、そして該プラスミド中に存在する保存されたシード部位をもつ、上で詳述した段階からの設計されたＶＩＲＯＭＩＲのみを選択した。１１塩基シードの前の一覧からのシード＃１および＃１２に対応するＶＩＲＯＭＩＲをこれに基づき除外した。しかしながら、当業者は、これら２種のＶＩＲＯＭＩＲが治療上有用でありうること、およびここの決定は選ばれた試験系との適合性に単純に基づいたことを理解するであろう。とりわけウイルス攻撃アッセイ、融合レポーター、ウイルス偽粒子のような他の試験系（それぞれは治療上関連する若しくは無関係の配列のいかなる数の多さも表す）を等しく考慮し得る。
その場合９種の１１塩基シードが考慮のため存在し、そしてこれらのうちシード６（ＰＯＬ／ＶＩＦ；上を参照されたい）を、ウイルスゲノム中の複数の部位を標的とするためのＶＩＲＯＭＩＲの設計の一例として選んだ。２種のシード６の存在に対する多数のコンセンサス標的配列を派生させ（表６−１）、候補ＶＩＲＯＭＩＲガイド配列を同定し、そしてＨＩＶ標的部位へのこれらの配列の予測されるハイブリダイゼーションを、ＲＮＡｈｙｂｒｉｄソフトウェアを使用して評価した。予測されるＶＩＲＯＭＩＲ ＲＮＡ二重鎖を、所望の鎖負荷バイアスを生成することがありそうな因子に関してさらに解析した。ＨＩＶゲノム中のシード部位６を標的とするＣＯＤＥＭＩＲガイド鎖の一例を図５に示す。
Figure 0005078904
コンセンサス標的配列は、１種の選択された９塩基シードおよび他の８種の１１塩基シードについて同様に設計した。当業者により認識されるとおり、ならびに本発明の他の実施例および表６−１に概説されるとおり、多くの可能なコンセンサス標的配列が存在するとは言え、各場合でただ１種のこうした配列をここで使用した。ガイド鎖は、上で示されたところのこれらのコンセンサス標的配列の相補物として生成した。対応するパッセンジャー鎖は、５’末端の最初の２塩基を含まずかつＵＵの３’末端伸長を伴いそれにより各３’末端に二重の２塩基オーバーハングを生成するガイド鎖の相補物となるよう設計した。
１０種のＶＩＲＯＭＩＲ候補は、従って：
Figure 0005078904
であった。
追加される予防措置として、ｐＮＬ４．３標的配列に対するこれらのＶＩＲＯＭＩＲの１０種のガイド鎖配列の予測されるハイブリダイゼーションを、ＲＮＡｈｙｂｒｉｄを使用して評価して、該シードの存在に基づき予測されるところの適切な結合を確実にした。いくつかの場合に、この結合分析が、候補ガイド鎖と、ＨＩＶゲノム上の他の部位の間の他の可能なシードに基づく結合相互作用を同定した。
ＨＩＶは、一般にｉｎ ｖｉｖｏウイルス感染源をもつ慢性感染を引き起こす。結果、ＨＩＶを標的とするＶＩＲＯＭＩＲは、潜在部位からの再出現を予防するための継続的治療的保護に対する必要性により、合成ＲＮＡ二重鎖よりむしろ細胞で発現される低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として治療上有効であることが最もありそうである。
３種の代表的ＶＩＲＯＭＩＲをｓｈＲＮＡとしての発現に選択した（ＶＭ００４、ＶＭ００６およびＶＭ０１０）。ＢａｍＨＩ制限部位、Ｇイニシエーター、ＶＩＲＯＭＩＲパッセンジャー、Ｘｈｏループ配列（ＡＣＴＣＧＡＧＡ）、ＶＩＲＯＭＩＲガイド鎖、ｐｏｌＩＩＩターミネーターおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に対応する連続するＤＮＡ配列を集成し、そしてｄｓＤＮＡとして製造した。それらをその後、１１１プロモーターの制御下にｐＳＩＬベクターにクローン化した。例として、ＶＭ００６を模倣するｓｈＲＮＡ ＶＩＲＯＭＩＲをコードするように設計した二本鎖ＤＮＡ挿入物を下に示す（ループ配列をカッコ内に、ターミネーターは斜体）：
Figure 0005078904
当業者は、転写される場合に，該コードされるＲＮＡが、細胞ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｃｒタンパク質により修飾されて活性のＶＩＲＯＭＩＲ ＲＮＡ二重鎖（１種若しくは複数）を生成するヘアピン構造にフォールディングすることを認識するであろう。当業者はまた、該ｓｈＲＮＡ構築物の設計の多数の変動を考慮し得ることも認識するであろう。これらは、限定されるものでないが、ｓｈＲＮＡ二重鎖成分（ガイド鎖、パッセンジャー鎖、前駆体）の長さ、配列および向き、ループの長さおよび配列、プロモーターの選択、イニシエーターおよびターミネーターの配列、ならびに最終構築物に集成するのに使用されるクローニング戦略を挙げることができる。
これらのｓｈＲＮＡ構築物のそれぞれを、ｐＮＬ４．３プラスミドとコトランスフェクトすることにより、ＨＥＫ−２９３細胞中で試験した。具体的には、ＨＥＫ−２９３細胞を２×１０＾５細胞の密度で１２ウェルプレート中ウェルあたり１ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地中に播種した。細胞を２４時間後に２００μＬのＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物（Ｏｐｔｉｍｅｍ中で２．７μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と複合体形成した、１００μＬ中の２００ｎｇのｐＮＬ４．３プラスミド、６７ｎｇのＶＩＲＯＭＩＲ ｐＳＩＬ構築物）でトランスフェクトした。２４時間後に培地を変えた後、さらなる２４時間のインキュベーション後の上清の収集によりｐ２４の産生をアッセイした。
ｐ２４の産生は、空の対照プラスミドでトランスフェクトした細胞からの産生のパーセントとして表した。図７に示すとおり、ＨＩＶはｓｈＲＮＡの形態のＶＭ００６の場合に６０％抑制された一方、他の２構築物は検出可能な活性を有しなかった。
多標的干渉ＲＮＡ分子がシードの相補物に対応する配列を含んでなることができることが当業者により認識されるであろう。本実施例では、これらの相補配列は、ＣＵＧＣＵＵＧＡＵ（配列番号１２）、ＵＣＣＵＵＵＣＣＡ（配列番号１３）、ＵＵＵＵＵＣＵＵＵ（配列番号１４）、ＵＵＣＵＧＡＵＧＵＵＵ（配列番号１５）、ＵＣＵＵＣＣＵＣＵＡＵ（配列番号１６）、ＵＧＧＵＡＧＣＵＧＡＡ（配列番号１７）、ＣＵＵＵＧＧＵＵＣＣＵ（配列番号１８）、ＣＵＡＣＵＡＡＵＧＣＵ（配列番号１９）、ＵＣＣＵＧＣＵＵＧＡＵ（配列番号２０）、ＡＵＵＣＵＵＵＡＧＵＵ（配列番号２１）、ＣＣＡＵＣＵＵＣＣＵＧ（配列番号２２）、ＣＣＵＣＣＡＡＵＵＣＣ（配列番号２３）、ＣＵＡＡＵＡＣＵＧＵＡ（配列番号２４）、ＵＵＣＵＧＵＵＡＧＵＧ（配列番号２５）、ＧＣＵＧＣＵＵＧＡＵＧ（配列番号２６）、ＡＣＡＵＵＧＵＡＣＵＧ（配列番号２７）、ＵＧＡＵＡＵＵＵＣＵＣ（配列番号２８）、ＡＡＣＡＧＣＡＧＵＵＧ（配列番号２９）、ＧＵＧＣＵＧＡＵＡＵＵ（配列番号３０）、ＣＣＣＡＵＣＵＣＣＡＣ（配列番号３１）、ＵＡＵＵＧＧＵＡＵＵＡ（配列番号３２）、ＣＡＡＡＵＵＧＵＵＣＵ（配列番号３３）、ＵＡＣＵＡＵＵＡＡＡＣ（配列番号３４）を含んでなることができる。
アルツハイマー病に関係する遺伝子産物のマルチターゲッティング
いくつかの場合には、目的の標的の最低１種に対応する複数の転写物バリアントを包含することが有益でありうる。例えば、プレセニリン−１、およびＢＡＣＥ−１の４種のバリアントアイソフォームの下方制御は、アルツハイマー病の処置に治療上有利であり得る
。この場合、５種の対応する配列の検査が、
ＡＴＡＴＧＡＴＡＧＧＣ（配列番号３３１）、ＡＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡ（配列番号６６）、ＧＣＣＡＴＡＴＴＡＡＴＴ（配列番号３３２）、ＡＧＣＣＣＡＧＡＧＧＧ（配列番号６８）、ＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡ（配列番号３３３）、ＴＣＴＧＴＡＴＡＡＡＴＡ（配列番号３３４）およびＧＡＡＴＴＴＴＧＧＴＧ（配列番号３３５）を包含する１１および１２ｂｐ同一の数種の候補シードを生じる。これらから、適切な二次的特徴（鎖負荷バイアス、継続的部分的同一性、配列の複雑さなど）を有するものが、アルツハイマー病の処置で有用なＣＯＤＥＭＩＲの設計のためとりわけ興味深いとみられる。
多標的干渉ＲＮＡ分子（ＣＯＤＥＭＩＲ）がシードの相補物に対応する配列を含んでなることができることが当業者により認識されるであろう。本実施例では、これらの相補配列は、ＧＣＣＵＡＵＣＡＵＡＵ（配列番号５８）、ＵＧＧＵＧＣＣＵＧＣＵ（配列番号５９）、ＡＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＣ（配列番号６０）、ＣＣＣＵＣＵＧＧＧＣＵ（配列番号６１）、ＵＵＣＵＵＣＣＵＣＡＵ（配列番号６２）、ＵＡＵＵＵＡＵＡＣＡＧＡ（配列番号６３）およびＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＣ（配列番号６４）である。
ＣＯＤＥＭＩＲの設計でのゆらぎおよび不適正の使用
シードの長さは、いくつかの場合に、必須のマルチターゲッティングが発生することを可能にするために短縮されうる。しかしながら、これらの場合に、これらの短いシードの選択を、同定されるシード近くに並置されたさらに同一の領域を有するものに制限することが望ましい。例えば、ＶＥＧＦ−ＡおよびｂＦＧＦのターゲッティングは、ＡＡＴＧＴＴＣＣＣＡＣＴＣＡ（ＶＥＧＦ−Ａ）（配列番号３３６）およびＡＡＴＧＴＴＣＡＧＡＣＴＣＡ（ｂＦＧＦ）（配列番号３３７）に結合することが予測されるとみられるＣＯＤＥＭＩＲガイド鎖の設計により達成し得る。この例では、このさらなる同一の領域が短いＡＣＴＣＡ（配列番号３３８）シードを補償しうる。
あるいは、シードは、標的とＣＯＤＥＭＩＲガイド鎖の間のゆらぎ塩基対形成に対応するとみられる不適正を包含し得る。この状況で、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対形成を、数種の標的転写物への予測される結合を伴うＣＯＤＥＭＩＲガイド鎖の５’領域を設計するのに利用し得る。表８−１で、ＶＥＧＦ−Ａ、ＩＣＡＭ−１、ＰＩＧＦおよびＩＧＦ−１を標的とするＣＯＤＥＭＩＲの５’領域は、対応する標的ｍＲＮＡの適するシード（ＣＣＴＧＧＡＧ）（配列番号３３９）に由来する。
Figure 0005078904
ＣＯＤＥＭＩＲ中の許容される不適正のさらなる場合を該シードの第一の塩基の状況で検査した。この位置の不適正の許容性は、ＣＯＤＥＭＩＲの多標的の性質を大きく高める
とみられる。例えば、２標的が同一のシードを共有するがしかし第三の標的が第一のシード位置に不適正を有する状況で、第三の標的に対するこの不適正にもかかわらず活性を維持することは、ＣＯＤＥＭＩＲ活性のレパートリーを高める。この位置の柔軟性は、活性にまた影響しうる鎖負荷バイアスを調節するという目標をもつＣＯＤＥＭＩＲガイド鎖の５’末端の修飾もまた可能にする。標的とのガイド鎖の５’不適正を伴うＣＯＤＥＭＩＲの有効性をＣＯＤＥＭＩＲ １３ないし１５で検討した（表８−２）。図６に示されるこれらの結果は、単一不適正をもつＣＯＤＥＭＩＲが標的に対する活性を保持することを示す。
Figure 0005078904
多標的干渉ＲＮＡ分子（ＣＯＤＥＭＩＲ）がシードの相補物に対応する配列を含んでなることができることが当業者により認識されるであろう。ＶＥＧＦ−ＡおよびｂＦＧＦの発現を変えるためのＲＮＡ分子の例において、ガイド鎖はＵＧＡＧＵＮＮＧＡＡＣＡＵＵ（配列番号７２）（式中Ｎはいずれかの塩基である）を含み得る。ＶＥＧＦ−Ａ、ＩＣＡ
Ｍ−１、ＰＩＧＦおよびＩＧＦ−１のいずれかの組合せの発現を変えるためのＲＮＡ分子の例において、シードＣＣＵＧＧＡＧ（配列番号７５）に対する相補配列はＣＵＣＣＡＧＧ（配列番号７４）を含んでなる。
ウイルスおよび疾患に関係する宿主タンパク質の共抑制
感染性疾患の場合、ＣＯＤＥＭＩＲは、感染性病原体のゲノムおよび該疾患の１種若しくはそれ以上の重要な宿主「駆動体」双方を標的とするのにもまた利用し得る。例えば、ＴＮＦ−αは、Ｃ型肝炎ウイルス感染およびその続発症において主要な疾患関連因子と考えられる。ＨＣＶのゲノムおよびＴＮＦ−α ｍＲＮＡ配列の分析を使用して、ＣＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡ（配列番号３５１）、ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＡＣ（配列番号３５２）、ＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧ（配列番号３５３）およびＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡ（配列番号３５４）よりなるシードを同定した。
１．第一のシード、ＣＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡ（配列番号３５１）は遺伝子型１ａ／１ｂ単離物の１５５種の入手可能な配列で高度に保存され（９２％）、そして、従って治療的観点から魅力的な標的配列であることが見出された。
遺伝子の情況に関して、該シードはＨＣＶの５’ＮＴＲおよびＴＮＦαのＯＲＦ中にある
Figure 0005078904
コンセンサス標的部位は、おそらく：
Figure 0005078904
および二重鎖：
Figure 0005078904
であり、予測される結合：
Figure 0005078904
を伴う。
