JP2000500342A - ヒトパピローマウイルス核酸に相補的な核酸プローブおよび関連する方法およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＨＰＶ１６型および／または１８型核酸配列を標的とし、ＨＰＶ１６型および／または１８型の検出を助けるのに有用なオリゴヌクレオチドを記載する。オリゴヌクレオチドは、各種の方法、例えばハイブリダイズアッセイプローブ、ヘルパープローブ、および／または増幅プライマーとして作用することにより、ＨＰＶ１６型および／または１８型を検出することを助けることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトパピローマウイルス核酸に相補的な核酸プローブ および関連する方法およびキット発明の分野 本発明は一般に、ヒトパピローマウイルス（以下”ＨＰＶ”と称する）核酸に 相補的な核酸プローブ、そのようなプローブを用いる方法、およびそのようなプ ローブを含むキットに関する。特に、試験試料、例えば膣スワブ、子宮頸部スワ ブ、尿道スワブ、組織試料、体液、または実験溶液中のＨＰＶ１６型および／ま たは１８型を検出するのに有用な各種のタイプのオリゴヌクレオチドプローブ（ 例えば、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパーオリゴヌクレオチ ドおよび増幅オリゴヌクレオチド）が記載される。発明の背景 本発明の背景の以下の記載およびここに引用される文献は、本発明に対する先 行技術であると認めるものではない。 パピローマウイルスは小さいＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは、あ る範囲の良性状態（良性病変および良性腫瘍を含む）に関連し、および／または その原因であると考えられている。パピローマウイルスはまた、悪性腫瘍、例え ば常染色体疾患であるゆうぜい状表皮発育異常症を有する患者における扁平上皮 細胞癌、および男性および女性両方の生殖器癌と関連している。 現在、少なくとも５９種類の異なる型のＨＰＶが特性決定されている（Ｍａｎ ｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；９９８−１００ ０；５ｔｈ ｅｄ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃ．ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９１を参照）。異なるＨＰＶ変種のゲノムは、すべての型の間で類似してい るようである（Ｖａｎ Ｒａｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．，７ ３：２６５３−６０，１９９２）。それにもかかわらず、ＨＰＶは、ウイルスの 異なる株のＤＮＡ配列における相違に基づいてタイプ分けされてきた（同上）。 これらのＨＰＶ型のうち、生殖器癌と関連しているものはＨＰＶ１６，１８， ３１，３３および３５型である。これらの５つの株は、すべての子宮頸癌の８０ ％ 以上に集合的に見いだされ、その原因としての役割が示唆されている。 ＨＰＶ１６型および１８型の抗原検出は記載されているが、市販の血清はすべ てのパピローマウイルスが共有する抗原と反応することが報告されている（Ｒｏ ｍａｎ ａｎｄ Ｆｉｆｅ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２：１６ ６−１９０，１９８９）。さらに、抗原陽性標本のパーセンテージは、疾患の重 篤度が軽度形成異常から上皮内癌、および浸潤癌へと増加するにつれて減少する ことが報告されている（同上）。 インビボでは、ＨＰＶ ＤＮＡは、エピソームにおよび宿主ゲノムへのインテ グレートの両方で見いだされる。ＨＰＶゲノムは８−１０種の蛋白質をコードす るオープンリーディングフレームを含むが、それらの蛋白質のすべてが同定され ているわけではない。これらのオープンリーディングフレームの多くは、”初期 ”または”後期”転写事象を表す接頭辞ＥまたはＬを付して称されるが、”初期 ”と称されるもののすべてが実際に初期に転写されるわけではなく、また逆も同 じである。 ＨＰＶ１６型および１８型のＥ６領域の検出のためのある種のプライマーおよ びオリゴヌクレオチドプローブは、Ｌｕｃｏｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃ ｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ７：３３９−３４４，１９９３；Ｄｅ Ｂｒｉｔｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｏｂｓｔ．Ｇｙｎｅｃ．８１：１９−２４，１９９３；Ｎｕｏｖ ｏ，，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：５３−５８，１９９１ ；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３６ ：２７９−２８２，１９９２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ．３６：５４−６，１９９２；Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ，ｅｔ ａｌ ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２４３−１２４６，１９９０，Ｈｕｓ ａｎｄ ＭｃＮｉｃｏｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ６：４５９−４６ ６，１９９２；Ｓａｎｇ ａｎｄ Ｂａｒｂｏｓａ Ｖｉｒｏｌ．１８９：４４ ８−４５５，１９９２；Ｊｏｓｅｐｈ，欧州公開０４７７９７２；Ｊｏａｎｎｅ ｓ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０２２１７；Ｅｍｅｒｙ，ｅｔ ａｌ ．，国際公開ＷＯ９２／０１８１５；Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ，国際公開ＷＯ９１／ ０８３１２，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７０５７；Ｍａｎｏｓ，ｅｔ ａｌ ．， 米国特許５，１８２，３７７；Ｈｅｒｚｏｇ，，ｅｔ ａｌ．，米国特許４，９ ８３，７２８；Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ａｄａｍｓ，国際公開ＷＯ８９／０ ２９３４;Ｇｅｏｒｇｅ ａｎｄ Ｇｒｏｆｆ,国際公開ＷＯ８９／０９９４０； Ｎｕｒ，ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／１４８４７；Ｍａｚｚａｔｅｎｔｅ ，ｅｔ ａｌ．，欧州特許公開ＥＰＯ４８９４４２；Ｓｈｉｍａｄａ，ｅｔ ａ ｌ．，欧州特許公開ＥＰＯ４０２１３２；およびＭｏｒｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．， 国際公開ＷＯ８８／０６６３４；（これらのすべての全内容を本明細書の一部と してここに引用する（図面を含む））に記載されている。発明の概要 本発明は、ＨＰＶ１６型および／または１８型を検出するのに有用なオリゴヌ クレオチド、これらのオリゴヌクレオチドを製造し使用する方法、およびこれら のオリゴヌクレオチドを含むキットを特徴とする。本発明のオリゴヌクレオチド は、ハイブリダイゼーションアッセイオリゴヌクレオチド、増幅オリゴヌクレオ チドおよびヘルパーオリゴヌクレオチドを含む。各種のオリゴヌクレオチドは、 異なる様式で、ＨＰＶ１６型および／または１８型の検出を助けることができる 。 ハイブリダイゼーションアッセイプローブオリゴヌクレオチドは、ＨＰＶ１６ 型および／または１８型領域を標的とし、および好ましくは標識されている。こ れらのオリゴヌクレオチドは、ＨＰＶ１６型および／または１８型変種を他のＨ ＰＶ変種（例えば、ＨＰＶ６，１１，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５ ２，または５８型）と区別するのに特に有用である。ハイブリダイゼーションア ッセイオリゴヌクレオチドのための標的領域には、ＨＰＶ１６型および／または １８型に特異的に見いだされる核酸、またはそれに相補的な核酸配列が含まれる 。相補的な核酸は、よく知られる標準的な核酸増幅技術を用いて製造することが できる。 増幅プライマーを用いて、ＨＰＶ標的核酸を用いる増幅反応を開始することが できる。プライマーは、標的領域の３’側の標的核酸の領域にハイブリダイズす るように設計される。プライマーを用いて、増幅を開始し、標的領域に相補的な 核酸のコピーを合成することができる。使用される増幅プライマーに依存して、 各種のタイプの増幅を実施することができる。例えば、標的配列の３’側の領域 にハイブリダイズする増幅プライマーと、相補的標的配列の３’側の領域にハイ ブリダイズする増幅プライマーのと対をＰＣＲ増幅において用いることができる 。標的配列の３’側の領域にハイブリダイズし、プロモーターにより認識される プロモーター配列（例えばバクテリオファージＴ７，Ｔ３またはＳＰ−６により 用いられるもの）を有するプライマーを用いて、標的配列に相補的な核酸を多数 コピー合成することができる。 ヘルパープローブは、ハイブリダイゼーションアッセイオリゴヌクレオチドの その標的配列へのハイブリダイゼーションを容易にするのに特に有用である。ヘ ルパープローブは、標的領域中またはその周りの核酸の二次構造を変更すること を助ける。ヘルパープローブの使用は、Ｈｏｇａｎ ａｎｄ Ｍｉｌｌｉｍａｎ ，米国特許５，０３０，５５７（この全体を図面を含め本明細書の一部としてこ こに引用する）に記載されている。本発明はまた、ＨＰＶを検出するためのハイ ブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための、１つまたはそれ以上の標識 プローブおよび少なくとも１つのヘルパープローブを含むプローブミックス、お よびＨＰＶ核酸を検出し増幅する方法を特徴とする。 プローブ、その相補物、またはＲＮＡ同等物を用いて、選択的ハイブリダイゼ ーションアッセイ条件下でＨＰＶ１６型および／または１８型の標的核酸配列領 域に優先的にハイブリダイズすることにより、ＨＰＶ１６型および／または１８ 型を密接に関連する系統発生学的近縁類から区別することができる。本明細書に 開示されるハイブリダイゼーションアッセイプローブは、試験試料、例えば、唾 液、尿、血液、組織切片、尿生殖器分泌物、尿生殖器スワブおよび他の臨床試料 の試料中に存在するＨＰＶ１６型および／または１８型の存在を検出するのに、 および／またはＨＰＶ１６型および／または１８型の量を決定するのに特に有用 である。 ハイブリダイゼーションアッセイオリゴヌクレオチドプローブは、ＨＰＶ標的 配列に完全に相補的な、または実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。一方 ではＨＰＶ１６型および／または１８型を、他方では異なるＨＰＶ変種を区別す るように設計された領域を有することに加え、ハイブリダイゼーションアッセイ プローブはまた、ＨＰＶ標的核酸の別のストレッチに相補的な１つまたはそれ以 上の追加の核酸配列または相補的でない核酸配列を有することができる。例えば 、追加の配列は、ＨＰＶ１６型および／または１８型および他のＨＰＶ変種の両 方に相補的であってもよく、またはＨＰＶ１６型および／または１８型、または ＨＰＶ変種に相補的でなくてもよく、または、ハイブリダイゼーションプローブ がＨＰＶ１６型および／または１８型を他のＨＰＶ変種、例えばＨＰＶ６，１１ ，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，または５８型から区別すること ができる限り、ＨＰＶ変種に対してわずかに高い程度の相補性を有していてもよ い。 ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、ストリンジェントなハイブリダ イゼーションアッセイ条件下で、安定かつ検出可能なハイブリッドプローブ：標 的デュープレックスを形成するのに十分に、標的配列を含む核酸に相補的である 。ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、好ましくは、１０−１００ヌク レオチドの長さであり、より好ましくは１４−５０ヌクレオチドの長さである。 さらにより好ましくは、プローブは、１８−４０ヌクレオチドの長さである。ハ イブリダイゼーションアッセイプローブは、好ましくは、プローブに取り込ませ たレポーター基成分、例えば放射性同位体、蛍光成分、化学発光成分、酵素、ま たはリガンドで標識する。これらの成分を用いて、プローブのその標的配列への ハイブリダイゼーションを検出または確認することができる。ハイブリダイゼー ションアッセイプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセ イ条件下でＨＰＶ１６型および／または１８標的核酸配列領域に優先的にハイブ リダイズすることにより、ＨＰＶ１６型および／または１８を他の型のＨＰＶ、 または一般的な生理的寄生菌から区別しうるオリゴヌクレオチドである。Ｉ．ハイブリダイゼーションアッセイプローブ すなわち、本発明の１つの観点においては、本発明は、選択的ストリンジェン シーハイブリダイゼーション条件下でＨＰＶ１６型および／または１８型標的核 酸とハイブリダイズして検出可能な標的：プローブデュープレックスを形成する ことができるが、好ましくはＨＰＶ６，１１，３１，３３，３５，３９，４５， ５１，５２，および／または５８型からの核酸とは検出可能な非標的：プローブ デュープレックスを形成しないであろうオリゴヌクレオチドを含むハイブリダイ ゼーションアッセイプローブを特徴とする。オリゴヌクレオチドは、標的領域中 に存在する１０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドの標的配列に少なくと も７０％（好ましくは８０％，より好ましくは９０％，そして最も好ましくは１ ００％）相補的な核酸の配列を含む。標的領域は、以下の表Ａを参照することに より、よりよく理解されるであろう。 好ましくは、標的領域は、配列番号９−１２，１７−２０，２９−３２，３３ −３６，４５−４８，および７３−７６に記載される配列からなる群より選択さ れる配列を含み、ここで、前記標的領域は、配列番号５−８，２５−２８，５７ −６０，６５−６８，７７−８０，および８１−８４に記載される配列からなる 群より選択される配列中に存在する配列からなる。好ましいオリゴヌクレオチド は、配列番号５−１２，１７−２０，２５−３６，４５−４８，５７−６０，６ ５−６８および７３−８４に記載される配列を有するか、本質的にその配列から なるか、その配列からなるか、またはその配列と実質的に同様である。 プローブは単離された核酸である。”単離された核酸”との用語は、ヒトの介 在のない、天然に見いだされない形（例えば、外来核酸との組換え、合成された もの、単離されたものまたはある程度精製されたもの）で存在するオリゴヌクレ オチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、単離された核酸は、少なくとも ７５％均一である。プローブはまた、追加のヌクレオチドがストリンジェントな ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションを妨害しない限り、標 的領域に連続する核酸配列に相補的な追加のヌクレオチドを含んでいてもよく、 また、標的領域に相補的ではないヌクレオチドを含んでいてもよい。相補的では ない配列、例えばプロモーター配列、ＲＮＡ転写のための結合部位、制限エンド ヌクレアーゼ認識部位、または所望の二次または三次構造を与える配列、例えば 触媒的活性部位を用いて、検出および／または増幅を容易にすることができる。 ”オリゴヌクレオチド”、”ヌクレオチドポリマー”または”核酸”とは、一 緒に共有結合した２つまたはそれ以上のヌクレオチドサブユニットを意味する。 ヌクレオチドサブユニットの糖部分は、リボース、デオキシリボース、またはそ れらの修飾された誘導体、例えば２’−Ｏ−メチルリボースでありうる。ヌクレ オチド塩基は、オリゴヌクレオチドのその相補的な標的核酸への優先的ハイブリ ダイゼーションを妨害しない非ヌクレオチド成分により修飾されていてもよい。 ヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合、修飾された結合または非 ヌクレオチド成分等の、オリゴヌクレオチドのその相補的な標的核酸への優先的 ハイブリダイゼーションを妨害しない連結により結合されていてもよい。修飾さ れた結合には、標準的ホスホジエステル結合が異なる結合、例えばホスホロチオ エート結合またはメチルホスホネート結合により置き換えられているものが含ま れる。 ”選択的ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件”とは、本発明のプ ローブおよび標的配列が互いにハイブリダイズして、ＨＰＶ１６型および／また は１８型をＨＰＶ６，１１，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，また は５８型または他のＨＰＶ変種から区別するのに用いることができる、検出可能 なプローブ：標的デュープレックスを形成することを可能とするパラメータの組 を意味する。これらのパラメーターの詳細な記載は、以下の”好ましい態様の記 載”中の節ＩＣ”ハイブリダイゼーションアッセイプローブの構築および使用” に与えられる。１つの例として、選択的ストリンジェンシーハイブリダイゼーシ ョン条件は、６０−７０℃で、好ましくはほぼ等モル量のＮａ₂ＨＰＯおよびＮ ａＨ₂ＰＯ₄、約１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０１−０．