DE3687645T2

DE3687645T2 - Verfahren der beschleunigten wiederassoziation der nukleinsaeure.

Info

Publication number: DE3687645T2
Application number: DE8686304429T
Authority: DE
Inventors: Daniel Kacian; David Kohne
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1986-01-07
Filing date: 1986-06-10
Publication date: 1993-05-27
Anticipated expiration: 2006-06-11
Also published as: DE3687645D1; CA1337753C; JPS62158500A; JPH0789955B2; AU5879986A; ATE85088T1; EP0229442A1; EP0229442B1; AU603767B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Renaturierung, Reassoziation oder Hybridisierung von Einzelstrang-Nucleinsäuremolekülen in Doppelstrangnucleinsäuremoleküle, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber der Reaktionsgeschwindigkeit unter Standardbedingungen mit einem 0,12 M Phosphatpuffer bei 60ºC beträchtlich erhöht ist. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Renaturierung, Reassoziation oder Hybridisierung von Nucleinsäuren, einschließlich DNA- mit DNA-, RNA- mit DNA- und RNA- mit RNA- Reaktionen, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit beträchtlich erhöht ist, und zwar um einen Faktor von 50-100fach und sogar bis zu mehreren 1000fach derjenigen der Reaktionsgeschwindigkeiten, die unter Standardbedingungen beobachtet werden. Diese stark beschleunigten Reaktionsgeschwindigkeiten werden durch die Verwendung von Reaktionslösungen erreicht, die Nucleinsäure ausfällende Agenzien enthalten.
Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren zur Nucleation von Einzelstrang-Nucleinsäuremolekülen in Doppelstrangmoleküle bekannt und haben sich als nützliche Werkzeuge zur Analyse genetischen Materials eines breiten Spektrums von Organismen erwiesen. Im allgemeinen basieren diese Nucleationsreaktionen, nämlich Renaturierung, Reassoziation und Hybridisierung, auf der Tendenz von Einzelstrang-Nucleinsäuremolekülen, die Blöcke oder Segmente komplementärer Basensequenzen aufweisen, zwischen diesen komplementären Sequenzen Basenpaarstrukturen zu bilden und sich unter Bildung von Doppelhelices wieder aufzuwinden. Je höher der Grad der Sequenzkomplementarität zwischen den Einzelstrang-Nucleinsäuremolekülen ist, desto größer ist die Tendenz eines gegebenen Molekülpaares, einen Kern und ein Doppelstrang- oder Duplexmolekül zu bilden.
Renaturierung, Reassoziation und Hybridisierung sind im wesentlichen synonyme Reaktionen zwischen einzelsträngigen Nucleinsäuremolekülen. Als solche werden sie in diesen Unterlagen als austauschbar behandelt. Die folgende Unterscheidung kann sich jedoch zum Verständnis der betroffenen Technologie als hilfreich erweisen. Renaturierung bezieht sich allgemein auf die Bildung eines doppelstrangigen Nucleinsäuremoleküls aus zwei einzelsträngigen Molekülen, deren Basen ursprünglich miteinander gepaart waren und durch einen Denaturierungsprozeß getrennt wurden. Die Reassoziation bezieht sich auf den Prozeß des Bildens doppelsträngiger Nucleinsäuremoleküle zwischen zwei einzelsträngigen Molekülen, die üblicherweise von verschiedenen ursprünglichen Molekülen stammen. Die Hybridisierung bezieht sich auf die Bildung doppelsträngiger Nucleinsäuremoleküle aus einzelsträngigen Nucleinsäuremolekülen, die jeweils individuellen Ursprungs sind. Man sollte sich bewußt sein, daß das keine scharf getrennten Unterscheidungen sind, und daß sie sich beträchtlich überlappen. Beispielsweise werden
DNA:DNA-Reaktionen allgemein sowohl Reassoziations- als auch Hybridisierungsreaktionen genannt. Andererseits wird die Bildung eines RNA:RNA-Doppelstrangmoleküls im allgemeinen als Hybridisierung bezeichnet.
Die Kinetik dieser Reaktionen ist in der Technik wohlbekannt, auch wenn sie Kinetiken zweiten Grades sind. Somit wird, wenn die Konzentration der Einzelstrang-Nucleinsäuremoleküle erhöht wird, auch die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht. Umgekehrt bewirkt eine Abnahme der Konzentration des Einzelstrang- Nucleinsäurereaktionspartners eine Abnahme der Reaktionsgeschwindigkeit und somit eine Zunahme der Zeit, die notwendig ist, damit die Bildung der Doppelstrang-Nucleinsäuremoleküle stattfindet.
Der Einfluß der Temperatur auf die Reaktionsgeschwindigkeit ist in der Technik ebenfalls wohlbekannt. Fällt die Reaktionstemperatur unter Tm (die Temperatur, bei der 50% der Doppelstrangmoleküle denaturiert werden, auch als "Schmelztemperatur" bekannt), wird ein Maximum der Reaktionsgeschwindigkeit bei Temperaturen von annähernd 15ºC bis 30ºC unterhalb Tm erreicht. Es ist bekannt, daß ein weiteres Absenken der Temperatur die Geschwindigkeit unter diese Maximumgeschwindigkeit absinken läßt.
Schließlich ist hinsichtlich der Kinetik dieser Reaktionen bekannt, daß die Reaktionsgeschwindigkeiten für Elektrolyten wie NaCl in starkem Maße von einer Ionenstärke unterhalb 0,4 M abhängig sind, und oberhalb dieser Ionenstärke von der Salzkonzentration nahezu unabhängig sind.