当業者は、この干渉ＲＮＡを、その鎖負荷バイアスおよび安定性を改良するようにさらに改変し得ることを認識するとみられる。これは、ガイド鎖の３’二重鎖区分での修飾塩基（例えばＬＮＡ、２’−Ｆ若しくは２’−Ｏ−メチル）の使用により達成され得（安定性を改良することもまたありそうであるとみられる）、例えば：
Figure 0005078904
式中、太字はＬＮＡ核酸塩基を示す。あるいは、例えば：
Figure 0005078904
（式中、太字は非活性パッセンジャー鎖中の不適正塩基を示す）のような不適正の賢明な導入を使用し得る。あるいは、
Figure 0005078904
（式中、太字は変えられた塩基を示す）のような、ガイド鎖の３’二重鎖部分の塩基の置換およびパッセンジャー鎖の対応する変化を考慮し得る。ガイド鎖の３’端の変化は、おそらく、下に示されるところの標的結合配列で起こるとみられるＧ：Ｕゆらぎを考えれば、活性若しくはハイブリダイゼーションの最少の変化と関連する：
Figure 0005078904
多標的干渉ＲＮＡ分子（ＣＯＤＥＭＩＲ）がシードの相補物に対応する配列を含んでなることができることが当業者により認識されるであろう。本実施例では、これらの相補配列は、ＵＣＣＵＣＡＣＡＧＧＧ（配列番号７８）、ＧＵＧＣＵＣＡＵＧＧＵＧ（配列番号７９）、ＣＣＵＧＧＡＧＣＣＣＵＧ（配列番号８０）およびＵＣＵＣＡＧＣＵＣＣＡＣ（配列番号８１）である。
癌の進行で重要な腫瘍および間質因子の同時マルチターゲッティング。
この概念の一拡張を、数種の組織「区画」が疾患の有害な影響の増強において一緒に作用する数種の疾患の場合に考慮し得る。こうした状況の例は、例えば癌における間質細胞の役割を包含するとみられる。この状況で、間質によるパラクリン因子（例えばＶＥＧＦのような増殖因子）の分泌を阻害することが有利であるとみられる。事実、細胞傷害性化学療法で同時に新生血管系を標的とすることは、結腸直腸癌の症例で有意の臨床的有益性を有する。こうした因子のいくつかはオートクリンの様式でもまた機能し、そして癌細胞は例えばＶＥＧＦおよび他の増殖因子を産生する。また、抗アポトーシスタンパク質（例えばｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ＸＬ）の同時の下方制御は、より大きな抗癌活性を可能にしうる。従って、ＶＥＧＦ−Ａ、Ｋ−ｒａｓ、ＥＧＦＲおよびｂｃｌ−２を標的とするＣＯＤＥＭＩＲはかなり興味深いとみられる。全部のこれらの標的に共通のシードの一例がＣＣＣＡＣＴＧＡと同定された。本実施例では、相補配列はＵＣＡＧＵＧＧＧ（配列番号７６）である。
ＶＥＧＦ、Ｂｃｌ−２およびＫ−Ｒａｓのより制限されたサブセットのｍＲＮＡ配列に共通のシードが、ＧＡＣＡＧＴＧＧＡ、ＣＴＡＴＴＣＴＧおよびＴＡＧＡＧＡＧＴＴと同定された。これらのシードに相補的な配列は、ＵＣＣＡＣＵＧＵＣ（配列番号９２）、ＣＡＧＡＡＵＡＧ（配列番号９３）およびＡＡＣＵＣＵＣＵＡ（配列番号９４）である。
８種のＣＯＤＥＭＩＲの組（ＣＣ０１４〜ＣＣ０２１）を後者の３種のシードから設計した。この初期のおよび予備実験で、ＣＯＤＥＭＩＲの設計は，最終的に開発されたガイドラインに必ずしも従っていなかった。例えば、シード結合領域の位置決めは、ガイド鎖の５’端に近位の領域に必ずしも拘束されなかった。全３種の標的への予測される結合を表１０−１に示す。
最終の設計ガイドラインに従い、これらのＣＯＤＥＭＩＲの１種（ＣＣ０１４）が、パッセンジャー鎖に関してガイド鎖のそのＧ／Ｃ豊富な５’末端のため、負荷の低下された見込みに基づき至適に及ばないことが予測されるとみられる。ＣＣ０１５は、該シードを特徴とする２種の結合部位の存在のため、Ｋ−ｒａｓのターゲッティングにとりわけ興味深かった。これらのＣＯＤＥＭＩＲの全部を合成し、そして評価の一部として全３種の標的に対し試験した。
２種の結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０を抗癌ＣＯＤＥＭＩＲの評価に使用した。細胞を９６ウェルプレートのウェルあたり４０００細胞でプレーティングした。トランスフェクションは、ウェルあたり０．２〜０．３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００および４０ｎＭの最終濃度を生じるのに十分なｄｓＲＮＡを使用して２４時間後に実施した。トランスフェクション効率を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅアッセイ（ＣＴＢ）を使用して、擬似および不活性対照に関して細胞生存に対するｓｉＴＯＸ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎからの細胞傷害性ｓｉＲＮＡ）の影響を測定することにより評価した。
全部の癌のＣＯＤＥＭＩＲをその後、このアッセイを使用して、細胞生存に対する影響についてスクリーニングした。簡潔には、トランスフェクション８時間後に血清含有培地を除去し、そしてＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）と交換した。これが非特異的（ｓｉＧＣ４７）細胞死に対する特異的（ｓｉＴＯＸ）の分離において該アッセイの動的ウィンドウを改良することをわれわれが見出したためである。血清除去および回復について異なる時間を試験した。至適のプロトコルは、１６時間の血清の除去、次いで１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中の４８時間の回復期間であるようであった。生存をトランスフェクション７２時間後に測定した。このアッセイを使用して、ＨＣＴ１１６細胞の生存に対する全部の癌のＣＯＤＥＭＩＲの効果を測定した（図８）。Ｋ−Ｒａｓ若しくはＢｃｌ−２を標的とするよう特別に設計したｓｉＲＮＡでのトランスフェクションは、欠乏させない細胞に比較して血清を欠乏させた細胞の生存に対するより大きい影響を有した。いくつかの種（ヒト、げっ歯類）で活性をもつＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ、ＰＶＥでのトランスフェクションは、非ターゲッティングｓｉＲＮＡ、ｓｉＧＣ４７に関して、これらの条件のいずれの下でもＨＣＴ１１６細胞の生存に影響を及ぼさなかった。癌のＣＯＤＥＭＩＲのうちＣＣ０１５がとりわけ、双方の条件下で細胞生存を低下した。
Figure 0005078904
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ＨＣＴ１１６細胞中のＢｃｌ−２の豊富さをＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびウエスタンにより測定した。このタンパク質のシグナルは比較的弱く、そしてウエスタンブロッティングにより測定される場合に、Ｂｃｌ−２特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＢｃｌ２）でトランスフェクトしたＨＣＴ−１１６細胞について認識可能なノックダウンを検出し得たのみであった。ＣＯＤＥＭＩＲ若しくはなおｓｉＢｃｌ２のいずれの影響も、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して検出されなかった。
ＣＯＤＥＭＩＲ、ＣＣ０１４〜ＣＣ０２１でのトランスフェクション後のＫ−Ｒａｓの豊富さを、ウエスタンによりＨＣＴ１１６細胞抽出液で測定した（図９）。ＣＣ０１５は、Ｋ−ｒａｓ特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＫＲａｓ）に類似のレベルまでＫ−Ｒａｓを低下させた一方、ＣＣ０２０およびＣＣ０２１もまた何らかの影響を有した（図９）。
ＨＣＴ−１１６細胞によるＶＥＧＦ産生は、ＡＲＰＥ細胞でＣＯＤＥＭＩＲ−１（ＡＭ００１）の効果を測定するのに使用した同一のＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。ＨＣＴ１１６細胞は、ＥＬＩＳＡにより測定されるところの中程度のレベルのＶＥＧＦ（４０００細胞／ウェルで播種した場合に４８時間で約２００ｐｇ／ｍＬ）を産生する。ＣＯＤＥＭＩＲ、ＣＣ０１５、ＣＣ０１９、ＣＣ０２０およびＣＣ０２１は全部、ＨＣＴ１１６細胞によるＶＥＧＦの産生の低下をもたらした。最も顕著な影響は、未トランスフェクト細胞に比較して約５５％低下をもたらしたＣＣ０１９により引き起こされた（図１０）。Ｋ−ｒａｓに対してもまた抑制活性を有したＣＣ０１５はＶＥＧＦを約２０％低下させた。
アネキシンＶおよびＰＩ染色、次いでＦＡＣＳ分析を使用して、多様なｓｉＲＮＡおよびＣＯＤＥＭＩＲでのトランスフェクション後のＨＣＴ１１６細胞でのアポトーシスを分析した。アネキシンＶについて陽性かつヨウ化プロピジウム（ＰＩ）について陰性の細胞は初期アポトーシスを受けている細胞であるとみなされる。このアッセイを使用して、ＨＣＴ１１６（図１１）およびＳＷ４８０（データは示されない）細胞への数種の癌のＣＯＤＥＭＩＲのトランスフェクション後の死細胞（ＰＩ陽性）およびアポトーシス細胞の数を測定した。ｓｉＴＯＸ、ｓｉＢｃｌ２およびｓｉＫＲａｓはそれぞれ、ＨＣＴ１１６細胞でアネキシンＶ結合の顕著な増大を引き起こした一方、別のＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡはわずかな増大を引き起こしたのみであった（図１１）。ＣＣ０１５でのＨＣＴ１１６細胞のトランスフェクションは、ＫＲａｓおよびＢｃｌ２特異的ｓｉＲＮＡのものに類似のアネキシンＶ結合をもたらした。ＣＣ０１５は、ｓｉＫＲａｓでのトランスフェクションがそうであったように、ＳＷ４８０細胞中でのアネキシンＶ結合もまた増大させた（データは示されない）。
カスパーゼ３／７活性化アッセイ（カスパーゼ基質を用いるＦＡＣＳ染色）を、ＣＣ０１５でのトランスフェクション後のＨＣＴ１１６細胞でのアポトーシスの様式へのより多くの洞察を得るために実施した。ｓｉＫＲａｓ、ｓｉＴＯＸ若しくはＣＣ０１５でのトランスフェクション後にカスパーゼ活性化の顕著な増大は存在しなかった（データは示されない）。
ソフトアガーに基づく足場非依存性増殖アッセイは、アガー中でコロニーを形成する細胞の能力がｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を形成するその能力に結び付けられることをそれが示したため、興味深い。細胞をトランスフェクトしかつ２４時間後に収集し、その点で各処理からの細胞を計数しかつ６ウェルプレート中で０．４％低溶融アガロース中に再プレーティングした、慣習的ソフトアガーアッセイを実施した。トランスフェクション７日後に生じたコロニーを顕微鏡下で計数した。ＨＣＴ１１６細胞で、ＣＣ０１５はｓｉＫＲａｓおよびｓｉＢＣｌ−２よりなおより大きい程度までのコロニー形成の低下で非常に有用であった一方、ＣＣ０１８、ＣＣ０１９、ＣＣ０２０およびＣＣ０２１は、非ターゲッティングｓｉＲＮＡ、ｓｉＧＣ４７に関してコロニー形成に対する明らかな影響を有しなかった（図１２）。ＳＷ４８０細胞中で、ＣＣ０１５でのトランスフェクションもまた、コロニーを形成する細胞の能力を顕著に低下した一方、ＣＣ０１９、ＣＣ０２０およびＣＣ０２１は影響を有しなかった（データは示されない）。
全体として、われわれは、Ｂｃｌ−２、Ｋ−ｒａｓおよびＶＥＧＦのｍＲＮＡ中で見出
されるシードを使用して設計したＣＣ０１５が、Ｋ−ｒａｓおよびより小さい程度までＶＥＧＦを抑制することが可能であったことを見出した。ＣＯＤＥＭＩＲ−１で実施したわれわれの実験と一致して、しかしながら、３個の不適正塩基の上流のガイド鎖のシード結合領域を有することが、Ｂｃｌ−２の抑制に至ることを期待し得なかったことが明らかとなった。同様に、この標的に関してのＣＣ０１６〜１８のシード結合領域の位置決めは至適に及ばなかった。しかしながら、Ｂｃｌ−２を測定することでの技術的問題は、われわれがＢｃｌ−２に対する可能な影響を除外し得ないことを意味している。癌のＣＯＤＥＭＩＲ、ＣＣ０１５は、ＨＣＴ−１１６およびＳＷ４８０細胞で細胞死を誘導するがしかし非癌細胞株ＡＲＰＥ−１９で誘導しないことが見出された（データは示されない）。ＣＣ０１５はソフトアガーでのコロニー形成もまた顕著に阻害した。表１０−２はＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０細胞でのＣＣ０１５の影響を要約する。
多標的干渉ＲＮＡ分子（ＣＯＤＥＭＩＲ）がシードの相補物に対応する配列を含んでなることができることが当業者により認識されるであろう。本実施例では、これらの相補配列は、ＵＣＣＡＣＵＧＵＣ（配列番号９２）、ＣＡＧＡＡＵＡＧ（配列番号９３）およびＡＡＣＵＣＵＣＵＡ（配列番号９４）である。
Figure 0005078904
最低１種の標的が非コードＲＮＡである場合のマルチターゲッティング
われわれはタンパク質標的をコードするｍＲＮＡを標的とすることに関する多くの実施例を上に提示するとは言え、該概念は非コードＲＮＡに等しく適用可能である。癌および他の疾患において、ＭＡＬＡＴ−１、ＢＩＣ、ＰＣＧＥＭ１、ＤＤ３およびＢＣ２００のような非コードＲＮＡが、より攻撃的な進行およびより悪い患者転帰と関連することが示されている。これらの数種若しくは全部に共通なシードを標的とすることをＣＯＤＥＭＩＲの設計で考慮し得る。（例えばミクロＲＮＡ、プレおよびプリミクロＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡなどのような）他の非コードＲＮＡを等しく考慮し得る。
２種の癌関連非コードＲＮＡ分子、ＭＡＬＡＴ−１およびＢＩＣを標的とするよう設計したＣＯＤＥＭＩＲの場合、例示的１シード配列はＧＧＴＧＣＧＡＧＣＧＴ（配列番号３
