CN116064511A - 一种抑制鲤疱疹病毒ii型立即早期基因orf121的rna干扰序列及其应用 - Google Patents

一种抑制鲤疱疹病毒ii型立即早期基因orf121的rna干扰序列及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列及其应用，该RNA干扰序列包括siRNA和/或shRNA，siRNA的正义链序列如SEQ ID NO:7所示，反义链序列如SEQ ID NO:8所示；shRNA的正义链序列如SEQ ID NO:15所示，反义链序列如SEQ ID NO:16所示。本发明首次靶向CyHV‑2立即早期基因ORF121的CDS区不同位点设计得到上述siRNA和/或shRNA，实验证明其能够有效降低ORF121的表达量以及GiCF细胞上清的病毒拷贝数，利用RNAi技术敲降CyHV‑2基因为制备抗CyHV‑2病毒的疫苗或药物提供新思路。

Description

一种抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列及其应用。
背景技术
鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)隶属于异疱疹病毒科、鲤疱疹病毒属，是一种能够感染鲫或金鱼并引起疱疹病毒造血器官坏死病(HVHN)的大型双链DNA囊膜病毒，该病毒基因组全长约290kb，至少由独立编码功能性蛋白质的140个开放阅读框(ORFs)组成。与疱疹病毒科病毒类似，鲤疱疹病毒的基因表达同样呈现时序性特征，唐睿哲等人通过高通量测序结合放线菌酮(CHX)和阿糖胞苷(Ara-C)抑制剂的方法在CyHV-2基因组中鉴定出5个立即早期(IE)、34个早期(E)以及39个晚期(L)基因(Tang R,Lu L,Wang B,et al.Identificationof the immediate-early genes of cyprinid herpesvirus 2[J].Viruses,2020,12(9):994.)。IE基因在病毒入侵宿主后立即启动转录并依赖宿主的转录翻译系统产生转录激活因子，促进E和L基因的转录，E基因参与病毒DNA的复制，L基因的转录促使病毒粒子完成组装和释放(Gruffat H,Marchione R,Manet E.Herpesvirus late gene expression:aviral-specific pre-initiation complex is key[J].Frontiers in microbiology,2016,7:869.)。
CyHV-2于1992年首次在日本发现，之后扩散至全球多个国家和地区，于2013年首次在我国发现该病毒的感染病例(Jung S J,Miyazaki T.Herpesviralhaematopoieticnecrosis of goldfish,Carassius auratus(L.)[J].Journal of fish diseases,1995,18(3):211-220；Xu J,Zeng L,Zhang H,et al.Cyprinid herpesvirus 2infectionemerged in cultured gibel carp,Carassius auratus gibelio in China[J].Veterinary Microbiology,2013,166(1-2):138-144.)。CyHV-2可以感染不同生长阶段的鲫或金鱼，具有高死亡率和易感性，通常爆发于春秋两季，能够造成病鱼食欲减退、嗜睡以及鳃、鳍基部和体表出血、腹部肿胀等一系列症状，最终导致死亡。研究证实CyHV-2感染宿主可引起急性感染，并在无症状感染的幸存鱼中建立潜伏期和持续性感染，而且持续性感染在特定条件下可以转化为急性感染，无症状感染的幸存鱼可能会成为重要的传染源(Chai W,Qi L,Zhang Y,et al.Evaluation of Cyprinid Herpesvirus 2Latency andReactivation in Carassius gibel[J].Microorganisms,2020,8(3):445.)，这种复杂多变的感染特点使该病毒易于传播，病毒防控也更困难。
RNA干扰(RNAi)是指在进化上高度保守的、基于外源性或内源性的双链RNA(dsRNA)分子靶向作用于体内同源mRNA并诱发其高效特异性降解的现象，广泛存在于多种生物体中，在宿主与病毒互作中发挥重要作用(Downward J.RNA interference[J].2004,328:1245-1248.)。RNA干扰基于短RNA序列(19-23nt)与靶向基因序列互补并介导其特异性沉默，RNAi分子包括小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和微小RNA(miRNA)。RNAi诱发基因沉默的机制大致分为两种途径，一是经典RNAi途径，siRNA靶向互补mRNA序列，然后被RNA诱导的沉默复合物(RISC)中的Argonaute 2(Ago2)蛋白瞬时降解(Wilson R,Doudna JA.Molecular mechanisms of RNA interference[J].Annual review of biophysics,2013,42:217.)