JP6002382B2 - 遺伝子発現阻害剤及び阻害方法 - Google Patents
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Description
RNA干渉法では、典型的には、標的遺伝子と相同な配列を有する21−23塩基長の二本鎖リボヌクレオチド(siRNA)が用いられ、このsiRNAを細胞内に導入することにより、標的遺伝子の遺伝子発現を抑制できる(特許文献1参照)。
RNA干渉法の成功は、主にsiRNAの設計にかかっており、これまで、修飾塩基の利用やDNAへの置換(特許文献2、非特許文献1参照)など、様々な試みがなされている。
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて9乃至15塩基
(2)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上、好ましくは3’側の塩基から数えて1番目と2番目の2塩基または2番目と3番目の2塩基
(3)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて9乃至15塩基
(4)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上、好ましくは5’側の塩基から数えて1番目と2番目の2塩基または2番目と3番目の2塩基
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて9乃至15塩基の領域
(2)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上の領域、好ましくは3’側の塩基から数えて1番目と2番目の2塩基または2番目と3番目の2塩基
(3)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて9乃至15塩基の領域
(4)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上の領域、好ましくは5’側の塩基から数えて1番目と2番目の2塩基または2番目と3番目の2塩基
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて9乃至15塩基の領域
(2)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて9乃至15塩基の領域
がRNAであって、残りの領域がDNAであり、前記遺伝子発現の阻害活性を有する二本鎖ポリヌクレオチドにおいて、
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から順に、
(2)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から順に、
両方の鎖で少なくとも1塩基ずつRNAに戻した変異二本鎖ポリヌクレオチドを作成する工程と、前記変異二本鎖ポリヌクレオチドについて、前記遺伝子発現の阻害活性と細胞毒性を調べる工程と、を含むスクリーニング方法である。
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて9乃至15塩基の領域
(2)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて9乃至15塩基の領域
がRNAであって、残りの領域がDNAであり、前記遺伝子発現の阻害活性を有する二本鎖ポリヌクレオチドにおいて、
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上の領域
(2)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上の領域
をRNAに戻した変異二本鎖ポリヌクレオチドを作成する工程と、前記変異二本鎖ポリヌクレオチドについて、前記遺伝子発現の阻害活性と細胞毒性を調べる工程と、を含むスクリーニング方法である。
本発明の遺伝子発現阻害剤は、二重鎖領域が15−30塩基長、好ましくは19−23塩基長、より好ましくは19−21塩基長、最も好ましくは19塩基長であって、当該二重鎖領域において、以下の領域(1)〜(4)がRNAであって、残りの領域がDNAである二本鎖ポリヌクレオチドを含有する。なお、本明細書で、二重鎖とは、二重になった2本のポリヌクレオチド鎖からなり、1重のポリヌクレオチド鎖からなる領域は含まないものとし、二本鎖とは、2本のポリヌクレオチド鎖からなればよく、オーバーハングなど1重のポリヌクレオチド鎖からなる領域を含んでも構わないものとする。
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて9乃至15塩基、より好ましくは10乃至11塩基、最も好ましくは11塩基の領域
(2)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて3’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上の領域、好ましくは3’側の塩基から数えて1番目と2番目の2塩基または2番目と3番目の2塩基
(3)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて9乃至15塩基、より好ましくは10乃至11塩基、最も好ましくは11塩基の領域
(4)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上の領域、好ましくは5’側の塩基から数えて1番目と2番目の2塩基または2番目と3番目の2塩基
