BR112015002177B1 - Composições para uso no tratamento ou prevenção de uma doença associada com a infecção pelo hpv - Google Patents

Composições para uso no tratamento ou prevenção de uma doença associada com a infecção pelo hpv Download PDF

Info

Publication number
BR112015002177B1
BR112015002177B1 BR112015002177-8A BR112015002177A BR112015002177B1 BR 112015002177 B1 BR112015002177 B1 BR 112015002177B1 BR 112015002177 A BR112015002177 A BR 112015002177A BR 112015002177 B1 BR112015002177 B1 BR 112015002177B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
cancer
nucleotide
seq
sirna
group
Prior art date
Application number
BR112015002177-8A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112015002177A2 (pt
Inventor
Young Kee Shin
Young Deug Kim
Hun Soon Jung
Deuk Ae Kim
Original Assignee
Enhancedbio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Enhancedbio Inc filed Critical Enhancedbio Inc
Publication of BR112015002177A2 publication Critical patent/BR112015002177A2/pt
Publication of BR112015002177B1 publication Critical patent/BR112015002177B1/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/122—Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/336—Modified G
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

COMPOSIÇÃO PARA TRATAR CÂNCER ASSOCIADO COM INFECÇÃO DE HPV. A presente invenção refere-se a uma composição para prevenir ou tratar doenças associadas com vírus do papiloma humano (HPV), e mais especificamente, ao câncer associado a HPV, e ainda mais especificamente, ao câncer cervical. A sequência de nucleotídeos da presente invenção, a sequência em que a base da mesma é modificada, e uma combinação específica da mesma podem ser úteis em uma composição para o tratamento eficaz de doenças associadas com a infecção pelo HPV inibindo significativamente a expressão do gene E6/E7 de HPV tipo 16 ou 18.