；二是表观遗传沉默，Argonaute 1(Ago1)蛋白使互补siRNA能够进入细胞核进而靶向基因启动子区域并形成RNA诱导的转录沉默(RITS)复合物，诱导可遗传的且抑制性的表观遗传修饰进而沉默下游基因表达(Ahlenstiel C L,Suzuki K,Marks K,etal.Controlling HIV-1:non-coding RNA gene therapy approaches to a functionalcure[J].Frontiers in Immunology,2015,6:474.)。已有大量研究聚焦于在体内或体外利用RNAi技术(外源输送化学合成的siRNA或shRNA)抑制病毒复制的疗法，如HIV-1、乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV)和人巨细胞病毒(HCMV)等(Kelleher A D,Cortez-Jugo C,Cavalieri F,et al.RNAi therapeutics:an antiviral strategy for humaninfections[J].Current Opinion in Pharmacology,2020,54:121-129.)。
目前，RNAi技术也广泛应用于抗水生动物病毒的研究中，如对虾白斑综合症病毒(WSSV)、草鱼出血病病毒(GCRV)和神经坏死病毒(NNV)等(宋华丽,孙效迎,孔祥会,等.RNA干扰技术在水产动物抗病毒和抗寄生虫研究中的应用研究进展[J].生物技术通报,2020,36(2):13.)。有关CyHV-2的感染机制尚不清晰，相关文献证据匮乏，针对该病毒的疫苗或靶向药物的开发比较缓慢和困难，采用养殖环境消毒的传统方式或提高鱼体免疫力等方法效果不显著，CyHV-2的传播仍给鲫或金鱼养殖业带来重大经济损失，很少有报道研究RNAi技术在CyHV-2复制的应用。金李萍等人靶向CyHV-2的ORF57设计3条siRNA，发现ORF57沉默后病毒的致病力和复制显著被抑制，为CyHV-2基于siRNA技术的抗病毒治疗和减毒株的改造提供借鉴(金李萍,潘晓艺,蔺凌云,等.siRNA干扰对鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF57基因表达的影响[J].水生生物学报,2022,46(4):371-378.)。此外，研究发现ORF121在感染CyHV-2的病鱼组织中表达量最高且被鉴定为该病毒的IE基因，表明ORF121可能对病毒E和L基因或宿主先天免疫基因有调控作用而影响病毒复制(Tang R,Lu L,Wang B,et al.Identification ofthe immediate-early genes of cyprinid herpesvirus 2[J].Viruses,2020,12(9):994；Xu L,Podok P,Xie J,et al.Comparative analysis of differential geneexpression in kidney tissues of moribund and surviving crucian carp(Carassiusauratus gibelio)in response to cyprinid herpesvirus 2infection[J].Archives ofvirology,2014,159(8):1961-1974.)。
发明内容
基于此，本发明首次提出一种抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列，其包括siRNA和/或shRNA。
本发明还提供上述抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列在制备抑制鲤疱疹病毒II型的立即早期基因ORF121表达的试剂中的应用。
本发明还提供上述抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列在制备抗鲤疱疹病毒Ⅱ型的药物或疫苗中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供的抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列，包括siRNA和/或shRNA，其中：
siRNA的正义链序列如SEQ ID NO:7所示，siRNA的反义链序列如SEQ ID NO:8所示；
shRNA的正义链序列如SEQ ID NO:15所示，shRNA的反义链序列如SEQ ID NO:16所示。
本发明的发明人首次靶向CyHV-2立即早期基因ORF121(Genbank登录号：NC_019495.1)的CDS区不同位点设计6对siRNA和/或shRNA，在异育银鲫尾鳍细胞系(GiCF)中感染CyHV-2或在HEK293T细胞中外源过表达ORF121后输送siRNA和/或shRNA并筛选有效敲降靶序列，最终筛选得到siRNA-424和shRNA-424：
siRNA-424序列为：
正义链：5’-AGCUCAUUUCAUUUCAAACTT-3’(SEQ ID NO:7)