９３）である。
該２種の標的ＲＮＡ配列中のこのシードの遺伝子の情況に関係して見られる場合：
Figure 0005078904
適するコンセンサス標的部位を、本発明の別の場所に提供される方法を用いて容易に生成し得ることが明らかである。シードの３’端近くのＧ／Ｃ豊富な領域のため、二重鎖多標的干渉ＲＮＡの活性（ガイド）鎖の５’端は、このＧ／Ｃ領域から離れて移動されることが必要であるとみられるとは言え、シードの５’伸長（所望のオーバーハングを除き）中のＧ／Ｃ領域の存在はこれらの影響の軽減において補助するとみられる。候補コンセンサス配列は（シ―ドに下線を付けかつ太字にする）：
Figure 0005078904
であり得、生じる二重鎖は例えば：
Figure 0005078904
である。
このＣＯＤＥＭＩＲのガイド鎖は、後に続くところの２標的への予測された結合を有する（ＲＮＡｈｙｂｒｉｄ）：
Figure 0005078904
多標的干渉ＲＮＡ分子がシードの相補物に対応する配列を含んでなることができることが当業者により認識されるであろう。本実施例で、この相補配列はＡＣＣＣＵＣＧＣＡＣＣ（配列番号８６）である。
肺線維症の処置若しくは予防のためのＣＯＤＥＭＩＲ
肺線維症は、頻繁に、肺傷害（煙の吸入、肺炎、外傷など）の続発症として観察される。それは、進行性かつほぼ普遍的に致死性である特発性肺線維症における既知の原因なしに発生もまたする。病因論に関係なく、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）系が肺線維症の主要なシグナル伝達経路であるようであるとは言え、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１のような他の因子もまたある役割を演じることがありそうである。ＴＧＦｂ、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１を標的とするＣＯＤＥＭＩＲを探索した。これらのｍＲＮＡの３’ＵＴＲを他の実施例で記述されるとおりにこの検索で使用した。ＩＬ−８およびＴＧＦｂに共通の１種のシードがＣＵＵＣＡＡＣＡＣ（配列番号８９）と同定された。２種のコンセンサス標的配列を、これら２標的の整列したｍＲＮＡ配列から眼により設計した。表１２−１に示されるとおり、該２標的の相補性のバイアスをＰＦ００７およびＰＦ００８について逆転させた。すなわち、コンセンサス標的配列は、１つの場合にＩＬ−８により類似に作成し（ＰＨ００７）、および第二のものでＴＧＦ−βにより類似であった（ＰＦ００８）。本発明の多標的干渉ＲＮＡの設計のこの局面は、１種若しくはそれ以上の標的ＲＮＡに対する多標的干渉ＲＮＡの活性の滴定を可能にすることが当業者により見られるであろう。この例において、ＰＦ００７およびＰＦ００８は、４０ｎＭのｄｓＲＮＡおよびリポフェクタミンを用いるトランスフェクション４８時間後にＥＬＩＳＡによりアッセイされる場合に、Ａ５４９細胞によるＴＧＦｂ分泌の約５０％低下を伴い、ＴＧＦｂに対する類似の活性を有した。対照的にＩＬ−８分泌はＰＦ００８およびＰＦ００７でそれぞれ８０％および３５％抑制された。従って、これら２種のＣＯＤＥＭＩＲは肺線維症の処置に潜在的に有用であることが期待されるとみられる。それらは鎖負荷を増大させるようにもまたさらに改良し得る。ガイド鎖の５’末端の塩基がＧであることを考えれば、パッセンジャー鎖で使用される対応する塩基は、より弱いゆらぎ塩基対形成を提供するようにＵであった。しかしながら、当業者は、限定されるものでないがガイド鎖の３’端への付加的なＣ若しくはＧ、ガイド鎖の５’端への付加的なＡ若しくはＵ、または双方の包含を挙げることができる付加的な改変を予見し得ることを理解するとみられる。対応するパッセンジャー鎖でこれらを一致させることは、それらの機能的活性に対するいかなる有害な影響も必ずしも伴わずに負荷バイアスをさらに向上させるとみられる。
Figure 0005078904
ＩＬ−８およびＭＣＰ−１中のＧＵＵＧＵＧＧＡＡのシードを標的とするＰＦ０１８を包含する他の活性のＣＯＤＥＭＩＲが見出された。ガイド配列ＵＵＣＣＡＣＡＡＣＡＣＡＡＧＣＵＧＵＧＵＵ（配列番号１３５）を伴うこのＣＯＤＥＭＩＲは、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１分泌をそれぞれ４５％および６０％抑制した。ＣＯＤＥＭＩＲ ＰＦ０１８二重鎖は後に続くとおりである：
Figure 0005078904
多標的干渉ＲＮＡ分子がシードの相補物に対応する配列を含んでなることができることが当業者により認識されるであろう。本実施例で、これらの相補配列はＧＵＧＵＵＧＡＡＧ（配列番号８８）およびＵＵＣＣＡＣＡＡＣ（配列番号９０）である。
ＨＣＶの処置のためのＣＯＤＥＭＩＲ
ＬＡＮＬデータベースから入手可能な１５５種のクレード１ａおよび１ｂのＨＣＶゲノム配列の最低１種に最低２回存在する全部の可能な６、７、８、９、１０、１１および１２ｍｅｒのシードを生成した。
これらは
シード長さ シード数
６ ４０１２
７ １０６８３
８ １１３５２
９ ５９４２
１０ ２２６７
１１ ７２５
１２ ２３６
のように分類する。
これは合計３５２１７種の配列である。
同定された組からのシードの１種は５’−ＧＴＣＴＴＣＡＣＧ−３’（配列番号４０１）であった。このシードはＨＣＶ １ａ／１ｂ遺伝子型配列中のその高保存に基づき選択した。事実、それは１５５種の１ａ／１ｂ単離物の１５４種の配列中で最低１回見出された（９９％の保存）。他の遺伝子型（１ａ−６ａ）に対し検査した場合に、それは単離物の９７％で最低１回見出された。このシードの他の重要な機能はその高分布すなわち大部分の配列中で１回以上存在することである。１５５種の単離物に関するこの分布は後に続くとおりである：
ゲノム中４回：５／１５５単離物
ゲノム中３回：６８／１５５単離物
ゲノム中２回：５０／１５５単離物
ゲノム中１回：３１／１５５単離物
さらなる選択基準は、このシードがヒトトランスクリプトームの３’ＵＴＲ部分にまれにのみ存在することであり、このシードが宿主組織に対する広範な非特異的影響を生成することがありそうにないとみられることを示した。
このシードは、しかしながら３’末端でＧ／Ｃ豊富であり、その結果、相補ガイド配列は、二本鎖多標的干渉ＲＮＡの情況で、ガイド鎖がこの配列に完全に相補的であるはずでありかつパッセンジャー鎖の３’末端が同様にＧ／Ｃ豊富でなかった場合に、負荷されることがありそうにないとみられる。
下に示される代表的単離物中のシードの遺伝子の情況を、負荷バイアスを調節するため
の戦略を考案するのに使用した。
Figure 0005078904
遺伝子の情況の検査により、相補配列（請求の範囲の定義によりＳ）がＵＵの付加を伴い５’の方向に伸長して、それにより候補ＸＳ配列：５’−ＵＵＣＧＵＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号４０６）を生成し得ることが明らかである。
この候補ＸＳ配列を含有する全部の可能な２１ｂｐの配列を生成した。各推定の完全長ＸＳＹ配列をその後、二本鎖多標的干渉ＲＮＡの情況でＲＩＳＣ複合体に負荷されるガイド鎖を有することがありそうであるとみられるＸＳＹ配列に有利にはたらくことをその負荷バイアスについて試験した。これは、各ＸＳＹ配列の５’末端の５塩基および３’末端の５塩基の塩基組成を検査すること、ならびに以下の表に従ってそれらに点数を付けることにより達成した：
Figure 0005078904
５’末端の５塩基に関する３’末端の５塩基の点数の総和の比が１．２未満であった全部の推定の完全長ＸＳＹ配列を廃棄した。加えて、５個若しくはそれ以上のＧヌクレオチドの連続する一続きを含有したいかなるＸＳＹ配列もまた廃棄した。ＸＳＹ配列の生じる初期の組は４２２８４８配列を含有した。ＲＮＡｈｙｂｒｉｄプログラム［Ｈｏｆａｃｋｅｒ、（２００３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１：３４２９−３１］をその後使用して、代表的ＨＣＶ株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＢ０４９０９２）の４種の遺伝子の情況のそれぞれに対するこれらの４２２８４８配列のそれぞれの結合パターンを決定した。ＲＮＡｈｙｂｒｉｄ解析は、位置３ないし１１の各遺伝子の情況へのＸＳ配列（ＵＵＣＧＵＧＡＡＧＡＣ）（配列番号４０６）の正確な結合を必要とした。結合パターンのそれぞれについて、最小自由エネルギー（ｍｆｅ）、および連続する完全に相補的な配列の最大長さを使用して、以下のアルゴリズム：
スコア＝（ＸＳＹ配列のｍｆｅ×連続する相補性の長さ×１００）／（その遺伝子の情況での完全に相補的な配列のｍｆｅ×２１）
に従って、相対結合スコアを生成した。
４種の遺伝子の情況にわたる各ＸＳＹ配列の平均スコアをその後決定した。４２２８４８配列から、上位１００位の平均スコアにある、若しくは該４種の遺伝子の情況の少なくとも３種で＞４０というスコアを有するという基準を満足した１８３種の潜在的ＸＳＹ配列を、さらなる分析に考慮した。上述されたＲＮＡｈｙｂｒｉｄおよび得点分析を使用して、全１５５種のクレード１ａ／１ｂ単離物の４種の遺伝子の情況の配列（６２０配列）に対する１８３種の選択したＸＳＹ配列の結合パターンを分析した。この分析で、ＸＳ配列（ＵＵＣＧＵＧＡＡＧＡＣ）（配列番号４０６）の正確な結合は必要とされなかった。
スコア≧５０という基準を使用して、６２０種の遺伝子の情況全体でスコア≧５０の最大数を与えたＸＳＹ配列を選択した。この場合、６２０種の遺伝子の情況の１４７種に、それぞれが５０≧のスコアを与えた９種のＸＳＹ配列が存在した。これら９種のＸＳＹ配
列は：
Figure 0005078904
である。
全９種のＸＳＹ配列が各遺伝子の情況で非常に類似の結合パターンを有した。すなわち、下の表１３−２に示される列２および３は、４種の遺伝子の情況への９種のＸＳＹ配列の６種の可能な結合パターンを表す。
Figure 0005078904
ＶＩＲＯＭＩＲの他の構築を、一例として上に示された９種の配列の第一のものすなわち５’−ＵＵＣＧＵＧＡＡＧＡＣＧＧＵＧＧＧＣＣＧＡ−３’（配列番号１３９）を使用して下に示す。
完全に相補的な二重鎖として、上の鎖はパッセンジャー鎖に関してそれに好都合な負荷バイアスを有することが予測されるとみられる。例示的オーバーハングの付加を伴い、最終的な候補ＨＣＶ ＶＩＲＯＭＩＲは、以下の式：
Figure 0005078904
を有し得る。
多標的干渉ＲＮＡ分子がシードの相補物に対応する配列を含んでなることができることが当業者により認識されるであろう。本実施例で、この相補配列はＣＧＵＧＡＡＧＡＣ（配列番号９８）である。
化学修飾Ｃｏｄｅｍｉｒ
ｄｓＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏで制限された安定性を有するため、安定性および活性を改良するために多標的干渉ＲＮＡを化学修飾することが望ましいことがあることが当業者により十分に理解される。多標的干渉ＲＮＡに対するいかなる化学修飾も本発明の範囲内にある。制限しない一例として、われわれはＣＯＤＥＭＩＲ−１（ＡＭ００１としてもまた知られる）の情況内での２’−Ｆ修飾ヌクレオチドの使用を考慮した。修飾ＣＯＤＥＭＩＲの安定性を検討するため、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ若しくはＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ １いずれかの蛍光色素を使用して、１０％ヒト血清中でＣＯＤＥＭＩＲの分解を評価した。これら、とりわけＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ １はｄｓＮＲＡに貪るように結合して高められた蛍光を生じる。従って、１０％ヒト血清若しくは他の生物学的溶液中でのｄｓＲＮＡのインキュベーションの間の蛍光のモニタリングは、安定性の容易なモニター方法を生じる。産生される分解の生成物の存在をさらに解明するため、ＣＯＤＥＭＩＲ−１および化学修飾アナログ（一方若しくは双方の鎖をすべてのＣおよびＵ位置で２’−Ｆ修飾した）を１０％血清中で３０分間インキュベートしそしてＰＡＧＥにより分離した。未修飾二重鎖ＲＮＡは実質的な分解を表し、そしておそらく完全に不活性であった。対照的に、双方の鎖を２’−フルオロ修飾した二重鎖ＲＮＡは分解を全く表さず、蛍光アッセイで観察された結果に良好に対応する（データは示されない）。単一の鎖のみを修飾した２種の二重鎖は、二重鎖（おそらく完全長の修飾鎖と部分的に分解された未修飾鎖の間のハイブリッド）に不完全に分解されるようであった。この分解生成物は大きく低下された活性を有することがありそうであるとみられるため、蛍光アッセイで分解を示さない構築物のみが最大活性を保持するとみられることを推論することが合理的と思われる。