Description

CAMPO TÉCNICO
[0001] Este pedido de patente reivindica prioridade de Pedido de Patente Coreana No. 10-2012-0084820, depositado em 02 de agosto de 2012, todo o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência.
[0002] A presente invenção refere-se a uma composição para a terapia de gene para uma doença associada com a infecção pelo HPV, incluindo o câncer cervical.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[0003] Vírus do papiloma humano (doravante, "HPV") de alto risco dos tipos 16 e 18 são os principais fatores de câncer cervical e displasia cervical, e se tornam causas de outros cânceres genitais e um câncer escamoso de cabeça e pescoço. O câncer cervical é um dos tipos mais gerais de tumores malignos em mulheres. Embora a incidência de câncer cervical invasivo tenha sido lentamente reduzida, o câncer cervical invasivo é um câncer ainda mais frequente nas mulheres de países em desenvolvimento, que detém 25% dos cânceres femininos. O HPV é um vírus de DNA pequeno que tem aproximadamente 8.000 sequências de bases que causam tumores benignos ou malignos. Até agora, de acordo com uma diferença genômica, pelo menos, cerca de 100 tipos de HPV foram identificados, e genótipos de aproximadamente 90 HPV foram completamente analisados. Entre estes tipos, tipos de HPV de alto risco (por exemplo, HPV-16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 e 56) referem-se a quase 90% do câncer cervical. Pelo menos 50% de câncer cervical infectado com o HPV referem-se ao HPV tipo 16, e seguido por HPV tipo 18 (12%), HPV tipo 45 (8%), e HPV tipo 31 (5%). Estes HPVs codificam 2 proteínas oncogênicas, que são, as proteínas E6 e E7. Ambas as proteínas estão envolvidas na imortalização das células mediada por HPV e transformação celular. A proteína E6 oncogênica liga-se a proteína supressora de tumor p53 do tipo selvagem, para assim, degradar p53, através de uma via da ubiquitina. Por outro lado, a proteína E7 se liga diretamente a Rb, para desse modo sobrefosforilar Rb. Em primeiro lugar, E6 forma um complexo com uma proteína associada a E6 (E6-AP), que é uma ligase de proteína ubiquitina E3. Em seguida, o complexo E6/E6-AP se liga e p53 de tipo selvagem de ubiqutinato, e, em seguida, interfere com a reação celular mediada por p53 para danos no DNA. Principalmente, a proteína supressora de tumor p53 é regulada por ubiquitinação mediada por Mdm2, no entanto, em células de câncer cervical infectadas pelo HPV, a degradação de p53 está completamente mudada para ubiquitinação mediada por E6 a partir da ubiquitinação mediada por Mdm2. Assim, ao contrário de muitos outros tipos de câncer, a maioria dos casos de câncer cervical infectado pelo HPV tem o gene p53 do tipo selvagem. No entanto, um nível de expressão da proteína p53 é muito baixo devido à degradação consistente pela proteína E6. Particularmente, a proteína E6 HPV tem sido significativamente perceptível como um alvo específico para matar apenas as células cancerosas cervicais. Estas estratégias, o direcionamento para E6 ou complexo E6/E6-AP, incluem vários tratamentos.
[0004] Exemplos incluem: o uso de um agente de toxina celular, um inibidor para liberar zinco da proteína oncogênica E6, um peptídeo de epítopo (mimotopo) mimetizando E6-AP, ribozima anti-E6, um aptâmero de peptídeo que é orientado para a proteína E6 oncogênica de um vírus, siRNA qual é orientado para a proteína E6 oncogênica do vírus, e um tratamento combinado dos mesmos. Recentemente, provou-se que o siRNA silencia seletivamente um gene intrínseco em células animais, e, bem como, silencia seletivamente um gene viral em uma doença causada por um vírus. Interferência de RNA (RNAi) devido à transfecção de siRNA emergiu como uma nova terapia para o tratamento de infecções virais do ser humano. siRNA, o qual é orientado para os genes E6 e E7 em células de câncer cervical infectadas pelo HPV, faz com que o acúmulo de p53 e pRB conduza a apoptose ou a senescência celular. Para uma linhagem celular de câncer cervical infectada por HPV-16 e de uma linhagem celular infectada por HPV-18, verificou-se que RNAi, o qual é orientado para os oncogenes E6 e E7 do vírus, seletivamente pesquisa expressão destas proteínas.
[0005] Enquanto isso, a eficácia de um ácido nucleico tendo várias modificações de ácidos nucleicos (por exemplo, em uma base, um açúcar e/ou fosfato) é melhorada pela inibição da degradação causada pela ribonuclease de soro. Vários exemplos que descrevem modificações de açúcar, base e fosfato, que poderão ser introduzidas para um ácido nucleico, são conhecidos na técnica. Por exemplo, um oligonucleotídeo é modificado para aumentar a estabilidade e/ou aumentar a atividade biológica por meio de uma modificação por um grupo resistente a nuclease, por exemplo, através de modificação de bases de nucleotídeos 2'-amino, 2'-C-alila, 2'-flúor, e 2'-O-metila, 2'-H (vide Eckstein et al., Publicação Aberta à Inspeção Pública PCT WO 92/07065; documento [Perrault et al., Nature 344:565-568, 1990]; documento [Pieken et al., Science 253: 314-317, 1991]; documento [Usman and Cedergren, Trends in Biochem. Sci. 17: 334-339, 1992]; Usman et al. Publicação Aberta à Inspeção Pública WO 93/15187; Sproat, US Patent No. 5,334,711 e documento [Beigelman et al., J. Biol. Chem., 270:25702, 1995]; Beigelman et al., Publicação Aberta à Inspeção Pública WO 97/26270; Beigelman et al., US Patent No. 5,716,824; Usman et al., US Patent No. 5,627,053; Woolf et al., Publicação Aberta à Inspeção Pública WO 98/13526; Thompson et al., US Patent Application No. 60/082,404 (depositado em 20 de abril de 1998); documento [Karpeisky et al., Tetrahedron Lett., 39:1131, 1998]; documento [ERNAshaw and Gait, Biopolymers (Nucleic acid Sciences) 48:39-55, 1998]; documento [Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67:99-134, 1998]; e documento [Burlina et al., Bioorg. Med. Chem. 5: 1999-2010, 1997]). Modificações semelhantes podem ser usadas para modificar o ácido nucleico da presente invenção.
[0006] Em 1999, como um resultado da terapia combinada de quimioterapia e radioterapia baseada em cisplatina, a taxa de sobrevivência das mulheres que têm câncer cervical severo no local foi significativamente melhorada. Atualmente, a cisplatina é uma droga que danifica o DNA, que é amplamente utilizada para tratar cânceres, incluindo o do ovário, cervical, cabeça e pescoço, cânceres de pulmão de células não pequenas e assim por diante. Mais recentemente, um mecanismo de funcionamento de um medicamento à base de platina tem sido investigado. No entanto, ainda não está completamente entendido sobre um processo em células incluindo a reparação do DNA, morte celular, a trajetória do ciclo celular, sinalização de danos de DNA, e regulação da absorção e secreção de uma droga, devido ao tratamento com cisplatina. Em células HPV-18 HeLa, a proteína p53 escapa da degradação mediada por E6 e preferivelmente acumula-se no nucléolo de um núcleo após tratamento com cisplatina. Além disso, as células SiHa HPV-16 recuperam a função de p53 por radioterapia simultânea e tratamento com cisplatina, aumentando assim radiossuscetibilidade.
[0007] Portanto, como um resultado de tentativa de investigar um siRNA eficaz tendo uma nova sequência conferindo uma modificação química a siRNA específico de E6/E7, de modo que o siRNA pode mostrar o efeito anticâncer, sozinhos ou em uma combinação de complexo, ou mostra um efeito sinérgico quando se realiza a terapia de combinação com quimioterapia ou radioterapia convencional, os presentes inventores descobriram que os nucleotídeos listados na seguinte exemplos e reivindicações e combinações particulares destes reduzem a expressão das proteínas relativas TP53 e E7, e mRNA E6 de HPV, e induzem a morte celular, e também comprovado experimentalmente que a eficácia alcançada quando utilizado sozinho ou em combinação com agentes anticâncer é muito melhor do aquele de RNA, que não tem uma modificação de resíduo de sequência de bases.
[0008] Ao longo da especificação, numerosas publicações e documentos de patentes são referenciados, e a citação é indicada. As descrições de periódicos citados e documentos de patentes são aqui incorporadas na sua totalidade por referência para descrever mais claramente o nível do campo técnico ao qual a presente invenção pertence e características da presente invenção.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
[0009] Os presentes inventores estudam continuamente e tentam desenvolver um agente terapêutico genético eficaz para várias doenças causadas por infecção pelo vírus do papiloma humano (HPV). Como resultado, a presente invenção foi completada pela constatação de que quando se utiliza RNA particular para inibir a expressão, que é orientada para um gene E6/E7 de vírus de HPV tipo 16 e HPV tipo 18, ou uma sequência de RNA que tem uma modificação em uma base do RNA, a expressão do gene de HPV é eficazmente inibida, desse modo, para mostrar uma excelente atividade terapêutica em doenças associadas com a infecção pelo HPV, incluindo um câncer cervical.
[00010] Um objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição para a prevenção ou tratamento de uma doença associada com a infecção pelo HPV, mais particularmente, um câncer associado a infecção por HPV, e ainda, mais particularmente um câncer cervical.
[00011] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para prevenir ou tratar uma doença associada com a infecção pelo HPV, mais particularmente, um câncer associado à infecção por HPV, e ainda, mais particularmente um câncer cervical.
[00012] Outros objetivos e vantagens da presente invenção tornam- se claros através da descrição detalhada anexa da invenção, reivindicações e desenhos.
SOLUÇÃO TÉCNICA
[00013] De acordo com um aspecto da presente invenção, a presente invenção proporciona uma composição para tratar ou prevenir uma doença associada com o vírus do papiloma humano (HPV), incluindo a composição, como um ingrediente ativo, uma ou mais sequências de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em sequências de SEQ ID NOs: 16, 22, 28, 34, 40, 66, 72, 84, 90, e 108, e as sequências de nucleotídeos antissentido dos mesmos.
[00014] Os presentes inventores estudam continuamente e tentam desenvolver um agente terapêutico genético eficaz para várias doenças causadas por infecção por HPV. Consequentemente, verificou-se que quando se utiliza RNA particular para inibir a expressão, que é orientado para os genes E6/E7 de vírus de HPV tipo 16 ou HPV de tipo 18, ou uma sequência de RNA que tem uma modificação em uma base do RNA, a expressão do gene do HPV é inibida eficientemente para assim mostrar uma excelente atividade terapêutica em doenças associadas com a infecção pelo HPV, incluindo o câncer cervical.
[00015] De acordo com a presente invenção, as sequências de SEQ ID Nos: 16, 22, 28, 34, e 40 e as sequências de SEQ ID Nos: 72, 84 90, e 108 são sequências de ácido nucleico de RNA para inibir a expressão, em que as sequências de SEQ ID NOS: 16, 22, 28, 34, e 40 são orientadas para vírus de HPV tipos 16; e sequências de SEQ ID Nos: 72, 84 90, e 108 são orientadas para vírus de HPV tipo 16.