Weitere Informationen über Kinetik und Reaktionsgeschwindigkeiten dieser Nucleinsäure-Assoziationsreaktionen ist in den folgenden Publikationen zu finden:
Wetmur, R., und Davidson, N. (1968), J. Molec. Biol. 31, 349;
Wetmur, R. (1975) Biopolymers 14, 2517;
Britten, R., J., Graham, D., und Neufeld, B. (1974), Methods Enzymol, 29, 363;
Kohne, D. E., Levinson, S.A., und Byers, M. J. (1977) Biochemistry 16, 5329; und
Orosz, J. M. und Wetmur, J. G., (1977) Biopolymer 16, 1183.
Dem Stand der Technik war schon lange bekannt, daß eine Hauptbegrenzung der Anwendbarkeit dieser bekannten Nucleinsäure- Assoziationstechniken die Grundgeschwindigkeit der Reaktion ist. Reaktionszeiten in der Größenordnung von mehreren Stunden bis 10 Stunden und sogar Tagen sind üblich. Eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit durch Erhöhung der in den Reaktionen verwendeten Mengen an Einzelstrang-Nucleinsäuremolekülen (gemäß der Kinetik zweiter Ordnung) ist aus drei Gründen für dieses Problem keine wünschenswerte Lösung. Erstens wird in vielen Fällen die Target-Einzelstrang-Nucleinsäure in der Reaktion aus physiologischen Proben extrahiert, was von Natur aus die Menge an solch verfügbarer Nucleinsäure auf die in den Zellen der physiologischen Probe enthaltenen beschränkt. Zweitens sind mit der Verwendung von Nucleinsäurereaktionspartnern beträchtliche Kosten verbunden, was die praktische Anwendung einer erhöhten Qualität der Reaktionspartner beschränkt. Drittens senkt eine Erhöhung der Mengen der Einzelstrang-Nucleinsäuremoleküle die Empfindlichkeit der Reaktion durch Ansteigen des Hintergrundgeräusches. Nichtsdestoweniger ist eine Anzahl von Techniken entwickelt worden, um die Grundgeschwindigkeit dieser Reaktionen um Faktoren von 5 bis 50 oder mehr zu erhöhen. Es wurden auch Techniken mit begrenzter Anwendbarkeit entwickelt, die die Grundgeschwindigkeit der Reaktion um Faktoren in der Größenordnung von 1000 oder mehr erhöhen. Wie jedoch im folgenden näher erläutert wird, war keine dieser bereits bekannten Techniken erfolgreich beim Erzeugen einer beträchtlich beschleunigten Reaktionsgeschwindigkeit um das 50-100- oder mehrfache der Grund-Standard-Reaktion in einem Einphasensystem, das auf DNA:DNA-, DNA:RNA- und RNA:RNA-Reaktionen anwendbar ist.
Beim Arbeiten mit Reaktionsgeschwindigkeiten ist die anerkannte Standardbedingung zum Vergleich dieser Geschwindigkeiten eine wäßrige Lösung eines 0,12 M Phosphatpuffers (PB) bei 60ºC. Eine ähnliche Standardbedingungß die oft verwendet wird und vergleichbare Reaktionsgeschwindigkeiten liefert, ist eine wäßrige Lösung von 0,18 M NaCl bei 60ºC.
Die bei weitem am meisten übliche Technik der Beschleunigung der Reaktionsgeschwindigkeit über die der Standardbedingung hinaus war, die Salzkonzentration der Reaktionslösung über die der Standardbedingung zu erhöhen. Wie in der folgenden Tabelle näher erläutert wird, geben, obwohl eine beträchtliche Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit durch Erhöhung der Salzkonzentration beobachtet wird, die bisher bekannten Techniken an, daß sich die Geschwindigkeit bei Salzkonzentrationen über 2 M nicht mehr erhöht oder sogar fällt. Tabelle 1 Bisher bekannte Wirkung der Salzkonzentration auf DNA:DNA-Hybridisierungsgeschwindikeiten
Salz Geschwindigkeitserhöhung bezogen auf 0,18 M NaCl-Referenzbedingung
A. Natriumchlorid
0,18M 1
0,72M 5,8
1M 7
1,2M 7,7 Britten, et al.
1,85M 8,6
3,2M 12,3
4,75M 21
B. Cäsiumchlorid
1M 7,6
4M 12,7
7,5M 15,6
C. Natriumphosphat
0,12 (0,18M Na) 1
0,4,8M (0,72M Na) 5,6 Britten, et al. und
1M (1,5 M Na) 8,4 Wetmur und Davidson
1,23M (1,85M Na) 10,1
2,1 (3,2M Na) 12,1
D. Natriumperchlorat
1M 11
2,2M 6,8 Wetmur und Davidson
4,0M 3,4
5,2M 1,5
6,4M 0,7
E. Lithiumchlorid
0,4M 3,9 Orosz und Wetmur
1M 11,6
F. Kaliumchlorid
0,7M 5,3
1M 5,8
2M 5,4 Orosz und Wetmur
3M 10,0
4M 11
G. Natriumbromid
3M 9 Orosz und Wetmur
H. Natriumsulfat
3M 9 Orosz und Wetmur
I. Ammoniumchlorid
4M 30
Obwohl sich die Daten in Tabelle 1 auf die Geschwindigkeitserhöhungen beziehen, die bezüglich DNA:DNA-Reaktionen gefunden wurden, ist zu beachten, daß die Reaktionsgeschwindigkeiten von RNA mit DNA als nur wenig abhängig von Salzkonzentrationsänderungen beeinflußt beschrieben werden. Andere Forscher haben gezeigt, daß für Salzkonzentrationen oberhalb der Standard-Referenzbedingungen die relative Geschwindigkeit der RNA:DNA-Reaktion um etwa die Hälfte des Grades derjenigen Geschwindigkeiten beeinflußt wird, die für DNA:DNA-Reaktionen gefunden wurden, wenn die verwendete RNA eine vergleichsweise geringe Sekundärstruktur aufweist. Für RNA-Reaktionspartner mit einer höheren Sekundärstruktur wurde gefunden, daß die Wirkung einer erhöhten Salzkonzentration sogar geringer war. In der Tat wird keine Änderung der Geschwindigkeit für die Hybridisierung überschüssiger RNA mit DNA über einen vergleichbaren Bereich der Salzkonzentrationen beobachtet (vgl. z. B. Van Ness, J. und Hahn, W. E. (1982) Nucl. Acids. Res. 10, 8061). Obwohl nur wenige Daten über die RNA:DNA-Hybridisierung verfügbar sind, in denen die DNA der überschüssige Reaktionspartner ist, wird bisher allgemein angenommen, daß die Wirkung einer erhöhten Salzkonzentration auf solch ein Reaktionssystem mit demjenigen eines Überschuß-RNA-Systems vergleichbar ist.