０３％のドデシル硫酸 ナトリウムを含む０．１０Ｍ−０．１４Ｍのリン酸緩衝液を含む。 好ましい態様においては、標的領域は： （ａ）配列番号９−１２，１７−２０，２９−３２，および３３−３６に記載さ れる配列からなる群より選択される配列を含むか、または配列番号５−８，およ び２５−２８に記載される配列からなる群より選択される配列からなり； （ｂ）配列番号４５−４８，および７３−７６に記載される配列からなる群より 選択される配列を含むか、または配列番号５７−６０，６５−６８，７７−８０ ，および８１−８４に記載される配列からなる群より選択される配列からなり； （ｃ）ＤＮＡまたはＲＮＡであり； （ｄ）配列番号３３−３６，および４５−４８に記載される配列からなる群より 選択される配列を含み； （ｅ）配列番号９−１２，１７−２０，２９−３２，および７３−７６に記載さ れる配列からなる群より選択される配列を含み；および／または （ｆ）配列番号５−８，２５−２８，５７−６０，６５−６８，７７−８０，お よび８１−８４に記載される配列からなる群より選択される配列からなる。 別の特に好ましい態様においては、プローブは、５０−６０℃で、０．９−１ ．１％のラウリル硫酸リチウムを含む０．０４Ｍ−０．０６Ｍのコハク酸リチウ ム 緩衝液中で、ＨＰＶ１６型および／または１８型の核酸に優先的にハイブリダイ ズし、ＨＰＶ６，１１，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，および／ または５８型にはハイブリダイズせず、ここで、前記ハイブリッドは、ＨＰＶＩ ６型および／または１８型の検出については安定であり、ＨＰＶ６，１１，３１ ，３３，３５，３９，４５，５１，５２，および／または５８型の検出について は安定ではない。 ”優先的にハイブリダイズする”との用語は、ストリンジェントなハイブリダ イゼーションアッセイ条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイプローブがそ の標的核酸にハイブリダイズして、検出されて標的核酸の存在を指示しうる安定 なプローブ：標的ハイブリッドを形成するが、プローブはその条件下で十分な数 の安定なプローブ：非標的ハイブリッドを形成せず密接に関連した非標的核酸の 存在を示さないことを意味する。ＨＰＶ１６型および／または１８型に”密接に 関連した”生物には、ＨＰＶ６，１１，３１，３３，３５，３９，４５，５１， ５２，または５８型が含まれる（Ｖａｎ Ｒａｎｓｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅ ｎ Ｖｉｒ．，７３：２６５３−６０，１９９２を参照）。 好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０個またはそれ以上の連続するヌクレ オチドの前記標的配列に少なくとも９０％相補的な配列を含み、より好ましくは オリゴヌクレオチドは、１０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドの前記標 的配列に１００％相補的な配列を含む。さらに別の好ましい態様においては、オ リゴヌクレオチドは、１０−１００ヌクレオチドの長さ、１４−５０塩基の長さ 、４０ヌクレオチド以下の長さ、または２３−４０塩基の長さである。オリゴヌ クレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラー ゼによる伸長の開始を促進する第２のオリゴヌクレオチド配列に連結されていて もよい。ＩＩ．核酸ハイブリッド 本発明の別の観点は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびそれに 実質的に相補的な核酸配列を有するＨＰＶ核酸分子から形成される検出可能な核 酸ハイブリッドを含む組成物に関する。ハイブリッドは、二本鎖の水素結合領域 を含む安定な核酸構造であり、好ましくは１０−１００ヌクレオチドの長さであ る。”ハイブリッド”との用語には、ＲＮＡ：ＲＮＡ，ＲＮＡ：ＤＮＡ，または ＤＮＡ：ＤＮＡデュープレックス分子が含まれる。核酸ハイブリッド中に存在す るハイブリダイゼーションプローブは、上述の配列の１つを有する。 ”実質的に相補的な”との用語は、核酸配列がストリンジェントなハイブリダ イゼーションアッセイ条件下で標的核酸領域に優先的にハイブリダイズしうるこ とを意味する。好ましくは、プローブは、対応する標的領域に相補的な少なくと も１０個の連続するヌクレオチド塩基の領域を有する。より好ましくは、プロー ブは、対応する標的領域に相補的な少なくとも１４個の連続するヌクレオチド塩 基の領域を有する。 ハイブリッドは好ましくは、ＨＰＶ１６型および／または１８型の検出につい て安定であり、ＨＰＶ６，１１，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２， および／または５８型の検出については安定ではなく、さらに核酸合成の開始の ための部位を含んでいてもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条 件下で、前記オリゴヌクレオチドは好ましくはＨＰＶ１６型および／または１８ 型の核酸に特異的にハイブリダイズし、ＨＰＶ６，１１，３１，３３，３５，３ ９，４５，５１，５２，または５８型にはハイブリダイズしない。ＩＩＩ．ヘルパープローブ 本発明の別の観点においては、本発明は、オリゴヌクレオチドを含むヘルパー プローブを特徴とする。ここで、前記オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブ リダイズするであろう配列を含み、前記標的配列は、配列番号６２，６４，１１ ８，１２０，１２２，１２４，１２６，および１２８からなる群より選択される 配列を有するか、本質的にその配列からなるか、その配列からなるか、またはそ の配列と実質的に同様である。 好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドは、配列番号６１，６３，１１ ７，１１９，１２１，１２３，１２５，および１２７からなる群より選択される 配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドと実質的に同一である（少な くとも７０％）。特に好ましい態様においては、ヘルパープローブはこれらの配 列からなる。 オリゴヌクレオチドが１０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドの前記サ ブ配列に少なくとも９０％相補的であることが好ましく、より好ましくは１０個 またはそれ以上の連続するヌクレオチドの前記サブ配列に１００％相補的である 。オリゴヌクレオチドは、好ましくは１０−１００ヌクレオチドの長さ、１５− ５０塩基の長さ、４０ヌクレオチド以下の長さ、または２３−４０塩基の長さで ある。 好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号６１，６３，１１７，１１９，１２ １，１２３，１２５および１２７に記載される配列を有するか、本質的にその配 列からなるか、その配列からなるか、またはその配列と実質的に同様である。ＩＶ．プローブミックス 本発明の別の観点においては、本発明は、少なくとも１つのハイブリダイゼー ションプローブおよび少なくとも１つのヘルパープローブを含む、ハイブリダイ ゼーションアッセイにおいて用いるためのプローブミックスを特徴とする。ヘル パープローブを用いて、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてプローブ：標 的デュープレックスのハイブリダイゼーションを容易にすることができる。ヘル パープローブは、標的：ハイブリダイゼーションプローブデュープレックスの速 度論および／またはＴｍを高くすることによりハイブリダイゼーションを容易に する。ヘルパープローブは、ＨｏｇａｎおよびＭｉｌｌｉｍａｎ、米国特許５， ０３０，５５７（その全体を図面を含め本明細書の一部としてここに引用する） に記載されている。 詳しくは、ヘルパーオリゴヌクレオチドは、標的核酸に結合し、標的に異なる 二次および三次構造を与えてアッセイプローブの標的への結合を容易にするよう に設計する。得られるアッセイプローブと標的核酸とのハイブリッドもまた、ヘ ルパーオリゴヌクレオチドの不在下でプローブを加えて得られるハイブリッドよ り高いＴｍを示す。この二次および三次構造の実質的な部分は核酸ハイブリダイ ゼーションに通常用いられる条件下（例えば高温、塩の存在、促進剤の存在等） では失われないため、この残った構造は、ヌクレオチド多量体（例えば、プロー ブとして用いられるＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマー）とリボソームＲＮＡまたは 他の一本鎖核酸（例えば、プローブが標的とするｍＲＮＡまたはＤＮＡ）中のそ れに相補的な配列との間のハイブリッド形成を立体的に阻害するか、またはブロ ックしさえする。この阻害は、ＲＮＡまたはＤＮＡのプローブが標的とする部位 以外の部位に結合し、一本鎖核酸の標的領域に新たな二次および三次構造を与え 、このことによりプローブの結合速度を加速する”ヘルパー”オリゴヌクレオチ ドを用いることにより減少させ、および排除しさえすることができる。すなわち 、ハイブリダイゼーションの速度は、実質的に増加し、または、それでなければ アッセイについて適当な、ヘルパーを用いなければ、実質的なハイブリダイゼー ションは生じない速度および条件下でハイブリダイゼーションが生ずることが可 能となる。 好ましい態様においては、プローブミックスの核酸ハイブリダイゼーションア ッセイプローブ成分は、ＨＰＶ１６型および／または１８型の存在を検出するこ とができ、配列番号９，１１，１７，１９，２９，３１，３３，３５，４５，４ ７，７３，および７５に記載される配列からなる群より選択される配列からなる か、または、配列番号５，７，２５，２７，５７，５９，６５，６７，７７，７ ９，８１，および８３に記載される配列からなる群より選択される配列からなる 第１の核酸標的領域に完全に相補的な１７個の連続する塩基のうち少なくとも１ ４個を有する、１０−１００塩基の長さの第１のオリゴヌクレオチドを含む。ハ イブリダイゼーションアッセイプローブは、好ましくは、選択的ハイブリダイゼ ーション条件下で、ＨＰＶ１６型および／または１８型をＨＰＶ６，１１，３１ ，３３，３５，３９，４５，５１，５２，および／または５８型から区別する。 すなわち、前記条件下で、前記ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｈ ＰＶ１６型および／または１８型のＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイズして検 出可能なプローブ：標的デュープレックスを形成するが、ＨＰＶ６，１１，３１ ，３３，３５，３９，４５，５１，５２，および／または５８からの非標的核酸 にはハイブリダイズせず検出可能なプローブ：非標的デュープレックスを形成し ない。 また、好ましい態様においては、プローブミックスのヘルパープローブ成分は 、配列番号６１，６３，１２１，１２３，１２５および１２７に記載される配列 からなる群より選択される配列を含むか、または配列番号１１７および１１９に 記載される配列からなる群より選択される配列からなる第２の標的配列に少なく と も７０％相補的な第２のオリゴヌクレオチドを含む。 ハイブリダイゼーションアッセイプローブまたはヘルパープローブに関しては 、”実質的に同様の”ヌクレオチド配列は、特定のヌクレオチド配列と同一であ るかまたはヌクレオチド塩基の１０％以下の相違を有し（ＲＮＡまたはＤＮＡ同 等ヌクレオチドの置換、例えば、ＴでＵを置換、またはＵでＴを置換することを 除く）、ハイブリダイゼーションアッセイプローブまたはヘルパープローブが、 ＨＰＶ１６型および／または１８型を検出するために用いられるストリンジェン トなハイブリダイゼーション条件下でＨＰＶ１６型および／または１８型核酸に ハイブリダイズすることを可能とするヌクレオチド配列である。増幅オリゴヌク レオチドに関しては、”実質的に同様の”ヌクレオチド配列は、特定のヌクレオ チド配列と同一であるかまたはヌクレオチド塩基の２０％以下の相違を有し（Ｒ ＮＡまたはＤＮＡ同等ヌクレオチドの置換、例えば、ＴでＵを置換、またはＵで Ｔを置換することを除く）、増幅オリゴヌクレオチドが増幅条件下でＨＰＶ標的 核酸の増幅をプライミングするかまたは開始することを可能とするヌクレオチド 配列である。 ”本質的に・・・からなる”または”本質的に・・・からなること”との句は 、オリゴヌクレオチドが、特定されたヌクレオチド配列と実質的に同様のヌクレ オチド配列を有し、 好ましくは追加の４ヌクレオチドを越えて長くはなく、２ヌクレオチドを越えて 短くないことを意味する。すなわち、これらの句は、配列の長さの制限および配 列変更の限定の両方を含む。本質的に特定されたヌクレオチド配列からなるオリ ゴヌクレオチドの任意の付加、置換または欠失は、その基本的かつ新規な特性、 力、その標的に特異的にハイブリダイズしプローブまたはプライマーとして機能 する能力を奪わない。例えば、ハイブリダイゼーションおよびヘルパープローブ に関しては、任意の付加、置換または欠失は、それらのプローブが、ストリンジ ェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、その標的核酸に非標的核酸 より優先的にハイブリダイズしうることを妨害しないであろう。増幅オリゴヌク レオチドに関しては、任意の付加、置換または欠失は、それが増幅条件下で増幅 反応を開始させて標的ＨＰＶ核酸を形成しうることを妨害しないであろう。Ｖ．増幅オリゴヌクレオチド 別の観点においては、本発明は、ＨＰＶ１６型および／または１８型核酸配列 を増幅する増幅オリゴヌクレオチドを特徴とする。オリゴヌクレオチドは、標的 配列中に存在する１０個またはそれ以上の連続する核酸のサブ配列に少なくとも ７０％相補的な領域を有する核酸の配列を含む。標的配列は、配列番号２，４， １４，１６，２２，２４，３８，４０，４２，４４，５０，５２，５４，５６， ７０，７２，８６，８８，９０，９２，９４，９６，１０２，１０４，１０６， １０８，１１０，１１２，１１４，および１１６に記載される配列からなる群よ り選択される配列を有するか、本質的にその配列からなるか、その配列からなる か、またはその配列と実質的に同様である。 好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドは、 （ａ）配列番号３７，３９，９３，９５，１０１，および１０３に記載される配 列からなる群より選択される配列； （ｂ）配列番号１，３，９，１１，１３，１５，２１，２３，４９，５１，５３ ，５５，６９，７１，８９，９１，１０５，１０７，１０９，１１１，１１３， および１１５に記載される配列からなる群より選択される配列；または （ｃ）配列番号４１，４３，８５，および８７に記載される配列からなる群より 選択される配列 の中に存在する１０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドのサブ配列と少な くとも７０％同一であるＤＮＡまたはＲＮＡである。オリゴヌクレオチドは、好 ましくは１０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドの前記サブ配列と少なく とも９０％同一であり、より好ましくは１０個またはそれ以上の連続するヌクレ オチドの前記サブ配列と１００％同一である。オリゴヌクレオチドは、好ましく は１０−１００ヌクレオチドの長さ、１５−５０塩基の長さ、４０ヌクレオチド 以下の長さ、または２３−４０塩基の長さである。 別の観点においては、本発明は、ＨＰＶ標的領域に結合し、それを介して伸長 し、またはそれを転写するのに有用な増幅オリゴヌクレオチドを特徴とする。増 幅オリゴヌクレオチドの５’末端に位置し、プロモーター配列として作用するも のは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる 開始または伸長を促進する配列である。同じ増幅オリゴヌクレオチドの３’末端 に位置するものは、ＨＰＶ１６型および／または１８型に対して標的ハイブリダ イズ領域として作用する１つまたはそれ以上の配列である。 ”ＲＮＡおよびＤＮＡ同等ヌクレオチド”とは、同等の塩基対ハイブリダイゼ ーション特性を有するＲＮＡおよびＤＮＡ分子を表す。ＲＮＡおよびＤＮＡ同等 物は、異なる糖基（リボース対デオキシリボース）を有し、ＲＮＡ中ではウラシ ルが、ＤＮＡ中ではチミンが存在することにより異なるであろう。ＲＮＡおよび ＤＮＡ同等物の間の相違は、実質的に同様の核酸塩基配列における相違に寄与し ない。 増幅オリゴヌクレオチドは、好ましくは１０−１００ヌクレオチドの長さ、よ り好ましくは２２−４４ヌクレオチドの長さである。増幅オリゴヌクレオチドは 、ブロックされた３’および／または５’末端または付加物等の修飾を有してい てもよく、例えば、ＲＮＡポリメラーゼにより認識される特定の核酸配列（例え ば、Ｔ７，Ｔ３，またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列 ）、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の開始または伸長を増強する配列が挙 げられるが、これらに限定されない（Ｋａｃｉａｎ，ｅｔ ａｌ．，米国特許５ ，３９９，４９１、その全体を図面を含め本明細書の一部としてここに引用する ）。 増幅オリゴヌクレオチドは、Ｋａｃｉａｎ ａｎｄ Ｆｕｌｔｚ（上掲）によ り記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応または転写付随増幅反応等、例えば ＲＮＡポリメラーゼおよびリバーストランスクリプターゼを用いる方法等の核酸 増幅方法において用いることができる。他の転写に基づく増幅系は、Ｓｎｉｎｓ ｋｙ，ｅｔ ａｌ．，米国特許５，０７９，３５１に記載されている。