[00016] Tal como aqui utilizado, o termo "nucleotídeo" significa um ribonucleotídeo presente em uma forma de único filamento ou duplo filamento, e inclui um análogo de nucleotídeo natural, a menos que de outra forma especificamente indicado (vide Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
[00017] Tal como aqui utilizado, o termo "inibição da expressão" significa para conduzir declínio em uma função de um gene-alvo, e preferivelmente significa que a expressão do gene-alvo tornar-se indetectável ou existe no nível insignificante.
[00018] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a sequência de nucleotídeos da presente invenção é uma sequência de RNA que tem uma capacidade para silenciar genes E6/E7 do vírus de HPV tipo 18, ou HPV tipo 16, e, de preferência, siRNA, shRNA, ou um oligonucleotídeo de antissentido.
[00019] Tal como aqui utilizado, o termo "siRNA" significa RNA de cadeia dupla curta que pode induzir interferência de RNA (RNAi), através da clivagem de mRNA particular. O siRNA consiste em um filamento de RNA de sentido tendo uma sequência homóloga com mRNA de um gene-alvo, e um filamento de RNA antissentido possuindo uma sequência complementar desta. siRNA pode inibir a expressão do gene-alvo, e é, assim, fornecida como um método eficiente de genes knock-down ou um método de terapia gênica.
[00020] siRNA não é limitado tal que siRNA tendo uma parte de RNA de duplo filamento com pares de RNA é completamente pareado; em vez inclui uma parte que não forma um par por causa de incompatibilidade (isto é, uma base correspondente não é complementar), protuberância (ou seja, não existe uma base que corresponde a uma cadeia lateral), e assim por diante. O comprimento total é de 10 a 100 bases, de preferência 15 a 80 bases, e mais preferivelmente 17 a 23 bases. Ambas um extremidade de protuberância e uma extremidade coesiva estão disponíveis como uma estrutura final de siRNA, se for possível, para inibir a expressão do gene-alvo pelo efeito de RNAi. Para a estrutura de extremidade coesiva, ambas uma estrutura de saliência de extremidade 3 e uma estrutura de saliência de extremidade 5 estão disponíveis. O número de bases salientes não é limitado. Por exemplo, o número de bases pode tornar- se 1 a 8 bases, e de preferência 2 a 6 bases. Além disso, o siRNA pode incluir, por exemplo, RNA de baixo peso molecular (por exemplo, moléculas de RNA naturais, tais como tRNA, rRNA e RNA viral, ou moléculas de RNA sintético) em uma parte de uma extremidade final na gama em que o efeito de inibição da expressão do gene-alvo pode ser retido. Na estrutura final de siRNA, não é necessário dispor de uma estrutura de clivagem em ambos os lados, e a estrutura pode ser uma estrutura de laço de haste, em que uma porção de extremidade de um lado de RNA de duplo filamento é ligada por RNA ligante. Um comprimento do ligante não é particularmente limitado, a menos que o comprimento afete pareamento em uma parte da haste.
[00021] Tal como aqui utilizado, o termo "RNA em grampo pequeno (shRNA)" significa 50 a 70 nucleotídeos de filamento simples, e que forma a estrutura de laço de haste in vivo. Em outras palavras, shRNA é uma sequência de RNA para formar uma estrutura em grampo apertado para inibir a expressão do gene através da interferência de RNA. Uma haste de duplo filamento é formada por pareamento de bases de RNA longo tendo de 15 a 30 nucleotídeos complementares em ambos os lados de um local de laço com 5 a 10 nucleotídeos. Para a expressão constitutiva, shRNA é transduzido nas células por meio de um vetor incluindo promotor U6, e na maior parte transferido para as células filhas para transmissão hereditária da inibição da expressão do gene. A estrutura em grampo de shRNA é clivada por um mecanismo intracelular para se tornar siRNA, e, em seguida, liga-se a um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Estes RISCs se ligam a e clivam mRNA. shRNA é transcrito pela RNA polimerase III. De acordo com a presente invenção, a sequência de nucleotídeos da presente invenção pode formar a estrutura de shRNA tendo uma sequência de haste de duplo filamento em ambos os lados do local do laço.
[00022] Tal como aqui utilizado, o termo "microRNA (miRNA)" significa uma molécula de RNA de filamento simples que regula a expressão do gene e inclui de 10 a 50 nucleotídeos de comprimento total, de preferência 15 a 40 nucleotídeos, e mais preferivelmente 17 a 25 nucleotídeos. miRNA é um oligonucleotídeo que não é expresso nas células e tem uma estrutura de haste-laço curta. miRNA é total ou parcialmente homólogo a, pelo menos, um RNA mensageiro (mRNA), e inibe a expressão de genes-alvo através da ligação de complementaridade ao mRNA.
[00023] Tal como aqui utilizado, o termo "oligonucleotídeo antissentido" significa que o RNA contendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de mRNA particular, ou um derivado do mesmo, e inibe a tradução de mRNA em proteína através da ligação à sequência complementar no mRNA. A sequência de nucleotídeos antissentido da presente invenção significa uma sequência de RNA que pode ser complementar ao mRNA de um gene- alvo para se ligar ao mRNA do gene-alvo, e pode inibir a tradução do gene-alvo em mRNA, translocação em citoplasma, maturação, ou outras atividades essenciais para funções biológicas globais.
[00024] Para aumentar a eficácia do oligonucleotídeo antissentido, uma alteração pode ser efetuada em uma posição de uma ou mais das bases, açúcares ou estruturas principais (vide De Mesmaeker et al, Curr. Opin. Struct. Bio.l, 5 (3): 343-55, 1995). A estrutura principal do oligonucleotídeo pode ser modificada com fosforotioato, fosfotriéster, fosfonato de metila, alquila de cadeia simples, cicloalquila, heteroátomo de cadeia simples, sulfonato de açúcar heterocíclico, e assim por diante. Além disso, um ácido nucleico antissentido pode incluir uma ou mais porções de açúcar substituído. O oligonucleotídeo antissentido pode incluir uma base modificada. Exemplos de bases modificadas incluem hipoxantina, 6-metil adenina, 5-metil pirimidina (particularmente, 5-metil citosina), 5-hidroximetil citosina (HMC), HMC de glicosila, HMC de gentobiosila, 2-aminoadenina, 2-tiouracil, 2-tiotimina, 5-bromouracila, 5- hidroximetil uracila, 8-azaguanina, 7-deazaguanina, N6 (6-amino-hexil) adenina, 2,6-diaminopurina, 2-O-metil uracil, 2-O-metilguanina, 2- fluorocitisina, e assim por diante.
[00025] De acordo com uma modalidade mais preferida da presente invenção, a sequência de nucleotídeos da presente invenção é uma sequência de siRNA.
[00026] De acordo com outro aspecto da presente invenção, a presente invenção proporciona uma composição para tratar ou prevenir uma doença associada com a infecção pelo HPV, incluindo a composição, como um ingrediente ativo, uma ou mais sequências de nucleotídeos selecionadas a partir do grupo consistindo nas sequências de SEQ ID NOs: 1, 7, 12, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 51, 56, 62, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102 e 108, e respectivas sequências de nucleotídeos antissentido, que têm uma estrutura principal modificada ou uma ou mais bases modificadas. Em outras palavras, um nucleotídeo tendo as sequências de nucleotídeos listadas acima, em que uma estrutura principal ou uma base é modificada, pode tornar-se a composição da presente invenção para prevenir ou tratar uma doença associada com a infecção pelo HPV.
[00027] As modificações de uma estrutura principal ou uma base a ser aplicada nas sequências de nucleotídeos da presente invenção podem incluir qualquer modificação que é convencionalmente empregue na técnica para aumentar a estabilidade ou a atividade desejada.
[00028] De preferência, a estrutura principal modificada da presente invenção inclui uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em alquilfosfonato, fosforotiolato, fosforoditiolato, alquilfosfonotioato, fosfoamidato, éster de fosfato, carbamato, acetamidato, ésteres de carboximetila, carbonato, e triéster de fosfato.
[00029] Preferivelmente, a base modificada da presente invenção inclui uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo consistindo em metilação, glicosilação e halogenação. Mais preferivelmente, a base modificada da presente invenção é uma base 2'-O metilado ou 2'-fluorado.
[00030] De acordo com a presente invenção, ao transmitir uma modificação, tais como 2'-O-metilação ou 2'-fluoração para uma posição particular de RNA alvo de genes E6/E7 de vírus do HPV tipo 16 ou HPV tipo 18, para a inibição da expressão, em comparação com um molécula de ácido nucleico não modificada, os presentes inventores descobriram que: a eficiência da inibição da expressão do gene-alvo é notavelmente aumentada; estabilidade no soro humano é aumentada; e vida útil é consideravelmente aumentada em, pelo menos, duas vezes em uma experiência farmacocinética em animais.
[00031] 2'-O metilação significa que um grupo hidroxila ligado ao carbono número dois de ribose de uma molécula de RNA é metilado, e assim modificado para um grupo 2'-metóxi; e 2'-fluoração significa que o grupo hidroxila ligado ao carbono número dois de ribose da molécula de RNA é substituído por um grupo flúor e assim modificado para um grupo 2'-flúor.
[00032] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a base 2'-o metilado nos nucleotídeos da presente invenção é U ou G.
[00033] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a base de 2'-fluorado no nucleotídeo da presente invenção é C.
[00034] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a sequência de nucleotídeos da presente invenção, possuindo um ou mais do grupo a base 2'-O metilado ou 2'-fluorado é selecionado a partir do grupo consistindo nas sequências de SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45, 47, 49, 50, 52, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 63, 65, 67, 68, 70, 71, 73, 74, 76, 77, 79, 80, 82, 83, 85, 86, 88, 89, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 100, 101, 103, 104, 106, 107, 109, 110, 112 e 113.
[00035] De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou tratamento de uma doença associada com a infecção pelo HPV, a composição incluindo, como um ingrediente ativo, uma associação de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em: um grupo tendo sequências de nucleotídeo de SEQ ID Nos: 2, 4, 8, 9, 12, e 15; um grupo tendo sequências de nucleotídeos de SEQ ID Nos: 18, 21, 29, e 32; um grupo tendo sequências de nucleotídeos de SEQ ID Nos: 42, 45, 52, e 55; um grupo com sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 58, 59, 63 e 65; um grupo tendo sequências de nucleotídeos de SEQ ID Nos: 68, 71, 91 e 94; e um grupo tendo sequências de nucleotídeos de SEQ ID Nos: 98, 100, 109 e 112.
[00036] De acordo com a presente invenção, os presentes inventores descobriram que quando a sequência de nucleotídeos da presente invenção é utilizada como um grupo, tendo combinação particular, a eficiência da inibição da expressão do gene-alvo é consideravelmente aumentada, quando comparado com o caso em que uma única sequência de RNA é utilizada, de modo que uma atividade terapêutica mais notável para uma doença associada com a infecção pelo HPV é alcançada.