Ein alternativer Vorschlag zur Beschleunigung der Geschwindigkeit dieser Nucleinsäure-Assoziationsreaktionen ist die kürzlich entwickelte Zweiphasen-Phenol-Wasser-Emulsionstechnik zur Reassoziation von DNA mit DNA ( Kohne, D. E., Levinson, S.A., und Byers, M. J. (1977) Biochemistry 16, 5329). In diesem Zweiphasen-System hat das Rühren einer zwischen Phenol und einer wäßrigen Salzlösung gebildeten Emulsion stark beschleunigte Reaktionsgeschwindigkeiten bewirkt, die über 100mal schneller sind als vergleichbare Geschwindigkeiten unter Standardbedingungen. Die Zweiphasen-Phenol-Emulsionstechnik hat jedoch keine ähnlich stark beschleunigten Reaktionsgeschwindigkeiten für RNA:RNA- und RNA:DNA-Systeme bewirkt. Die stärkste beobachtete Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit für RNA:RNA- und RNA:DNA-Reaktionen beträgt nur das 50-100fache derjenigen der Geschwindigkeit unter Standard-Referenzbedingungen. Diese Technik ist darüber hinaus dadurch eingeschränkt, daß die Reaktion nicht stattfindet, bis nicht eine Emulsion vorliegt und gerührt wird und die Reaktionstemperatur unterhalb 75ºC liegt.
Eine Anzahl anderer Techniken zum Steigern der Reaktionsgeschwindigkeit in einer Größenordnung des 10fachen oberhalb der Geschwindigkeit unter Standard-Referenzbedingungen haben das Volumenausschlußprinzip verwendet, um die Beschleunigung der Reaktionsgeschwindigkeit zu fördern. Diese Techniken verwenden die synthetischen Polymere Polyethylenglycol, Dextran oder Dextransulfat, um das Volumen der Reaktionslösung, das den Nucleinsäurereaktionspartnern zur Verfügung steht, zu reduzieren und dadurch ihre effektive Konzentration zu erhöhen. Während jedoch von 10-50fachen Reaktionsgeschwindigkeitssteigerungen gegenüber der Geschwindigkeit unter Standard-Referenzbedingungen für DNA:DNA-Reaktionen berichtet wird, wird für RNA:DNA-Reaktionen nur von 3fachen Geschwindigkeitssteigerungen berichtet. Nähere Erläuterungen dieser Techniken sind in den folgenden Publikationen zu finden:
Renz, M., und Kurz, C. (1984) Nucl. Acids. Res. 12, 3435, und
Wahl, G. M., Stern, M., und Stark, G. R. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3683.
Demgemäß ist es ein grundsätzliches Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Renaturierung, Reassoziation oder Hybridisierung von Nucleinsäuren bereitzustellen, das stark beschleunigte Reaktionsgeschwindigkeiten in der Größenordnung des 100- oder mehrfachen der Geschwindigkeit unter Standard- Referenzbedingungen bewirkt und das auf DNA: DNA-, RNA:DNA- oder RNA:RNA-Reaktionssysteme anwendbar ist. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das stark beschleunigte Reaktionsgeschwindigkeiten fördert, ohne die Verwendung eines Zweiphasen-Systems oder die Bildung einer Emulsion zu erfordern. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, in dem stark beschleunigte Reaktionsgeschwindigkeiten ohne die Notwendigkeit erhältlich sind, die Konzentrationen der Einzelstrang- Nucleinsäurereaktionspartner zu erhöhen. Schließlich ist es ein zusätzliches Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur starken Beschleunigung der Geschwindigkeit dieser Nucleinsäure-Assoziationsreaktionen bereitzustellen, das auf ein breites Spektrum von Reaktionsgemisch, Volumen und Hybridisierungstemperaturen anwendbar ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Allgemein ist festzustellen, daß die vorliegende Erfindung die zuvor beschriebenen Ziele dadurch erreicht, daß sie ein Verfahren zur Bildung von Doppelstrang-Nucleinsäuremolekülen aus getrennten Einzelstrang-Nucleinsauremolekülen zur Verfügung stellt, indem eine Reaktionslösung mit einer einzelnen Phase, die eine bekannte Konzentration von mindestens einem Nucleinsäure ausfällenden Detergens enthält, verwendet wird, um die Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber der Reaktionsgeschwindigkeit unter Standard-Referenzbedingungen stark zu erhöhen. Das verbesserte Verfahren der vorliegenden Erfindung ist umfassend abwendbar auf einen breiten Bereich von Reaktionslösungsvolumen und Nucleinsäurekonzentrationen und fördert Reaktionsgeschwindigkeiten in der Größenordnung von dem 100- 1000fachen der Reaktionsgeschwindigkeit unter Standard-Referenzbedingungen für DNA:DNA-, RNA:DNA- und RNA:RNA-Reaktionen.
Insbesondere umfaßt das Verfahren der vorliegenden Erfindung Schritte zur Herstellung einer wäßrigen Reaktionslösung, die komplementäre Einzelstrang-Nucleinsäuren enthält, von denen eine vorzugsweise einen nachweisbaren Marker enthält und eine bekannte Konzentration von mindestens einem Nucleinsäure ausfällenden Agens. Die so hergestellte wäßrige Reaktionslösung wird bei einer Temperatur inkubiert, bei der Hybridisierung stattfinden kann und wird dann auf das Vorhandensein doppelsträngiger Nucleinsäuremoleküle untersucht.