これらの 参考文献の両方とも、本明細書の一部としてここに引用する。好ましくは，ＲＮ Ａポリメラーゼ、例えばＴ７，Ｔ３またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼにより認 識されるプロモーターを、転写に基づく増幅に用いる。 ”増幅”との用語は、少なくとも１つの特異的標的核酸配列を有する核酸分子 の数を増加させることを意味する。標的配列を含むオリゴヌクレオチドの増幅を 増加させるためには、本出願人は、好ましくは二本鎖プロモーター領域を含む標 的鋳型鎖を生成してＲＮＡポリメラーゼの鋳型とする増幅系を用いる。標的鋳型 増幅は、好ましくはリバーストランスクリプターゼのＤＮＡポリメラーゼ活性に より認識されるプライマーを用いて実施する。ＶＩ．増幅および検出の方法 本発明の別の観点においては、核酸を１つまたはそれ以上の本発明のプローブ で増幅させることにより、試料中のＨＰＶ１６型および／または１８型核酸を選 択的に増幅させる方法が提供される。 本発明のさらに別の観点においては、本発明は、ＨＰＶ１６型および／または １８型を含む可能性のあるの試料中のＨＰＶ１６型および／または１８型を検出 する方法を特徴とする。この方法は、 ａ）前記試料に１つまたはそれ以上の本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッ セイプローブを提供し、そして ｂ）ＨＰＶ１６型および／または１８型の存在を指示する前記検出可能なプロー ブ：標的デュープレックスの形成を検出する、 の各工程を含む。 好ましい態様においては、標的核酸は増幅プローブで増幅し、検出プローブで 検出する。特定の増幅プローブと特定の検出プローブとの最も好ましい組み合わ せの例（すなわち、最良のミックス組み合わせ）は、本明細書に記載される実施 例において示される。 別の観点においては、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ，ヘルパープ ローブおよび増幅オリゴヌクレオチドを用いて、ＨＰＶ１６型および／または１ ８型を検出し、ＨＰＶ１６型および／または１８型を密接に関連した生物から区 別する方法が記載される。これらの増幅アッセイは、試験すべき試料中の標的核 酸を増幅し、増幅された配列を、ストリンジェントなハイブリダイゼーションア ッセイ条件下で、密接に関連する生物中に存在する核酸よりＨＰＶ１６型および ／または１８型核酸に優先的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションアッ セイプローブと接触させ、ハイブリダイズしたプローブを検出または測定するこ とを含む。 試料は、好ましくは臨床試料、例えば唾液、尿、血液、尿生殖器分泌物、臨床 スワブ、組織切片または臨床試料から単離された核酸である。より好ましくは、 増幅アッセイを用いてＨＰＶ１６型および／または１８型を臨床試料から直接検 出する。臨床試料から直接検出するとは、増幅アッセイを実施する前に試料の培 養が不要であることを意味する。 好ましくは、増幅アッセイは、上に掲げたものの１つからなるハイブリダイゼ ーションプローブを用いる。増幅アッセイの好ましい態様において用いるための ヘルパープローブは、配列番号１１７−１２８からなる群より選択される配列を 有するかまたはその配列と実質的に同様である。ＶＩＩ．キット 本発明はまた、本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブまたはプロ ーブミックスの１つまたはそれ以上を含むキットを特徴とする。キットは、本明 細書に記載される検出の方法を実施するために必要なすべての試薬、例えば、１ つまたはそれ以上の本明細書に記載される増幅オリゴヌクレオチドまたはヘルパ ープローブを含む。キットは、１つまたはそれ以上の容器手段、生成物挿入標識 、および／または緩衝溶液を含んでいてもよい。当業者は、本発明のプローブを 当該技術分野においてよく知られる確立されたキット様式中に容易に取り込ませ ることができることを認識するであろう。 ＨＰＶを標的とするオリゴヌクレオチドは、ＨＰＶ１６型および／または１８ 型の異なる種および株に独特の特定の核酸配列の存在を検出することにより、Ｈ ＰＶの同定および定量の迅速、客観的かつ感度の高い方法を提供する。本発明の プローブを用いて、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、臨床試料からの ＨＰＶを同定することができる。増幅アッセイにおいて増幅工程とハイブリダイ ゼーションアッセイとを組み合わせることにより、標的の量を増大させ、したが ってアッセイの感度を高めることができる。ＨＰＶ１６型および１８型の両方と も同じ反応容器中で増幅し検出することができる。特別に設計したミスマッチプ ライマーは、同じ反応容器中で、ＨＰＶ１６型および／または１８型を別々にま たは同時に増幅することができる。プローブは、ＨＰＶ１６型および／または１ ８型の非スプライスおよび不均一ｍＲＮＡスプライスを検出することができる。 本発明のプローブのいくつかは、ｍＲＮＡ標的の検出を排除するように設計され 、これはある種の応用において有利であろう。 本発明の他の特徴および利点は、以下の本発明の好ましい態様の記載および特 許請求の範囲から明らかであろう。好ましい態様の説明 以下は、ＨＰＶ核酸、オリゴヌクレオチドプローブを製造し使用する方法、お よびそのようなプローブを含むキットの記載である。特に、臨床試料、例えば膣 スワブ、子宮頸部スワブ、尿道スワブ、組織試料、体液または実験溶液等の中の ＨＰＶ１６型または１８型を検出するのに有用な、各種タイプのオリゴヌクレオ チドプローブ（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ，ヘルパーオ リゴヌクレオチドおよび増幅オリゴヌクレオチド）が記載される。図面の簡単な説明 図１および２はそれぞれ、ＨＰＶ１６型およびＨＰＶ１８型ゲノム中のＥ６領 域の描写である。上の線は、ゲノムの示される塩基対（縦線）の間の部分を表す 。その下の線は、スプライシングアクセプター部位および転写の間に切り出され てｍＲＮＡのＥ６^*またはＥ６^**種のいずれかを生成するｍＲＮＡの部分を示す （切り出される領域は三角の下に示される。すなわち、図１において、ＨＰＶ１ ８型ＲＮＡの塩基２３３−４１６の間の領域は、転写の間に切り出されて、Ｅ６^* ｍＲＮＡとなる）。さらにその下の線は、以下の実施例の節で用いた（特定の 実施例番号は、線の左側に示される）、すなわち、ＨＰＶ１６型またはＨＰＶ１ ８型のＥ６，Ｅ６^*，またはＥ６^**ｍＲＮＡのいずれかを増幅して検出するため に用いた、好ましいプローブ、プライマーおよび増幅オリゴヌクレオチドを表す （隣接する配列番号とともに示される矩形）。Ｉ．ハイブリダイゼーションアッセイプローブの構築および使用 Ａ．プローブの設計 デオキシリボ核酸（”ＤＮＡ”）またはリボ核酸（”ＲＮＡ”）の鎖は、特定 の配置すなわち配列で連結したヌクレオチド単位から形成される。ヌクレオチド は、それぞれ１つの”塩基”構造を含み、それが含有する塩基により互いに区別 される。塩基には、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、グアニン （Ｇ）、ウラシル（Ｕ）またはイノシン（Ｉ）が含まれる。 ヌクレオチド中の塩基の構造は、塩基のある対が水素結合の形成により互いに 相互作用することを可能とする。一般に、Ａは、ＴまたはＵと水素結合し、Ｇは Ｃと水素結合する。したがって、鎖の任意の点において、伝統的な塩基対である ＡＴまたはＡＵ，ＴＡまたはＵＡ，ＧＣ，またはＣＧを見いだすことができる。 また、ＡＧ，ＧＵおよび他の”ゆらぎ”もしくはミスマッチした塩基対も見いだ される。水素結合しうる塩基は、互いに相補的であるといわれる。 ＤＮＡ又はＲＮＡの２個の一本鎖は特異的に整列し、会合して（“ハイブリダ イズして”）、２本の鎖が相補的塩基の対の間に形成される水素結合によって一 緒に維持される二本鎖構造を形成することができる。核酸の第１の一本鎖が第２ の一本鎖に対して充分な連続した相補的塩基を含有し、これらの２つの鎖をそれ らのハイブリダイゼーションを促進する条件下で一緒にすると、二本鎖核酸が生 ずる。適当な条件下で、二本鎖ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ、またはＲＮＡ ／ＲＮＡハイブリッドが形成されうる。一定の二本鎖ハイブリッドが形成される 確率を低下させる条件は、ハイブリッド形成の可能性がより小さい条件よりもス トリンジェントな条件であるといわれる。 プローブは一般に、検出が求められる”標的配列”を含む、本質的にその配列 からなる、またはその配列からなる核酸オリゴヌクレオチド”標的領域”にある 程度相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸である。これは、検出可能な成分、例 えば、放射性同位体、抗原または化学発光成分を含んでいてもよい。特定の核酸 を検出するための方法としての核酸ハイブリダイゼーションの使用の背景的解説 は、Ｈｏｇａｎら、”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｄｅ ｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ−Ｖ ｉｒａｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”と題する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３ ００９に記載されており、このすべてを図面を含めて本明細書の一部としてここ に引用する。 当業者に知られ、本明細書に記載される方法を用いて、ＨＰＶ１６型および／ または１８型からのＲＮＡまたはＤＮＡ配列の領域が同定された。各種生物から の各種のヌクレオチド配列を有する核酸を、保存一次配列に基づいて相同領域中 で整列させることができる。本明細書に記載されるハイブリダイゼーションアッ セイプローブのための潜在的標的配列は、整列した配列の相同性における変異に 注目することにより同定した。 領域のそれぞれにおける配列進化はたいてい分枝的である。この分枝性のため 、ＨＰＶ１６型および／または１８型のより離れた系統発生学的類縁物の対応す るＤＮＡ領域は、ＨＰＶ１６型および／または１８型のＲＮＡまたはＤＮＡと、 系統発生学的に近い類縁物のＤＮＡが示すよりもより大きい相違を示す。ＨＰＶ １６型および／または１８型と、その最も近い既知の系統発生学的類縁物である ＨＰＶ６，１１，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，または５８との 間の十分な変化が観察され、予期される標的部位の同定およびこれらの生物の核 酸の間を区別するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブの設計を 可能とした。Ｂ．オリゴヌクレオチドプローブ ＨＰＶ１６型および／または１８型に特異的なハイブリダイゼーションアッセ イプローブを設計し、これらのプローブを用いて、ＨＰＶ１６型および／または １８型を検出し、これらの株を互いに、およびこれらと最も密接に関連する分類 学的または系統発生学的近縁物と区別するための特異的アッセイに用いることに 成功した。これらのプローブはまた、ＨＰＶ１６型および／または１８型のため の増幅アッセイにおいて機能することが示された。さらに、より好ましい態様に おいては、このプローブを増幅アッセイにおいて用いて、ＨＰＶ１６型および／ または１８型を、膣スワブ、唾液、バイオプシ、組織、尿性器液、尿性器洗浄液 等の臨床試料から直接検出した。さらに、このプローブを用いて、他の臨床試料 、例えば、血液および組織切片、および他の試料、例えばスワブ、分泌物、また はバイオプシから、ＨＰＶ１６型および／または１８型を検出することができる 。本発明のプローブは、好ましくは上述した配列の１つを含む、本質的にその配 列からなる、またはその配列からなる。 以下の実施例により例証されるように、記載されるハイブリダイゼーションア ッセイプローブは、ＨＰＶ１６型および／または１８型を検出することができ、 これをＨＰＶ６，１１，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，または５ ８型から区別することができる。Ｃ．ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパープローブは、ストリ ンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれらの標的配列にハイブリダイ ズする。ヘルパープローブまたは増幅オリゴヌクレオチドとして作用するオリゴ ヌクレオチドは、ＨＰＶ１６型および／または１８型核酸に優先的にハイブリダ イズしうる必要はない。 ハイブリダイゼーションアッセイプローブのその標的核酸への優先的ハイブリ ダイゼーションは、適当なハイブリダイゼーションアッセイ条件および正しいプ ローブ設計を選択することにより達成することができる。プローブ：標的核酸ハ イブリッドの安定性は、安定かつ検出可能なハイブリッドが高度に相補的な配列 を有する核酸の間にのみ形成されるように、アッセイおよび洗浄条件に適合する ように選択すべきである。各種のアッセイパラメータの１つまたはそれ以上を操 作することにより、特定のハイブリダイゼーションアッセイプローブの正確な感 度および特異性が決定される。 優先的ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ ンアッセイ条件下で生ずる。一般に、オリゴヌクレオチド標的化領域のその標的 配列領域に対する相補性の程度を低下させると、プローブオリゴヌクレオチドの その標的配列領域に対するハイブリダイゼーションの程度または速度が低下する 。 優先的ハイブリダイゼーションは、当該技術分野において知られ、本明細書、 例えば以下の実施例に記載される技術を用いて測定することができる。好ましく は、標的と非標的のハイブリダイゼーションシグナルの間には少なくとも１００ 倍、より好ましくは少なくとも１，０００倍の差異、さらにより好ましくは少な くとも１０，０００倍の差異が存在する。また好ましくは、非標的ハイブリダイ ゼーションシグナルは、バックグラウンドレベルを越えない。 以下のガイドラインは、プローブを設計し、特定のストリンジェントなハイブ リダイゼーションアッセイ条件を決定するのに有用である。ハイブリダイゼーシ ョン反応の感度および特異性、例えば本明細書に記載されるものは、多くの因子 、例えばハイブリダイゼーションアッセイプローブのヌクレオチド配列および長 さ、標的配列領域の配列、標的配列と密接に関連する生物からの類似の整列され たＨＰＶ核酸配列との間の相同性の程度、ハイブリダイゼーション温度およびハ イブ リダイゼーション試薬の組成等に依存するため、その標的に完全に相補的であっ てもそうでなくとも、これらの因子の１つまたはそれ以上の操作が、特定のプロ ーブの正確な感度および特異性を決定するであろう。種々のハイブリダイゼーシ ョンアッセイ条件の重要性および効果は、以下にさらに説明するが、当該技術分 野において知られている。 第１に、プローブ：標的核酸ハイブリッドの安定性は、高度に相補的な配列を 有する核酸の間にのみ安定かつ検出可能なハイブリッドが形成されるように、ア ッセイ条件に適合するように選択すべきである。プローブは適切な溶融温度（Ｔ ｍ）を有するように設計すべきである。これは、プローブの長さおよびヌクレオ チド組成（Ｇ＋Ｃ対Ａ＋Ｔのパーセンテージ）を変化させることにより行うこと ができる。プローブの長さおよびヌクレオチド組成は、好ましくは、最終的アッ セイが実施されるであろう温度より約２−１０℃高いＴｍに対応するように選択 される。例えば、Ｔｍは、長いＡＴリッチ配列を回避することにより、またはハ イブリッドをＧ：Ｃ塩基対で終わらせることにより、高くすることができる。プ ローブの開始点および末端点は、長さおよび％Ｇ＋Ｃ含量が、最終アッセイが実 施されるであろう温度より約２−１０℃高いＴｍを与えるように選択すべきであ る。 一般に、オリゴヌクレオチドのための最適ハイブリダイゼーション温度は、所 定のデュープレックスの溶融温度から約５℃低い。最適温度より低い温度でのイ ンキュベーションは、ミスマッチ塩基配列がハイブリダイズすることを可能とし 、したがって、特異性を低下させうる。オリゴヌクレオチドが長くなればなるほ ど、より多くの塩基対が存在して水素結合し、一般にＴｍがより高くなる。Ｇ− Ｃ塩基対は、Ａ−Ｔ塩基対より多くの水素結合を示し、したがってより高い熱安 定性を示すため、プローブの塩基組成は重要である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ，，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ １１（２ｄ ｅｄ．１９８９）［以下Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇと称する］を参照）。すなわち、より高いＧ−Ｃ含量の相補 的な核酸を含むハイブリダイゼーションは、より高い温度において安定であろう 。 ハイブリダイゼーションアッセイプローブのその標的に対する特異性を確実に するため、高ストリンジェンシーの条件において標的核酸とハイブリダイズし非 標的核酸とはハイブリダイズしないプローブを設計することが好ましい。高スト リンジェンシー条件においては、高度に相補的な核酸ハイブリッドのみが形成さ れるであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、これらの条 件下でハイブリッドを形成するために２つの核酸鎖の間に存在すべき相補性の量 を決定する。ストリンジェンシーは、プローブ：標的ハイブリッドと潜在的プロ ーブ：非標的ハイブリッドとの間の安定性の差異が最大になるよう選択すべきで ある。 さらに、正しい特異性は、非標的生物の配列に完全な相補性を有するハイブリ ダイゼーションアッセイプローブの長さを最小にし、非標的配列と相同なＧＣリ ッチ領域を避け、非標的配列に対して可能な限り多くの不安定化ミスマッチを含 むプローブを構築することにより、達成することができる。