[00037] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, uma doença associada com a infecção pelo HPV a ser tratada pela composição da presente invenção é selecionada a partir do grupo consistindo em verrugas genitais, inflamação da vagina, inflamação pélvica e um câncer, e mais de preferência, um câncer tratado pela composição da presente invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer cervical, câncer da vagina, câncer da vulva, câncer anal, câncer do pênis, câncer da amígdala, câncer da faringe, câncer da laringe, câncer da cabeça e pescoço e adenocarcinoma do pulmão. Mais preferivelmente, o câncer a ser tratado pela composição da presente invenção é o câncer cervical.
[00038] A composição da presente invenção pode ser preparada como uma composição farmacêutica incluindo uma quantidade farmaceuticamente eficaz da molécula de ácido nucleico da presente invenção.
[00039] Tal como aqui utilizado, o termo "quantidade farmaceuticamente eficaz" significa uma quantidade suficiente para atingir a atividade ou eficácia para tratar, aliviar ou prevenir a artrite, tal como descrito acima, da presente invenção.
[00040] Um veículo farmaceuticamente aceitável, que está incluído na composição farmacêutica da presente invenção, é um tipicamente usado na preparação, e inclui, mas não se limita a, lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, borracha de acácia, fosfato de cálcio, alginato, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, xarope, metil celulose, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila, talco, estearato de magnésio, ciclodextrina e um seu copolímero, óleo mineral, e assim por diante. A composição farmacêutica da presente invenção pode ainda incluir um lubrificante, um agente umectante, um agente edulcorante, um agente de favorecimento, um emulsionante, um agente de suspensão, e um agente de conservação além dos componentes acima. Um veículo farmaceuticamente aceitável adequado e uma preparação estão descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995).
[00041] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por via oral ou parentérica, e de preferência administrada por via parentérica. Para administração parentérica, infusão intravenosa, infusão subcutânea, infusão intramuscular, infusão peritoneal, administração tópica, administração transdérmica eadministração intra-articular pode ser utilizada.
[00042] Dose de administração adequada da composição farmacêutica da presente invenção pode ser diferencialmente prescrita, dependendo de vários fatores, tais como um método para a formulação, o modo de administração, idade, peso, sexo, e estados de doença, dieta de doentes, o tempo de administração, uma via de administração, taxa de secreção e uma susceptibilidade à reação. Uma dose de administração preferida da composição farmacêutica da presente invenção é 0,0001-100 mg/kg por dia.
[00043] Quando a composição farmacêutica da presente invenção é utilizada como um agente anticâncer, a composição pode ser utilizada como combinação com a composição anticâncer, tipicamente utilizada na área. Mais especificamente, a composição pode ser administrada combinatoriamente com agentes anticâncer tais como a cisplatina ou paclitaxel.
[00044] A composição farmacêutica da presente invenção é preparada em uma forma de dosagem unitária sendo formulada utilizando um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou excipiente, ou preparada sendo incorporada dentro de um recipiente de múltiplas doses, de acordo com um método através do qual uma pessoa com conhecimentos correntes no campo técnico ao qual a presente invenção pertence pode facilmente realizar. Neste caso, a formulação pode ser uma forma de uma solução, suspensão ou emulsão em um óleo ou em um meio aquoso, ou um extrato, pó, grânulo, comprimido ou forma de cápsula, e pode incluir ainda um agente de dispersão ou um agente estabilizador.
[00045] De acordo com a modalidade mais preferida da presente invenção, a molécula de ácido nucleico da presente invenção está incluída em um sistema de entrega de genes.
[00046] Tal como aqui utilizado, o termo "sistema de liberação de gene" significa um mediador para introduzir um gene-alvo desejado em células sujeitas a expressar. O sistema de entrega de genes ideal deve ser não tóxico para o corpo humano, facilmente produzido em massa, e entregar eficazmente o gene.
[00047] Tal como aqui utilizado, o termo "entrega de genes" significa entregar o gene para as células, e tem o mesmo significado que transdução celular do gene. Ao nível do tecido, o prazo de entrega de genes tem o mesmo significado como propagação do gene. Assim, o sistema de entrega de genes da presente invenção pode ser descrito como o sistema de transdução do gene e o sistema de espalhamento do gene.
[00048] Para preparar o sistema de entrega de genes da presente invenção, a sequência de nucleotídeos da presente invenção está de preferência presente em um construto de expressão adequado. No construto de expressão, é preferível que a sequência de nucleotídeos da presente invenção esteja operacionalmente ligada a um promotor. Tal como aqui utilizado, o termo "operacionalmente ligado a" significa uma ligação funcional entre uma sequência de regulação da expressão de ácido nucleico (por exemplo, um promotor, uma sequência de sinal, ou uma matriz em um sítio de ligação de fator regulador de transcrição) com outras sequências de ácidos nucleicos, e a sequência reguladora regula assim a transcrição e/ou tradução das outras sequências de ácidos nucleicos. Na presente invenção, um promotor, o qual se liga à sequência de nucleotídeos da presente invenção, pode ser operado de preferência em células animais, e mais preferivelmente em células de mamífero para regular a transcrição do gene da relaxina, e inclui, mas não se limita a um promotor derivado de vírus de mamíferos e um promotor derivado de um genoma de células de mamíferos, tais como o citomegalovírus em mamíferos (CMV), promotor tardio de adenovírus, promotor 7,5K do vírus da vaccinia, promotor SV40, promotor de tk de HSV, promotor RSV, promotor alfa EF1, promotor de metalotioneína, promotor da beta-actina, um promotor de gene IL-2 humano, um promotor do gene de IFN humano, um promotor do gene de IL-4 humano, um promotor do gene da linfotoxina humana, um promotor do gene de GM-CSF humano, e promotor U6.
[00049] O sistema de entrega de genes da presente invenção pode ser construído de várias formas que são (i) uma molécula de DNA recombinante nua, (ii) um plasmídeo, (iii) um vetor de vírus, e (iv) um lipossoma ou uma forma perniciosa incluindo a molécula de DNA recombinante nua ou o plasmídeo.
[00050] A sequência de nucleotídeos da presente invenção pode ser aplicada a todo o sistema de entrega de genes utilizados para terapia gênica normal. De preferência, a sequência de nucleotídeos da presente invenção pode ser aplicada a um plasmídeo, adenovírus (Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), adenovírus associado (AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), retrovírus (Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), lentivirus (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), virus da herpes simplex (Chamber R., et al., Proc. Natl. Act. Sci USA 92:1411-1415(1995)), virus da vaccinia (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), um lipossoma (Metho s in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) ou um niossoma.
[00051] Mais preferivelmente, a sequência de nucleotídeos da presente invenção é entregue através da utilização de um lipossoma catiônico.
[00052] De acordo com outro aspecto da presente invenção, a presente invenção proporciona um método para tratar ou prevenir uma doença associada com a infecção pelo HPV, o método incluindo a administração, a um indivíduo, de uma composição farmacêutica incluindo: (a) uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma ou mais sequências de nucleotídeos selecionadas a partir do grupo consistindo nas sequências de SEQ ID Nos: 16, 22, 28, 34, 40, 66, 72, 84, 90, e 108 e as sequências de nucleotídeos antissentido dos mesmos; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00053] De acordo com outro aspecto da presente invenção, a presente invenção proporciona um método para tratar ou prevenir uma doença associada com a infecção pelo HPV, o método incluindo a administração, a um indivíduo, de uma composição farmacêutica incluindo: (a) uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma ou mais sequências de nucleotídeos selecionadas a partir do grupo consistindo nas sequências de SEQ ID Nos: 1, 7, 12, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 51, 56, 62, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102 e 108, e suas sequências de nucleotídeos antissentido que têm uma estrutura principal modificada ou uma ou mais bases modificadas; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00054] De acordo com outro aspecto da presente invenção, a presente invenção proporciona um método para prevenir ou tratar uma doença associada com a infecção pelo HPV, o método incluindo a administração, a um indivíduo, de uma composição farmacêutica incluindo: (a) uma quantidade farmaceuticamente eficaz de grupo de nucleotídeos selecionado a partir do grupo que consiste em: um grupo tendo sequências de nucleotídeos de SEQ ID Nos: 2, 4, 8, 9, 12, e 15; um grupo tendo sequências de nucleotídeos de SEQ ID Nos: 18, 21, 29, e 32; um grupo tendo sequências de nucleotídeos de SEQ ID Nos: 42, 45, 52, e 55; um grupo com sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 58, 59, 63 e 65; um grupo tendo sequências de nucleotídeos de SEQ ID Nos: 68, 71, 91 e 94; e um grupo tendo sequências de nucleotídeos de SEQ ID Nos: 98, 100, 109 e 112; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00055] Uma vez que o método da presente invenção utiliza a presente composição descrita acima, as características comuns a ambos a composição e o método não são aqui descritas para evitar a complexidade excessiva na especificação.
EFEITOS VANTAJOSOS
[00056] As características e benefícios da presente invenção podem ser assim resumidos:
[00057] (a) A presente invenção é para proporcionar uma composição para a prevenção ou tratamento de uma doença associada com vírus do papiloma humano (HPV), mais particularmente, um câncer associado ao vírus do HPV, e ainda, mais particularmente um câncer cervical;
[00058] (b) A sequência de nucleotídeos da presente invenção, uma sequência tendo uma alteração em uma base da sequência de nucleotídeos, e combinação particular da mesma inibe significativamente a expressão dos genes E6/E7 de vírus do HPV tipo 16 ou HPV tipo 18, e é assim utilmente empregue como uma composição ou um método eficiente para o tratamento de uma doença associada com a infecção pelo HPV.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00059] FIG. 1 mostra imagens de resultados que verificam a melhora na estabilidade (FIG. 1a), um aumento em um efeito a nível molecular de uma proteína (FIG. 1b), e um aumento em um efeito a nível molecular de mRNA (FIG. 1c) de acordo com uma modificação substitucional de um resíduo de uma sequência de bases em siRNA de HPV tipos 16 e 18.
[00060] FIG. 2 mostra imagens de resultados que confirmam um excelente efeito de induzir a senescência celular (FIG. 2a) e um excelente efeito de matar células (FIG. 2b) de siRNA tendo resíduo substituído em uma sequência de base do HPV tipo 18.