Zusätzlich werden alternative erfindungsgemäße Verfahren beschrieben, in denen die wäßrige Reaktionslösung ebenfalls eine bekannte Konzentration eines Nucleinsäure- Denaturierungsmittels enthält und auch solche, in denen das Nucleinsäure ausfällende Agens in einer zweiten Lösung enthalten ist, die der wäßrigen Reaktionslösung vor dem Inkubationsschritt zugefügt wird.
Die Nucleinsäure ausfällenden Agenzien, die verwendet werden, um die verschiedenen alternativen erfindungsgemäßen Verfahren durchzuführen, werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Detergenzien, z. B. Natriumdodecylsulfat, Natrium-diisobutylsulfosuccinat und Natriumtetradecylsulfat. Die Konzentration des die Nucleinsäure ausfällenden Agens liegt vorzugsweise im Bereich von annähernd 5 Vol.% bis 95 Vol.%, und die bevorzugte Konzentration des Nucleinsäure-Denaturierungsmittels liegt im Bereich von annähernd 5 Vol.% bis 95 Vol.%.
Die Inkubationstemperaturen liegen vorzugsweise im Bereich von gerade unterhalb der Tm des Doppelstrang-Nucleinsäure- Assoziationsproduktes bis zu Temperaturen, die sich der Raumtemperatur von annähernd 22ºC nähern. Es wird darauf hingewiesen, daß der Zusatz von Nucleinsäure-Denaturierungsmitteln zu der wäßrigen Reaktionslösung die Temperatur, bei der Hybridisierung stattfindet, herabsetzt. Die Hybridisierungstemperaturen für die meisten Reaktionen, die die erfindungsgemäßen Verfahren anwenden, liegen im Bereich von annähernd Raumtemperatur bis 90ºC.
Nach der Inkubation wird die Reaktionslösung durch eine Reihe bekannter Untersuchungstechniken untersucht, um die Gegenwart des Doppelstrang-Nucleinsäureproduktes nachzuweisen. Ein bevorzugtes Untersuchungsverfahren verwendet für diesen Zweck Hydroxyapatit (HA).
Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Fachmann bei der Betrachtung der folgenden näheren Beschreibung erkennen. Die folgenden Abkürzungen sollen das Verständnis der Beschreibung erleichtern.

Abkürzungen

PB Natriumphosphatlösung (eine Mischung aus
äquimolaren Mengen Naz HPO&sub4; und NaH&sub2; PO&sub4;)
PK Proteinase K
EGTA Ethylenglycol-bis-(β-aminoethylether)- N,N,N',N'-Tetraessigsäure
HA Hydrosyapatit
STDS Natrium-tetradecylsulfat
SDIBSS Natrium-diisobutylsulfosuccinat
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid
G HCl Guanidinhydrochlorid
DNA Desoxyribonucleinsäure
RNA Ribonucleinsäure
rRNA ribosomale Ribonucleinsäure
cDNA komplementäre DNA
DTT Dithiothreit
SDS Natrium-dodecylsulfat

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Im weitesten Sinne basiert das Verfahren der vorliegenden Erfindung auf der überraschenden Entdeckung, daß relativ hohe Konzentrationen von Nucleinsäure ausfällendem Detergens die Geschwindigkeit, bei der sich Einzelstrang-Nucleinsäuremoleküle mit Regionen komplementärer Basensequenzen vereinigen, um unter Ausbildung von Basenpaaren Doppelstrang-Nucleinsäuremoleküle zu bilden, stark beschleunigt. Die Reaktionsgeschwindigkeiten sind für DNA:DNA-Reaktionen um das 800fache der Geschwindigkeit unter Standard-Referenzbedingungen erhöht und um das 3000fache der Geschwindigkeit unter Standard-Referenzbedingungen für RNA:DNA-Reaktionen und um das 1000fache der Geschwindigkeit unter Standard-Referenzbedingungen für RNA:RNA-Reaktionen. Was noch wichtiger ist, diese stark erhöhten Reaktionsgeschwindigkeiten finden in einem Einphasensystem statt, und es ist keine Emulsion oder Schütteln notwendig.
Solche signifikanten Steigerungen in der Geschwindigkeit dieser Reaktionen stehen in völligem Gegensatz zum bisher bekannten Stand der Technik. Z.B. wird ca. 1 M NaCl (oder ein Äquivalent davon), das eine annähernd 8-25mal schnellere Reaktionsgeschwindigkeit als unter Standard-Referenzbedingungen bewirkt, oft als beschleunigende Reaktionsbedingung verwendet. Eine solche Geschwindigkeitssteigerung ist nicht die von der vorliegenden Erfindung beschriebene "stark beschleunigte" Geschwindigkeit. Wie in der zuvor erörterten Tabelle des Standes der Technik gezeigt ist, führt eine Erhöhung der Konzentration von NaCl auf 4,75 M zu geringer Geschwindigkeitssteigerung. Entsprechend bewirken Konzentrationen von CsCl (ebenfalls allgemein verwendet, um Reaktionsgeschwindigkeiten zu steigern) bis zu 7,5 M analoge Steigerungen von annähernd 15mal derjenigen der Geschwindigkeit unter Standard-Referenzbedingungen. Entsprechende Geschwindigkeitssteigerungen gegenüber der Geschwindigkeit unter Standard-Referenzbedingungen wurden ebenfalls für 1 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; und für 1 M LiCl gefunden, wobei jedes Salz Geschwindigkeitssteigerungen von annähernd dem 13fachen bis 18fachen bewirkt, was annähernd mit der für 1 M NaCl oder CsCl beobachteten Geschwindigkeitssteigerung vergleichbar ist. Im Gegensatz zu diesen bekannten Ergebnissen wurde jedoch überraschenderweise entdeckt, daß eine Steigerung der Konzentration von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; auf 2 M die Reaktionsgeschwindigkeit um einen zusätzlichen Faktor von 33 bis annähernd 600mal desjenigen der Geschwindigkeit unter Standard-Referenzbedingungen stark erhöht. Weitere Forschungen zeigten eine vergleichbare Geschwindigkeitssteigerung, wenn die LiCl- Konzentration auf 4 M erhöht wurde, wobei eine Geschwindigkeitssteigerung von zusätzlich dem 30fachen beobachtet wurde, wodurch eine beschleunigte Reaktionsgeschwindigkeit erreicht wurde, die 467mal größer ist als diejenige unter Standard-Referenzbedingungen. Vergleichbare Muster starker Beschleunigung wurden ebenfalls bei Ammoniumformiat, Cäsiumsulfat, Natriumsulfat, Lithiumsulfat, Natriumphosphat und verschiedenen Detergenzien und organischen Verbindungen entdeckt.