この遺伝子発現阻害剤を細胞に導入することにより、その細胞内で標的遺伝子の発現を阻害することができる。細胞は、培養細胞でも、組織にあっても、個体(ヒト個体であってもヒト以外の動物個体であってもよい)にあってもよく、細胞タイプも限定されず、それぞれに適した公知の導入方法を用いればよい。標的遺伝子の発現抑制の目的は、特に限定されず、研究であっても医療であってもよく、遺伝子発現阻害剤が試薬であっても医薬であっても構わない。
本発明者らは、二重鎖領域において、第一の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて9乃至15塩基、より好ましくは10乃至11塩基、及び、第二の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて9乃至15塩基、より好ましくは10乃至11塩基がRNAであって、残りがDNAであるような二本鎖ポリヌクレオチド(本明細書では、dsDRCと称する。)は、細胞毒性が弱いが、発現抑制活性も弱いことを知り、その解決法として、第一の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて数塩基、及び、第二の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えてほんの数塩基をRNAに戻すことにより、細胞毒性を増強させずに、発現抑制活性だけを増強できることを見出した。
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて9乃至15塩基の領域
(2)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて9乃至15塩基の領域
がRNAであって、残りの領域がDNAである二本鎖ポリヌクレオチドにおいて
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から順に、
(2)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から順に、
両方の鎖で少なくとも1塩基ずつRNAに戻した変異二本鎖ポリヌクレオチドを作成し、遺伝子発現抑制活性と細胞毒性を調べることにより、遺伝子発現抑制活性が強く、かつ細胞毒性の弱い二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。両方のポリヌクレオチド鎖とも、5番目の塩基まで、好ましくは4番目の塩基まで、さらに好ましくは3番目の塩基まで、RNAへ戻すことで、目的の二本鎖ポリヌクレオチドを見つけることができる。両方のポリヌクレオチド鎖で、RNAに戻す塩基数は異なっていても良く、例えば、4塩基、3塩基、2塩基あるいは1塩基異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。
すなわち、二重鎖領域が19−23塩基長であって、当該二重鎖領域において
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて9乃至15塩基の領域
(2)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて9乃至15塩基の領域
がRNAであって、残りの領域がDNAであり、前記遺伝子発現の阻害活性を有する二本鎖ポリヌクレオチドにおいて、
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上の領域
(2)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上の領域
をRNAに戻した変異二本鎖ポリヌクレオチドを作成し、遺伝子発現抑制活性と細胞毒性を調べることにより、遺伝子発現抑制活性が強く、かつ細胞毒性の弱い二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。
<1> 細胞株
HPV16陽性子宮頸癌細胞株(SiHa)、HPV18陽性子宮頸癌細胞株(HeLa)は、American Type Culture Collectionから購入した。細胞は、10%仔牛血清加ダルベッコ改変MEM(DMEM)を用いて37℃ 、5% CO2存在下で培養した。
初代培養ヒトケラチノサイトHDKに由来するHPV16 E6E7不死化細胞株HDK1E6E7(Haga,T他、Cancer Sci 98:147-154,2007)およびHDK由来TERT不死化細胞株HDK1Tは、清野透博士(国立がんセンター研究所)より供与された。これらケラチノサイト由来の細胞は、ヒト組換え上皮増殖因子およびウシ下垂体抽出物添加ケラチノサイトSFM (インビトロジェン社)を用いて培養した。
HPV16遺伝子(アクセション番号K02718.1)のΔNE6 フラグメント(231-559)と E7フラグメント(562 - 858)が、それぞれpsiCheck-2 (アクセション番号AY535007)に挿入されたプラスミドである16ΔNE6/psiCheck-2及び16E7psiCheck-2(Yamato, K. et al., Cancer Gene Therapy 15:140-153, 2008)から、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子と各断片が融合したRLuc-ΔN16E6断片とRLuc -16E7断片を制限酵素Nhe IとNot Iで切り出し、pZeoSV2のNhe I/Not Iサイトに挿入し、それぞれhRL-ΔN16E6/pZeoSV2およびhRL-16E7/pZeoSV2と命名した。
プラスミドのトランスフェクションにはLipofectamine 2000(インビトロジェン社)を用いた。
また、siNAのトランスフェクションにはLipofectamine RNAiMAX(Invitrogen社)を用いた。具体的には、Lipofectamine RNAiMAX 0.6〜0.8 μLをOpti-MEM I(Invitrogen社)を用いて50 μLに稀釈し、5分間室温で静置後、Opti-MEM Iで50 μL に稀釈したsiRNAと混和し、20分間室温で静置後、培養細胞の培地に0.5 mlに全量を加え、アッセイまでそのまま培養を続けた。不死化ケラチノサイトはトランスフェクション後、5時間通常条件で培養後、培地交換を行い再び培養をおこなった。