反义链：5’-GUUUGAAAUGAAAUGAGCUGC-3’(SEQ ID NO:8)
shRNA-424序列为：
正义链：5’-GCAGCTCATTTCATTTCAAACTTCA-3’(SEQ ID NO:15)
反义链：5’-TTCGTCGAGTAAAGTAAAGTTTGAGAG-3’(SEQ ID NO:16)
作为优选，所述鲤疱疹病毒II型为鲤疱疹病毒II型分离株YC-01。
第二方面，本发明还提供上述抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列在制备抑制鲤疱疹病毒II型的立即早期基因ORF121表达的试剂中的应用，利用siRNA或shRNA在GiCF细胞中有效敲降CyHV-2立即早期基因ORF121。
第三方面，本发明还提供上述抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列在制备抗CyHV-2的药物或疫苗中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明首次靶向CyHV-2立即早期基因ORF121提供RNA干扰序列siRNA(shRNA)，在体外输送后能够有效降低ORF121的表达量以及GiCF细胞上清的病毒拷贝数，利用RNAi技术敲降CyHV-2基因研究其感染复制机制以及基于该技术制备CyHV-2病毒治疗和减毒株改造的疫苗或药物提供新思路。
附图说明
图1是实施例中RT-qPCR检测GiCF细胞感染CyHV-2并转染靶向siRNA后对ORF121表达的影响。
图2是实施例中RT-qPCR检测GiCF细胞感染CyHV-2并转染靶向shRNA后对上清病毒拷贝数的影响。
图3是实施例中RT-qPCR检测HEK293T细胞过表达ORF121并转染靶向siRNA后对其表达的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。下列实施例仅用于说明本发明，但不用作限定本发明的范围。另外，如未特别注明，具体技术操作手段均为本领域内技术人员常规的操作步骤或条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为常规市售产品。
实施例1
1材料
1.1实验毒株、细胞
异育银鲫尾鳍细胞系(GiCF)由本实验室构建，冻存于液氮中。GiCF细胞复苏所用培养基为含有10％胎牛血清(购自吉诺生物)和1％100×青-链霉素(购自Gibco)的M199培养基(购自Gibco)，于27℃恒温培养箱培养。
CyHV-2分离株YC-01(由本实验室分离并保存至-150℃，以下简称CyHV-2)在25℃条件下感染细胞，待细胞全部死亡后，收集细胞上清液用0.22μm的针头式滤器过滤后得病毒液，于-80℃保存备用。
HEK293T细胞复苏所用培养基为含有10％胎牛血清(购自吉诺生物)和1％100×青-链霉素(购自Gibco)的DMEM培养基(购自cytivaHyClone)，于37℃，5％CO2恒温培养箱培养。
1.2实验试剂
Trizol、Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司；三氯甲烷购自上海柯灵斯试剂有限公司；无水乙醇、甲醇、异丙醇购自国药集团化学试剂有限公司；DEPC处理水、20×PBS、氯化钠(NaCl)、卡那霉素、无缝克隆试剂盒购自生工生物(上海)股份有限公司；DDH2O、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)、无内毒素质粒大提试剂盒(DP120)购自天根生化科技(北京)有限公司；
Figure BDA0003746155550000052
Premix Ex TaqTM II(RR820A)、PrimeScriptTM RT MasterMix(RR036A)购自TaKaRa公司；大肠杆菌Trans5α感受态细胞购自北京全式金生物公司；胰化蛋白胨、酵母提取物购自OXOID；琼脂粉购自索莱宝生物；限制性内切酶EcoRⅠ、10×QuickCut Green Buffer、
Figure BDA0003746155550000053
Max DNA聚合酶(R045A)、DL2000DNAMarker购自TaKaRa；YeaRed核酸染料(10000×水溶液)购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；琼脂糖购自上海兰拓生物。
1.3实验仪器
桌上式洁净工作台(VD-850，上海力辰邦西仪器科技有限公司)；PCR仪(T100TMThermal Cycler，Bio-Rad)；台式高速冷冻离心机(H3-16KR，湖南可成仪器)；紫外分光光度计(NanoDrop 2000，Thermo)；化学发光成像系统(ChemiDocTM Imaging System，Bio-Rad)；荧光定量PCR仪(CFX96，Bio-Rad)；恒温振荡培养箱(INFORS-HT Multitron Standard，伊孚森中国)；涡旋振荡仪(上海沪析实业)；手提式高压蒸汽灭菌器(DSX-24L-I，上海申安医疗器械厂)。
2方法
2.1靶向siRNA(shRNA)的设计与合成