Dieselben Faktoren (Aggregation oder Präzipitation), die frühere Forscher daran hinderten, das erfindungsgemäße Verfahren zu entdecken, werden auch als verantwortlich für die stark beschleunigten Reaktionsgeschwindigkeiten der erfindungsgemäßen Verfahren angesehen. Es wird angenommen, daß Nucleinsäure ausfällende Agenzien eine Aggregation der Einzelstrang- Nucleinsäuremoleküle verursachen und dadurch die Reaktionsgeschwindigkeit stimulieren. Wie zuvor erläutert, steht die Geschwindigkeit, bei der ein gegebenes Paar komplementärer Einzelstrang-Nucleinsäure Doppelstrang-Nucleinsäuremoleküle bildet, direkt in Beziehung zu ihrer Konzentration in der Reaktionslösung. Je höher die Nucleinsäurekonzentration, desto höher die Reaktionsgeschwindigkeit. In Gegenwart eines eine Nucleinsäure ausfällenden Agens aggregieren oder assoziieren sich die Einzelstrang-Nucleinsäuremoleküle in Lösung. Diese Aggregation oder Semi-Präzipitation führt in lokalen Bereichen der Reaktionslösung zu hohen Nucleinsäurekonzentrationen. Wenn die Aggregation bei einer Temperatur stattfindet, bei der auch Hybridisierung oder Reassoziation stattfinden kann, ist die Reaktionsgeschwindigkeit stark erhöht.
Um die komplementären Einzelstrang-Nucleinsäuremoleküle zusammen in einer Reaktionslösung, die ein Nucleinsäure ausfällendes Agens enthält, zu reassoziieren oder zu hybridisieren, muß die Temperatur hoch genug sein, damit die Reaktion stattfinden kann. Renaturierung, Reassoziation oder Hybridisierung findet normalerweise mit optimalen Geschwindigkeiten bei annähernd 10ºC bis 30ºC unterhalb der Tm der beteiligten Doppelstrang- Nucleinsäuremoleküle statt. In der erfindungsgemäßen Reaktionslösung liegt die Tm der meisten Doppelstrang- Nucleinsäuremoleküle im Bereich von 85ºC bis 100ºC. Wenn die erfindungsgemäße Reaktionslösung eines oder mehrere Nucleinsäure denaturierende Agenzien enthält, wird die Tm stark erniedrigt und es können so niedrige Temperaturen wie Raumtemperatur angewendet werden, um optimale Reaktionsgeschwindigkeiten zu erreichen. Demgemäß sollten Reaktionstemperaturen von annähernd 20ºC bis 90ºC optimale Reaktionsgeschwindigkeiten bewirken.
Wie zuvor erläutert, fördern organische Verbindungen, die mit der Reaktionslösung mischbar sind und die ausfällende oder aussalzende Eigenschaften aufweisen, stark beschleunigte Reaktionsgeschwindigkeiten. Beispiele für solche Verbindungen enthalten Detergenzien, wie Natrium-dodecysulfat, Natriumdiisobutylsulfosuccinat und Natriumtetradecylsulfat.
Um festzustellen, welche Verbindungen die erforderlichen Eigenschaften aufweisen, Nucleinsäuren auszufällen, um das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen, ist es notwendig, die zu untersuchenden Verbindungen zuerst zu screenen und zu bestimmen, ob die Verbindungen Einzelstrang- Nucleinsäuremoleküle präzipitieren, und dann zu bestimmen, ob der so gebildete Niederschlag verschwindet, wenn die Reaktionslösung auf eine Temperatur erwärmt wird, bei der eine Reaktion stattfinden kann. Die Nucleinsäure ausfällenden Agenzien werden dann analysiert, um die bevorzugten Konzentrationen und Inkubationstemperaturen zur Herstellung optimaler Reaktionsgeschwindigkeitssteigerungen zu bestimmen. Dieses Screening-Verfahren ermöglicht es auch, die wirksame Konzentration des Nucleinsäure ausfällenden Agens zu bestimmen, das zum Fördern stark erhöhter Reaktionsgeschwindigkeiten notwendig ist.
Beispielsweise wurde Sarkosyl (N-Lauroylsarkosin-Natriumsalz) auf folgende Weise auf seine Fähigkeit hin gescreent, Nucleinsäure-Reassoziationsgeschwindigkeiten zu steigern. Zunächst wurden Lösungsreihen hergestellt, die bekannte Mengen gereinigter Leber-RNA (Endkonzentration bei 4 mg/ml) und variierende Mengen von Sarkosyl (im Bereich von annähernd 9 Vol.% bis 24 Vol.%) enthielten. Die Lösungen wurden sorgfältig gemischt und auf das Vorhandensein eines Niederschlages überprüft, wobei entweder direkte visuelle Beobachtung angewendet wurde oder ein Spektrophotometer unter Verwendung einer Wellenlänge, bei der weder das Sarkosyl noch die Nucleinsäure absorbieren. Wenn ein Niederschlag in der Lösung beobachtet wurde, wurde die Lösung auf annähernd 40ºC bis 90ºC erwärmt, um zu bestimmen, ob sich der Grad des Niederschlages ändert. Es wurde gefunden, daß bei 10-14% Sarkosyl wenig oder kein Nucleinsäure-Niederschlag zu beobachten ist. Bei höheren Konzentrationen wurde jedoch gefunden, daß Sarkosyl Nucleinsäure ausfällt. Eine Anzahl weiterer Experimente wurden dann durchgeführt, um die bevorzugte Konzentration und Inkubationstemperaturen zum Erreichen optimaler Steigerungen der Reaktionsgeschwindigkeit zu bestimmen.