しかしながら、それらの対応する２’−Ｆアナログでの全部のピリミジンヌクレオチドの置換は、ＡＲＰＥ−１９細胞によるＶＥＧＦ分泌の抑制により評価される場合に、活性に対しいくぶん有害であった。対照的に、ガイド鎖の類似の修飾は活性を有意に変えなかった。ＲＩＳＣへのガイド鎖の効率的な負荷はパッセンジャー鎖の切断を（いくつかの場合に）必要とするため、われわれはパッセンジャー鎖の２’−Ｆ修飾が鎖負荷を阻害したと仮定した。これを試験するため、ガイドおよび／若しくはパッセンジャー鎖の各ＣおよびＵ位置で２’−Ｆ修飾をもつＣＯＤＥＭＩＲ−１のバリアントを設計した（表１４−１）。とりわけ、パッセンジャー鎖の位置９（ｐｏｓ９）（ＲＩＳＣ負荷の間のパッセンジャー鎖切断に決定的に重要な位置）の改変の影響を検査した。ＡＲＰＥ−１９細胞中のＶＥＧＦ発現を抑制するそれらの能力について試験される場合、パッセンジャー鎖のみを修飾した（すなわちＣＯＤＥＭＩＲ−１４４および８７）ｐｏｓ９−Ｆｌｕｏｒｏおよびｐｏｓ９−ｒｉｂｏバリアントの間で中程度の差違が観察されたとは言え、これは有意でなかった。対照的に、双方の鎖を別の方法で修飾したｐｏｓ９−ｒｉｂｏバリアント（ＣＯＤＥＭＩＲ−１４５）は、比較可能なｐｏｓ９−Ｆｌｕｏｒｏバリアント（ＣＯＤＥＭＩＲ−３３）より有意に（ｐ＜０．０１）より活性であった。未修飾ＣＯＤＥＭＩＲ−１と比較すると、パッセンジャー鎖のみ修飾した（ＣＯＤＥＭＩＲ−８７）ｐｏｓ９−Ｆｌｕｏｒｏバリアントの活性は有意に低下された（ｐ＜０．０１）が、しかしｐｏｓ９−ｒｉｂｏバリアント（ＣＯＤＥＭＩＲ−１４４）はされなかった。
ＣＯＤＥＭＩ−１のｐｏｓ９−ｒｉｂｏおよびｐｏｓ９−Ｆバリアントの安定性を、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ １を使用して１０％ヒト血清中で評価した。ｐｏｓ９−ｒｉｂｏおよびｐｏｓ９−Ｆｌｕｏｒｏバリアントの間の差違は観察されなかった。しかしながら、上で論考されたとおり、単一鎖のみが修飾されている場合の分解の最終生成物が活性を有することはありそうでない。血清のＲＮア―ゼ活性はＲＮアーゼ−Ａ様エンドヌクレアーゼ（１種若しくは複数）による（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ，Ｊ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７１、７０２−７１０）。これらのＲＮアーゼは一本鎖特異的であり、ＣおよびＵ塩基の３’のみを切断し、そして２’−Ｆ修飾により阻害される（Ｋｅｌｅｍｅｎ，Ｂ．Ｒ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９、１４４８７−１４４９４）。従って、血清中の短いＲＮＡ二重鎖の分解のありそうな一モデルは、二重鎖の「呼吸する」端がＲＮアーゼ分解に最も敏感である一方、二重鎖の中央区分はその二重鎖の性質により保護されることである。このモデルを評価するため、各鎖の端のみを２’−Ｆ修飾したＣＯＤＥＭＩＲ−１のバリアントを設計した（表１４−１）。二重鎖領域の端からの３塩基の修飾（ＣＯＤＥＭＩＲ−１６５）は安定性の中程度の改良を生じたが、しかしこれは、３’末端のみを修飾した場合に消失した（ＣＯＤＥＭＩＲ−１６７）。興味深いことに、二重鎖領域の端からの５塩基の修飾（ＣＯＤＥＭＩＲ−１６６）もまた安定性の増大を生じた。しかしながら、ＶＥＧＦ抑制活性について試験した場合、末端修飾したＣＯＤＥＭＩＲの全部がＣＯＤＥＭＩＲ−１に関して（パッセンジャーｐｏｓ９−ｒｉｂｏ塩基を含有する他の２’−Ｆ修飾ＣＯＤＥＭＩＲに対する活性で匹敵する）有意に損なわれた活性を表した（図１３）。
全体として、従って、２’フルオロ修飾は本発明の多標的干渉ＲＮＡの化学修飾に対する実現可能な戦略を表すとはいえ、広範囲の修飾、とりわけパッセンジャー鎖のｐｏｓ−９ヌクレオチドのものは細胞に基づくアッセイで活性を低下させうる。安定性のトレードオフがいくつかの場合には価値があるようではないかも知れないとは言え、脂質に基づく複合体形成がヌクレアーゼによる分解から核酸を保護するため、トランスフェクション試薬（この場合はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）の使用が化学修飾の利益のいくらかを遮蔽しうる。従って、ＣＯＤＥＭＩＲ−１は、（リポフェクションを用いる）細胞スクリーニングアッセイで最も強力なものの１つであった一方、それは血清中で最小の安定性を有した。究極的には、多標的干渉ＲＮＡの差別的活性は、細胞に基づくアッセイにて予測的様式で試験し得る一方、化学修飾の影響は、治療的分子に意図される情況で試験することを必要とするとみられる。
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多様な色素、ファルマコフォア、リガンド、ペプチド、リンカー、複合物、ポリマー、脂質、ペプチドおよび他の分子への核酸治療薬の末端複合を、前記核酸の取り込み、分布、組織ターゲッティング、安定性若しくは生物学的効力を改善若しくはモニターするのに使用し得ることが、当業者により十分に認識されている。大部分の場合、必要とされる複合反応は、脂肪族鎖によってのリン酸エステル結合の形成により実施される。本発明の多標的干渉ＲＮＡに関してのこうした戦略の適合性を検討するため、われわれは、活性ガイド鎖を５’若しくは３’いずれかのオリゴヌクレオチド末端に連結したＣＯＤＥＭＩＲ−１のアナログの生物学的活性を検討した。これらは、ヒドロキシル若しくはアミノ部分、ポリエチレングリコールおよび非塩基糖をもつ脂肪族鎖を連結したリン酸を包含する（ＣＯＤＥＭＩＲ １４６〜１５６；図１４）。これらのＣＯＤＥＭＩＲの全部は、１０ｎＭでＡＲＰＥ−１９細胞にトランスフェクトした場合に高いＶＥＧＦ抑制活性を示し（図１５）、本発明の分子の生物学的活性とのこれらの修飾の適合性を示す。ＣＯＤＥＭＩＲ−１の化学修飾バリアントの安定性（図１７）およびさらなるＲＮＡｉ活性（図１８）もまた分析した。細胞のホスホエステラーゼが細胞内に一旦送達されればリンカーの遊離を引き起こしたこと、および、これがこれらのアナログの高くかつ均一な活性を説明するとみられることが可能かつ実際にありそうである。これは、リンカーの少なくともいくつかを、多標的干渉ＲＮＡが細胞に一旦浸透すればターゲッティング若しくは保護的リガンドが分泌されるプロドラッグのアプローチで使用し得ることを示す。
抗血管新生ＣＯＤＥＭＩＲの評価のためのＡＲＰＥ−１９細胞の使用
ＣＯＤＥＭＩＲ−１は、化学的および配列の改変の影響を試験する原型配列であった。このＣＯＤＥＭＩＲは、湿性形態のＡＭＤならびに黄斑浮腫および糖尿病性網膜症の処置にとりわけ有用でありうる。これは、分泌型ＶＥＧＦ−Ａがこれらの疾患の全部で主要な役割を演じているからである（Ｗｉｔｍｅｒら（２００３）Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ、２２、１−２９）とは言え、ＩＣＡＭ−１の過剰発現は、とりわけ糖尿病性
網膜症および黄斑浮腫の初期の開始事象でありうる（Ｆｕｎａｔｓｕら、（２００５）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、１１２、８０６−１６；Ｊｏｕｓｓｅｎら（２００２）Ａｍ
Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、１６０、５０１−９；Ｌｕら（１９９９）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、４０、１８０８−１２）。われわれは、ＣＯＤＥＭＩＲ−１が、ヒト網膜上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９細胞株）によるＶＥＧＦ−ＡおよびＩＣＡＭ−１双方の産生を抑制する能力を示したことを示した。網膜色素上皮細胞は、これらの眼血管新生疾患におけるこれらのタンパク質の産生への主要な寄与体である（Ｍａｔｓｕｏｋａら、（２００４）Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、８８、８０９−１５、Ｙｅｈら（２００４）、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、４５、２３６８−７３）。ＲＰＥ細胞は眼の外来核酸の主取り込み部位でもまたあり、そしてこれら２つの理由から、抗血管新生ＣＯＤＥＭＩＲの評価の適切な細胞モデルである。２種のオリゴヌクレオチド薬物のｉｎ ｖｉｖｏ活性は、培養物中のＲＰＥ細胞に対するそれらの活性と相関し（Ｇａｒｒｅｔｔら（２００１）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、３、３７３−８３；Ｒａｋｏｃｚｙら（１９９６）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ、６、２０７−１３）、この細胞培養物モデルの価値を示す。この細胞株の一利点は、眼のＲＰＥ層を模倣し（Ｄｕｎｎら、（１９９６）、Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ、６２、１５５−６９）かつ長期間研究し得る分極した単層をそれが形成することである。この特性を使用して、ＡＲＰＥ−１９単層の上清の反復サンプリングによりＶＥＧＦ分泌を評価した（ＩＣＡＭ−１は細胞の収集を必要とするため、この同一の方法でそれは研究し得ない）。ＶＥＧＦ分泌はＣＯＤＥＭＩＲ−１の単回投与後最短９日間抑制された（図１６）。これは、ＣＯＤＥＭＩＲ−１が眼でのＶＥＧＦ産生の永続的阻害を生じさせることが期待されることを示す。
シード領域の不適正はＣＯＤＥＭＩＲ−１活性を損なう
シード結合がＣＯＤＥＭＩＲ活性に不可欠であったことを検証するために、ＣＯＤＥＭＩＲ−１に基づくがしかし標的に対する不適正をシード領域にもつ多数のＲＮＡ二重鎖を設計かつ試験した。これらを、ＢＬＡＳＴを使用してヒトトランスクリプトームと整列し、そして最低の予測されるオフターゲットｓｉＲＮＡ活性をもつ３種の配列を選んだ（ＣＯＤＥＭＩＲ １２２〜１２４）。これらはそれぞれ位置４、４＋６および４＋６＋８の不適正を特徴とする（表１６−１）。これらのＣＯＤＥＭＩＲのそれぞれを、ＡＲＰＥ−１９細胞中のＶＥＧＦおよびＩＣＡＭに対する活性について評価した（図１９）。位置４の不適正はＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ−１双方に対するわずかに損なわれた活性を表した一方、４および６若しくは４＋６＋８の不適正はＶＥＧＦ抑制を大きく低下しかつＩＣＡＭ−１抑制を無効にし、シード結合がＣＯＤＥＭＩＲ活性に重要であることを示す。
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該結果は、シード中の不適正に関するＣＯＤＥＭＩＲのより多いミクロＲＮＡ様、より少ないｓｉＲＮＡ様の質を示した。
ＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ−１ ＲＮＡｉ活性についてのＣＯＤＥＭＩＲ−１の３２種のバリアントのスクリーニング
ガイド鎖の３’尾部の組成が異なるＣＯＤＥＭＩＲ−１の付加的な３２種のバリアントのＲＮＡｉ効力を分析した。ＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ−１標的部位のコンセンサス配列を生成した（ガイド鎖と標的部位の間のゆらぎ塩基対形成を可能にする。すなわち、ＧがＡに同等であることおよびＵがＣに同等であることを可能にする；図２０）。双方の転写物を標的とする３２種（２５）の可能な３’尾部を表すＣＯＤＥＭＩＲを設計した（表１７−１）。これらのＣＯＤＥＭＩＲのそれぞれの４０ｎＭで処理したＡＲＰＥ−１９細胞は、約５０％から約９０％までの範囲にわたるＶＥＧＦ抑制を示した（図２１）。ガイド鎖の位置１３にＶＥＧＦ ｍＲＮＡに対する相補性をもつ（すなわち標的に相補的な１４個の連続する塩基を有する）ＣＯＤＥＭＩＲは、位置１３に不適正をもつもの（標的に相補的な連続する１２塩基）より実質的により有効であり；おそらく位置１３の不適正がＶＥＧＦ ｍＲＮＡのＲＩＳＣに媒介される切断を損なうためである。
ＣＯＤＥＭＩＲ−１結合部位を標的とするｓｉＲＮＡの活性に対する中央の不適正の影響（上）と一致して、ＣＯＤＥＭＩＲはＶＥＧＦの４０％未満の抑制を示さなかった。事実、ＣＯＤＥＭＩＲ−１のシード結合領域の一部を共有するがしかし３’尾部でＶＥＧＦ
ｍＲＮＡに対する相補性をほとんど有しない、合成ミクロＲＮＡ二重鎖（本明細書でＣＯＤＥＭＩＲ−８４と命名されるｈｓａ−ｍｉｒ−２９９）でのＡＲＰＥ−１９細胞のトランスフェクション（表１７−１）もまた、ＶＥＧＦ発現を約４０％阻害した。ＶＥＧＦ抑制のこのレベルは、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡのＣＯＤＥＭＩＲ−１のシード部位に対する完全な相補性を伴い結合するほぼいかなる低分子ＲＮＡによっても誘導される翻訳抑制を表すようである。４０％以上のＶＥＧＦ抑制を表したＣＯＤＥＭＩＲのうち、活性と、相補性の程度（不適正の数と逆相関）および相補的シード領域の長さの双方の間に強い相関が存在した（図２２）。１２塩基の相補的シードをもつＣＯＤＥＭＩＲは、単一不適正（位置１３の）のみを伴ってさえ約７０％の抑制のみを生じた。対照的に、１４塩基の相補的シードをもつＣＯＤＥＭＩＲは強い抑制（約８５％）を生じたが、しかしこれらのＣＯＤＥＭＩＲの活性は３’尾部の残部中の不適正により損なわれた。１７塩基の相補的シード領域をもつＣＯＤＥＭＩＲの全部が高度に活性であり、３’尾部中の不適正は活性に対する影響をほとんど有しなかった。１７塩基より長い相補的シードをもつＣＯＤＥＭＩＲは、いずれかの他の因子とよりも鎖負荷とより緊密に相関するように思われた活性を有した。