プローブ配列が特定 のタイプの生物のみを検出するのに適当であるか否かは、プローブ：標的ハイブ リッドとプローブ：非標的ハイブリッドとの間の熱安定性の差異に大きく依存す る。プローブの設計においては、それらのＴｍ値の差異は可能な限り大きくすべ きである（例えば、少なくとも２℃、好ましくは５℃またはそれ以上）。 標的核酸配列の長さ、したがってプローブ配列の長さもまた重要でありうる。 場合によっては、特定の領域からの、位置および長さの異なる、所望のハイブリ ダイゼーション特性を有するプローブを与えるであろういくつかの配列がありう る。別の場合には、１つの配列が、それと単に１つの塩基のみが異なる他の配列 より顕著に優れているであろう。完全に相補的ではない核酸が特異的にハイブリ ダイズすることは可能であるが、完全に相同な塩基配列の最も長いストレッチが 一般にハイブリッド安定性を決定する。 第３に、ハイブリダイゼーションに阻害的な強い内部構造を形成することが知 られているＲＮＡの領域は、あまり好ましくない標的領域である。同様に、過度 の自己相補性を有するプローブも避けるべきである。鎖が完全にまたは部分的に 分子内または分子間ハイブリッドに関与する場合、これは新たな分子間プローブ ：標的ハイブリッドの形成にあまり関与することができないであろう。リボソー ムＲＮＡ分子は、水素結合により非常に安定な分子内へリックスおよび二次構 造を形成することが知られている。標的核酸の、ハイブリダイゼーション条件下 で実質的に一本鎖で残る領域に対してプローブを設計することにより、プローブ と標的との間のハイブリダイゼーションの速度および程度が増加するであろう。 ＨＰＶ標的配列は、最初に核酸デュープレックスの一部として存在してもよい 。例えば、ゲノムＤＮＡ標的は天然には二本鎖形で生ずる。ポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）および転写系増幅システムも、二本鎖生成物を生じさせることがで きる。これらの二本鎖標的は、ハイブリダイゼーションの前に変性することが必 要である。適当な変性およびハイブリダイゼーション条件は当該技術分野におい て知られている（例えば、Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ９８：５０３（１９７５））。 ハイブリダイゼーションの速度は、Ｃ₀Ｔ_1/2を決定することにより測定するこ とができる。プローブがその標的にハイブリダイズする速度は、プローブ領域に おける標的の二次構造の熱安定性の尺度である。ハイブリダイゼーション速度の 標準的測定は、Ｃ₀Ｔ_1/2であり、これは、１リットルあたり１秒あたりのヌクレ オチドのモル数として測定される。すなわち、Ｃ₀Ｔ_1/2の値は、プローブの濃度 にその濃度におけるハイブリダイゼーションの半減期を乗じたものである。この 値は、決められた時間について、種々の量のプローブを一定量のハイブリッドに ハイブリダイズさせることにより決定される。 １つの例においては、０．０５ｐｍｏｌの標的を０．００１２，０．０２５， ０．０５，０．１および０．２ｐｍｏｌのプローブとともに３０分間インキュベ ートする。好ましくは、３０分間後のハイブリッドの量を、以下に記載するハイ ブリダイゼーション保護アッセイを用いて測定する。次に、シグナルを最大相対 光単位（ＲＬＵ）のパーセントの対数単位として、プローブ濃度（１リットルあ たりのヌクレオチドのモル数）に対してプロットする（最も高いプローブ濃度か ら）。ＲＬＵは、ルミノメーターで測定された、標識プローブから放出された光 子の量の尺度である。Ｃ₀Ｔ_1/2は、最大ハイブリダイゼーションの５０％に対応 する濃度にハイブリダイゼーション時間（秒）を乗じた値から、グラフから読み とる。これらの値は、９．０ｘ１０^-6から９ｘ１０^-5の範囲であり、好ましい値 は３．５ｘ１０^-5より低い。 核酸再会合の他の方法を用いることもできる。例えば、Ｋｏｈｎｅ ａｎｄ Ｋａｃｉａｎ、”Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅａ ｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ”と題するＥＰ２２９４４２は、核酸再会 合を加速する方法を記載する。 Ｔｍを決定する好ましい方法は、Ａｒｎｏｌｄら、”Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ”と題する米国特許５，２８３，１７１にし たがって、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）を用いてハイブリダ イゼーションを測定する。Ｔｍは、ＨＰＡを用いて以下の様式で測定することが できる。プローブ分子をアクリジニウムエステルで標識する。過剰量の標的を用 いて、コハク酸リチウム緩衝液（０．１Ｍコハク酸リチウム緩衝液，ｐＨ５．０ ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＥＧＴＡ，１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウ ム）中でプローブ：標的ハイブリッドを形成させる。次に、核酸ハイブリッドを 含む溶液のアリコートをコハク酸リチウム緩衝化溶液中で希釈し、予測されるＴ ｍ(典型的には５５℃)より低い温度から初めて２−５℃ずつ上昇させた種々の温 度で５分間インキュベートする。次に、この溶液を弱アルカリ性ホウ酸緩衝液（ ０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム，ｐＨ７．６，５％（ｖ／ｖ）ポリオキシエチレ ンエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００））で希釈し、より低い温度 （例えば５０℃）で１０分間インキュベートする。 これらの条件下で、一本鎖プローブに結合したアクリジニウムエステルは加水 分解されるが、ハイブリダイズしたプローブに結合したアクリジニウムエステル は加水分解から比較的保護される。すなわち、加水分解処理後に残存するアクリ ジニウムエステルの量は、ハイブリッド分子の数に比例する。残存するアクリジ ニウムエステルは、過酸化水素およびアルカリを溶液に加えることにより、残存 するアクリジニウムエステルから生成する化学発光をモニターすることにより測 定することができる。化学発光は、ルミノメーター（例えばＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）ＩまたはＬＥＡＤＥＲ（登録商標）５０）で測定する ことができる。得られるデータを、最大シグナルのパーセントとして温度に対し てプロットする（通常は最低温度から）。Ｔｍは、最大シグナルの５０％が残存 する温度として定義される。上述の方法に加えて、Ｔｍは、当業者に知られる同 位体法によって測定することもできる（例えば、Ｈｏｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，（ 上掲）を参照）。 所定のハイブリッドについてのＴｍは、用いられるハイブリダイゼーション溶 液の性質により変化する。塩濃度、界面活性剤、および他の溶質等の因子は、熱 変性の間にハイブリッド安定性に影響を及ぼしうる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，， ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照）。プローブが用いられるイオン強度およびイン キュベーション温度等の条件は、プローブの構築の際に考慮すべきである。ハイ ブリッド核酸の熱安定性は反応混合物のイオン強度に伴って増加することが知ら れている。一方、水素結合を崩壊させる化学的試薬、例えばホルムアミド、尿素 、ＤＭＳＯおよびアルコールの添加は、ハイブリッドの熱安定性を著しく減少さ せ、このことによりハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高めること ができる。一般に、約１０−５０塩基の長さの合成オリゴヌクレオチドプローブ についての最適なハイブリダイゼーションは、所定のデュープレックスの溶融温 度より約５℃低い温度で生ずる。最適温度より低い温度でのインキュベーション は、ミスマッチの塩基配列がハイブリダイズすることを可能とし、したがって、 特異性を低下させうる。 ハイブリダイゼーションアッセイプローブのための特定のストリンジェントな ハイブリダイゼーション条件の例は、以下に記載される実施例において与えられ る。当業者は、本明細書の開示に基づいて、ストリンジェントなハイブリダイゼ ーション条件の別の組を決定することができる（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ，（上掲）を参照）。Ｄ．オリゴヌクレオチド合成 定義されたオリゴヌクレオチドは、いくつかのよく知られる方法のいずれか、 例えば、シアノエチルホスホルアミダイト前駆体を用いる自動化固相化学合成に より製造することができる（Ｂａｒｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：４０５１（１９８４））。さらに、合成オ リゴヌクレオチドの構築のための他のよく知られる方法を用いることができる（ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，（上掲）（２：１１）。オリゴヌクレオ チドを合成して精製した後、いくつかの異なる方法を用いてサイズおよび純度 に関するオリゴヌクレオチドの許容性を決定することができる。このような方法 には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーがあ り、いずれも当業者に知られている。 いったん合成したら、選択されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション アッセイプローブもまた、いくつかのよく知られた方法のいずれかにより、レポ ーター基で標識することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，（上 掲）（２：１１）。有用な標識には、放射性同位体ならびに非放射性レポーター 基がある。同位体標識には、³Ｈ，³⁵Ｓ，³²Ｐ，¹²⁵Ｉ，コバルトおよび¹⁴Ｃがあ る。同位体標識は当該技術分野において知られる技術、例えばニックトランスレ ーション、末端標識、第２鎖合成、逆転写、および化学的方法によりオリゴヌク レオチド中に導入することができる。放射性標識プローブを用いる場合、ハイブ リダイゼーションはオートラジオグラフィー、シンチレーション計数、またはガ ンマ計数により検出することができる。選択される検出方法は、ハイブリダイゼ ーション条件および標識に用いられる特定の放射性同位体に依存する。 標識に非同位体物質を用いることもでき、これを、ヌクレオチドの間に内部的 にまたはオリゴヌクレオチドの末端に導入することができる。修飾されたヌクレ オチドを酵素的または化学的に取り込ませることができる。プローブの化学的修 飾は、Ａｒｎｏｌｄらの、”Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ”と題する欧 州特許出願８８３０８７６６．０、公開番号３１３２１９（その全体を図面を含 め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるように、プローブの合成 の間にまたはその後に、例えば、非ヌクレオチドリンカー基を用いることにより 行うことができる。非同位体標識としては、蛍光分子、化学発光分子、酵素、補 因子、酵素基質、ハプテンまたは他のリガンドが挙げられる。 好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、アクリジニウムエ ステルで標識する。アクリジニウムエステル標識は、Ａｒｎｏｌｄら、”Ａｃｒ ｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ”と題する米国特許５，１ ８５，４３９（１９９３年２月９日発行、その全体を図面を含めて本明細書の一 部としてここに引用する）に記載のように実施することができる。ＩＩ．ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびＨＰＶ標的配列を含むハ イブリッド 本発明の別の観点は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびＨＰＶ １６型および／または１８型からの標的配列により形成されるハイブリッドであ る。形成されるハイブリッドは、標的の存在の検出に有用である。例えば、ハイ ブリッド中に存在するアクリジニウムエステル（”ＡＥ”）はアルカリ溶液中で の加水分解に耐性であるが、一本鎖核酸中に存在するアクリジニウムエステルは アルカリ溶液中で加水分解される。すなわち、ＡＥ標識プローブの標的への結合 は、未結合ＡＥ標識プローブの加水分解の後に、核酸ハイブリッド中に残留する アクリジニウムエステルの化学発光を測定することにより検出することができる 。さらに、非ハイブリダイズプローブからハイブリダイズ標的を分離するための 基礎として形成されたハイブリッドを用いて、このことにより未ハイブリダイズ プローブに起因するバックグラウンドを除去することができる。例えば、当業者 によく知られる方法を用いて、一本鎖プローブを保持させない条件下でハイブリ ッド分子を選択的にヒドロキシアパタイトカラムまたはフィルター上に保持する ことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，（上掲）を参照）。ＩＩＩ．ハイブリダイゼーションアッセイプローブとヘルパープローブのミック ス ハイブリダイゼーションアッセイプローブとヘルパープローブとのミックスを 、ＨＰＶ１６型および／または１８型の検出において用いることができる。ヘル パープローブを用いてアッセイプローブとその標的核酸との核酸ハイブリダイゼ ーションの速度を増加させ、ハイブリダイゼーションアッセイプローブのその標 的へのハイブリダイゼーションを容易にする。さらに、ヘルパープローブは、ス トリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でヘルパープローブ： 標的デュープレックスを形成するのに十分にその標的核酸配列に相補的である。 所定のヘルパープローブとともに用いるストリンジェントなハイブリダイゼーシ ョンアッセイ条件は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いてその標 的配列に優先的にハイブリダイズさせるような条件により決定される。 一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡの領域は、ストリンジェントなハイブリダイゼーシ ョンアッセイ条件下であっても、二次および三次構造に関与しうる。このような 構造は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブのその標的領域へのハイブリ ダイズを立体的に阻害するか、またはブロックすることができる。ヘルパープロ ーブのハイブリダイゼーションは、標的核酸の二次および三次構造を変化させ、 このことによりハイブリダイゼーションアッセイプローブの標的領域をよりアク セスしやすくする。その結果、ヘルパープローブは標的：ハイブリダイゼーショ ンプローブデュープレックスの速度論および／またはＴｍを高める。ヘルパープ ローブは、一般にハイブリダイゼーションアッセイプローブの標的領域の近くに 位置する核酸配列にハイブリダイズするように選択される。 本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブとともに用いることができ るヘルパープローブは、ＨＰＶゲノムの核酸配列領域を標的とし、好ましくは少 なくとも１４ヌクレオチドを含み、ここで１４ヌクレオチドのうち少なくとも１ ２ヌクレオチドは、ＨＰＶ標的領域中に存在する核酸配列に完全に相補的である 。ＩＶ．増幅オリゴヌクレオチドおよび増幅アッセイ条件 試料中の標的配列の数を増幅する方法をプローブ配列の使用と組み合わせて、 検出アッセイの感度を高めることができる。（Ｍｉｌｌｅｒ，，ｅｔ ａｌ．， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｍｙ ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｔｅｓ ｔ ａｎｄ ＰＣＲ ｆｏｒ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙ ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．１９９４：３９３−３９７； Ｒｅｄｄｙ，，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ７：１２１− １２６，１９９３）。 増幅オリゴヌクレオチドは、プライマーとして作用することができ、ＨＰＶ１ ６型および／または１８型標的配列を増幅するプロモーター−プライマーの組み 合わせの一部であってもよい（すなわち、結合したプロモーター配列を有するプ ライマー）。好ましくは、増幅オリゴヌクレオチドは、以下のいずれかの配列を 有する：配列番号１，３，１３，１５，２１，２３，３７，３９，４１，４３， ４９，５１，５３，５５，６９，７１，８９，９１，９３，９５，１０１，１０ ３，１０５，１０７，１０９，１１１，１１３および１１５。より好ましい態様 においては、増幅オリゴヌクレオチドは、以下のいずれかの配列を有するであろ う：配列番号８５，８７，９１，９３，９５，１０１，１０３，１０５，１０７ ，１０９，１１１，１１３，および１１５。さらにより好ましい態様においては 、増幅オリゴヌクレオチドは、以下のいずれかの配列を有するであろう：配列番 号１０９および１１１。 