Die folgenden Tabellen zeigen eine Auflistung, die die Steigerungen der Reaktionsgeschwindigkeit veranschaulicht, die mit einer Vielzahl von Konzentrationen bevorzugter anorganischer Salze als Nucleinsäure ausfällende Agenzien zu erwarten ist. Tabelle 2 Wirkung hoher Konzentrationen von bestimmten Salzen auf die DNA:DNA-Hybridisierungsgeschwindigkeit
Salz Geschwindigkeitssteigerung bezogen auf 0,18M Na als Referenzbedingung
A. Ammoniumsulfat
1M 17,5
2M 600
2,1M 600
2,5M 467
3,1M 70
B. Lithiumchlorid
1M 13
3,5M 66
4M 467
5M 280
6M 19
C. Andere Salze
2M Cäsiumsulfat 280
1,9M Natriumsulfat 600
2M Lithiumsulfat 420
6M Ammoniumformiat 210
2,4M Natriumphosphat 800 Tabelle 3 Wirkung hoher Konzentrationen von überschüssigen Salzen auf RNA:DNA-Hybridisierungsgeschwindigkeiten
Salz Geschwindigkeitssteigerung bezogen auf 0,18M Na als Referenzbedingung 0,18M Natriumchlorid 1
0,72M Natriumchlorid 3,6
2M Ammoniumsulfat 1500
2,4M Natriumphosphat 3000
4M Lithiumchlorid 600
2M Natriumsulfat 3460
Ammoniumsulfat
1M 90
2M 1500
3M 600
Ausgehend von diesen Nucleinsäure ausfällenden Agenzien ist das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt. Die erste Stufe des bevorzugten Verfahrens ist die Herstellung einer wäßrigen Reaktionslösung, die eine Menge eines ersten Einzelstrang- Nucleinsäuremoleküls und eine Menge eines zweiten Einzelstrang-Nucleinsäuremoleküls enthält, wobei vorzugsweise ein nachweisbarer Marker eingebaut ist und mindestens ein Segment von Basensequenzen, die komplementär zu einem korrespondierenden Segment von Basensequenzen des ersten Einzelstrang-Nucleinsäuremoleküle sind. Darüber hinaus enthält die wäßrige Reaktionslösung ebenfalls eine bekannte Konzentration von mindestens einem der zuvor erörterten Nucleinsäure ausfällenden Agenzien in einer Konzentration, die ausreicht, die Reaktionsgeschwindigkeit um einen Faktor von mindestens 50-100mal der Reaktionsgeschwindigkeit unter Standard-Referenzbedingungen stark zu beschleunigen. Abgesehen von praktischen Erwägungen wie der Löslichkeitsgrenze der Einzelstrang-Nucleinsäure-Reaktionspartner, gibt es keine wirkliche Grenze, was das Volumen der wäßrigen Reaktionslösung betrifft, die zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann oder auch was die Menge an Einzelstrang- Nucleinsäuremolekül-Reaktionspartnern betrifft. Obwohl nachdrücklich darauf hingewiesen wird, daß das Nucleinsäure ausfällende Agens alles ist, was notwendig ist, um die stark erhöhten Reaktionsgeschwindigkeiten zu erhalten, können zusätzliche Additive in der wäßrigen Reaktionslösung enthalten sein, wie Puffer, EGTA, EDTA, SDS, SK, PK, ETOH, Harnstoff, Guanidin HCl, Glycogen und verdünntes Amphyl. Darüber hinaus sollte beachtet werden, daß, obwohl es bevorzugt ist, daß mindestens einer der Einzelstrang-Nucleinsäuremolekül- Reaktionspartner einen nachweisbaren Marker enthält, der Marker zur Förderung der stark beschleunigten Reaktionsgeschwindigkeiten nicht wesentlich ist.
Die nächste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Inkubieren der wäßrigen Reaktionslösung. Wie zuvor erläutert, reichen Temperaturen im Bereich von gerade unterhalb der Tm bis annähernd Raumtemperatur zum Inkubieren der Reaktionslösung aus. Die tatsächlich verwendete Temperatur schwankt in Abhängigkeit der Konzentrationen der Reaktionspartner und davon, welche zusätzlichen Additive der Reaktionslösung zugemischt sind. Die meisten Reaktionen werden jedoch bei Inkubationstemperaturen im Bereich von annähernd Raumtemperatur bis 90ºC durchgeführt.
Die letzte Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Überprüfung der inkubierten waßrigen Reaktionslösung auf die Gegenwart doppelsträngiger Nucleinsäuremoleküle. Ein breites Spektrum von Untersuchungstechniken sind bisher bekannt und gehören zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Eine bevorzugte Untersuchungstechnik umfaßt das Entfernen eines Aliquots aus der inkubierten Reaktionslösung zu einer bestimmten Zeit nach dem Start der Reaktion. Das Aliquot wird in 1 ml 0,14 M PB, 0,02% Natriumdodecylsulfat (SDS) verdünnt. Die verdünnte Lösung wird dann über eine Säule aus Hydroxyapatit (HA) (Bettvolumen entsprechend 1 ml) geleitet, die mit 0,14 M PB, 0,02% SDS bei 67ºC vorägullibriert war. Einzelsträngige DNA-Moleküle werden nicht an das HA gebunden, aber RNA und doppelsträngige Nucleinsäuremoleküle werden an der Säule adsorbiert. Nicht hybridisierte einzelsträngige Nucleinsäuremoleküle werden dann von der Säule entfernt, indem 5 ml des Säulenpuffers 0,14 M PB, 0,02% SDS über die Säule geleitet werden. Die adsorbierte Nucleinsäure wird von der Säule wiedergewonnen, indem die Säule mit 0,3 M PB bei 67ºC eluiert wird. Die so hergestellten verschiedenen Lösungsfraktionen können dann auf den nachweisbaren Marker hin untersucht werden (wie radioaktiver Wasserstoff oder Jod).