プラスミドとsiNAとのコトランスフェクションにはLipofectamine 2000を用いた。
psiCheck-2プラスミド由来ホタルルシフェラーゼ(2532〜4184)を標的とするsiRNA配列FLuc 2900とpsiCheck-2プラスミド由来ウミシイタケルシフェラーゼ(694〜1629)を標的とするsiRNA配列RLuc 1383について、表1及び表2に、siRNA、dsRDCおよびdsRDC RNA置換体の配列を示す。なお、本明細書で、dsRDC-n(nは整数)とは、siRNAにおいてその塩基配列に関わらず、オーバーハングを除く二重鎖部分について、パッセンジャー鎖の3’端より、n個分の塩基をDNAに置換したsiNAを言うものとする。また、dsRDCとは、dsRDC-nの総称とする。そして、dsRDC-nG12...jP12...k(j及びkは整数)とは、dsRDC-nに対し、置換されたDNAのうち、パッセンジャー鎖で1からkまで、ガイド鎖で1からjまでの塩基がRNAに戻されたことを言うものとする。パッセンジャー鎖またはガイド鎖の一方だけがRNAに戻された場合、dsRDC-nG12...jまたはdsRDC-nP12...kとして表される。
各配列を有する21塩基リボヌクレオチドを化学合成し、脱塩後バッファー(100 mM potassium acetate、30 mM HEPES-KOH pH 7.4、2 mM magnesium acetate)中でアニーリングした。
ホタルルシフェラーゼ(FLuc)安定発現SiHa細胞(FL-SiHa-2)(Yamato、K. et al., Cancer Gene Therapy vol.15, p.140-153, 2008)にhRL-ΔN16E6/pZeoSV2またはhRL-16E7/pZeoSV2をトランスフェクション後、G418(1 mg/ml)とZeocin (1 mg/ml)存在下で培養し、FLucとRLuc-ΔNE6あるいはFLucとRLuc-E7を同時に発現するSiHa細胞クローンを分離し、それぞれRLE6-FL-SiHa-10、及びRLE7-FL-SiHa-2と命名した。
レンチウイルス(ViraPower HiPerform Lentiviral Expression System、インビトロジェン社)を用いてそれぞれpsiCheck-2由来firefly luciferase (FLuc) (プロメガ社)とpd2GFP-N1由来d2EGFP(クロンテック社)の組換えレンチウイルスを作成した。FLuc cDNAおよびd2EGFPは、それぞれpsiCheck2およびpd2EGFP-N1プラスミドを鋳型とし、センスおよびアンチセンスプライマー(表7)とPlatinum PCR Supermix High Fidelity(インビトロジェン社)を用いてPCRによって増幅した。PCR産物は、Topoisomerase I(インビトロジェン社)を用いてpCR8/GW/TOPO (インビトロジェン社)に組み込んだ。さらにそこからFLuc cDNAをLR Clonase II (インビトロジェン社)を用いてレンチウイルス発現プラスミドであるpLenti6.3/V5-DEST(インビトロジェン社)に組み込み、このプラスミドをFLuc/pLenti6.3/V5-DESTおよびd2EGFP/pLenti6.3/V5-DESTと命名した。感染性組換えウイルスは、293FT 細胞(インビトロジェン社)にLipofectamine 2000を用いてレンチウイルス発現プラスミドとパッケージングプラスミド (pLP1, pLP2, pLP/VSVG) (インビトロジェン社)をコトランスフェクションすることによって得られた。トランスフェクション24時間後に培地交換をし、さらに96時間後に、感染性ウイルスを回収した。これらを用いてPolybren (6 μg/ml, シグマ アルドリッチ) 存在下でHDK1TとHDK1E6E7に組換えレンチウイルスを感染させ、ブラストシチジン(2μg/ml)で選択し、ルシフェラーゼ発現HDK1T細胞(HDK1T-luc)とEGFP発現HDK1-E6E7細胞(HDK1-E6E7-EGFP)を作成した。
siRNA、dsRDCおよびdsRDC RNA置換体(50 μM溶液)とFCSを1:1で混和、37℃でインキュベーションし、経時的にサンプリングし、Isogen(日本ジーン社)によって核酸を抽出した。サンプルは、10-20% ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後SYBR Gold(インビトロジェン社)で染色し、FLA2000蛍光イメージ解析装置(富士フイルム社)で画像解析をおこなった。
細胞におけるルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの48時間後に、Dual Luciferase Reporter Assay System(プロメガ社)を用いて測定した。
HeLa細胞に、各siNAをLipofectamine RNAiMAXを用いて1 nMまたは2 nMの濃度で導入し、5日目にWST-8によって生存細胞をしらべた。mockを導入した細胞の生存細胞を100%とし、各測定値を相対値で表し、細胞生存率とした。
[実施例1]
本実施例では、siRNAのRNAをDNAに置換すると、遺伝子発現抑制能が低下することを示す。
ここで、siNAとして用いたdsRDC-6およびdsRDC-8では、それぞれsiRNAガイド鎖5’端から6塩基と8塩基、およびそのパッセンジャー鎖相補部分をDNAに置換した(図1A)。なお、対照として、DNAに置換されていないsiRNAを用いた。