ＶＥＧＦ抑制データと対照的に、３２種のＣＯＤＥＭＩＲ−１バリアントをＩＣＡＭ−１抑制活性についてアッセイした場合、５’相補性の長さ若しくは標的に対する不適正の数に関して明確な傾向は識別可能でなかった（図２３）。部分的に、これは、ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡに対する高程度の相補性をもつＣＯＤＥＭＩＲが、活性に有害でありうる連続するグアノシンの長い連続もまた含有した（ＣＯＤＥＭＩＲ−５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６および８０）ためであったかも知れない。これを試験するため、連続するＧを破壊するために（ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡとＧ：Ｕ対形成を形成する）ガイド鎖の位置１４のグアノシンを（ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡとＡ：Ｕ対を生成するために）Ａで置換したＣＯＤＥＭＩＲ−５６および７６のバリアントを設計した。これらのバリアント（ＣＯＤＥＭＩＲ １２０および１２１−表１７−２）は、位置１４にグアノシンを含有するそれらのそれぞれのアナログに比較してＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ−１双方の抑制活性の顕著な増大を示した（図２４）。ＩＣＡＭ−１抑制活性の増大は、（７Ｇモチーフを除去することの直接の影響であるよりはむしろ）ガイド／標的相互作用におけるＧ：Ｕ対の代わりのＡ：Ｕ対の導入に潜在的に帰される。しかしながら、（これらのＣＯＤＥＭＩＲのＶＥＧＦ ｍＲＮＡへの予測される結合がＣＯＤＥＭＩＲ ５６および７６に比較して不変であるという事実にもかかわらず−表１７−２）ＶＥＧＦに対するこれらのＣＯＤＥＭＩＲの活性もまた改善されたという事実は、７ＧモチーフがＣＯＤＥＭＩＲ ５６および７６の活性に有害であったことを示す。
標的ｍＲＮＡに対する実質的な相補性を有するＣＯＤＥＭＩＲの活性を増大させるための可能な一戦略は、決定的に重要な点（全部の転写物に一致し得ずかつＲＩＳＣ切断部位に近い部位）にイノシン塩基を包含することである。ＲＮＡｉ機構によるイノシン塩基に対する許容性を試験するため、ガイド鎖の位置１３、１５若しくは１３および１５にイノシン塩基を包含したＣＯＤＥＭＩＲ−１の３種のバリアントを設計した（それぞれＣＯＤＥＭＩＲ−１００、１０１および１０２；表１７−３）。これらのＣＯＤＥＭＩＲはＣＯＤＥＭＩＲ−１（位置１３に不適正を含有する）に匹敵するＩＣＡＭ−１抑制活性を示したが、しかしＣＯＤＥＭＩＲ−１００および１０２の場合にはＣＯＤＥＭＩＲ−１に関してＶＥＧＦ抑制を低下させた（図２５）。ＩＣＡＭ−１に対する比較可能な活性は、シード結合単独に主として依存する翻訳抑制から生じるとみられ、そして従って３’尾部の変化により影響を受けない。ＣＯＤＥＭＩＲ−１のイノシン含有バリアントのＶＥＧＦ抑制活性は、位置１３、１５若しくは１３および１５にＶＥＧＦ ｍＲＮＡに対する不適正をもつＣＯＤＥＭＩＲ−１の類似のバリアント（ＣＯＤＥＭＩＲ ６８〜７１）ともまた比較した。このアッセイのため、ＡＲＰＥ−１９細胞を、該アッセイのダイナミックレンジを増大させるために１０ｎＭ ＲＮＡ二重鎖でトランスフェクトした。イノシン含有バリアントのいずれも、そのそれぞれの不適正にされたバリアントと比較して実質的に改良された活性を示さなかったとは言え、位置１３にイノシンをもつバリアントは不適正にされたバリアントよりわずかにより活性であった（図２６でＣＯＤＥＭＩＲ−７０をＣＯＤＥＭＩＲ−１００と比較されたい）。にもかかわらず、これらの実験は、イノシン置換をＣＯＤＥＭＩＲの設計で考慮し得ることを示す。
５’相補領域の長さを増大させるための一戦略としてのイノシン含有ＣＯＤＥＭＩＲに対する一代替は、標的若しくはガイド鎖のいずれかでの相補性の長さを増大させるように（標的若しくはガイド鎖いずれか上に）単一塩基対ループを導入することである。２種のこうしたＣＯＤＥＭＩＲ（予測される標的ループをもつ１種（ＣＯＤＥＭＩＲ １０５）およびガイド鎖の位置１４の後に予測されるガイド鎖ループをもつ１種（ＣＯＤＥＭＩＲ
１０６）−表１７−３）を、ＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ−１発現を抑制する能力について試験した（図２７）。興味深いことに、これらのそれぞれはＣＯＤＥＭＩＲ−１（位置１５にＡ：Ａ不適正を有する）に比較して実質的に低下された活性を表した。これは、対称的不適正（ループ）が非対称不適正より良好に許容されることができ、そして潜在的に有用な設計原理であることを示唆する。
複数の標的に対するＣＯＤＥＭＩＲの活性を増大させるための別の戦略は、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中で増大されたハイブリダイゼーション能力を有する化学修飾塩基の包含により３’尾部のハイブリダイゼーション強さを増大させることである。こうした修飾塩基は、とりわけ、ＬＮＡ（ロック核酸）、ＥＮＡ（エチレン架橋核酸）、２’フルオロ、２’Ｏ−メチルおよび２’Ｏ−アルキルリボースを包含する。シード領域中のハイブリダイゼーションの強化もまた予見し得るが、しかしながら、これは鎖負荷バイアスに負に影響しうる。ＣＯＤＥＭＩＲ−１のガイド鎖の位置１６のＧの修飾を、ハイブリダイゼーション、および従ってＣＯＤＥＭＩＲ−１のガイド鎖の尾部の双方の標的への結合の安定性を増大させるための試みで選んだ。この修飾ＣＯＤＥＭＩＲ（ＣＯＤＥＭＩＲ−９９）は位置１６にＬＮＡ塩基で置換されたリボ塩基を有する。ＡＲＰＥ−１９細胞中のＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ−１発現を抑制する能力について試験される際に、このＣＯＤＥＭＩＲはＣＯＤＥＭＩＲ−１に比較可能な活性を表した（図２５）。ＣＯＤＥＭＩＲ−１のイノシン含有バリアント（および一般にＣＯＤＥＭＩＲ−１の大部分のバリアント）でのとおり、比較可能なＩＣＡＭ−１抑制は、ＲＩＳＣに媒介される切断の誘導を伴わずに改良され得ない最大近くの翻訳抑制を反映しうる。再度、しかしながら、この実験は、こうした化学修飾が許容されかつＣＯＤＥＭＩＲの設計で考慮し得ることを示す。ＬＮＡ修飾塩基のような改変は、ガイド鎖のこの部分のパッセンジャー鎖の対応する部分との相互作用を強化してそれにより負荷バイアスを改良するように、候補の多標的干渉ＲＮＡの３’尾部で使用し得る。従って、本発明で予見される修飾核酸の多数の用途が存在する。
該データは、主としてＣＯＤＥＭＩＲ設計の原理に関し、そしてとりわけ、活性ＲＮＡのその標的のそれぞれへの最大のハイブリダイゼーションを得るというアプローチを裏付ける。しかしながら、これらのデータは、完全な相補性が最大活性に必要でない、および、ガイド鎖がシード領域のみに対する完全な相補性を有する場合にさえ該ガイド鎖で有意の活性を得ることができるという事実もまた裏付ける。
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ＶＥＧＦ活性についての複数のシードのスクリーニング
ＣＯＤＥＭＩＲ−１の３２種のバリアントのＶＥＧＦ抑制活性の系統的分析から獲得されたデータ（上）は、標的に対する５’相補性の長さ、ならびに標的に対する全体的相補
性が、とりわけガイド鎖のハイブリダイゼーションがＲＩＳＣに媒介される切断を支援する場合に、ＣＯＤＥＭＩＲ活性の決定的に重要な決定子であることを示した。これらの因子、ならびにＲＩＳＣ中の活性鎖の負荷に関係する因子は、今日まで解明された最も重要なＣＯＤＥＭＩＲ設計基準である。しかしながら、これらの因子は、活性のＣＯＤＥＭＩＲのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ同定に決定的に重要である、活性および不活性のシード部位の間の識別を可能にしない。所定のシード部位でのＣＯＤＥＭＩＲ活性の活性に影響することが期待されうる因子のいくつかは：ｉ）ｍＲＮＡの標的部位での二次構造、ｉｉ）標的部位の最後の位置のアデノシン（すなわちガイド鎖の最初の位置のウラシル−天然に存在するミクロＲＮＡはこの対形成に対する好みを有する）、およびｉｉｉ）標的ｍＲＮＡ中のシード部位の数（すなわち標的中のガイド鎖結合部位の数）である。これらの因子を評価するため、特徴：１）自由な標的二次構造、最初のＡなしかつ単一部位のみ（ＣＯＤＥＭＩＲ １０８〜１１０）、ｉｉ）自由な標的二次構造、最初の１個のＡおよび単一部位のみ（ＣＯＤＥＭＩＲ １１１〜１１３）、ｉｉｉ）自由でない標的二次構造、最初の１個のＡおよび単一部位のみ（ＣＯＤＥＭＩＲ １１４〜１１６）、ならびにｉｖ）自由でない標的二次構造、最初の１個のＡおよび２部位（ＣＯＤＥＭＩＲ １１７〜１１９）を有したシード部位をもつ１２種のＣＯＤＥＭＩＲを設計した（表１８−１）。これらのＣＯＤＥＭＩＲのガイド鎖上の異なる３’尾部から生じる複雑な状態を排除するため、好都合な鎖負荷の特徴を有しかつＶＥＧＦの翻訳抑制を支援するＣＯＤＥＭＩＲ−８４からの配列（ｍｉＲ−２９９）を使用して、均一な３’尾部を組み込んだ（上および図４を参照されたい）。これらのＣＯＤＥＭＩＲのそれぞれを、ＡＲＰＥ−１９細胞でのＶＥＧＦ抑制活性についてアッセイした（図２８）。しかしながら、これらのＣＯＤＥＭＩＲのいくつかは無関係の対照に関して有意の活性を有したという事実にもかかわらず、検討中のシードの特徴に関して認識可能な傾向は観察されなかった。
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ｓｈＲＮＡとしてのＣＯＤＥＭＩＲの発現
ＨＩＶ ＶＩＲＯＭＩＲの例で示されたとおり、ＣＯＤＥＭＩＲが低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として発現されうることをさらに確認するため、ｓｈＲＮＡ ＣＯＤＥＭＩＲをＣＯＤＥＭＩＲ−１に基づき設計した。このヘアピンは、ヘアピンの自由（非
ループ）末端にＣＯＤＥＭＩＲ−１の２１ヌクレオチドのコアを包含するよう設計した（図２９）。該ヘアピンをプラスミドベクターにクローン化し、そしてＨ１プロモーターから発現させた。ＡＲＰＥ−１９細胞を９６ウェルプレートに播種し（４０００細胞／ウェル）、そして２４時間後に２００ｎｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。ＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ−１を４８時間後にそれぞれＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳにより評価した。該ヘアピンは、長さを一致させたヘアピン対照に関してＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ−１抑制活性を示し（図３０）；発現された低分子ヘアピン型ＣＯＤＥＭＩＲの応用可能性を示す。
該研究からの結果は、ＣＯＤＥＭＩＲがヘアピンとして発現され得ることを示す。ヘアピンとしての干渉ＲＮＡの発現は十分に報告されており、そしてこれらの知見は、ＣＯＤＥＭＩＲの概念がヘアピンならびに合成二重鎖に応用可能であることを示す。
当業者は、ｓｈＲＮＡの適する発現系の構築が、例えば産生されるＲＮＡの量に影響する多くの因子（プロモーター、転写物の長さおよび安定性など）の考慮を必要とすることを認識するであろう。これゆえに、ＣＯＤＥＭＩＲ−１ ｓｈＲＮＡの前駆体の発現系のさらなる至適化を考慮し得、そしてより高い抑制能力につながることがありそうであるとみられることが明らかである。
平滑端ＣＯＤＥＭＩＲ
ショウジョウバエからの細胞ライセートを使用する実験は、二重鎖の末端の２ヌクレオチドの３’オーバーハングがＲＮＡサイレンシングに至適であることを同定した。しかしながら、哺乳動物細胞でのいくつかの実験で、「平滑端」二重鎖がかなり活性であることが見出され、そして、ＦＢＳを含有する培地中で増大された安定性を有した（Ｃｚａｕｄｅｒｎａら（２００３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３１、２７０５−１６）。
ＣＯＤＥＭＩＲ活性に対する平滑端の影響を試験するため、ＣＯＤＥＭＩＲ−１のバリアントを、１若しくは０塩基いずれかのオーバーハングを伴い設計した（表２０−１）。４０ｎＭでＡＲＰＥ−１９細胞にトランスフェクトした場合、これらのＣＯＤＥＭＩＲは、ＣＯＤＥＭＩＲ−１に比較して、ＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ−１に対する低下された効力を示した（図３１）。Ｃｚａｕｄｅｒｎａらの結果と対照的に、平滑端二重鎖がかなりより安定ではなかったことが見出された（データは示されない）。さらに、平滑端の存在がより短い鎖の負荷を低下させることを示すデータが生成され（データは示されない）、それにより上の実験で観察された否定的な結果を説明する。従って、平滑端二重鎖は分子の安定性を高めることにおいて有用でないかも知れない一方、この戦略を使用して、パッセンジャー鎖がガイド鎖より短くなるように設計しかつその５’端を二重鎖の平滑端に配置させることにより、活性鎖の負荷を高め得る。
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ＣＯＤＥＭＩＲ−１を用いるｉｎ ｖｉｖｏ試験
ＣＯＤＥＭＩＲ−１および本発明の他の多標的ＲＮＡの活性は、当業者に既知の多様な前臨床モデルで試験し得る。制限しない一例として、ＣＯＤＥＭＩＲ−１を未熟児網膜症