プライマーまたはプロモーター−プライマーの組について観察される増幅の程 度は、いくつかの因子、例えばオリゴヌクレオチドがその特異的標的配列にハイ ブリダイズする能力、およびそれが伸長され、またはＲＮＡポリメラーゼにより 認識される能力に依存する。異なる長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドを 用いることができるが、より好ましい増幅オリゴヌクレオチドは３０−６０塩基 の標的結合領域および約６５℃の推定ハイブリッドＴｍを有する。 核酸分子上に存在する標的核酸配列は、標的配列の５’側の増幅オリゴヌクレ オチドおよび標的配列の３’側の増幅オリゴヌクレオチドを用いて増幅すること ができる。増幅オリゴヌクレオチドのための好ましい標的部位は、約１４塩基よ り長い長さの領域である。増幅される領域は、増幅オリゴヌクレオチドにより規 定され、好ましくは約３５０塩基対以下の長さであり、より好ましくは約１５０ 塩基対以下の長さである。 プローブのハイブリダイゼーションに影響を与えるパラメータ、例えばＴｍ、 相補性および二次構造はまた、プライマーのハイブリダイゼーションに影響を与 え、したがって、増幅オリゴヌクレオチドの特性に影響を与える。これらの要件 は、上でプローブ設計に関する節において議論したが、増幅条件に依存して変更 することができる。例えば、増幅は診断ハイブリダイゼーションアッセイ条件よ り低いストリンジェンシー条件下で実施することができる。 非特異的伸長（プライマーダイマーまたは非標的コピー）の程度は、増幅効率 に影響を及ぼしうる。プライマーは、好ましくは、特に、配列の３’末端におい て、低い自己相補性または交叉相補性を有するように選択される。偽プライマー 伸長を減少させるために、好ましくは、長いホモポリマー領域および高いＧＣ含 量を避ける。設計のこの面を助けるコンピュータプログラムが市販されている。 ”Ｅ６”，”Ｅ６^*”および”Ｅ６^**”との用語は、ＨＰＶゲノムの６番目の ”初期”遺伝子をコードするオープンリーディングフレームを表す。この遺伝子 は、初期遺伝子についての接頭文字”Ｅ”と６番目についてのアラビア数字”６ ”とを組み合わせて称される。符号”^*”または”^**”により表される修正用語 は、ＨＰＶゲノムのＥ６領域中の代替アクセプタースプライシング部位を用いる 、代替的にスプライシングされたメッセンジャーＲＮＡを表す。Ｅ６遺伝子の転 写の間にこれらの部位でスプライシングされると、標準的なＥ６ｍ ＲＮＡとは 長さが異なる２つの異なるＥ６ｍ ＲＮＡ種が生成する。したがって、ゲノムの Ｅ６領域中のいずれのアクセプタースプライシング部位が用いられるかにより、 ３つの異なるＥ６メッセンジャーＲＮＡが生成する。ＨＰＶ１６型ゲノムはＥ６ ｍ ＲＮＡの３つのタイプすべてを発現しているようであるが、ＨＰＶ１８型ゲ ノムはＨＰＶ１８型Ｅ６およびＥ６^*のみを発現しているようである。 本発明の特定の態様においては、不均一なＥ６メッセンジャーＲＮＡ種のそれ ぞれを増幅および検出するようプライマーおよびプローブを設計した。より好ま しい態様においては、２つの型のＥ６メッセンジャーＲＮＡを、同じ反応容器中 で、１組のプライマーおよびプローブで増幅および検出することができる。最も 好ましい態様においては、本発明のプライマーおよびプローブを用いて、特定の 型のすべてのＥ６メッセンジャーＲＮＡ種を同じ反応容器中で同時に増幅し検出 することができる。実施例 ここに記載されるものは、ＨＰＶ１６型および／または１８型のＲＮＡまたは ＤＮＡ中の標的配列にハイブリダイズするように設計されるハイブリダイゼーシ ョンアッセイプローブ、ヘルパープローブ、および増幅オリゴヌクレオチドにつ いての好ましい配列である。さらに、ＨＰＶ１６型および／または１８型を検出 するのに有用な、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとヘルパープローブ との混合物の好ましい態様が記載される。また、ハイブリダイゼーションアッセ イブローブと標的配列との間に形成されるハイブリッドが記載される。プローブ および増幅オリゴヌクレオチドを用いてＨＰＶ１６型および／または１８型を検 出するための好ましい方法がこの記載に含まれる。 以下の実施例は、本発明のいくつかの好ましい態様を例証するものであり、い かなる意味においても特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定する ものと解釈すべきではない。当業者は、特許請求の範囲により定義される発明の 範囲から逸脱することなく、これらの例の種々の変更を行うことができる。実施例１：ＨＰＶ１６型を１８型から、およびその逆を区別するプローブ この実施例は、ＨＰＶ１６型および１８型に特異的であるように設計されたプ ローブの特異性を記述する。ＨＰＶ１６型または１８型のいずれかからのＥ６遺 伝子の一部を含む１億コピーのプラスミドＤＮＡを、配列番号５または配列番号 ４５のプローブにハイブリダイズさせた。 ハイブリダイゼーションを実施するため、ＨＰＶ ＤＮＡ配列を含む線状化し たプラスミドを、Ｈ₂Ｏを含む５０μｌの溶液中で９５℃に５分間加熱し、室温 の水浴中で１−２分間冷却した。次に、最終容量１００μｌの０．０５Ｍコハク 酸リチウム、ｐＨ５，０．６Ｍ ＬｉＣｌ，１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウ ム，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＥＧＴＡ中に０．０２５−０．０５ｐｍｏ ｌ（＝２．６Ｘ１０⁶ＲＬＵ／アッセイ）の配列番号５のプローブまたは配列番 号４５のプローブのいずれかを加えた。 ハイブリダイゼーションは６０℃で１５分間実施した。ハイブリダイゼーショ ンの後、３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム，ｐＨ８．５，１％ＴＲＩ ＴＯＮ Ｘ−１００を６０℃で５分間加えた。続いて、試料を、１ｍＭ硝酸中の ０．１％過酸化水素、次に１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を注入する自動化注入を備 えたルミノメーターで読んだ。結果は表１に示され、配列番号５および配列番号 ４５のプローブとその標的ヌクレオチド配列との間に形成された標識ハイブリッ ドからの、ルミノメータで検出される光子の測定値である相対光単位（ＲＬＵ） で表される。 結果（２つのハイブリダイゼーション反応試験の平均）は、配列番号５のプロ ーブがＨＰＶ１６型Ｅ６配列をＨＰＶ１８型Ｅ６配列より優先的に検出すること を示す。同様に、配列番号４５のプローブは、ＨＰＶ１８型Ｅ６配列をＨＰＶ１ ６型Ｅ６配列より優先的に検出する。 ＨＰＶ１６型およびＨＰＶ１８型は系統発生学的に隣接して関連するため、こ の例は、設計されたオリゴヌクレオチドが標的配列を系統発生的に近縁の種から 区別しうることを示す。（Ｖａｎ Ｒａｎｓｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ ｉｒ．，７３：２６５３−６０，１９９２を参照）。実施例２：ＨＰＶ１６型Ｅ６ＤＮＡおよびＲＮＡの増幅および検出 この実施例は、ＨＰＶ１６型を標的とする増幅オリゴヌクレオチドおよびハイ ブリダイゼーションアッセイプローブを用いて、ＨＰＶ１６型核酸の増幅および 検出を容易にすることを記載する。この例においては、Ｅ６ｍ ＲＮＡと同じセ ンスのＨＰＶ１６型用のアッセイプローブを用いて、核酸増幅方法の生成物を検 出した（Ｋａｃｉａｎ，ｅｔ ａｌ．，（上掲））。 ＨＰＶ１６型Ｅ６ＤＮＡの一部を表すクローン化ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎから 購入した試薬を用いて、標準的なミニプレップ方法を用いて精製した。培養Ｓｉ Ｈａ細胞からの核酸をトリプシン処理および遠心分離により調製した。細胞ペレ ットを洗浄し、リン酸緩衝化食塩水中に再懸濁し、この中で計数した。規定数の 細胞をペレット化し、試薬１、すなわち、３％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム ，３０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ６．８，１．０ｍＭエチレンジアミン四酢酸 （ＥＤＴＡ），１．０ｍＭエチレングリコールビス（βアミノエチルエーテル） Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸（ＥＧＴＡ）を含む溶液に再懸濁した。酢酸カリウム を最終濃度０．６Ｍとなるように加えて、界面活性剤を沈殿により試料から除去 した。 上清に含まれる核酸を直接増幅した。 標的核酸を、５’末端にプロモーター配列５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣ ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’（配列番号９７）、および３’末端に標的 ハイブリダイズ領域５’−ＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＴＴＴＴＧＡＣ−３’ （配列番号８５）で合成した３０ｐｍｏｌｅのプロモーター−プライマー、およ び配列５’−ＧＡＣＡＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＡＧＴＴＴＧＴＡＴＧＧＡＡＣ−３ ’（配列番号１）で合成した３０ｐｍｏｌｅのプライマーを含む９０μｌの溶液 中で、９５℃に５分間加熱し、６０℃に１５分間冷却した。３７℃で５分間イン キュベートした後、９００Ｕのモロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）リバ ーストランスクリプターゼおよび４００ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加えた。 反応は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，１００ｍＭ酢酸カリウム，１ ７．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，５．０ｍＭ ＤＴＴ，２．０ｍＭスペルミジン，６． ２ｍＭｒＡＴＰ，２．５ｍＭ ｒＣＴＰ，６．２ｍＭ ｒＧＴＰ，２．５ｍＭ ｒＵＴＰ，１ｍＭ ｄＡＴＰ，１ｍＭ ｄＣＴＰ，１ｍＭ ｄＧＴＰ，１ｍＭ ｄＴＴＰ，７ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン，０．０３ｍＭ ＥＤＴＡ， ３％グリセロール，および１０％Ｔｗｅｅｎ中で実施した。 ３７℃で３時間インキュベートした後、１０μｌの各反応を、配列５’−ＧＡ ＡＣＡＧＣＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＣＧＴＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号５） で合成したアクリジニウムエステル標識プローブを用いて、１００μｌの０．０ ５Ｍコハク酸リチウム，ｐＨ５，０．６Ｍ ＬｉＣｌ，１％（ｗ／ｖ）ラウリル 硫酸リチウム，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＥＧＴＡ中で６０℃で１５分間 、次に３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム，ｐＨ８．５，１％ＴＲＩＴ ＯＮ Ｘ−１００中で６０℃で５分間のハイブリダイゼーションによりアッセイ した。 １ｍＭ硝酸中の０．１％過酸化水素、続いて１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の自動 化注入を備えたルミノメーターで試料を読んだ。結果は相対光単位（ＲＬＵ）、 すなわちルミノメーターで検出された光子の測定値で示される。示される結果は 、２つの反応の平均である。 これらのプライマーおよびプローブはまた、ＣａＳｋｉ細胞から調製したＤＮ ＡおよびＲＮＡを増幅し検出することができた。実施例３：ＨＥＬＡ細胞抽出物中のＨＰＶ１８型配列の増幅および検出 この例は、ＨＰＶ１８型を標的とする増幅オリゴヌクレオチドおよびハイブリ ダイゼーションアッセイプローブを用いてＨＰＶ１８型核酸を増幅し検出するこ とを記述する。この例においては、ＨＰＶ１８型に対して設計されたＥ６ｍ Ｒ ＮＡと同じセンスのアッセイプローブを用いて、標的核酸増幅の生成物を検出し た。 ＨＰＶ１８型Ｅ６ ＤＮＡの一部を表すクローン化ＤＮＡ、またはＨｅＬａ細 胞から調製した核酸（ＨＰＶ１８型Ｅ６核酸配列を含む）を、配列番号５３で合 成したプライマーおよび５’末端に配列５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’（配列番号９７）を、３’末端に標的ハイブリ ダイズ配列（配列番号１０９）を含むプロモータープライマーで増幅した。 培養ＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、洗浄し、再懸濁し、リン 酸緩衝化食塩水中で計数した。規定数の細胞をペレット化し、試薬１に懸濁した 。最終濃度０．６Ｍの酢酸カリウムで界面活性剤を沈殿させ、上清に含まれる核 酸を直接増幅した。クローン化ＤＮＡを、試薬１からの界面活性剤の酢酸カリウ ム 沈殿により調製した偽標本中に入れた。 標的核酸を、３０ｐｍｏｌｅのそれぞれのプライマーおよびプロモーター−プ ライマーを含む９０μｌの溶液中で、９５℃で５分間加熱し、６０℃に１５分間 冷却し、次に３７℃に冷却した。３７℃で５分間の後、９００ＵのＭＭＬＶリバ ーストランスクリプターゼおよび４００ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加えた。 反応条件は実施例１に記載のとおりであった。 ３７℃で３時間インキュベートした後、１０μｌの反応を、配列番号４５で合 成したアクリジニウムエステル標識プローブを用いて、１００μｌの０．０５Ｍ コハク酸リチウム，ｐＨ５，０．６Ｍ ＬｉＣｌ，１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸 リチウム，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＥＧＴＡ中で５５℃で１５分間ハイ ブリダイゼーション、次に３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム，ｐＨ８ ．５，１％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００を加えて５５℃で５分間インキュベートす ることによりアッセイした。試料の発光の値は、実施例１に記載のように決定し た。 ＊ 界面活性剤沈殿の後に、プラスミドＤＮＡを加えた。１つのＨｅＬａ細胞は 、約１０−５０コピーのＤＮＡを含む。したがって、１００個のＨｅＬａ細胞は 、 約１，０００−５，０００コピーのＤＮＡと等しい。ＨｅＬａ細胞の数は、クロ ーン化ＤＮＡから予測されたものより低く、これはおそらく界面活性剤沈殿の間 に物質が失われたためである。実施例４：同じ反応容器中でのＨＰＶ１６型および１８型の両方の増幅および検 出 本明細書に記載されるように、増幅オリゴヌクレオチドを、ＨＰＶ１６型およ び１８型の両方のＤＮＡを同じ反応容器中で増幅するよう設計して、１６型と１ ８型を区別しうる特異的プローブで検出した。この例においては、ＨＰＶ１６型 および１８型の両方からのクローン化標的ＤＮＡを増幅し、記載されるアッセイ プローブで検出した。 ＨＰＶ１６型Ｅ６ＤＮＡを表すクローン化ＤＮＡを、配列番号１からなる非Ｔ ７プライマーおよび配列番号８５の３’標的ハイブリダイズ配列で合成されたプ ロモータープライマーで増幅した。ＨＰＶ１８型ＤＮＡを表すクローン化ＤＮＡ を、配列番号５３からなるプライマーおよび配列番号１０９の３’標的ハイブリ ダイズ配列を有するプロモータープライマーで増幅した。いずれのプロモーター プライマーも、その５’末端に配列５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ ＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’を有する。 界面活性剤を沈殿させた試薬１中の標的核酸を、３０ｐｍｏｌのそれぞれのプ ライマーおよびプロモータープライマーを含む９０μｌの溶液中で、９５℃で５ 分間加熱し、６０℃に１５分間冷却し、次に３７℃に冷却した。３７℃で５分間 の後、９００ＵのＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼおよび４００ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを加えた。反応条件は、実施例１に記載のとおりである。 ３７℃で３時間インキュベートした後、１０μｌの反応液を、配列番号４５で 合成したアクリジニウムエステル標識プローブを用いて、１００μｌの０．０５ Ｍコハク酸リチウム，ｐＨ５，０．６Ｍ ＬｉＣｌ，１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫 酸リチウム，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＥＧＴＡ中で５５℃で１５分間の ハイブリダイゼーション、続いて３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム， ｐＨ８．５，１％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００を加えて５５℃で５分間インキュベ ートすることによりアッセイした。１０μｌの各反応液はまた、配列番号４５の プローブについて記載したように、１００μｌ中の配列番号５のアクリジニウム エステル標識プローブで分析した。ただし、インキュベーションは６０℃で実施 した。