[00061] FIG. 3 são imagens que mostram o efeito de induzir a senescência celular por tratamento combinado do agente anticâncer, a cisplatina, e 426 siRNA tendo uma substituição em uma sequência de bases de uma linhagem celular de câncer cervical HeLa infectada com o vírus do HPV do tipo 18 (FIG. 3a) e um resultado observado microscopicamente dos mesmos (FIG. 3b).
[00062] FIG. 4 apresentam imagens de resultados que confirmam o efeito terapêutico de um grupo de excelente siRNA tendo uma substituição em uma sequência de base do HPV tipos 16 e 18, e um efeito sinergético com a terapia combinada com cisplatina. As FIGs. 4a, 4b, e 4c, respectivamente, mostram um efeito de inibição de proliferação celular, um efeito de morte celular, e um efeito no nível molecular de uma proteína.
[00063] FIG. 5 mostra imagens de resultados que confirmam um efeito off-alvo de siRNA de HPV tipo 18 em células e animais. As FIGs. 5a e 5b mostram, respectivamente, um efeito de redução de IL-6 em células e um efeito de redução de IFN-gama em animais.
[00064] FIG. 6 mostra uma imagem de resultados que quantificam 426 siRNA de HPV tipo 18 através de PCT em tempo real de laço de haste.
[00065] FIG. 7 mostra uma imagem de resultados que confirmam o fato de que os siRNAs em vários tipos de lipossomas mostram o mesmo efeito de matar células em células.
[00066] FIG. 8 são imagens que mostram um efeito sinérgico, por tratamento combinado de um agente anticâncer e um grupo de siRNAs, que tem uma substituição em uma sequência de bases e mostram o excelente efeito, em uma experiência com animais. As FIGs. 8a, 8b, e 8c mostram, respectivamente, uma variação no tamanho de um tumor de um camundongo, uma imagem do tumor do camundongo, e uma variação no peso corporal do camundongo.
MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO
[00067] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos exemplos. Estes exemplos são proporcionados apenas para descrever especificamente a presente invenção, e será óbvio para um versado na técnica que o âmbito da presente invenção não está limitado aos exemplos de acordo com as características essenciais da presente invenção.
Exemplo MÉTODO EXPERIMENTAL CONSTRUÇÃO DE sIRNA DE HPV TIPOS 16 E 18
[00068] siRNAs nas Tabelas 1 e 2 abaixo são obtidos de Bioneer Corporation (Coreia do Sul) através da produção personalizada. Na tabela abaixo, a sequência de siRNA sublinhada indica um nucleotídeo substituído por um nucleotídeo modificado por Me-2'-O, no qual um grupo metila se encontra ligado a um resíduo da base, e a sequência em itálico espessa indica uma base substituída por nucleotídeo modificado por 2'F em que um grupo hidroxila de um resíduo da base é substituído por flúor. Tabela 1 siRNA para HPV tipo 16
Figure img0001
Figure img0002
Figure img0003
Figure img0004
AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DE siRNA
[00069] siRNA foi misturado com 10% de soro fetal bovino ou 10% de soro humano, enquanto permanecia a 37°C, e as amostras foram colhidas de uma forma baseada no tempo. Em seguida, as amostras foram rapidamente congeladas e armazenadas a -70°C. As amostras coletadas foram submetidas à eletroforese de uma hora e meia sobre 12% em gel de poliacrilamida a 50 V, seguida de coloração Et-Br para medição UV.
CULTURA CELULAR E TRANSDUÇÃO DE siRNA
[00070] Uma célula de câncer cervical, uma linhagem celular de câncer cervical HeLa (ATCC CCL-2) infectada com vírus do HPV tipo 18, ou linhagem celular de câncer cervical SiHa (ATCC HTB-35) ou CaSki (ATCC CRL-1550) infectada com vírus do HPV tipo 16 semeada em uma placa de 6 poços no número de células de 2 x 105 ou 1,6 x 105, respectivamente e cultivadas em RPMI 1640 ou DMEM com 10% de soro bovino fetal adicionada ao mesmo, durante 24 horas, sob a condição de 37°C, e 5% de CO2. Após cultura durante 24 horas no meio para fixar as células à superfície de uma placa de cultura, siRNA não modificado como um controle e um oligonucleotídeo de siRNA modificado pelo método acima descrito como um grupo experimental (20 nM para cada), foram transduzidos utilizando DharmaFECT 1 (Dharmacon, EUA), e o produto resultante foi cultivado durante 24 horas.
TRATAMENTO COM AGENTE ANTICÂNCER
[00071] Uma linhagem celular HeLa ou CaSki, que foi semeada em uma placa de 6 poços em 2 x 105 de células ou 1,5 x 105 células e em seguida cultivadas durante um dia pelo método como descrito acima, foi transduzida com siRNA. Então, cada linhagem celular transduzida foi tratada com cisplatina (CDDP), em uma concentração final de 2,5 uM, e cultivadas.
MEDIÇÃO DE ATIVIDADE DE β-GALACTOSIDASE ASSOCIADA À SENESCÊNCIA CELULAR (SA-β-GAL)
[00072] Pelo método como descrito acima, uma linhagem celular HeLa ou CaSki foi transduzida com siRNA, sozinho ou em combinação com um agente anticâncer, e em seguida cultivada durante um dia. Ao utilizar o kit de ensaio de senescência celular (BioVision, EUA), as células foram lavadas com PBS e tratadas com solução de coloração de SA-β-gal durante 12 horas a 37°C. As células coradas de azul foram observadas utilizando um microscópio óptico geral com a ampliação de 100 a 200 vezes.
MEDIÇÃO DA MORTE CELULAR POR CITOMETRIA DE FLUXO
[00073] Pelo método como descrito acima, uma linhagem celular HeLa ou CaSki foi transduzida com siRNA, sozinho ou em combinação com um agente anticâncer, e em seguida cultivada durante um dia. As células foram coradas e reagidas com Anexina V e reagentes de iodeto de propídio (PI) durante 30 minutos à temperatura ambiente usando kit de ensaio de morte celular (BD, EUA), e, posteriormente, a morte celular foi avaliada utilizando citometria de fluxo.
INVESTIGAÇÃO DE INFLUÊNCIA DE TRATAMENTO DE siRNA
[00074] Pelo método como descrito acima, uma linhagem celular HeLa ou CaSki foi transduzida com siRNA, sozinho ou em combinação com um agente anticâncer, e em seguida cultivada durante um dia. Para observar uma alteração em uma proteína, as células foram rompidas por adição de tampão RIPA de lise celular [150 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM de EDTA, SDS a 0,1%, desoxicolato a 0,5% e 1% de NP-40]. Em seguida, a variação no nível de proteína foi observada através do método western-blot geral. Anti-TP53, anti-E7, e anticorpo antiactina de camundongo foram adquiridos a partir de Santa Cruz (EUA), diluído a 1: 1000, e usado. O anticorpo conjugado HRP IgG anticamundongo de cabra de foi adquirido a partir de Jackson Laboratories (EUA), diluído a 1: 3000, e usado.
[00075] Além disso, para observar a variação no nível de mRNA, células foram rompidas por meio de uma solução de Trizol (Invitrogen, EUA), e o RNA foi detectado passando através da purificação de etanol para assim observar variação no nível de mRNA através do método de reação de cadeia polimerase em tempo real (PCR) geral. INVESTIGAÇÃO DE EFEITO DE INFLUÊNCIA DE OFF-ALVO DE siRNA
[00076] Uma linhagem celular HeLa ou CaSki foi semeada em uma placa de 6 poços, e respectivamente cultivadas durante 24 horas em meio DMEM ou RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino sob a condição de 37°C, e 5% de CO2. β-gal siRNA, que foi um controle positivo, e siRNA foram transduzidas e cultivadas, e, em seguida, o meio foi colhido para executar a IL-6 método geral (BD, EUA) ELISA.
[00077] Um camundongo, com a idade de 6 semanas, foi injetado por via intravenosa com β-gal siRNA como um controle positivo, siRNA como um controle negativo, e siRNA, e a reação continua durante 6 horas. A partir daí, foi colhido sangue de camundongo, e o soro foi separado para realizar ELISA INF-gama (BD, EUA).
PCR EM TEMPO REAL DE HASTE DE LAÇO PARA QUANTIFICAR SIRNA
[00078] Um camundongo pesando cerca de 260 a 300 g (com a idade de 4 semanas) foi injetado por via intravenosa com siRNA, e então o sangue do camundongo foi recolhido para separar o plasma. O plasma separado foi diluído em 0,25% de tampão triton X-100. O cDNA foi sintetizado utilizando o kit de Transcrição Reversa TaqMan microRNA (Applied Biosystem, EUA), e quantificado por PCR em tempo real para detectar siRNA.
ENSAIO DE ANIMAL DE siRNA
[00079] Um camundongo nu feminino foi xenoenxertado com 5 x 106 de células HeLa de HPV tipo 18 e geração de células cancerígenas foi avaliada 10 dias mais tarde. Em seguida, 3 mg/kg de siRNA para ser utilizado foi injetado intravenosamente em caudas no intervalo de 2-3 dias. Cisplatina (2 mg/kg) e paclitaxel (4 mg/kg) foram injetados repetidamente 9 vezes através de uma injeção intraperitoneal, a intervalos de 3-4 dias. O tamanho de um tumor foi medido em intervalos de 2-3 dias.
RESULTADOS EXPERIMENTAIS VARIAÇÃO EM CONCENTRAÇÃO DE TRATAMENTO DE siRNA E NÚMERO DE TRATAMENTO
[00080] Para uma linhagem celular CaSki ou HeLa infectada com HPV tipo 16 ou 18, ao realizar a transdução de siRNA e um tratamento com o agente anticâncer, sozinho ou em combinação, na técnica convencional, a eficácia do siRNA foi verificada no tratamento sucessivo por longo período a uma alta concentração (100 nM), enquanto que o siRNA modificado da presente invenção exibiu excelente eficácia no tratamento único por um curto período a uma baixa concentração (20 nM).
TESTE DE ESTABILIDADE DE siRNA TENDO RESÍDUO SUBSTITUÍDO
[00081] siRNAs de combinação 51 a 54, obtidos pelo método descrito acima, foram misturados com 10% de soro humano. Em seguida, cada siRNA foi feito de um modo baseado no tempo à temperatura de 37°C, e armazenado a -70°C. Em seguida, electroforese em gel foi realizada em 12% de gel de poliacrilamida. A resultante foi corado com Et-Br, e medido com UV. Por conseguinte, como mostrado na FIG. 1a, siRNA de combinação 51 tendo um resíduo não substituído em uma sequência de bases desapareceu dentro de duas horas, enquanto que siRNAs de combinação 52 a 54 tendo resíduo substituído em uma sequência de bases permaneceram pelo menos 4 horas, o que indica um aumento considerável da estabilidade. Em particular, a combinação 54 mostrou estabilidade mais notável que dura ao longo de 24 horas.
EFEITO DE siRNA TENDO RESÍDUO SUBSTITUÍDO NO NÍVEL MOLECULAR
[00082] Pelo método descrito anteriormente, uma linhagem celular de HeLa foi transduzida com siRNAs de combinação de 44 a 50, e siRNA GFP e modelo, e em seguida variação em TP 53, e níveis de proteína E7 foram avaliados, utilizando actina como um gene de manutenção, em que os siRNAs de combinação 44 a 50 foram siRNAs de HPV tipo 18, e modelo e GFP foram controles. Como mostrado na FIG. 1b, a variação no nível de proteína TP53 e E7 de combinação 44 foi comparada com a combinação 45 a 50, em que a combinação 44 tem um resíduo não substituído em uma sequência de base, e uma combinação de 45 a 50 tem um resíduo substituído em uma sequência de bases. Provou-se que a eficácia da combinação 48 para aumentar a expressão da proteína TP53 e para reduzir a expressão da proteína E7 era superior a outras sequências.
[00083] Além disso, para siRNA 497 de HPV tipo 16, uma linhagem celular CaSki foi transduzida com a combinação 12 a 15 segundo o método descrito acima, e em seguida o mRNA foi extraído para avaliar os níveis de expressão de mRNA de E6 e P21. Por conseguinte, como mostrado na FIG. 1c, foi provado que a combinação 13 reduziu em 60% ou mais de mRNA de E6 e aumentou 1100% ou mais de mRNA p21 em relação ao controle, em que, a combinação 13 tem um resíduo substituído em uma sequência de bases. Foi também avaliado que a combinação 13 era superior a outras sequências, comparando com a combinação 12, o qual tem um resíduo não substituído em uma sequência de bases.