モデルで試験し得る。このモデルは眼血管新生の分野で研究している者に公知であり、そして目的の疾患（ＡＭＤ、糖尿病性網膜症など）に対し活性の薬物の開発のためのいくつかのモデルの１つとして広範に使用されている。該試験は、処置群に等しく分割された適する数のマウス若しくはラットの新生仔より構成し得る。処置群はベヒクルのような陰性対照、無関係な若しくはスクランブル配列対照およびＣＯＤＥＭＩＲ−１を包含する多数の多標的ＲＮＡを包含し得る。既知の競合体として、ＶＥＧＦ若しくは他の検証された血管新生標的に対するｓｉＲＮＡを包含することもまた考慮し得る。
このモデルで、生命の第１日に開始して、同腹子を低酸素の周期、次いで数日の室空気に曝露する。注入は、４日の正常酸素期間の前の周期の最後の日に実施し得る。数日後に動物にＦＩＴＣデキストランを注入しかつ殺し得る。網膜のフラットマウントの蛍光画像を使用して、各動物での血管新生の程度を推定し得る。加えて、標的ＲＮＡ分子若しくはそれらのコードされるタンパク質（この場合はＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ）の産生量の測定値を、均質化したサンプルの分析により、若しくは、あるいはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで測定し得る。
さらなる制限しない一例として、ＣＯＤＥＭＩＲ−１は、あるいは、ラット若しくは霊長類のレーザー誘発性脈絡叢血管新生（ＣＮＶ）モデルを使用して、疾患に関係する血管新生の阻害についてｉｎ ｖｉｖｏで評価し得る。このモデルでは、全身麻酔下の動物のそれらの瞳孔を散大させかつ網膜の写真を撮影する。脈絡叢血管新生（ＣＮＶ）をクリプトンレーザー光凝固により誘導する。これは、全処置群からの各動物の左、若しくは、あるいは右眼いずれかへのスリットランプを通してのレーザー照射を使用して実施する。合計６〜１１回のレーザー燃焼を、後極の視神経を取り囲む各眼に全般に適用する。
レーザー傷害後の適する時点で、多標的ＲＮＡを冒された眼に注入する。該適する時間は、レーザー誘導の翌日であり得るか、または確立したＣＮＶに対する評価のためには、該注入を傷害数日若しくは数週後に実施し得る。オリゴヌクレオチドの硝子体内注入は、硝子体中に３０若しくは３２ゲージ針を挿入することにより実施する。挿入および注入は、手術用顕微鏡により実施し得かつ直接見ることができる。水晶体若しくは網膜を傷害しないよう注意を払う。理想的には、試験化合物を硝子体腔の上および周辺に置く。処置後定期的に、血管新生を、画像化および／若しくは直接サンプリング（例えば組織学、免疫組織化学）いずれかにより評価する。全部の場合で、ＣＮＶの評価は、情報の記録の偏りの欠如を確実にするために、実際の処置に対し盲検化した熟練した操作者により最良に実施される。
直接画像化法の一例はカラー眼底撮影法（ＣＦＰ）である。再度、上述されたところの麻酔下で瞳孔を散大させる。眼底をその後、適切なフィルムを使用してカメラで写真撮影する。
あるいは、若しくは好ましくはＣＦＰに加えて、フルオレセイン血管造影を使用して、網膜中の血管および血管漏出の領域を画像化する。これは、フルオレセインナトリウムの腹腔内若しくは静脈内注入後に動物の全部で実施する。網膜脈管構造をその後、ＣＦＰに使用されると同一のカメラを使用して、しかしフルオレセイン血管造影のためのバリアフィルターを追加して写真撮影する。単一の写真を、フルオレセインナトリウムの投与直後に０．５〜１分間隔で撮影し得る。フルオレセイン漏出の程度を、訓練を積んだ操作者により点数を付ける。時間点のそれぞれからの平均重症度スコアを適する統計学的解析により比較し、そしてｐ＜０．０５で差違を有意とみなす。加えて、各病変スコアの頻度を計数し、表にしかつグラフで表す。
あるいは、若しくは加えて、ラットを処置後の選択された時点（例えば注入７、１４お
よび２８日後）に安楽死させ得、そして、眼を慣習的組織病理学により検査し得る。病変の数および重症度の低下が、本発明の活性オリゴヌクレオチドにより処理したサンプルで見られることが期待される。
他の制限しない例は、当業者に公知であるもののような他の前臨床モデルでの本発明の多標的ＲＮＡを試験することを包含する。網羅的でない一覧は、肺線維症（ブレオマイシン誘発性）、足の炎症（カラギーナン）、関節炎、糖尿病、ウイルス感染症、腫瘍異種移植などを包含する。
前述の明細は、具体的説明の目的上提供される実施例とともに本発明の原理を教示する一方、本発明の実務は、以下の請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内にあるところの通常の変形、翻案および／若しくは改変の全部を包含することが理解されるであろう。全部の参考文献は、ここに、そっくりそのまま本明細書に組み込まれる。
多標的干渉ＲＮＡ（ＣＯＤＥＭＩＲ若しくはＶＩＲＯＭＩＲ）の例示的一設計過程の局面を強調するフローチャート。 トランスフェクション４８時間後の培地中のＡＲＰＥ−１９細胞における最終濃度４０ｎＭの対照ｓｉＲＮＡおよびＣＯＤＥＭＩＲの細胞傷害性を示すグラフ。Ａ：擬似トランスフェクト細胞（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００単独）；Ｂ：無関係なｓｉＲＮＡ対照；Ｃ：ＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ；Ｄ：ＩＣＡＭ特異的ｓｉＲＮＡ；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−２。 多様なｓｉＲＮＡおよびＣＯＤＥＭＩＲで処理した細胞中の対照（未トランスフェクト）細胞のパーセントとしてのＶＥＧＦ（黒棒）およびＩＣＡＭ（白棒）タンパク質発現を示すグラフ。Ａ：未刺激細胞；Ｂ：未トランスフェクトの刺激した細胞；Ｃ：無関係の対照ｓｉＲＮＡ；Ｄ：ＩＣＡＭ特異的ｓｉＲＮＡ；Ｅ：ＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｇ：ＣＯＤＥＭＩＲ−２。 何らかの配列類似性をもつ天然に存在するミクロＲＮＡの活性とのＣＯＤＥＭＩＲ １活性の比較。Ａ：未トランスフェクト細胞；Ｂ：無関係の対照ｓｉＲＮＡ；Ｃ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｄ：合成ｍｉＲ−２９９（ＣＯＤＥＭＩＲ−８４）。 同一の標的ＲＮＡ（この場合はＨＩＶゲノム）中の２部位を標的とするＶＩＲＯＭＩＲの例。 ＶＥＧＦ（黒棒）およびＩＣＡＭ−１（白棒）発現に対する活性に対する５’末端の不適正に対するＣＯＤＥＭＩＲの許容性。Ａ：未トランスフェクト細胞；Ｂ：無関係のｓｉＲＮＡ；Ｃ：ＩＣＡＭおよびＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ；Ｄ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１３；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５。シードの５’末端の単一不適正の存在は、ＣＯＤＥＭＩＲ−１３の完全に一致したシードに関して、ＣＯＤＥＭＩＲ−１４および１５の活性を有意に低下させる（配列については表８−２を参照されたい）。 ｐＮＬ４．３プラスミド、および６７ｎｇのｐＳＩＬベクター（対照）またはＶＭ００４、ＶＭ００６若しくはＶＭ０１０を模倣するｓｈＲＮＡの配列をコードするｐＳＩＬベクターでコトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞中のｐ２４ ＨＩＶキャプシドタンパク質の産生。Ａ：対照（空）ベクター；Ｂ：ＶＭ００４ ｓｈＲＮＡ構築物；Ｃ：ＶＭ００６ ｓｈＲＮＡ構築物；Ｄ：ＶＭ０１０ ｓｈＲＮＡ構築物。 ４０ｎＭのＣＣ０１４〜２１およびｓｉＲＮＡ対照でのトランスフェクション後の血清除去を伴うおよび伴わないＨＣＴ１１６細胞の生存。Ａ：擬似トランスフェクト細胞；Ｂ：無関係な対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＣ４７）；Ｃ：細胞傷害性のトランスフェクションｓｉＲＮＡ対照（ｓｉＴＯＸ）；Ｄ：Ｂｃｌ−２特異的ｓｉＲＮＡ；Ｅ：Ｋｒａｓ特異的ｓｉＲＮＡ；Ｆ：ＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ（ＰＶＥ）；Ｇ：ＣＣ０１４；Ｈ：ＣＣ０１５；Ｉ：ＣＣ０１６；Ｊ：ＣＣ０１７；Ｋ：ＣＣ０１８；Ｌ：ＣＣ０１９；Ｍ：ＣＣ０２０およびＮ：ＣＣ０２１。 ウエスタンにより測定しかつβ−アクチンに対し正規化したところの、４０ｎＭのＣＣ０１４〜２１でのトランスフェクション後のＨＣＴ１１６細胞中のＫ−Ｒａｓの豊富さ。Ａ：擬似トランスフェクト細胞；Ｂ：ＣＣ０１４；Ｃ：ＣＣ０１５；Ｄ：ＣＣ０１６；Ｅ：ＣＣ０１７；Ｆ：ＣＣ０１８；Ｇ：ＣＣ０１９；Ｈ：ＣＣ０２０；Ｉ：ＣＣ０２１；Ｊ：Ｋｒａｓ特異的ｓｉＲＮＡ。 ４０ｎＭのＣＣ０１４〜２１でのトランスフェクション４８時間後のＨＣＴ１１６細胞によるＶＥＧＦの分泌。細胞培地中のＶＥＧＦはＥＬＩＳＡにより測定した。ＰＶＥはいくつかの種（ヒトおよびげっ歯類）で活性のＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡである。Ａ：擬似トランスフェクト細胞；Ｂ：無関係な対照ｓｉＲＮＡ；Ｃ：ＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ（ＰＶＥ）；Ｄ：Ｋｒａｓ特異的ｓｉＲＮＡ；Ｅ：Ｂｃｌ−２特異的ｓｉＲＮＡ；Ｆ：ＣＣ０１４；Ｇ：ＣＣ０１５；Ｈ：ＣＣ０１６；Ｉ：ＣＣ０１７；Ｊ：ＣＣ０１８；Ｋ：ＣＣ０１９；Ｌ：ＣＣ０２０；Ｍ：ＣＣ０２１。 ４０ｎＭのＣＣ０１４〜１８および対照でのトランスフェクション４８時間後のＨＣＴ１１６細胞のアネキシンＶ（初期アポトーシス）およびヨウ化プロピジウム（壊死／後期アポトーシス）染色の陽性性。Ａ：未処理細胞；Ｂ：擬似トランスフェクト細胞；Ｃ：無関係な対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＣ４７）；Ｄ：細胞傷害性のトランスフェクション対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＯＸ）；Ｅ：ＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ；Ｆ：Ｂｃｌ−２特異的ｓｉＲＮＡ；Ｇ：Ｋｒａｓ特異的ｓｉＲＮＡ；Ｈ：ＣＣ０１４；Ｉ：ＣＣ０１５；Ｊ：ＣＣ０１６；Ｋ：ＣＣ０１７およびＬ：ＣＣ０１８。 ４０ｎＭのｓｉＲＮＡ、ＣＣ０１５およびＣＣ０１８〜２１でのトランスフェクション後のＨＣＴ１１６細胞のコロニー形成能力。Ａ：未処理細胞；Ｂ：無関係な対照ｓｉＲＮＡ Ｃ：ＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ；Ｄ：Ｋｒａｓ特異的ｓｉＲＮＡ；Ｅ：Ｂｃｌ−２特異的ｓｉＲＮＡ；Ｆ：ＣＣ０１５；Ｇ：ＣＣ０１８；Ｈ：ＣＣ０１９；Ｉ：ＣＣ０２０およびＪ：ＣＣ０２１。 ４０ｎＭの２’−Ｆ修飾ＣＯＤＥＭＩＲ−１アナログでトランスフェクトしたＡＲＰＥ−１９細胞によるＶＥＧＦ分泌。ＶＥＧＦ産生は細胞培養上清のＥＬＩＳＡにより測定した。各点は三重のウェルの平均を表し；エラーバーは平均の標準偏差を示す。Ａ：未処理細胞；Ｂ：擬似トランスフェクト細胞；Ｃ：無関係なｓｉＲＮＡ対照；Ｄ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−３３；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−８７；Ｇ：ＣＯＤＥＭＩＲ−９２；Ｈ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４４；Ｉ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４５；Ｊ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１６５；Ｋ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１６６およびＬ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１６７。 ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験したＣＯＤＥＭＩＲ−１のガイド鎖末端修飾（データについては図１５を参照されたい）。「Ｏｌｉｇｏ」はＣＯＤＥＭＩＲ−１の活性ガイド鎖を指す。Ａ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４６；Ｂ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４７；Ｃ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４８；Ｄ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４９；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５０；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５１；Ｇ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５２；Ｈ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５３；Ｉ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５４；Ｊ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５５およびＫ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５６。 