本実施例では、dsRDC-8のガイド鎖のDNAを5’端より順次RNAに戻しても、パッセンジャー鎖のDNAを二重鎖部分の3’端より順次RNAに戻しても、抑制活性が事実上回復しないことを示す。
本実施例では、dsRDC-8のガイド鎖及びパッセンジャー鎖のDNAを二重鎖部分の5’端及び3’端より順次RNAに戻すと、両側で2個以上RNAに戻したときに抑制活性が顕著に回復することを示す。
実施例3と同様の実験を、他の標的遺伝子を用いて行った。用いたsiNAの構造を表13にまとめた。また、用いたsiNA、標的遺伝子、細胞の組み合わせを表14にまとめた。そして、図4A-Dには、各濃度におけるルシフェラーゼ活性をプロットしたグラフを示し、表15には、遺伝子発現を50%抑制するsiNAの濃度をまとめた。また、表16には、1.6pM及び8.0pMの濃度で導入した時の遺伝子発現阻害活性(%)を比較した。
本実施例では、dsRDCにおいて置換したDNAを、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の両側鎖で、それぞれ5’端及び3’端より1番目と2番目の2塩基または2番目と3番目の2塩基をRNAに戻したときに、最も効率よく遺伝子発現を抑制できることを示す。
本実施例では、siRNAは細胞毒性が強いこと、dsRDCは細胞毒性が弱く、dsRDCのガイド鎖及びパッセンジャー鎖のDNAを5’端及び3’端より順次RNAに戻すと、両側で3個までRNAに戻しても、細胞毒性が増強しないことを示す。
本実施例では、dsRDCにおいて置換したDNAを、両側鎖で、5’端及び3’端より2塩基ずつRNAに戻したときに、細胞生存に影響を与えず、最も効率よく遺伝子発現を抑制できることを示す。
本実施例では、正常細胞と腫瘍細胞に対し、腫瘍細胞特異的に細胞死を起こさせるsiRNAを導入し、正常細胞生存率/腫瘍細胞生存率を指標とすることにより、本発明のsiNAが最も副作用の少ない医薬として有効であることを示す。
本実施例では、dsRDCにおいて置換したDNAを、両側鎖で、5’端及び3’端より2塩基ずつRNAに戻しても、血清中で安定に存在することを示す。
Claims (7)
- パッセンジャー鎖である第一の鎖とガイド鎖である第二の鎖から成り、二重鎖領域が19−23塩基長であって、当該二重鎖領域において、以下の(1)〜(4)の全ての領域がRNAであって(1)と(3)のRNA領域の塩基数が同一であり、残りの領域がDNAである二本鎖ポリヌクレオチドを含有する遺伝子発現阻害剤。
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて9乃至15塩基までの領域
(2)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上の領域
(3)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて9乃至15塩基までの領域
(4)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上の領域 - 第一の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて1番目と2番目の2塩基及び第二の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて1番目と2番目の2塩基がRNAである、請求項1に記載の遺伝子発現阻害剤。
- 第一の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて2番目と3番目の2塩基及び第二の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて2番目と3番目の2塩基がRNAである、請求項1に記載の遺伝子発現阻害剤。
- 前記二本鎖ポリヌクレオチドを構成する二本のポリヌクレオチド鎖のうち、少なくとも一方が、その3’末端に、1−3塩基のヌクレオチドから成るオーバーハングを有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の遺伝子発現阻害剤。
- 前記オーバーハングを構成する前記ヌクレオチドがDNAであることを特徴とする、請求項4に記載の遺伝子発現阻害剤。
- 細胞内での遺伝子発現阻害方法であって、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺伝子発現阻害剤を、前記細胞(ヒト個体内の細胞を除く)に導入することを特徴とする方法。 - 遺伝子発現を阻害するための二本鎖ポリヌクレオチドのスクリーニング方法であって、
パッセンジャー鎖である第一の鎖とガイド鎖である第二の鎖から成り、二重鎖領域が19−23塩基長であって、当該二重鎖領域において、
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて9乃至15塩基
(2)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて9乃至15塩基
が同数の塩基からなるRNAであって、残りの領域がDNAであり、前記遺伝子発現の阻害活性を有する二本鎖ポリヌクレオチドにおいて、
(1)第一の鎖の当該二重鎖領域の最も3’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上の領域
(2)第二の鎖の当該二重鎖領域の最も5’側の塩基から数えて3塩基までのうちで連続する2塩基以上の領域
の両方の領域をRNAに戻した変異二本鎖ポリヌクレオチドを作成する工程と、
前記変異二本鎖ポリヌクレオチドについて、前記遺伝子発現の阻害活性と細胞毒性を調べる工程と、を含むスクリーニング方法。
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