EFEITO DE INDUÇÃO DE SENESCÊNCIA CELULAR DE siRNA TENDO RESÍDUO SUBSTITUÍDO
[00084] Atividade SA β-Gal de uma linhagem celular HeLa ou CaSki, que foi tratada pelo método como descrito acima, foi medida. Consequentemente, na FIG. 2a, nos casos em que o HPV 18E6/E7 siRNA e combinação 51 foram transduzidos, a atividade SA-β Gal foi aumentada por cerca de 10 a 20 vezes, enquanto a atividade de Gal SA-β para combinação 54 foi aumentada em 50 vezes ou mais comparando com aquele do siRNA de controle, em que o HPV 18E6/E7 siRNA foi utilizado na invenção anterior; combinação 51 consistiu em 450 siRNA tendo um resíduo não substituído em uma sequência de bases; e combinação 54 consistiu em siRNA tendo um resíduo substituído em uma sequência de bases. O resultado mostrou que o efeito de senescência celular de combinação 54 tendo subestação em uma sequência de bases era consideravelmente melhor do que a combinação de 51 não tendo substituição de uma sequência de bases. EFEITO DE MORTE CELULAR DE siRNA TENDO RESÍDUO SUBSTITUÍDO
[00085] Pelo método descrito acima, um efeito de morte celular foi medido utilizando citometria de fluxo. Como um resultado obtido pelo cálculo do efeito de morte celular por comparação do HPV 18E6/E7, 18E6 siRNA, combinação 48, e combinação 54 (que têm um resíduo substituído em uma sequência de bases) com o de controle, que foi provado que o HPV 18E6/E7 e grupos 18E6 siRNA mostraram efeito de matar células de apenas 15 a 20%, enquanto que os grupos de siRNA tendo um resíduo substituído mostrou que cerca de 60% ou mais do efeito de morte celular, no que diz respeito ao controle (FIG. 2b). O resultado mostrou que as sequências de siRNA com substituição em uma sequência de bases mostrou efeito de matar células de câncer mais significativa do que típico siRNA.
EFEITO DE TRATAMENTO COMBINADO DE CISPLATINA E siRNA TENDO RESÍDUO SUBSTITUÍDO
[00086] Como um resultado de medição da atividade de β-Gal SA por tratamento de uma linhagem celular HeLa com cisplatina e combinação 48 tendo um resíduo substituído em uma sequência de bases pelo método como descrito acima, como mostrado nas FIGs. 3a e 3b, as células foram coradas em azul em linhagens celulares tratadas respectivamente com cisplatina e combinação 48 sozinho, que mostra a atividade de SA β-Gal. No entanto, quase todas as células foram coradas em azul escuro, que indica a atividade de SA β-Gal forte para o grupo de tratamento combinado de combinação 48 e cisplatina. O resultado mostrou que o grupo de tratamento combinado exibiu efeito de senescência celular muito superior ao do grupo de monotratamento de siRNA ou cisplatina.
EFEITO DE INIBIR PROLIFERAÇÃO CELULAR POR MONOTRATAMENTO OU TRATAMENTO COMBINADO DE GRUPO siRNA
[00087] Pelo método descrito acima, as linhagens celulares HPV tipo 16 CaSki foram, respectivamente, tratadas com 20 mM de siRNA combinação 2, 9, e 13 sozinhos, em que a combinação de siRNA 2, 9, e 13 tem uma substituição de sequência de base do HPV tipo 16, e linhagens celulares HPV tipo 16 CaSki foram transduzidas com: o conjunto de combinação 2 e combinação 9 (10 nM, para cada um); o grupo de combinação 2 e combinação 13 (10 nM, para cada um); o grupo de combinação 9 e combinação 13 (10 nM, para cada um); e grupo de combinação 2, combinação 9, e uma combinação 13 (7 nM, para cada um). Então, o número de células foi medido 24 horas mais tarde. Por conseguinte, como mostrado na FIG. 4a, a proliferação celular foi reduzida nos grupos de monotratamento de cada siRNA tendo substituição em uma sequência base, e o grupo de tratamento do grupo siRNA de um modo semelhante. Particularmente, embora cada siRNA tenha sido tratada em uma quantidade de 7 nM, o conjunto de três tipos de siRNA mostrou o efeito equivalente ao caso em que 20 nM de cada siRNA foi tratada.
[00088] Combinação do grupo siRNA aqui utilizado foi mostrada na Tabela 3 abaixo, e grupo siRNA mostrado na Tabela 4 abaixo inclui uma mistura de duas ou mais de combinação tendo os efeitos de inibição de proliferação de células particularmente elevados,. Tabela 3 Combinação de siRNA
Figure img0005
Figure img0006
Figure img0007
Figure img0008
EFEITO DE MORTE CELULAR DE MONOTRATAMENTO E TRATAMENTO COMBINADO DE GRUPO siRNA
[00089] Pelo método descrito acima, uma linhagem celular HeLa HPV tipo 18 foi tratada com a combinação 48 e combinação 54 (20 nm, para cada uma) em que, a combinação de 48 e combinação 20 têm siRNA de HPV tipo 18 tendo subestação em uma sequência de bases, e transduzidas com 10 nM do grupo SP4, que é o conjunto de siRNA de 5 nM de combinação 48 e 5 nM de combinação 54. Após 24 horas, a linhagem celular foi corada com Anexina V e iodeto de propídio, e efeito de morte celular foi medido utilizando citometria de fluxo. Por conseguinte, como mostrado na FIG. 4b, ambos os grupos de monotratamento de siRNA, que têm a substituição em uma sequência base, e o grupo siRNA (SP4) mostraram o efeito de morte de 80% ou mais de células. Como resultado, provou-se que 20 nM do grupo de monotratamento de siRNA mostraram o efeito de morte celular semelhante ao de 10 nM de siRNA do grupo, indicando que o grupo siRNA foi melhor.
EFEITO DE GRUPO SIRNA EM MONO E TRATAMENTO COMBINADO EM NÍVEL MOLECULAR
[00090] Pelo método descrito acima, em umA linhagem celular de HPV CaSki tipo 16, o método de western blot foi usado para comparar um nível de expressão da proteína TP53 para um grupo de tratamento combinado de cisplatina e combinação 2, 9, 13; um grupo de monotratamento de cisplatina; um grupo de tratamento combinado de cisplatina e uma combinação 2 e 9; um grupo de tratamento combinado de cisplatina e uma combinação 2 e 13; um grupo de tratamento combinado de cisplatina e combinação de 9 e 13; e um grupo de cisplatina e grupo SP1 (um grupo de combinação 2, combinação 9, e combinação 13), em que combinação 2, 9 e 13 têm uma substituição na sequência de bases. Por conseguinte, como mostrado na FIG. 4C, entre os grupos de tratamento combinado de grupos de siRNA e cisplatina, a maior aumento no nível de expressão de proteína TP53 foi mostrado no grupo SP1, que foi tratado com baixa concentração de 7 nM.
[00091] O resultado mostrou que uma vez que o grupo consistiu seletivamente em siRNA que era competente e eficiente ao mesmo tempo enquanto imitava características de grupo siRNA de ocorrência natural, é possível misturar e usar em uma concentração inferior à concentração de tratamento típico, e reduzir o efeito off-alvo.
EFEITO OFF-ALVO DE siRNA
[00092] Pelo método descrito acima, linhagem celular de HeLa de HPV tipo 18, foi transduzida com β-gal siRNA como um controle positivo, combinação 44 tendo um resíduo não substituído, e combinação 48 tendo um resíduo substituído em uma sequência de bases. Em seguida, uma experiência de resposta imune de IL-6 foi realizada. Por conseguinte, como mostrado na FIG. 5a, a resposta imune de IL-6 foi aumentada na combinação de controle positivo e 44, enquanto a resposta imune de IL-6 foi reduzida a 1/2 do nível do controle positivo para a combinação 48 tendo um resíduo substituído em uma sequência de bases.
[00093] Além disso, um camundongo, na idade de 6 semanas, foi injetado por via intravenosa com β-gal siRNA e combinação de 44 e 48 do siRNA HPV tipo 18, que fazem surgir resposta imune, e reagidos durante 6 horas para realizar uma experiência de resposta imune do IFN-gama (Fig. 5b). Embora a resposta imune tenha sido observada no β-gal siRNA controle positivo e combinação 44, que foi expresso por um aumento do nível de IFN-gama, a resposta imune não foi observada em combinação 48 uma vez que INF-gama em combinação 48 mostrou um nível semelhante ao do controle negativo e não aumentou.
[00094] Assim, verificou-se que a resposta imune foi reduzida no grupo de tratamento com siRNA tendo um resíduo substituído comparando com aquele siRNA tendo um resíduo não substituído.
EXPERIÊNCIA FARMACOCINÉTICA DE SIRNA TENDO RESÍDUO SUBSTITUÍDO
[00095] Pelo método descrito acima, um camundongo foi injetados intravenosamente com combinação 44 e combinação 48 de siRNA de HPV tipo 18 e, e foi colhido sangue de uma forma baseada no tempo. Em seguida, o plasma foi separado para quantificar siRNA através do método de PCR em tempo real de haste de laço. Por conseguinte, como mostrado na FIG. 6a, uma meia-vida de combinação 48 era pelo menos duas vezes maior do que a combinação 44 significando que a combinação 48, o qual tem um resíduo substituído em uma sequência de bases, é mais estável in vivo.
EFEITO DE siRNA EM VÁRIOS TIPOS DE LIPOSSOMA
[00096] Pelo método descrito anteriormente, uma linhagem celular HeLa de HPV tipo 18 foi transduzida com siRNA usando sistemas de entrega de droga Dharmafect (Dharmacon), Oligofectamine e Lipofectamine 2000 (Invitrgen) disponíveis comercialmente e um lipossoma catiônico preparado pelos presentes inventores. Após 24 horas, o número de células foi medido para avaliar o efeito de inibição da proliferação celular. Por conseguinte, como mostrado na FIG. 7a, siRNA foi efetivamente fornecido a uma linhagem celular infectada com o HPV em diversos sistemas de administração de drogas.
EFEITO DO TRATAMENTO COMBINADO DE GRUPO siRNA E AGENTE ANTICÂNCER
[00097] Pelo método descrito acima, as células cancerosas foram xenoenxertadas em um camundongo. Após 10 dias, a geração de células de câncer foi avaliada. Em seguida, siRNA e um agente anticâncer foram repetidamente injetados 9 vezes, e o tamanho de um tumor foi medido em intervalos de 2-3 dias. Por conseguinte, como mostrado na FIG. 8a, o grupo de tratamento combinado da droga anticâncer e SP4 (um grupo de combinação 48 e 54) mostrou o efeito terapêutico significativamente proeminente do que o grupo de tratamento combinado da droga anticâncer e o grupo de combinação 44 e 51. Verificou-se que SP4 tendo um resíduo substituído em uma sequência de bases mostrou melhor eficácia e efeito do que o grupo siRNA de combinação 44 e 51 tendo um resíduo não substituído em uma sequência de bases. Além disso, como mostrado na FIG. 8b, quando comparado o tamanho de tumores de um camundongo do grupo de administração do agente anticâncer de cisplatina e paclitaxel com aquele do grupo de tratamento combinado do agente anticâncer e grupo SP4 no dia 17, foi comprovado que há grandes diferenças no tamanho e estado. Além disso, como mostrado na FIG. 8c, um resultado obtido pela observação de valores de variação no peso corporal do camundongo no dia 9 e 28 não mostrou nenhuma redução no peso corporal causada pela toxicidade. Assim, determinou-se que não houve efeito colateral causado pela toxicidade de siRNA.
[00098] Até agora, as características específicas da presente invenção são descritas em detalhe. No entanto, será evidente para um versado na técnica que a descrição específica é apenas modalidade preferível, e o âmbito da invenção não está limitado a ela. Por isso, uma margem substancial da presente invenção pode ser definida por meio de reivindicações de acompanhamento e seus equivalentes.