試料の発光の値は、実施例１に記載されるように決定した。 表４から判定されるように、設計されたオリゴヌクレオチドプライマーは同じ 反応容器中でよく作用した。ＨＰＶ１６型および／または１８型のいずれかの増 幅は、他のパピローマウイルスの増幅を妨げず、ＨＰＶ１６型および／または１ ８型のいずれかのハイブリダイゼーションプローブの存在は、他のプローブがＨ ＰＶ１６型を１８型から、またはその逆を区別する能力を妨害しない。実際、各 プローブの特異性は、その標的に対して非標的ヌクレオチド配列に対するより１ ０倍高い。 実施例５：設計されたミスマッチプライマーはＨＰＶ１６型および／または１８ 型を別々にまたは同時に増幅することができる ＨＰＶ１６型および１８型の標的ヌクレオチド配列の両方にミスマッチである ようにプロモータープライマー（配列番号１１３）を設計した。このプロモータ ープライマーの設計は、ＨＰＶ１６型および１８型の両方のＤＮＡ標的配列を、 同じ反応容器中で、別々にまたは同時に増幅することができる。 二本鎖クローン化標的を、５’末端に配列番号97のプロモーターおよび３’末 端に配列番号１１３または配列番号９３の標的ハイブリダイズを有するように合 成した、それぞれ３０ｐｍｏｌｅのプロモータープライマーで、ＨＰＶ１８型に ついては配列番号６９で合成したプライマー、またはＨＰＶ１６型については配 列番号３７で合成したプライマーの存在下で増幅した。 容量７５μｌの標的核酸を９５℃に１５分間加熱し、４２℃に冷却した。４２ ℃で５分間の後、６００ＵのＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼおよび３０ ０ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加えた。増幅反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ，ｐＨ８．５，５ｍＭ塩化カリウム，２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，４ｍＭ ｒＡ ＴＰ，４ｍＭ ｒＣＴＰ，４ｍＭ ｒＧＴＰ，４ｍＭ ｒＵＴＰ，１ｍＭ ｄＡ ＴＰ，１ｍＭ ｄＣＴＰ，１ｍＭ ｄＧＴＰ，１ｍＭ ｄＴＴＰ，２０ｍＭ Ｎ −アセチル−Ｌ−システイン，および５％グリセロール中で実施した。 ４２℃で２時間インキュベートした後、３重の増幅反応をプールし、１００μ ｌの各プールを、ＨＰＶ１８型の検出については配列番号７３を、またはＨＰＶ １６型の検出については配列番号３３を有するように合成したアクリジニウムエ ステル標識プローブとハイブリダイズさせた。 表５の試験からわかるように、配列番号１１３の１個のミスマッチプロモータ ープライマーは、プライマー結合部位において配列が３塩基異なる２つのＨＰＶ 核酸（１６および１８）を増幅することができた。実施例６：ＨＰＶ１６型のスプライスＥ６^*ｍＲＮＡの増幅および検出 この実施例は、ＨＰＶ１６型のＥ６^*ｍＲＮＡを増幅し特異的に検出するＨＰ Ｖ１６型用の増幅オリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションアッセイプ ローブの使用を記述する。この例においては、標的Ｅ６^*ＲＮＡ核酸と同じセン スのアッセイプローブを用いて標的核酸増幅方法の生成物を検出した。 培養したＳｉＨａ細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、洗浄し、リン酸緩衝 化食塩水中に再懸濁し、この中で計数した。規定数の細胞をペレット化し、試薬 １に再懸濁した（すなわち、実施例１）。酢酸カリウムを最終濃度０．６Ｍとな るように加えることにより、試薬１中に懸濁した試料から沈殿により界面活性剤 を除去した。上清に含まれる核酸を直接増幅した。 標的核酸を、３０ｐｍｏｌｅの、５’末端にＴ７プロモーターを有するように 合成した２つのプロモーター−プライマーの１つを含有する９０μｌの溶液中で 、９５℃に５分間加熱し、６０℃に１５分間冷却した。第１のプロモーター−プ ラ イマーはその３’末端に標的ハイブリダイズ領域を有しており（配列番号８９） 、第２のプロモーター−プライマーは、その３’末端に標的ハイブリダイズ領域 を有していた（配列番号２１）。３７℃で５分間の後、９００ＵのＭＭＬＶリバ ーストランスクリプターゼおよび４００ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加えた。 反応条件は実施例１に記載のとおりである［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．６，１００ｍＭ酢酸カリウム，１７．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，５．０ｍＭ Ｄ ＴＴ，２．０ｍＭスペルミジン，６．２ｍＭ ｒＡＴＰ，２．５ｍＭ ｒＣＴＰ ，６．２ｍＭ ｒＧＴＰ，２．５ｍＭ ｒＵＴＰ，１ｍＭ ｄＡＴＰ，１ｍＭ ｄＣＴＰ，１ｍＭ ｄＧＴＰ，１ｍＭ ｄＴＴＰ，７ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ− システイン，０．０３ｍＭ ＥＤＴＡ，３％グリセロール，Ｔｗｅｅｎ−２０（ 登録商標）中で実施］。３７℃で３時間インキュベートした後、１０μｌの反応 液を配列番号９で合成したアクリジニウムエステル標識プローブを用いて、１０ ０μｌの０．０５Ｍコハク酸リチウム，ｐＨ５，０．６Ｍ ＬｉＣｌ，１％（ｗ ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＥＧＴＡ中で６ ０℃で１．５分間のハイブリダイゼーション、次に３００μｌの０．１５Ｍ四ホ ウ酸ナトリウム，ｐＨ８．５，１％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００を加えて６０℃で ５分間インキュベートすることによりアッセイした。試料の発光の値は、実施例 １に記載されるようにして決定した。結果は２つの反応の平均である。 これらのプライマーおよびプローブはまた、ＣａＳｋｉ細胞から調製したＤＮ ＡおよびＲＮＡを増幅し検出することができた。実施例７：ハイブリダイゼーションアッセイプローブはＨＰＶ１６型Ｅ６，Ｅ６ ^*およびＥ６^**核酸を検出する ＨＰＶ１６型について設計したアッセイプローブは、非スプライス，Ｅ６，Ｅ ６^*およびＥ６^**ｍＲＮＡ標的を含むＥ６核酸の増幅生成物を検出することがで きる。プライマーおよびプロモータープライマーは、支配的増幅生成物がメッセ ンジャーＲＮＡと同じセンスとなる向きとした。この実施例においては、Ｃａｓ ｋｉ細胞から調製した核酸を用いた。規定数の細胞をペレット化し、試薬１に懸 濁した。酢酸カリウムを最終濃度０．６Ｍとなるように加えて界面活性剤を沈殿 させ、上清に含まれる核酸を直接増幅した。１．６ｘ１０⁴個の細胞からの核酸 を、実施例１に記載されるように、配列番号２１の５’Ｔ７プロモーターおよび ３’標的ハイブリダイズを有するように合成したプロモータープライマーおよび ３０ｐｍｏｌｅの配列番号１３で合成したプライマーで増幅した。１０μｌの各 反応液を、配列番号２９、配列番号２５または配列番号１７で合成したプローブ とハイブリダイズさせた。 表７に示される結果は、Ｅ６ｍＲＮＡの不均一スプライス変種は、細胞内でそ の量が様々であるという文献の報告を支持する。実施例８：プライマーおよびプローブはＨＰＶ１８型Ｅ６^*ｍＲＮＡを検出する ＨＰＶ１８型のＥ６^*ｍＲＮＡを検出しうるプライマーおよびプローブを設計 した。規定数のＨｅＬａ細胞を試薬１に懸濁し、実施例７に記載されるように界 面活性剤沈殿により核酸を回収し、直接増幅した。増幅反応は、配列番号９７の ５’プロモーターおよび配列番号１０１の標的ハイブリダイズ領域で合成したプ ロモータープライマー、および配列番号４９からなるプライマーで実施した。反 応条件は実施例１に記載されるとおりである。１０μｌの増幅反応液を、配列番 号７７で合成したアクリジニウムエステル標識プローブと、１００μｌの０．０ ５Ｍコハク酸リチウム，ｐＨ５，０．６Ｍ ＬｉＣｌ，１％（ｗ／ｖ）ラウリル 硫酸リチウム，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＥＧＴＡ中で、５５℃で１５分 間ハイブリダイズさせ、３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム，ｐＨ８． ５，１％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００を５５℃で５分間加えた。発光の値は実施例 １に記載されるように決定した。 実施例９：プローブおよびプライマーはスプライスおよび非スプライスＨＰＶ１ ８型Ｅ６ｍ ＲＮＡの両方を増幅および検出する ＨＰＶ１８型の非スプライスおよびスプライスＥ６配列の両方を増幅および検 出するように、プライマーおよびプローブを設計した。配列番号４１を有するよ うに合成したプライマーおよび５’プロモーター配列５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡ ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’および３’標的ハイブリダイズ領 域（配列番号１０９）を有するように合成したプロモータープライマーを用いて 、ＨＰＶ１８型Ｅ６配列を表すクローン化ＤＮＡを増幅した。標的核酸を、２５ ピコモルのプライマーおよびプロモータープライマーを含む溶液７５μｌ中で、 ９５℃に１５分間加熱し、４２℃に冷却した。４２℃で５分後、６００ＵのＭＭ Ｌ Ｖリバーストランスクリプターゼおよび３００ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを 加えた。増幅反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，３５ｍＭ酢酸 カリウム，２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，４ｍＭ ｒＡＴＰ，４ｍＭ ｒＣＴＰ，４ｍ Ｍ ｒＧＴＰ，４ｍＭ ｒＵＴＰ，１ｍＭ ｄＡＴＰ，１ｍＭ ｄＣＴＰ，１ｍ Ｍ ｄＧＴＰ，１ｍＭ ｄＴＴＰ，２０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン， および５％グリセロール中で実施した。４２℃で２時間インキュベートした後、 ２０μｌの各反応を、Ｅ６^*検出用には配列番号８１の、Ｅ６検出用には配列番 号６５の、またはＥ６およびＥ６^*の両方の検出用には配列番号５７のアクリジ ニウムエステル標識プローブを用いて、実施例１に記載される条件を用いて、ハ イブリダイゼーションによりアッセイした。プローブ８１および６５には配列番 号６１の配列からなる未標識ヘルパープローブを、配列番号５７のプローブには 配列番号１１７の配列の未標識ヘルパープローブを用いた。 実施例１０：臨床試料からのＨＰＶ１６型および１８型の検出 医者にかかっている患者からの子宮頸管内膜スワブを５ｍｌの試薬１を含む試 験管に入れた。スワブをしぼりだし廃棄した。酢酸カリウムを０．６Ｍとなるよ うに加え、界面活性剤ペレットを遠心分離により除去することにより試薬１から の核酸を抽出した。確立された方法により上清中の核酸の試料をＨＰＶの存在に ついて分析した。１つの試験においては、核酸の一部をフェノールクロロホルム で抽出し、Ｌ１遺伝子配列を標的とする公開されているプライマーを用いてポリ メラーゼ連鎖反応で増幅した。試料はまた、直接または制限エンドヌクレアーゼ 消化後にアガロースゲル分析によりＬ１配列の増幅についてアッセイした。ある いは、ＨＰＶ１６型および１８型の公開されている配列に向けられたアクリジニ ウムエステル標識プローブでのハイブリダイゼーションにより試料を分析した。 ゲルからＨＰＶ１６型またはＨＰＶ１８型以外の型について陽性の試料は、確認 のため、同定された型（ＨＰＶ６，１１，３１，３３，３５，３９，４５，５１ ，５２および５８型）に対応するアクリジニウムエステル標識Ｌ１プローブでア ッセイした。このようにして特性決定された試料を、次に本明細書に記載される プライマーおよびプロモータープライマーを用いて増幅様式で試験した。増幅し た試料は、ＨＰＶ１６型（配列番号５）またはＨＰＶ１８型（配列番号４５）の 配列に向けられた検出プローブを用いるＨＰＡによりアッセイした。 この表中のデータは、この例において用いたルミノメータについて、ＲＬＵ値 が負対照の値の１．５−２．０倍を越えた場合に陽性とした。ＨＰＶ１６型の検 出には配列番号５のアクリジニウムエステル標識プローブを用い、ＨＰＶ１８型 の検出には配列番号４５のアクリジニウム標識プローブを配列番号１２１，１２ ３，１２７，または１２５の未標識ヘルパープローブとともに用いた。 上述の種々の実施例において示したデータは、本明細書に記載され特許請求さ れる新規プローブがＨＰＶをその既知の最も近い系統発生学的類縁物から区別し うることを確認する。さらに、相補的なオリゴヌクレオチドプローブ、すなわち 、標的と同じセンスを有するプローブが、生物のアッセイの検出感度を上昇させ るためにここで用いられる標的増幅方法の生成物を検出するのに用いられる。 配列情報は、実験的におよび公開されている情報から得た(Ｗｅｉｓｂｕｒｇ ，，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７１：６４５５（１９８９）を 参照)。実験的情報は、当該技術分野において知られている標準的技術を用いて 、種々の生物からＲＮＡまたはＤＮＡを単離し配列決定することにより得た。詳 しくは、ＲＮＡ配列情報は、まず原核生物の間でほとんど変化のない保存領域に 相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて得た。オリゴヌクレオチドプラ イマーを精製したＲＮＡの保存領域にハイブリダイズさせ、酵素リバーストラン スクリプターゼおよびデオキシリボヌクレオチドで伸長してｃＤＮＡを生成した 。例えば、Ｌａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ８２：６９５５（１９８５）。 本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書中に特異的に開示されてい ない任意の要素または限定なしに、適切に実施することができる。用いられる述 語および表現は、記載の用語として用いられており、限定するものではない。ま た、そのような述語および表現の使用において、示され記載される特徴またはそ の一部の均等物を排除することを意図するものではなく、特許請求の範囲の範囲 内で種々の変更が可能であることが認識される。すなわち、好ましい態様および 任意の特徴について本発明を詳しく開示してきたが、当業者がここに開示される 概念の修正および変更を行いうること、およびそのような修正および変更は特許 請求の範囲において定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解さ れるべきである。 これまでに本明細書の一部として引用されなかった文献は、特許文献も非特許 文献も含めて、すべての目的のために本明細書の一部として明示的に引用する。 他の態様は以下の特許請求の範囲の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブレンターノ，スティーヴン・ティー アメリカ合衆国カリフォルニア州92071, サンティー，メサ・リッジ・ロード 8426 (72)発明者 ハモンド，フィリップ・ダブリュー アメリカ合衆国コロラド州80301，ボール ダー，ヴァルモント・ロード 5505，アパ ートメント ナンバー38