Ein alternatives bevorzugtes Untersuchungsverfahren der inkubierten wäßrigen Reaktionslösung auf die Gegenwart doppelsträngiger Nucleinsäuren hin folgt.
(a) Entfernen eines Aliquots aus der zu testenden Lösung und Mischen mit 5 ml 0,14 M PB, 0,02% SDS, das 0,1 g HA enthält. Schütteln der Mischung für 5-10 Sekunden.
(b) Inkubieren der Mischung 5 Min. lang bei 72ºC.
(c) Zentrifugieren der Mischung in einer Tischzentrifuge 1 Min. lang, um den HA abzutrennen. Verwerfen der Überstandfraktion.
(d) Zufügen von 5 ml 0,14 M PB, 0,02% SDS in das Röhrchen und Schütteln, um den HA zu resuspendieren.
(e) Wiederholen von Stufe (c).
(f) Untersuchen des HA auf einen nachweisbaren Marker.
Eine andere Vorgehensweise zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt die zusätzliche Stufe, eine zweite Lösung, die das Nucleinsäure ausfällende Agens enthält, in die zuvor hergestellte wäßrige Reaktionslösung zu mischen, bevor das resultierende Gemisch inkubiert wird. Auf diese Weise umfaßt das alternative Verfahren die Schritte Herstellen der zuvor erörterten wäßrigen Reaktionslösung, Mischen der wäßrigen Reaktionslösung mit einer zweiten Lösung, die eine bekannte Konzentration von mindestens einem eine Nucleinsäure ausfällenden Agens enthält, das mit der wäßrigen Lösung mischbar und in der Lage ist, einzelsträngige Nucleinsäuremoleküle aus einer wäßrigen Lösung auszufällen, Inkubieren des so erhaltenen Gemischs bei den zuvor erörterten Temperaturen und Untersuchen des inkubierten Gemisches auf das Vorliegen doppelsträngiger Nucleinsäuremoleküle. Dieses alternative Verfahren dient dazu, Probleme zu eliminieren, die bei der vorzeitigen Aggregation einzelsträngiger Nucleinsäuremolekül-Reaktionspartner in der wäßrigen Reaktionslösung auftreten können.
Eine weitere Modifikation der beiden alternativen Verfahren zum Durchführen der Reaktion der vorliegenden Erfindung bei erhöhter Geschwindigkeit umfaßt die Zugabe einer bekannten Konzentration von mindestens einem Nucleinsäure-Denaturierungsmittel wie Alkohol zu der wäßrigen Reaktionslösung. Vorzugsweise liegt die Konzentration des zugegebenen Denaturierungsmittels im Bereich von annähernd 5 Vol.% bis annähernd 95 Vol.%. Beispielsweise ist Alkohol ein Denaturierungsmittel und dient zum Erniedrigen der Temperatur, bei der die Reaktion stattfindet. Ethanol ist in 2 M (NH&sub4;&sub2;SO&sub4; zu annähernd 20% löslich. Bei dieser Konzentration findet die Reaktion bei einer Temperatur von annähernd 49ºC anstelle der üblichen 60ºC bis 80ºC statt.
Ein weiteres Denaturierungsmittel, das dem wäßrigen Reaktionsgemisch zugefügt werden kann, ist Harnstoff. Die Gegenwart von Harnstoffin dem Reaktionsgemisch weist nur geringe Auswirkungen auf den Umfang oder die Hybridisierungsgeschwindigkeit in mehreren der bisher überprüften beschleunigten Geschwindigkeitssysteme auf. Beispiel 17 ist ein Beispiel eines solchen Systems. Harnstoff ist ein ausgezeichnetes Lösungsmittel für viele Nicht-Nucleinsäureverbindungen, die in einer Probe vorhanden sein können und ist dazu verwendbar, irgendwelche Wirkungen zu minimieren, die diese Verbindungen auf die Hybridisierungsreaktion haben könnten. Vorzugsweise beträgt die in dem Reaktionsgemisch vorliegende Harnstoffkonzentration annähernd 0,01 bis etwa 4 M. Die tatsächlich zu verwendende Harnstoffmenge muß für jede unterschiedliche Situation bestimmt werden.
Guanidin HCl (GHCl) ist ein weiteres Denaturationsmittel, das dem wäßrigen Reaktionsgemisch zugefügt werden kann. Dieses Mittel ist dazu verwendbar, Nicht-Nucleinsäuresubstanzen löslich zu machen, die sonst mit der Hybridisierungsreaktion interferieren könnten. Die Zugabe von GHCl zu einem wäßrigen Reaktionsgemisch optimiert sowohl Geschwindigkeit als auch Umfang der Hybridisierung, die zu bestimmten Zeiten der Inkubation zu sehen ist. Eine höhere Konzentration des Beschleunigungsmittels muß verwendet werden, um den Umfang der Hybridisierung zu optimieren, wenn GHCl vorhanden ist. Beispiel 26 zeigt dies betreffende Daten. Es ist wahrscheinlich, daß das GHCl Nucleinsäuren zu einem bestimmten Grad löslich macht, und daß mehr Beschleunigungsmittel notwendig ist, um die Nucleinsäuren für eine schnelle Hybridisierung zu konzentrieren. Eine ähnliche Situation liegt bei dem Natriumphosphat-System vor, wie in Beispiel 26 zu sehen ist.