Claims (8)

1. Composição para uso no tratamento ou prevenção de uma doença associada com a infecção pelo HPV, a composição sendo caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais pares de nucleotídeos selecionados do grupo que consiste em: (i) um par de nucleotídeos de: um nucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 1, e um nucleotídeo compreendendo uma sequência antissenso de SEQ ID NO: 1, (ii) um par de nucleotídeos de: um nucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 7, e um nucleotídeo compreendendo uma sequência antissenso de SEQ ID NO: 7, (iii) um par de nucleotídeos de: um nucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 12, e um nucleotídeo compreendendo uma sequência antissenso de SEQ ID NO: 12, (iv) um par de nucleotídeos de: um nucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 56, e um nucleotídeo compreendendo uma sequência antissenso de SEQ ID NO: 56, e (v) um par de nucleotídeos de: um nucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 62, e um nucleotídeo compreendendo uma sequência antissenso de SEQ ID NO: 62, em que o par de nucleotídeos inclui uma ou mais bases modificadas que são selecionadas do grupo que consiste em U 2'-O metilado, G 2'-O metilado e C 2'-fluorado; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o nucleotídeo é RNA de interferência pequeno (siRNA), RNA de grampo curto (shRNA), ou um oligonucleotídeo antissenso (ASO).
3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o nucleotídeo é siRNA.
4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a doença associada à infecção por HPV é selecionada do grupo que consiste em verrugas genitais, inflamação da vagina, inflamação pélvica e um câncer.
5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer cervical, câncer de vagina, câncer de vulva, câncer anal, câncer de pênis, câncer de amígdala, câncer de faringe, câncer de laringe, cabeça e pescoço câncer e adenocarcinoma de pulmão.
6. Composição para uso na prevenção ou no tratamento de uma doença associada com a infecção pelo HPV, a composição sendo caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma quantidade farmaceuticamente eficaz de conjunto de nucleotídeos selecionado do grupo que consiste em: um conjunto de sequências de siRNA compreendendo sequências de nucleotídeos consistindo em SEQ ID Nos: 2, sequências de nucleotídeos consistindo em SEQ ID Nos: 4, sequências de nucleotídeos consistindo em SEQ ID Nos: 8, sequências de nucleotídeos consistindo em SEQ ID Nos: 9, sequências de nucleotídeos consistindo em SEQ ID Nos: 12 e sequências de nucleotídeos consistindo em SEQ ID Nos: 15; e um conjunto de sequências de siRNA compreendendo sequências de nucleotídeos consistindo em SEQ ID Nos: 58, sequências de nucleotídeos consistindo em SEQ ID Nos: 59, sequências de nucleotídeos consistindo em SEQ ID Nos: 63 e sequências de nucleotídeos consistindo em SEQ ID Nos: 65; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a doença associada à infecção por HPV é selecionada do grupo que consiste em verrugas genitais, inflamação vaginal, inflamação pélvica e um câncer.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer cervical, câncer da vagina, câncer da vulva, câncer anal, câncer do pênis, câncer da amígdala, câncer da faringe, câncer da laringe, câncer da cabeça e pescoço e adenocarcinoma do pulmão.
BR112015002177-8A 2012-08-02 2013-08-01 Composições para uso no tratamento ou prevenção de uma doença associada com a infecção pelo hpv BR112015002177B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120084820A KR101520383B1 (ko) 2012-08-02 2012-08-02 Ｈｐｖ 감염과 관련된 암의 치료용 조성물
KR10-2012-0084820 2012-08-02
PCT/KR2013/006963 WO2014021667A1 (ko) 2012-08-02 2013-08-01 H p v 감염과 관련된 암의 치료용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112015002177A2 BR112015002177A2 (pt) 2017-11-07
BR112015002177B1 true BR112015002177B1 (pt) 2022-09-27