在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索CyHV-2立即早期基因ORF121(Genbank登录号：NC_019495.1)的CDS区序列，根据siRNA设计原则，综合分其GC含量、mRNA作用位点的二级结构、siRNA碱基偏好性要求等，在siRNA在线设计软件DSIR(http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html)设计基础上，寻找合适的siRNA靶序列，然后在NCBI上的BLAST软件选择转录本参考序列数据库，对上述siRNA序列进行同源分析，排除siRNA非特异性抑制ORF121以外基因的可能，初步筛选出6对siRNA序列，如表1所示。本实施例设计的6对siRNA序列、siRNA-NC以及shRNA质粒载体pGPU6/RFP/Neo-ORF121-424(以下简称shRNA-424)和pGPU6/RFP/Neo-shNC(以下简称shRNA-NC)均由上海吉玛基因有限公司合成。
表1：siRNA(shRNA)序列
Figure BDA0003746155550000051
Figure BDA0003746155550000061
2.2 CyHV-2感染GiCF细胞与靶向siRNA敲降ORF121
1)GiCF细胞所用培养基为含有10％胎牛血清和1％100×青-链霉素的M199培养基，于27℃恒温培养箱培养，待细胞生长至对数期时传至12孔板中(每孔接种细胞数量为1-5×105个)。生长稳定后(细胞汇合度达60-80％)，用MOI＝0.1的CyHV-2感染GiCF细胞2h后，吸去病毒液，准备转染；
2)转染：
用125μL DEPC处理水去重悬1OD的siRNA，配制为20μM(20pmol/μL)溶液(1ODduplex≈2.5nmol≈33μg)；
稀释阳离子脂质体(添加63μL Opti-MEM培养基，1.9μL LipofectamineTM 3000Reagent)，涡旋振荡并简短离心；稀释siRNA(添加63μL Opti-MEM培养基，4μL siRNA即80pM)，涡旋振荡并简短离心；siRNA缓慢滴入到阳离子脂质体中，轻吹混匀，室温孵育15min，形成转染复合物；
每孔提前换为700μL新鲜的Opti-MEM培养基，然后每孔加入125μL转染复合物，混匀，GiCF细胞于27℃培养箱培养8h后提取细胞RNA进行RT-qPCR检测。
2.3 CyHV-2感染GiCF细胞与靶向shRNA敲降ORF121
1)GiCF细胞培养至2.2中1)所述状态，准备转染质粒；
2)转染：
shRNA-424和shRNA-NC质粒经过大肠杆菌Trans5α感受态细胞转化扩增并用无内毒素质粒大提试剂盒提取纯化，紫外分光光度计测定质粒DNA浓度和纯度，合格则于-20℃保存备用。稀释阳离子脂质体(添加63μL Opti-MEM培养基，1.9μL LipofectamineTM 3000Reagent)，涡旋振荡并简短离心；稀释质粒DNA(添加63μL Opti-MEM培养基，1000ng质粒DNA，2.5μL P3000TM Reagent)，涡旋振荡并简短离心；质粒DNA缓慢滴入到阳离子脂质体中，轻吹混匀，室温孵育15min，形成转染复合物；
每孔提前换为700μL新鲜的Opti-MEM培养基，然后每孔加入125μL转染复合物，混匀，GiCF细胞于27℃培养箱培养至稳定表达shRNA-424和shRNA-NC质粒(载体由RFP荧光标记)后，用MOI＝0.1的CyHV-2感染8h后移去病毒液，分别在24h、48h、72h、96h取细胞上清，利用RT-qPCR检测上清病毒拷贝数(定量检测ORF121)。
2.4 HEK293T细胞过表达ORF121与靶向siRNA敲降ORF121
1)构建pDsRed-express-ORF121重组质粒：
ORF121片段从感染CyHV-2的GiCF细胞中扩增，PCR反应体系和反应条件参考
Figure BDA0003746155550000071
Max DNA聚合酶(表2、表3)，PCR引物在表4列出。使用限制性核酸内切酶EcoRI在37℃酶切pDsRed-express-N1载体(购自Clontech公司)1h，反应体系如下：10μL 10×QuickCut Green Buffer，2μg质粒DNA，2μL QuickCut EcoRⅠ，补充ddH2O至100μL。将纯化的PCR片段与纯化的线性化载体在50℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞，挑取平板单菌落扩培后提取重组质粒并测序验证。
2)HEK293T细胞所用培养基为含有10％胎牛血清和1％100×青-链霉素的DMEM培养基，于37℃，5％CO2恒温培养箱培养，待细胞生长至对数期时传至12孔板中(每孔接种细胞数量为1-5×105个)。生长稳定后(汇合度达70％)，转染pDsRed-express-ORF121质粒进行过表达，转染方法同2.3中2)shRNA-424质粒载体的输送方法，过表达24h后，转染靶向ORF121的siRNA，方法同2.2中2)siRNA的输送方法，8h后提取细胞RNA进行RT-qPCR检测。
表2：PCR反应体系
Figure BDA0003746155550000081
表3：PCR反应条件
Figure BDA0003746155550000082