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．選択的ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でＨＰＶ１６型お よび／または１８型標的核酸とハイブリダイズして検出可能な標的：プローブデ ュープレックスを形成するであろうが、前記条件下でＨＰＶ６、１１、３１、３ ３、３５、３９、４５、５１、５２、および／または５８型からの核酸とは検出 可能な非標的：プローブデュープレックスを形成しないであろうオリゴヌクレオ チドを含むハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、 前記オリゴヌクレオチドは、標的領域中に存在する１０個またはそれ以上の連続 するヌクレオチドの標的配列に少なくとも７０％相補的な核酸の配列を含み； 前記標的領域は、配列番号９−１２、１７−２０、２９−３２、３３−３６、４ ５−４８、および７３−７６に記載される配列からなる群より選択される配列を 含むか、または前記標的領域は、配列番号５−８、２５−２８、５７−６０、６ ５−６８、７７−８０、および８１−８４に記載される配列からなる群より選択 される配列中に存在する配列からなる、 ことを特徴とするプローブ。 ２．前記標的領域は、配列番号９−１２、１７−２０、２９−３２、および３３ −３６に記載される配列からなる群より選択される配列中に存在する配列を含む か、または前記標的領域は、配列番号５−８、および２５−２８に記載される配 列からなる群より選択される配列中に存在する配列からなる、ＨＰＶ１６型核酸 にハイブリダイズするであろう請求項１記載のプローブ。 ３．前記条件下でＨＰＶ１８型核酸にハイブリダイズしないであろう、請求項２ 記載のプローブ。 ４．前記標的領域が配列番号４５−４８、および７３−７６に記載される配列か らなる群より選択される配列を含むか、または前記標的領域が配列番号５７−６ ０、６５−６８、７７−８０、および８１−８４に記載される配列からなる群よ り選択される配列からなる、ＨＰＶ１８型標的核酸にハイブリダイズするであろ う、請求項１記載のプローブ。 ５．前記条件下でＨＰＶ１６型核酸にハイブリダイズしないであろう、請求項４ 記載のプローブ。 ６．前記標的領域がＤＮＡである、請求項１記載のプローブ。 ７．前記標的領域がＲＮＡである、請求項１記載のプローブ。 ８．前記標的領域が、配列番号３３−３６、および４５−４８に記載される配列 からなる群より選択される、請求項１記載のプローブ。 ９．前記標的領域が、配列番号９−１２、１７−２０、２９−３２、および７３ −７６に記載される配列からなる群より選択される、請求項１記載のプローブ。 １０．前記標的領域が、配列番号５−８、２５−２８、５７−６０、６５−６８ 、７７−８０、８１−８４、および８５−８８に記載される配列からなる群より 選択される、請求項１記載のプローブ。 １１．５０−６０℃で、０．９−１．１％のラウリル硫酸リチウムを含有する０ ．０４Ｍ−０．０６Ｍのコハク酸リチウム緩衝液中でＨＰＶ１６型および／また は１８型の核酸にハイブリダイズし、ＨＰＶ６、１１、３１、３３、３５、３９ 、４５、５１、５２、および／または５８型にハイブリダイズせず、前記デュー プレックスは、ＨＰＶ１６型および／または１８型の検出について安定であり、 ＨＰＶ６、１１、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、および／または ５８型の検出について安定ではない、請求項１記載のプローブ。 １２．前記選択的ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が、６０−７ ０℃で、ほぼ等モル量のＮａ₂ＨＰＯ₄およびＮａＨ₂ＰＯ₄を含有する０．１０Ｍ −０．１４Ｍリン酸緩衝液、約１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０１−０．０３％ のドデシル硫酸ナトリウムを含む、請求項１記載のプローブ。 １３．前記オリゴヌクレオチドが、１０個またはそれ以上の連続するヌクレオチ ドの前記標的配列に少なくとも９０％相補的な配列を含む、請求項１記載のプロ ーブ。 １４．前記オリゴヌクレオチドが、１０個またはそれ以上の連続するヌクレオチ ドの前記標的配列に１００％相補的な配列を含む、請求項１記載のプローブ。 １５．前記オリゴヌクレオチドが１０−１００ヌクレオチドの長さである、請求 項１記載のプローブ。 １６．前記オリゴヌクレオチドが１５−５０塩基の長さである、請求項１記載の プローブ。 １７．前記オリゴヌクレオチドが２３−４０塩基の長さである、請求項１記載の プローブ。 １８．請求項１−１７のいずれかに記載の標的領域中に存在する１０個またはそ れ以上の連続する核酸の標的核酸配列と、請求項１−１６のいずれかに記載の対 応するオリゴヌクレオチドとの間に形成される核酸ハイブリッドであって、前記 ハイブリッドは、ＨＰＶ１６型および／または１８型の検出について安定であり 、ＨＰＶ６、１１、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、および／また は５８型の検出について安定ではないことを特徴とする核酸ハイブリッド。 １９．核酸合成の開始用の部位をさらに含み、前記オリゴヌクレオチドが、スト リンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＨＰＶ１６型および／または １８型の核酸に特異的にハイブリダイズするが、ＨＰＶ６、１１、３１、３３、 ３５、３９、４５、５１、５２、または５８型にはハイブリダイズしない、請求 項１８記載の核酸ハイブリッド。 ２０．オリゴヌクレオチドを含むヘルパープローブであって、前記オリゴヌクレ オチドは、ＨＰＶ１６型および／または１８型標的配列にハイブリダイズするで あろうヌクレオチドの配列を含み、前記標的配列が配列番号６２、６４、１１８ 、１２０、１２２、１２４、１２６および１２８に記載される配列からなる群よ り選択されることを特徴とするプローブ。 ２１．前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡである、請求項２０記載のプローブ。 ２２．前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡである、請求項２０記載のプローブ。 ２３．前記標的配列が、配列番号１２６、および１２８に記載される配列からな る群より選択される配列を含む、請求項２０記載のプローブ。 ２４．前記標的配列が、配列番号６２、６４、１２２、および１２４に記載され る配列からなる群より選択される配列を含む、請求項２０記載のプローブ。 ２５．前記標的配列が、配列番号１１８、および１２０に記載される配列からな る群より選択される配列からなる、請求項２０記載のプローブ。 ２６．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号６１、６３、１１７、１１９、１２ １、１２３、１２５、および１２７からなる群より選択される配列の１０個また はそれ以上の連続するヌクレオチドと少なくとも９０％同一である、請求項２０ 記載のプローブ。 ２７．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号６１、６３、１１７、１１９、１２ １、１２３、１２５、および１２７からなる群より選択される配列の１０個また はそれ以上の連続するヌクレオチドと１００％同一である、請求項２０記載のプ ローブ。 ２８．前記オリゴヌクレオチドが１０−１００ヌクレオチドの長さである、請求 項２０記載のプローブ。 ２９．前記オリゴヌクレオチドが１５−５０塩基の長さである、請求項２０記載 のプローブ。 ３０．前記オリゴヌクレオチドが２３−４０塩基の長さである、請求項２０記載 のプローブ。 ３１．次の組み合わせ： （１）１つまたはそれ以上の核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、お よび （２）１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、および／または （３）１つまたはそれ以上のヘルパープローブ を含み、ここで、前記組み合わせは、以下の組み合わせ： （ａ）１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、そのう ち少なくとも１つは配列番号５または６と実質的に同様の核酸配列を有し、およ び１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、そのうち少なくとも１つは配 列番号１または８５と実質的に同様の核酸配列を有し； （ｂ）１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、そのう ち少なくとも１つは配列番号３３または３４と実質的に同様の核酸配列を有し、 および１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、そのうち少なくとも１つ は配列番号３７、９３、または１１３と実質的に同様の核酸配列を有し； （ｃ）１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、そのう ち少なくとも１つは配列番号９または１０と実質的に同様の核酸配列を有し、お よび１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、そのうち少なくとも１つは 配列番号２１または８９と実質的に同様の核酸配列を有し； （ｄ）１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、そのう ち少なくとも１つは配列番号１７、１８、２５、２６、２９、または３０と実質 的に同様の核酸配列を有し、および１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチ ド、そのうち少なくとも１つは配列番号１３または２１と実質的に同様の核酸配 列を有し； （ｅ）１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、そのう ち少なくとも１つは配列番号４５または４６と実質的に同様の核酸配列を有し、 および１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、そのうち少なくとも１つ は配列番号５３または１０９と実質的に同様の核酸配列を有し； （ｆ）１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、そのう ち少なくとも１つは配列番号７３または７４と実質的に同様の核酸配列を有し、 および１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、そのうち少なくとも１つ は配列番号１１３または６９と実質的に同様の核酸配列を有し；および （ｇ）１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、そのう ち少なくとも１つは配列番号６５、６６、８１、または８２と実質的に同様の核 酸配列を有し、および、１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、そのう ち少なくとも１つは配列番号４１または１０９と実質的に同様の核酸配列を有し ； （ｈ）１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、そのう ち少なくとも１つは配列番号６５、６６、８１、または８２と実質的に同様の核 酸配列を有し、および１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、そのうち 少なくとも１つは配列番号４１または１０９と実質的に同様の核酸配列を有し、 および１つまたはそれ以上のヘルパープローブ、そのうち少なくとも１つは配列 番号６１、６３、１１７、または１１９と実質的に同様の核酸配列を有し；およ び （ｉ）１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、そのう ち少なくとも１つは配列番号５、６、７、８、４５、４６、４７、４８、または ４９と実質的に同様の核酸配列を有し、および１つまたはそれ以上のヘルパープ ローブ、そのうち少なくとも１つは配列番号１２１、１２３、１２５、または１ ２７と実質的に同様の核酸配列を有する； からなる群より選択されることを特徴とするプローブミックス。 ３２．ＨＰＶ１６型および／または１８型核酸配列を増幅するための増幅オリゴ ヌクレオチドであって； 前記オリゴヌクレオチドは、標的配列中に存在する１０個またはそれ以上の連続 するヌクレオチドのサブ配列に少なくとも７０％相補的な領域を有するヌクレオ チドの配列を含み、 前記標的配列は、配列番号２、４、１４、１６、２２、２４、３８、４０、４２ 、４４、５０、５２、５４、５６、７０、７２、９０、９２、９４、９６、１０ ２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４および１１６に記載され る配列からなる群より選択される配列を含むか、または配列番号８６および８８ に記載される配列からなる群より選択される配列からなる、 ことを特徴とするオリゴヌクレオチド。 ３３．前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡである、請求項３２記載のオリゴヌクレ オチド。 ３４．前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡである、請求項３２記載のオリゴヌクレ オチド。 ３５．前記標的配列が、配列番号３８、４０、９４、９６、１０２、および１０ ４に記載される配列からなる群より選択される配列を含む、請求項３２記載のオ リゴヌクレオチド。 ３６．前記標的配列が、配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、２２、２４ 、５０、５２、５４、５６、７０、７２、９０、９２、１０６、１０８、１１０ 、１１２、１１４、および１１６に記載される配列からなる群より選択される配 列を含む、請求項３２記載のオリゴヌクレオチド。 ３７．前記標的配列が、配列番号４２、４４、８６、および８８に記載される配 列からなる群より選択される配列からなる、請求項３２記載のオリゴヌクレオチ ド。 ３８．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、３、１３、１５、２１、２３、 ３７、３９、４１、４３、４９、５１、５３、５５、６９、７１、８５、８７、 ８９、９１、９３、９５、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、 １１３および１１５に記載される配列からなる群より選択される配列中に存在す る１０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドのサブ配列と少なくとも９０％ 同一である、請求項３２記載のオリゴヌクレオチド。 ３９．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、３、１３、１５、２１、２３、 ３７、３９、４１、４３、４９、５１、５３、５５、６９、７１、８５、８７、 ８９、９１、９３、９５、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、 １１３および１１５に記載される配列からなる群より選択される配列中に存在す る１０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドのサブ配列と１００％同一であ る、請求項３２記載のオリゴヌクレオチド。 ４０．前記オリゴヌクレオチドが、１０−１００ヌクレオチドの長さである、請 求項３２記載のオリゴヌクレオチド。 ４１．前記オリゴヌクレオチドが１５−５０塩基の長さである、請求項３２記載 のオリゴヌクレオチド。 ４２．前記オリゴヌクレオチドが２３−４０塩基の長さである、請求項３２記載 のオリゴヌクレオチド。 ４３．試料中のＨＰＶ１６型および／または１８型核酸を選択的に増幅する方法 であって、前記核酸を請求項３２−４２のいずれかに記載の１つまたはそれ以上 の増幅オリゴヌクレオチドで増幅する工程を含む方法。 ４４．ＨＰＶ１６型および／または１８型を含む可能性のある試料中のＨＰＶ１ ６型および／または１８型を検出する方法であって、 ａ）前記試料に１つまたはそれ以上の請求項１−１９のいずれかに記載の核酸ハ イブリダイゼーションアッセイプローブを提供し；そして ｂ）ＨＰＶ１６型および／または１８型の存在を示す前記検出可能なプローブ： 標的デュープレックスの形成を検出する； の各工程を含む方法。 ４５．前記標的核酸が、請求項３２−４３のいずれかに記載のプローブで増幅さ れ、請求項１−１６のいずれかに記載のプローブで検出される、請求項４４記載 の方法。 ４６．請求項１−１６のいずれかに記載の１つまたはそれ以上のプローブを含む キット。 ４７．試料中のＨＰＶ１６型核酸をＨＰＶ１８型核酸に優先して特異的に検出す る方法であって、 ａ）前記ＨＰＶ１６型核酸を、以下の配列： （ｉ）配列番号２および４；および （ｉｉ）配列番号８６および８８ からなる群より選択されるＨＰＶ１６型ヌクレオチド配列に結合するかまたはこ れを介して伸長を引き起こすであろう少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチド で増幅し； ｂ）増幅されたＨＰＶ１６型核酸を、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ ン条件下で以下の配列： （ｉ）配列番号６および配列番号８；および （ｉｉ）配列番号５および配列番号７ からなる群より選択されるＨＰＶ１６型のヌクレオチド配列標的領域の少なくと も一部と検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するであろう少なくとも １つのハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ； ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を与え；そして ｄ）プローブ：標的ハイブリッドの存在を前記試料中のＨＰＶ１６型の存在また は量の指標として検出する； の各工程を含む方法 ４８．少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ転写の開始を促進し うる５’部分をさらに有する、請求項４７記載の方法。 ４９．前記５’部分が配列番号９７と実質的に同様のヌクレオチド配列を含む、 請求項４８記載の方法。 ５０．前記増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号１または８５と実質的に同様の ヌクレオチド配列を有する、請求項４７記載の方法。 ５１．前記プローブが配列番号５または６と実質的に同様のヌクレオチド配列 を有する、請求項５０記載の方法。 ５２．試料中のＨＰＶ１６型核酸をＨＰＶ１８型核酸に優先して特異的に検出す る方法であって： ａ）前記ＨＰＶ１６型核酸を、以下の配列： （ｉ）配列番号３８および４０； （ｉｉ）配列番号９４および９４；および （ｉｉｉ）配列番号１１４および１１６ からなる群より選択されるＨＰＶ１６型ヌクレオチド配列に結合するかまたはそ れを介して伸長を引き起こすであろう少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチド で増幅し、 ｂ）増幅されたＨＰＶ１６型核酸を、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ ン条件下で以下の配列： （ｉ）配列番号３４および配列番号３６；および （ｉｉ）配列番号３３および配列番号３５ からなる群より選択されるＨＰＶ１６のヌクレオチド配列標的領域の少なくとも 一部と検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するであろう少なくとも１ つのハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ、 ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を与え、そして ｄ）プローブ：標的ハイブリッドの存在を前記試料中のＨＰＶ１６型の存在また は量の指標として検出する； の各工程を含む方法。 ５３．少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ転写の開始を促進し うる５’部分をさらに有する、請求項５２記載の方法。 ５４．前記５’部分が、配列番号９７と実質的に同様のヌクレオチド配列を含む 、請求項５３記載の方法。 ５５．前記増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号３７、９３、または１１３と実 質的に同様のヌクレオチド配列を有する、請求項５２記載の方法。 ５６．前記プローブが、配列番号３３または３４と実質的に同様のヌクレオチド 配列を有する、請求項５０記載の方法。 ５７．試料中のＨＰＶ１６型核酸をＨＰＶ１８型核酸に優先して特異的に検出す る方法であって： ａ）前記ＨＰＶ１６型核酸を、以下の配列： （ｉ）配列番号９０および９２；および （ｉｉ）配列番号２２および２４ からなる群より選択されるＨＰＶ１６型ヌクレオチド配列に結合するかまたはそ れを介して伸長を引き起こすであろう少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチド で増幅し； ｂ）増幅されたＨＰＶ１６型核酸を、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ ン条件下で以下の配列： （ｉ）配列番号９および配列番号１１；および （ｉｉ）配列番号１０および配列番号１２ からなる群より選択される、ＨＰＶ１６のヌクレオチド配列標的領域の少なくと も一部と検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するであろう少なくとも １つのハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ； ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を与え；そして ｄ）プローブ：標的ハイブリッドの存在を、前記試料中のＨＰＶ１６型の存在ま たは量の指標として検出する； の各工程を含む方法。 ５８．少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ転写の開始を促進し うる５’部分をさらに有する、請求項５７記載の方法。 ５９．前記５’部分が配列番号９７と実質的に同様のヌクレオチド配列を含む、 請求項５８記載の方法。 ６０．前記増幅オリゴヌクレオチドが配列番号２１または８９と実質的に同様の ヌクレオチド配列を有する、請求項５７記載の方法。 ６１．前記プローブが配列番号９または１０と実質的に同様のヌクレオチド配列 を有する、請求項５８記載の方法。 ６２．試料中のＨＰＶ１６型核酸をＨＰＶ１８型核酸に優先して特異的に検出す る方法であって： ａ）前記ＨＰＶ１６型核酸を、以下の配列： （ｉ）配列番号２２および２４；および （ｉｉ）配列番号１４および１６ からなる群より選択されるＨＰＶ１６型ヌクレオチド配列に結合するかまたはそ れを介して伸長を引き起こすであろう少なくとも１つのプライマーで増幅し； ｂ）増幅されたＨＰＶ１６型核酸を、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ ン条件下で以下の配列： （ｉ）配列番号３０および配列番号３２； （ｉｉ）配列番号２６および配列番号２８；および （ｉｉｉ）配列番号１８および配列番号２０ からなる群より選択されるＨＰＶ１６のヌクレオチド配列標的領域の少なくとも 一部と検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するであろう少なくとも１ つのオリゴヌクレオチドプローブと接触させ； ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を与え；そして ｄ）プローブ：標的ハイブリッドの存在を、前記試料中のＨＰＶ１６型の存在ま たは量の指標として検出する； の各工程を含む方法。 ６３．少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ転写の開始を促進し うる５’部分をさらに有する、請求項６２記載の方法。 ６４．前記５’部分が、配列番号９７と実質的に同様のヌクレオチド配列を含む 、請求項６３記載の方法。 ６５．前記増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号１３または２１と実質的に同様 のヌクレオチド配列を有する、請求項６２記載の方法。 ６６．前記プローブが、配列番号１７、１８、２５、２６、２９、または３０と 実質的に同様のヌクレオチド配列を有する、請求項６２記載の方法。 ６７．前記プローブが、配列番号２９または３０と実質的に同様のヌクレオチド 配列を有し、前記増幅された１６型核酸が、非スプライスＥ６ｍ ＲＮＡまたは その相補物、およびウラシルのかわりにチミンを有するそのＤＮＡ版に特異的な 配列を有する、請求項６２記載の方法。 ６８．前記プローブが配列番号２５または２６と実質的に同様のヌクレオチド配 列を有し、前記増幅された１６型核酸が、スプライスＥ６^*ｍＲＮＡまたはその 相補物、およびウラシルのかわりにチミンを有するそのＤＮＡ版に特異的な配列 を有する、請求項６２記載の方法。 ６９．前記プローブが配列番号１７または１８と実質的に同様のヌクレオチド配 列を有し、前記増幅された１６型核酸が、Ｅ６^**ｍＲＮＡまたはその相補物、お よびウラシルのかわりにチミンを有するそのＤＮＡ版に特異的な配列を有する、 請求項６２記載の方法。 ７０．試料中のＨＰＶ１８型核酸をＨＰＶ１６型核酸に優先して特異的に検出す る方法であって： ａ）前記ＨＰＶ１８型核酸を、以下の配列： （ｉ）配列番号５４および５６；および （ｉｉ）配列番号１１０および１１２ からなる群より選択されるＨＰＶ１８型ヌクレオチド配列に結合するかまたはそ れを介して伸長を引き起こすであろう少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチド で増幅し； ｂ）増幅されたＨＰＶ１８型核酸を、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ ン条件下で以下の配列： （ｉ）配列番号４６および配列番号４８；および （ｉｉ）配列番号４５および配列番号４７ からなる群より選択される、ＨＰＶ１８のヌクレオチド配列標的領域の少なくと も一部と検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するであろう少なくとも １つのハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ； ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を与え；そして ｄ）プローブ：標的ハイブリッドの存在を、前記試料中のＨＰＶ１８型の存在ま たは量の指標として検出する； の各工程を含む方法： ７１．少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ転写の開始を促進し うる５’部分をさらに有する、請求項７０記載の方法。 ７２．前記５’部分が、配列番号９７と実質的に同様のヌクレオチド配列を含む 、請求項７１記載の方法。 ７３．前記増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号５３または１０９と実質的に同 様のヌクレオチド配列を有する、請求項７０記載の方法。 ７４．前記プローブが、配列番号４５または４６と実質的に同様のヌクレオチド 配列を有する、請求項７０記載の方法。 ７５．試料中のＨＰＶ１８型核酸をＨＰＶ１６型核酸に優先して特異的に検出す る方法であって； ａ）前記ＨＰＶ１８型核酸を、以下の配列： （ｉ）配列番号７０および７２； （ｉｉ）配列番号３８および３０；および （ｉｉｉ）配列番号１１４および１１６ からなる群より選択されるＨＰＶ１８型ヌクレオチド配列に結合するかまたはそ れを介して伸長を引き起こすであろう少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチド で増幅し； ｂ）増幅したＨＰＶ１８型核酸を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション 条件下で以下の配列： （ｉ）配列番号７４および配列番号７６；および （ｉｉ）配列番号７３および配列番号７５ からなる群より選択されるＨＰＶ１８のヌクレオチド配列標的領域の少なくとも 一部と検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するであろう少なくとも１ つのハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ； ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を与え、そして ｄ）プローブ：標的ハイブリッドの存在を、前記試料中のＨＰＶ１８型の存在ま たは量の指標として検出する； の各工程を含む方法。 ７６．少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ転写の開始を促進し うる５’部分をさらに有する、請求項７５記載の方法。 ７７．前記５’部分が、配列番号９７と実質的に同様のヌクレオチド配列を含む 、 請求項７６記載の方法。 ７８．前記増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号１１３または６９と実質的に同 様のヌクレオチド配列を有する、請求項７５記載の方法。 ７９．前記プローブが、配列番号７３または７４と実質的に同様のヌクレオチド 配列を有する、請求項７５記載の方法。 ８０．試料中のＨＰＶ１８型核酸をＨＰＶ１６型核酸に優先して特異的に検出す る方法であって： ａ）前記ＨＰＶ１８型核酸を、以下の配列： （ｉ）配列番号４２および４４；および （ｉｉ）配列番号１１０および１１２ からなる群より選択されるＨＰＶ１８型ヌクレオチドに結合するかまたはそれを 介して伸長を引き起こすであろう少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドで増 幅し； ｂ）増幅されたＨＰＶ１８型核酸を、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ ン条件下で以下の配列： （ｉ）配列番号８２および配列番号８４； （ｉｉ）配列番号６６および配列番号６８；および （ｉｉｉ）配列番号５６および配列番号５８ からなる群より選択されるＨＰＶ１８のヌクレオチド配列標的領域の少なくとも 一部と検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するであろう少なくとも１ つのハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ； ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を与え、そして ｄ）プローブ：標的ハイブリッドの存在を、前記試料中のＨＰＶ１８型の存在ま たは量の指標として検出する； の各工程を含む方法。 ８１．少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ転写の開始を促進し うる５’部分をさらに有する、請求項８０記載の方法。 ８２．前記５’部分が、配列番号９７と実質的に同様のヌクレオチド配列を含む 、請求項８１記載の方法。 ８３．前記増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号４１または１０９と実質的に同 様のヌクレオチド配列を有する、請求項８０記載の方法。 ８４．前記プローブが、配列番号６５、６６、８１、または８２と実質的に同様 のヌクレオチド配列を有する、請求項８０記載の方法。 ８５．前記プローブが配列番号６５または６６と実質的に同様のヌクレオチド配 列を有し、前記増幅された１８型核酸が非スプライスＥ６ｍ ＲＮＡまたはその 相補物、およびウラシルのかわりにチミンを有するそのＤＮＡ版に特異的な配列 を有する、請求項８０記載の方法。 ８６．前記プローブが配列番号８１または８２と実質的に同様のヌクレオチド配 列を有し、前記増幅された１８型核酸が、スプライスＥ６^*ｍＲＮＡまたはその 相補物、およびウラシルのかわりにチミンを有するそのＤＮＡ版に特異的な配列 を有する、請求項８０に記載の方法。 ８７．前記プローブが配列番号５７または５８と実質的に同様のヌクレオチド配 列を有し、前記増幅された１６型核酸がＥ６^**ｍＲＮＡまたはその相補物、およ びウラシルのかわりにチミンを有するそのＤＮＡ版に特異的な配列を有する、請 求項８０記載の方法。 ８８．前記試料にオリゴヌクレオチドを含むヘルパープローブを提供することを 含み、 ここで、前記オリゴヌクレオチドは、ＨＰＶ１６型および／または１８型標的配 列にハイブリダイズするであろうヌクレオチドの配列を含み、 前記標的配列は、配列番号６２、６４、１１８、および１２０に記載される配列 からなる群より選択される、請求項８０記載の方法。 ８９．試料中のＨＰＶ１６型核酸またはＨＰＶ１８型核酸をＨＰＶ６、１１、３ １、３３、３５、３９、４５、５１、５２、または５８型核酸に優先して特異的 に検出する方法であって： ａ）ＨＰＶ１６型核酸を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で 以下の配列： （ｉ）配列番号６および配列番号８；および （ｉｉ）配列番号５および配列番号７； からなる群より選択されるＨＰＶ１６のヌクレオチド配列標的領域の少なくとも 一部と検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するであろう少なくとも１ つのハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ； ｂ）増幅されたＨＰＶ１８型核酸を、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ ン条件下で以下の配列 （ｉ）配列番号４６および配列番号４８；および （ｉｉ）配列番号４５および配列番号４７； からなる群より選択される、ＨＰＶ１８のヌクレオチド配列標的領域の少なくと も一部と検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するであろう少なくとも １つのハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ； ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を与え；そして ｄ）プローブ：標的ハイブリッドの存在を、前記試料中のＨＰＶ１６型またはＨ ＰＶ１８型の存在または量の指標として検出する； の各工程を含む方法。 ９０．前記試料に配列番号１２１、１２３、１２５、または１２７と実質的に同 様の配列を有するオリゴヌクレオチドを含むヘルパープローブを提供することを 含む、請求項８９記載の方法。 ９１．試料中のＨＰＶ１８型核酸をＨＰＶ１６型核酸に優先して特異的に検出す る方法であって： ａ）前記ＨＰＶ１８型核酸を、以下の配列： （ｉ）配列番号４２および４４、または （ｉｉ）配列番号１１０および１１２、 からなる群より選択されるＨＰＶ１８型ヌクレオチド配列に結合するかまたはそ れを介して伸長を引き起こすであろう少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチド で増幅し； ｂ）増幅されたＨＰＶ１８型核酸を、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ ン条件下で以下の配列： （ｉ）ＨＰＶ１８Ｅ６については配列番号８１および８３、 （ｉｉ）ＨＰＶ１８Ｅ６^*については配列番号６５および６７、 （ｉｉｉ）ＨＰＶ１８Ｅ６^**については配列番号５７および５９； からなる群より選択されるＨＰＶ１８のヌクレオチド配列標的領域の少なくとも 一部と検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するであろう少なくとも１ つのハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ； ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を与え； ｄ）プローブ：標的ハイブリッドの存在を、前記試料中のＨＰＶ１８型の存在ま たは量の指標として検出する； の各工程を含む方法。 ９２．前記プライマーが、配列番号４１または１０９と実質的に同様のヌクレオ チド配列を有する、請求項９１記載の方法。 ９３．少なくとも１つのプライマーが、ＲＮＡの転写を促進しうる５’部分をさ らに有し、および／または、配列番号９７と実質的に同様のヌクレオチド配列を 含む、請求項９１記載の方法。 ９４．前記プローブが、配列番号８１、５７、または６５からなる群より選択さ れる配列と実質的に同様のヌクレオチド配列を有する、請求項９１記載の方法。 ９５．前記試料に、配列番号６１または１１７と実質的に同様の配列を有するオ リゴヌクレオチドを含むヘルパープローブを提供することを含む、請求項９１記 載の方法。 ９６．（ａ）請求項１−１６のいずれかに記載の１つまたはそれ以上のハイブリ ダイゼーションアッセイプローブ；および （ｂ）請求項３２−４３のいずれかに記載の１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌ クレオチド を含むキット。 ９７．（ａ）１つまたはそれ以上の請求項１−１６のいずれかに記載のハイブリ ダイゼーションアッセイプローブ；および （ｂ）１つまたはそれ以上の請求項２０−３０のいずれかに記載のヘルパープロ ーブ を含むキット。 ９８．請求項３１記載のプローブミックスを含むキット。