Family

ID=50028269

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112015002177-8A BR112015002177B1 (pt) 2012-08-02 2013-08-01 Composições para uso no tratamento ou prevenção de uma doença associada com a infecção pelo hpv

Country Status (13)

Country Link
US (3) US9719093B2 (pt)
EP (6) EP3699279A1 (pt)
JP (4) JP2015529654A (pt)
KR (1) KR101520383B1 (pt)
CN (1) CN104884096B (pt)
AU (1) AU2013297196B2 (pt)
BR (1) BR112015002177B1 (pt)
CA (2) CA2880777C (pt)
ES (1) ES2851904T3 (pt)
MX (2) MX2015001428A (pt)
RU (2) RU2636003C2 (pt)
UA (1) UA117563C2 (pt)
WO (1) WO2014021667A1 (pt)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105505929A (zh) * 2014-09-26 2016-04-20 中國香港貝億生物科技有限公司 针对hpv16e6基因的小干扰rna及其应用
KR20170139055A (ko) * 2015-04-16 2017-12-18 에이비온 주식회사 백금계 항암제에 의해 유도된 세포 내 증가된 p53 수준을 유지시키는 방법 및 이의 활용
KR20160133293A (ko) * 2015-05-12 2016-11-22 에이비온 주식회사 Hpv 바이러스의 발암 유전자 발현 저해물질을 유효성분으로 포함하는 암세포 감작용 조성물

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2093664C (en) 1990-10-12 2003-07-29 Fritz Eckstein Modified ribozymes
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
CA2135646A1 (en) * 1992-05-11 1993-11-25 Kenneth G. Draper Method and reagent for inhibiting viral replication
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5716824A (en) 1995-04-20 1998-02-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-alkylthioalkyl and 2-C-alkylthioalkyl-containing enzymatic nucleic acids (ribozymes)
CA2237891C (en) * 1995-11-15 2013-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes complementary to human papillomavirus nucleic acid and related methods and kits
EP0886641A2 (en) 1996-01-16 1998-12-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of methoxy nucleosides and enzymatic nucleic acid molecules
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
DE19924668A1 (de) 1999-05-28 2000-11-30 Bayer Ag Substituierte alpha-Phenyl-beta-Ketosulfone
WO2003008573A2 (en) 2001-07-17 2003-01-30 Anne Josephine Milner Silencing of gene expression by sirna
WO2004011647A1 (en) 2002-07-26 2004-02-05 Chiron Corporation Modified small interfering rna molecules and methods of use
EP2000160A3 (en) * 2002-10-30 2009-03-11 Gambro Lundia AB Method and apparatuses for determining the efficiency of dialysis
EP1560931B1 (en) * 2002-11-14 2011-07-27 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
US20040198640A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-07 Dharmacon, Inc. Stabilized polynucleotides for use in RNA interference
US7732166B2 (en) 2005-11-15 2010-06-08 Oncohealth Corporation Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer
CN101410518A (zh) * 2006-03-24 2009-04-15 诺瓦提斯公司 治疗HPV感染的dsRNA组合物和方法
MX2008012173A (es) * 2006-03-24 2008-10-03 Novartis Ag Composiciones de arnds y métodos para el tratamiento de infecciones por el virus de papiloma humano (hpv).
DE102006035618A1 (de) 2006-07-31 2008-02-07 Curevac Gmbh Nukleinsäure der Formel (I): GlXmGn, insbesondere als immunstimulierendes Adjuvanz
WO2008033413A2 (en) 2006-09-14 2008-03-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
KR100962301B1 (ko) * 2006-11-03 2010-06-11 재단법인서울대학교산학협력재단 자궁경부암을 위한 치료용 조성물
JPWO2008139938A1 (ja) * 2007-05-02 2010-08-05 国立大学法人 東京医科歯科大学 ヒトパピローマウイルス１６型遺伝子を標的とする二本鎖核酸分子及びそれを含む医薬
EP2173875B1 (en) 2007-06-15 2017-08-30 Cequent Pharmaceuticals, Inc. Bacteria mediated gene silencing
US20110130440A1 (en) * 2008-03-26 2011-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Non-natural ribonucleotides, and methods of use thereof
WO2010057009A1 (en) 2008-11-14 2010-05-20 Cequent Pharmaceuticals, Inc. E. coli mediated gene silencing of beta-catenin
WO2010129941A1 (en) 2009-05-08 2010-11-11 Becton, Dickinson And Company Correlation of hpv e6 and e7 expression with progression of cervical disease
AU2009356969B2 (en) 2009-12-23 2014-05-15 Colgate-Palmolive Company Oral care implement
KR101197627B1 (ko) * 2010-01-18 2012-11-07 (주)레퍼런스바이오랩 Ｈｐｖ 감염과 관련된 암의 치료용 조성물
WO2012016139A2 (en) * 2010-07-29 2012-02-02 Sirnaomics, Inc. Sirna compositions and methods for treatment of hpv and other infections

Also Published As

Publication number Publication date
US20180044679A1 (en) 2018-02-15
EP3757213A1 (en) 2020-12-30
US20150299711A1 (en) 2015-10-22
RU2015106855A (ru) 2016-09-27
EP3699279A1 (en) 2020-08-26
EP3178498B1 (en) 2020-11-18
US9719093B2 (en) 2017-08-01
KR101520383B1 (ko) 2015-05-15
US20170198291A1 (en) 2017-07-13
JP6727381B2 (ja) 2020-07-22
AU2013297196A1 (en) 2015-03-19
ES2851904T3 (es) 2021-09-09
RU2636003C2 (ru) 2017-11-17
EP3178498A2 (en) 2017-06-14
CN104884096B (zh) 2022-05-24
RU2664466C1 (ru) 2018-08-17
CA2880777C (en) 2020-06-30
CA2880777A1 (en) 2014-02-06
AU2013297196B2 (en) 2017-01-05
JP2016190845A (ja) 2016-11-10
MX2020002286A (es) 2020-07-13
EP3178498A3 (en) 2017-09-27
CA3075050C (en) 2022-05-17
KR20140018560A (ko) 2014-02-13
CN104884096A (zh) 2015-09-02
JP2018109058A (ja) 2018-07-12
UA117563C2 (uk) 2018-08-27
WO2014021667A1 (ko) 2014-02-06
JP6347433B2 (ja) 2018-06-27
EP2881123A4 (en) 2016-07-06
BR112015002177A2 (pt) 2017-11-07
MX2015001428A (es) 2016-01-20
US10221418B2 (en) 2019-03-05
JP2015529654A (ja) 2015-10-08
CA3075050A1 (en) 2014-02-06
EP3699278A1 (en) 2020-08-26
EP2881123A1 (en) 2015-06-10
EP3722425A1 (en) 2020-10-14
JP2019194234A (ja) 2019-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2743600T3 (es) Métodos de tratamiento de los trastornos inflamatorios vasculares
JPWO2008139938A1 (ja) ヒトパピローマウイルス１６型遺伝子を標的とする二本鎖核酸分子及びそれを含む医薬
JP6727381B2 (ja) Ｈｐｖ感染に係わる癌の治療用組成物
Li et al. LncRNA-PVT1 activates lung fibroblasts via miR-497-5p and is facilitated by FOXM1
KR101197627B1 (ko) Ｈｐｖ 감염과 관련된 암의 치료용 조성물
US10709729B2 (en) Compositions and methods for inhibiting expression of ADAMTS-5 and ADAM17
JPWO2020116537A1 (ja) がん処置用ＲＮＡｉ分子
Xu et al. Effect of silencing key proteins in telomerase mechanism and alternative lengthening of telomeres mechanism in laryngeal cancer cells
US20110039909A1 (en) Methods and materials for reducing gli2 expression
WO2014115889A1 (ja) 血管内皮細胞の活性化に起因する疾患の治療又は予防剤
WO2017159739A1 (ja) 抗がん剤
US20180135055A1 (en) Composition for cancer cell sensitization containing as active ingredient substance inhibiting expression of oncogene of hpv virus
Guncay Evaluation of LNA Gapmer efficacy in FSHD patients' muscle cells
CN113038955A (zh) 用于抑制乙型肝炎病毒复制的组合物

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06I Publication of requirement cancelled [chapter 6.9 patent gazette]

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 6.6.1 NA RPI NO 2462 DE 13/03/2018 POR TER SIDO INDEVIDA.

B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: ENHANCEDBIO INC. (KR)

B07G Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE DEVOLUCAO DO PEDIDO EM FUNCAO DA REVOGACAO DO ART. 229-C DA LEI NO 9.279, DE 1996, POR FORCA DA LEI NO 14.195, DE 2021

B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 01/08/2013, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS

B21F Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time

Free format text: REFERENTE A 11A ANUIDADE.