表4：引物
Figure BDA0003746155550000083
2.4细胞总RNA的提取
收集处理后的细胞，每孔加入1mL Trizol吹打混匀后，加入200μL三氯甲烷涡旋振荡15s，静置3min，在4℃下12000×g离心15min；取上清加入等量异丙醇，静置10min，在4℃下12000×g离心10min；弃上清，加入75％乙醇(用DEPC处理水配制)1mL，在4℃下7500×g离心5min；加入20μL DEPC处理水溶解RNA。
2.5荧光定量PCR检测(RT-qPCR)
逆转录反应为每10μL体系加入500ng RNA，参照PrimeScriptTM RT Master MixKit进行实验。
表5：逆转录反应体系
Figure BDA0003746155550000091
表6：逆转录反应条件
Figure BDA0003746155550000092
RT-qPCR反应体系参照TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)Kit。通过2-ΔΔCt方法计算每个基因的相对表达量(GiCF细胞的内参基因用β-actin，HEK293T细胞的内参基因用GAPDH)，RT-qPCR所用引物列于表4。
表7：RT-qPCR反应体系
Figure BDA0003746155550000093
表8：RT-qPCR反应条件
Figure BDA0003746155550000094
2.6细胞上清的病毒拷贝数检测
重组质粒pDsRed-express-N1-ORF121由本实验室构建，浓度用NanoDrop 2000测得。拷贝数(copies/μL)＝6.02×1023(copies/mol)×质粒浓度(ng/μL)×10-9/(重组质粒碱基数×660g/mol)，以10倍梯度稀释的质粒为模板进行RT-qPCR分析，分别以循环数Ct和拷贝数的对数为横纵坐标建立标准曲线，所用引物在表4列出。用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取200μL病毒上清液中的基因组DNA，共洗脱30μL，以病毒基因组DNA为模板，使用与标准曲线相同的引物进行RT-qPCR，将Ct带入标准曲线换算得到病毒拷贝数。
3结果
3.1 CyHV-2感染GiCF细胞与靶向siRNA(shRNA)敲降ORF121
如图1和2所示，siNC(NC)：阴性对照；si145、si237、si303、si424、si687、si777：靶向ORF121的siRNA；shRNA-424：靶向ORF121的shRNA质粒；注：*、***分别表示与阴性对照组相比，p<0.05、p<0.001(n＝3，mean±SEM)。GiCF细胞感染CyHV-2(MOI＝0.1)2h后分别转染6对siRNA，与对照组相比，发现仅si424显著抑制ORF121在mRNA水平的表达；GiCF细胞转染shRNA-424稳定表达后，感染CyHV-2(MOI＝0.1)后48h对细胞上清的病毒拷贝数有明显抑制作用。
3.2 HEK293T细胞过表达ORF121与靶向siRNA敲降ORF121
如图3所示，siNC(NC)：阴性对照；si145、si237、si303、si424、si687、si777：靶向ORF121的siRNA；shRNA-424：靶向ORF121的shRNA质粒；注：**表示与阴性对照组相比，p<0.01(n＝3，mean±SEM)。HEK293T细胞在过表达ORF12124 h后，分别转染6对siRNA，与对照组相比，发现仅si424显著抑制ORF121在mRNA水平的表达。
综上可知，本发明首次发现一种能够抑制CyHV-2立即早期基因ORF121表达的siRNA，在体外输送后能够有效降低ORF121的表达量以及GiCF细胞上清的病毒拷贝数，可以用于制备CyHV-2病毒治疗或减毒株改造的疫苗或药物。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列，包括siRNA和/或shRNA，其中：
siRNA的正义链序列如SEQ ID NO:7所示，siRNA的反义链序列如SEQ ID NO:8所示；
shRNA的正义链序列如SEQ ID NO:15所示，shRNA的反义链序列如SEQ ID NO:16所示。
2.根据权利要求1所述抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列，其特征在于，所述鲤疱疹病毒II型为鲤疱疹病毒II型分离株YC-01。
3.权利要求1或2所述抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列在制备抑制鲤疱疹病毒II型的立即早期基因ORF121表达的试剂中的应用。
4.权利要求1或2所述抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列在制备抗鲤疱疹病毒II型的药物或疫苗中的应用。
5.一种抑制或降低鲤疱疹病毒II型基因表达的试剂盒，其含有权利要求1或2所述抑制鲤疱疹病毒II型立即早期基因ORF121的RNA干扰序列。
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