ＣＯＤＥＭＩＲ−１の各末端複合バリアント１０ｎＭでトランスフェクトしたＡＲＰＥ−１９細胞によるＶＥＧＦ分泌。細胞培養上清中のＶＥＧＦをＥＬＩＳＡにより測定した。各点は三重のウェルの平均を表し；エラーバーは平均の標準偏差を示す。Ａ：未トランスフェクト細胞；Ｂ：擬似トランスフェクト細胞；Ｃ：無関係なｓｉＲＮＡ対照；Ｄ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４６；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４７；Ｇ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４８；Ｈ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４９；Ｉ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５０；Ｊ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５１；Ｋ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５２；Ｌ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５３；Ｍ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５４；Ｎ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５５およびＯ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１５６。 ＣＯＤＥＭＩＲ−１によるＶＥＧＦ抑制の時間経過。細胞を第０日に４０ｎＭ ｄｓＲＮＡで１回トランスフェクトし、そしてデフェロキサミンで反復して刺激した。指定された時点で上清を収集しかつＥＬＩＳＡによりアッセイした。エラーバーは平均の標準偏差を示す。■：未トランスフェクト細胞；▲：擬似トランスフェクト；▼無関係なｓｉＲＮＡ対照および◆：ＣＯＤＥＭＩＲ−１。 ヒト血清中のＣＯＤＥＭＩＲ−１の化学修飾バリアントの安定性。すなわち、１００ｎＭの二重鎖ＲＮＡを１０％ヒトＡＢ血清中３７℃でインキュベートし、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ色素を使用してＲＮＡ濃度をモニターした。各点は３検体のサンプルの平均である。エラーバー（多くの場合記号より小さい）は平均の標準偏差を示す。■：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；▲：ＣＯＤＥＭＩＲ−３３；▼：ＣＯＤＥＭＩＲ−８７；◆：ＣＯＤＥＭＩＲ−９２；●：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４４および□：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４５。 ＣＯＤＥＭＩＲ−１の化学修飾バリアントでトランスフェクトしたＡＲＰＥ−１９細胞によるＶＥＧＦ（黒棒）およびＩＣＡＭ（白棒）分泌。ＡＲＰＥ−１９細胞を４０ｎＭの二重鎖ＲＮＡでトランスフェクトし、そしてＶＥＧＦ若しくはＩＣＡＭ分泌をトランスフェクション４８時間後にＥＬＩＳＡによりアッセイした。各棒は３検体のサンプルの平均を表す。エラーバーは平均の標準偏差を示す。１（上図）で、Ａ：未トランスフェクト細胞；Ｂ：擬似トランスフェクト細胞；Ｃ：無関係なｓｉＲＮＡ対照；Ｄ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−３３；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−８７およびＧ：ＣＯＤＥＭＩＲ−９２。２（下図）で、Ａ：未トランスフェクト細胞；Ｂ：擬似トランスフェクト細胞；Ｃ：無関係なｓｉＲＮＡ対照；Ｄ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−８７；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４４；Ｇ：ＣＯＤＥＭＩＲ−３３およびＨ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１４５。 ＶＥＧＦ（白棒）およびＩＣＡＭ（黒棒）の抑制活性に対するＣＯＤＥＭＩＲ−１のシード領域中の不適正の影響。ＡＲＰＥ−１９細胞を４０ｎＭの二重鎖ＲＮＡでトランスフェクトし、そしてＶＥＧＦ（ＥＬＩＳＡ）若しくはＩＣＡＭ（ＦＡＣＳ）をアッセイしかつ未トランスフェクト細胞で得られた結果に関して表した。発現はトランスフェクション４８時間後にアッセイした。各棒は３検体のサンプルの平均を表す。エラーバーは平均の標準偏差を示す。Ａ：未トランスフェクト細胞；Ｂ：擬似トランスフェクト；Ｃ：無関係なｓｉＲＮＡ対照；Ｄ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１２２；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１２３およびＧ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１２４。 ＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ ｍＲＮＡに直接整列されているＣＯＤＥＭＩＲ−１の全３２種のバリアントの設計の図解。２種の標的配列の配列アライメントを示す。潜在的ガイド鎖（ＣＯＤＥＭＩＲ）を配列アライメントの下に示す。該２標的間の全体的コンセンサスの欠如により、２個の可能な塩基をいくつかの位置で使用し得る（不適正位置の代替塩基は矢印で示される行に示す）。２種の標的配列をそれぞれ一致およびゆらぎ対形成させるためのＵの可能な使用に注目されたい。 ＶＥＧＦ抑制活性についてのＣＯＤＥＭＩＲ−１の３２種のバリアントのスクリーニング。ＡＲＰＥ−１９細胞を４０ｎＭの指定されるＲＮＡ二重鎖でトランスフェクトし、そしてＶＥＧＦ分泌をトランスフェクション４８時間後にＥＬＩＳＡにより測定した。各ＣＯＤＥＭＩＲのガイド鎖を５’から３’の方向で示す。各棒は３検体のサンプルの平均を表す。エラーバーは平均の標準偏差を示す。Ａ：未トランスフェクト；Ｂ：無関係なｓｉＲＮＡ対照；Ｃ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｄ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５２；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５３；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５４；Ｇ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５５；Ｈ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５６；Ｉ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５７；Ｊ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５８；Ｋ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５９；Ｌ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６０；Ｍ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６１；Ｎ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６２；Ｏ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６３；Ｐ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６４；Ｑ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６５；Ｒ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６６；Ｓ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６７；Ｔ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６８；Ｕ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６９；Ｖ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７０；Ｗ：：ＣＯＤＥＭＩＲ−７１；Ｘ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７２；Ｙ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７３；Ｚ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７４；ＡＡ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７５；ＢＢ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７６；ＣＣ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７７；ＤＤ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７８；ＥＥ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７９；ＦＦ：ＣＯＤＥＭＩＲ−８０；ＧＧ：ＣＯＤＥＭＩＲ−８１；ＨＨ：ＣＯＤＥＭＩＲ−８２；ＩＩ：ＣＯＤＥＭＩＲ−８３およびＪＪ：ＣＯＤＥＭＩＲ−８４。 ＣＯＤＥＭＩＲ−１の３２種のバリアントの標的相補性、５’相補性の長さおよびＶＥＧＦ抑制の間の関係。□：ＶＥＧＦ結合配列に相補的な連続する１２塩基を伴うＣＯＤＥＭＩＲ−１バリアント；▲：１４塩基の連続する相補性を伴うＣＯＤＥＭＩＲ−１バリアント；▼：１７塩基の連続する相補性を伴うＣＯＤＥＭＩＲ−１バリアント；◇：１８塩基の連続する相補性を伴うＣＯＤＥＭＩＲ−１バリアント；●：１９塩基の連続する相補性を伴うＣＯＤＥＭＩＲ−１バリアントおよび■：２１塩基の連続する相補性を伴うＣＯＤＥＭＩＲ−１バリアント（ＶＡＩＣ）。 ＩＣＡＭ産生の抑制についてのＣＯＤＥＭＩＲ−１の３１種のバリアントのスクリーニング。ＡＲＰＥ−１９細胞を４０ｎＭの指定されるＲＮＡ二重鎖でトランスフェクトし、そしてｓＩＣＡＭ分泌をトランスフェクション４８時間後にＥＬＩＳＡにより測定した。各ＣＯＤＥＭＩＲのガイド鎖を５’から３’の方向に示す。各棒は３検体のサンプルの平均を表す。エラーバーは平均の標準偏差を示す。Ａ：未トランスフェクト；Ｂ：無関係な対照ｓｉＲＮＡ；Ｃ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｄ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５２；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５３；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５４；Ｇ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５５；Ｈ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５６；Ｉ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５７；Ｊ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５８；Ｋ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５９；Ｌ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６０；Ｍ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６１；Ｎ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６２；Ｏ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６３；Ｐ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６４；Ｑ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６５；Ｒ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６６；Ｓ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６７；Ｔ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６８；Ｕ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６９；Ｖ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７０；Ｗ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７１；Ｘ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７２；Ｙ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７３；Ｚ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７４；ＡＡ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７５；ＢＢ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７６；ＣＣ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７７；ＤＤ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７８；ＥＥ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７９；ＦＦ：ＣＯＤＥＭＩＲ−８０；ＧＧ：ＣＯＤＥＭＩＲ−８１；ＨＨ：ＣＯＤＥＭＩＲ−８２；ＩＩ：ＣＯＤＥＭＩＲ−８３およびＪＪ：ＩＣＡＭ特異的ｓｉＲＮＡ。 ７個のＧモチーフを伴う（ＣＯＤＥＭＩＲ−５６およびＣＯＤＥＭＩＲ−７６）ならびに伴わない（ＣＯＤＥＭＩＲ−１２０およびＣＯＤＥＭＩＲ−１２１）の比較。ＡＲＰＥ−１９細胞を４０ｎＭの二重鎖ＲＮＡでトランスフェクトし、そしてＶＥＧＦ（白棒）若しくはＩＣＡＭ（黒棒）発現をトランスフェクション４８時間後にアッセイした。各棒は３検体のサンプルの平均を表す。エラーバーは平均の標準偏差を示す。Ａ：未トランスフェクト；Ｂ：擬似トランスフェクト細胞；Ｃ：無関係な対照ｓｉＲＮＡ；Ｄ：ＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ特異的ｓｉＲＮＡ；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−５６；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７６；Ｇ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１２０ならびにＨ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１２１。 ＬＮＡおよびイノシンを含有するＣＯＤＥＭＩＲでのトランスフェクション後のＡＲＰＥ−１９細胞中のＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ発現。ＡＲＰＥ−１９細胞を４０ｎＭの二重鎖ＲＮＡでトランスフェクトし、そしてＶＥＧＦ（黒棒）若しくはＩＣＡＭ（白棒）発現をトランスフェクション４８時間後にアッセイした。各棒は３検体のサンプルの平均を表す。エラーバーは平均の標準偏差を示す。Ａ：未トランスフェクト；Ｂ：擬似トランスフェクト細胞；Ｃ：無関係なｓｉＲＮＡ対照；Ｄ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−９９；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１００；Ｇ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１０１およびＨ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１０２。 ガイド鎖の位置１３および／若しくは１５にイノシン塩基若しくは不適正を含有するＣＯＤＥＭＩＲのＶＥＧＦ抑制活性の比較。ＡＲＰＥ−１９細胞を１０ｎＭの二重鎖ＲＮＡでトランスフェクトし、そしてＶＥＧＦ（ＥＬＩＳＡ）発現をトランスフェクション４８時間後にアッセイした。各棒は３検体のサンプルの平均を表す。エラーバーは平均の標準偏差を示す。Ａ：未トランスフェクト；Ｂ：擬似トランスフェクト細胞；Ｃ：無関係なｓｉＲＮＡ対照；Ｄ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６８；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−６９；Ｇ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７０；Ｈ：ＣＯＤＥＭＩＲ−７１；Ｉ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１００；Ｊ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１０１およびＫ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１０２。 非対称バルジを含有するＣＯＤＥＭＩＲ−１のバリアントでのトランスフェクション後のＡＲＰＥ−１９細胞によるＶＥＧＦ産生。ＡＲＰＥ−１９細胞を、４０ｎＭの指定されたＲＮＡ二重鎖でトランスフェクトし、そしてＶＥＧＦ分泌をトランスフェクション４８時間後にＥＬＩＳＡにより測定した。各棒は３検体のサンプルの平均を表す。エラーバーは平均の標準偏差を示す。Ａ：未トランスフェクト；Ｂ：擬似トランスフェクト細胞；Ｃ：無関係なｓｉＲＮＡ対照；Ｄ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１０４；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１０５；Ｇ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１０６およびＨ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１０７。 ＶＥＧＦ ３’ＵＴＲ中の複数のシード部位のスクリーニング。ＡＲＰＥ−１９細胞を４０ｎＭの指定されたＲＮＡ二重鎖でトランスフェクトし、そしてＶＥＧＦ分泌をトランスフェクション４８時間後にＥＬＩＳＡにより測定した。各棒は３検体のサンプルの平均を表す。エラーバーは平均の標準偏差を示す。Ａ：未トランスフェクト；Ｂ：擬似トランスフェクト細胞；Ｃ：無関係なｓｉＲＮＡ対照；Ｄ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１０８；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１０９；Ｇ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１１０；Ｈ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１１１；Ｉ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１１２；Ｊ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１１３；Ｋ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１１４；Ｌ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１１５；Ｍ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１１６：Ｎ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１１７；Ｏ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１１８およびＰ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１１９。 ＣＯＤＥＭＩＲ−１に基づくｓｈＲＮＡの設計。配列は５’から３’（上鎖）に示す。太字の配列は予測される活性ＣＯＤＥＭＩＲ−１二重鎖を示す。 ＶＥＧＦおよびＩＣＡＭ−１発現に対するＣＯＤＥＭＩＲ−１ヘアピンの影響。ＡＲＰＥ−１９細胞を２μｇ／ｍｌの各ヘアピンプラスミドでトランスフェクトした。ＶＥＧＦ（Ａ）およびＩＣＡＭ（Ｂ）発現をトランスフェクション４８時間後に測定した。白棒は「空の」ベクター対照で得られた結果を示し、また、黒棒はＣＯＤＥＭＩＲ−１を模倣するように構築したｓｈＲＮＡで得られたものである。各棒は３検体のサンプルの平均の平均を表す。エラーバーは平均の標準偏差を示す。ＣＯＤＥＭＩＲ−１を模倣するｓｈＲＮＡの有意の影響が双方の標的について見出された（＊＝ｐ＜０．００１；＊＊＝Ｐ＜０．０５）。 ＶＥＧＦ（黒棒）およびＩＣＡＭ−１（白棒）に対するＣＯＤＥＭＩＲ−１の１ｂｐオーバーハング（ＣＯＤＥＭＩＲ−２４）および「平滑端」バリアント（ＣＯＤＥＭＩＲ−２５）の有効性。Ａ：未トランスフェクト；Ｂ：擬似トランスフェクト細胞；Ｃ：無関係なｓｉＲＮＡ対照；Ｄ：ＩＣＡＭおよびＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ；Ｅ：ＣＯＤＥＭＩＲ−１；Ｆ：ＣＯＤＥＭＩＲ−２４ならびにＧ：ＣＯＤＥＭＩＲ−２５。

Claims (13)

  1. 式（Ｉ）：
    ５’−ｐ−ＸＳＹ−３’
    式中、ｐは独立に存在若しくは非存在である末端リン酸基よりなり；
    式中、Ｓは異なる遺伝子構成で１種若しくはそれ以上の予め選択された標的ＲＮＡ分子に存在する最低２種の結合配列のそれぞれの第一の部分に少なくとも部分的に相補的である少なくとも５個のヌクレオチドの長さの第一のヌクレオチド配列よりなり、ここでＳがＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧ（配列番号１）から実質的に成る核酸配列を含んでなり；
    式中、Ｘは非存在であるか若しくは第二のヌクレオチド配列よりなり；
    式中、Ｙは非存在であるか若しくは第三のヌクレオチド配列よりなるが、但しＸおよびＹは同時に非存在でなく；
    式中、ＸＳＹは、それらとの安定な相互作用を可能にするように前記結合配列のそれぞれに少なくとも部分的に相補的である、
    のガイド鎖を含んでなる多標的干渉ＲＮＡ分子であって、
    ここで多標的干渉ＲＮＡ分子が、
    ５’ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＡＧＵＣＵＡＡ３’（配列番号１００）
    ３’ＵＵＡＵＡＣＡＣＣＣＡＣＣＣＡＣＵＣＡＧＡ５’（配列番号１０１）
    から実質的に成る、上記多標的干渉ＲＮＡ分子。
  2. Ｓが最低２種の結合配列のそれぞれの第一の部分に完全に相補的である、請求項１に記載の多標的干渉ＲＮＡ分子。
  3. 最低２種の結合配列のそれぞれの第一の部分がシード配列である、請求項１若しくは請求項２に記載の多標的干渉ＲＮＡ分子。
  4. Ｙが、結合配列のそれぞれの第二の部分に少なくとも部分的に相補的であり、前記第二の部分が、該結合配列の前記第一の部分の５’端に隣接しかつそれと結合されている、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の多標的干渉ＲＮＡ分子。
  5. Ｓが８ないし１５ヌクレオチドの長さのものである、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の多標的干渉ＲＮＡ分子。
  6. パッセンジャー鎖とガイド鎖の間の安定な二重鎖の形成を可能にするようにガイド鎖に少なくとも部分的に相補的であるパッセンジャー鎖をさらに含んでなる、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の多標的干渉ＲＮＡ分子。
  7. パッセンジャー鎖およびガイド鎖が相互に完全に相補的である、請求項６に記載の多標的干渉ＲＮＡ分子。
  8. １個若しくはそれ以上の末端オーバーハングを含んでなる、請求項１ないし７のいずれか１つに記載の多標的干渉ＲＮＡ分子。
  9. オーバーハングが１ないし５ヌクレオチドよりなる、請求項８に記載の多標的干渉ＲＮＡ分子。
  10. 結合配列が、異なる遺伝子構成で１種の予め選択された標的ＲＮＡ分子に存在する、請求項１ないし９のいずれか１つに記載の多標的干渉ＲＮＡ分子。
  11. 結合配列が、異なる遺伝子構成で最低２種の予め選択された標的ＲＮＡ分子に存在する、請求項１ないし９のいずれか１つに記載の多標的干渉ＲＮＡ分子。
  12. 予め選択された標的ＲＮＡ分子の最低１種が非コードＲＮＡ分子である、請求項１ないし１１のいずれか１つに記載の多標的干渉ＲＮＡ分子。
  13. 予め選択された標的ＲＮＡ分子の最低１種がメッセンジャーＲＮＡ分子である、請求項１ないし１２のいずれか１つに記載の多標的干渉ＲＮＡ分子。
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