Unabhängig davon, welches der alternativen Verfahren angewendet wird, um das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen, werden die Nucleinsäure ausfällenden Mittel vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Detergenzien, z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS), Natriumdiisobutylsulfosuccinat (SDIBSS) oder Natriumtetradecylsulfat (STDS). Es gehört auch zum Umfang der vorliegenden Erfindung, verschiedene Mitglieder dieser Gruppe in einer einzigen wäßrigen Reaktionslösung zu kombinieren. Darüber hinaus gehört es ebenfalls zum Umfang der vorliegenden Erfindung, eine Vielzahl von Detergenzien zusätzlich zu den beschriebenen organischen Verbindungen zu verwenden. Demgemäß sind diese spezifisch beschriebenen und in der vorliegenden Erfindung beanspruchten Verbindungen jene, die gegenwärtig als zum Ausführen des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet bekannt sind. Analoge Verbindungen werden deshalb auch vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Es wird darauf hingewiesen, daß die zum Ausführen des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendigen wirksamen Konzentrationen an Nucleinsäure ausfällenden Agenzien mit der Menge an Nucleinsäure variieren sowie mit der Größe der Nucleinsäure in der Reaktionslösung und dem pH der Lösung sowie mit der Gegenwart anderer Verbindungen. Demgemäß ist es bevorzugt, daß die Konzentrationen in einem Bereich von annähernd 1 M bis 10 M für anorganische Salzverbindungen und annähernd 5 Vol.% bis annähernd 95 Vol.% für organische Verbindungen liegen. Darüber hinaus ist es bevorzugt, daß der pH der Reaktionslösung im Bereich von annähernd 4 bis 11 liegt.
Schließlich sollte, wie zuvor erörtert, die bevorzugte Inkubationstemperatur der wäßrigen Reaktionslösung im Bereich von annähernd Raumtemperatur bis annähernd 90ºC liegen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für bakteriell, viral, chemisch und von Säugetieren synthetisierte Nucleinsäure. Die Vollständigkeit der Reaktion schwankt in Abhängigkeit von der Konzentration des starken Nucleinsäure ausfällenden Mittels sowie der Menge an Nucleinsäure in der ursprünglichen Reaktionslösung und der Zusammensetzung des Reaktionsgemisches. Bei niedrigen Nucleinsäurekonzentrationen assoziiert gut über 90% der einzelsträngigen Nucleinsäure, um doppelsträngige Nucleinsäuremoleküle zu bilden. Bei höheren Nucleinsäurekonzentrationen beträgt die Vollständigkeit der Reaktion nur annähernd 70% oder weniger, selbst wenn die Reaktionsgeschwindigkeit stark erhöht ist. Es ist zu beachten, daß bei sehr hohen Konzentrationen der Nucleinsäure- Reaktionspartner die Reaktionsgeschwindigkeit in geringerem Maß beschleunigt wird.
Die Menge an einzelsträngigen Nucleinsäuremolekül- Reaktionspartnern, die in der wäßrigen Reaktionslösung vorliegen, können im Bereich von einem oberen Höchstwert, der sich der Löslichkeitsgrenze der Nucleinsäuremoleküle nähert bis zu einem unteren Grenzwert in der Größenordnung von 10&supmin;&sup9; Mikrogramm liegen. Interessanterweise ist die Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit bei hohen Konzentrationen von DNA:DNA- oder DNA:RNA-Reaktionen niedriger als bei niedrigeren Konzentrationen von DNA:DNA- und RNA:RNA-Reaktionen. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren sowohl bei hohen als auch bei niedrigen Konzentrationen der Reaktionspartner anwendbar. Demgemäß liegen die bevorzugten Volumen der Reaktionslösung in der Größenordnung von einem Milliliter oder weniger bis zu einer Fraktion von einem Mikroliter. Es wird jedoch ausdrücklich darauf hingewiesen, daß auch andere Reaktionslösungsvolumen von der vorliegenden Erfindung mit umfaßt werden. Obwohl die Gegenwart geringer Mengen Protein oder anderer Zellkomponenten die Reaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht stark beeinflussen, verlangsamen darüber hinaus überschüssige heterologe RNA oder DNA oder andere zelluläre Komponenten die Reaktionsgeschwindigkeit in unterschiedlichem Umfang und beeinflussen die Vollständigkeit der Hybridisierung.
Detergenzien sind dazu geeignet, die Wirkung überschüssiger Zell- und anderer Komponenten auf die Reaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens zu minimieren. Die Zugabe von Detergenzien, die mit einzelnen geschwindigkeitsbeschleunigenden Mitteln kompatibel sind, zu den Reaktionsgemischen ist in dieser Hinsicht hilfreich. Bestimmte Detergenzien beschleunigen die Nucleinsäurehybridisierung stark und sind in dieser Hinsicht sehr hilfreich. Die optimale Konzentration eines Geschwindigkeitsbeschleunigers zur Verwendung bei verschiedenen Nucleinsäuren hängt von den zuvor erörterten Variablen ab.
Es ist ebenfalls zu beachten, daß die stark beschleunigten Reaktionsgeschwindigkeiten, die für Nucleinsäuremoleküle erreicht wurden, im Bereich einer Länge von annähernd 30 Basen bis zu Molekülen in der Größenordnung einer Länge von 10&sup4; Basen liegen. Das erfindungsgemäße Verfahren wird jedoch als anwendbar betrachtet für Nucleinsäuremoleküle, die von kurzen Molekülen in der Größenordnung von 10 bis 15 Basen Länge bis zu längeren Molekülen mit einer Länge von größer als 10&sup4; Basen reichen.
Die folgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren veranschaulichen, es jedoch nicht beschränken.
Die in den vorherigen Beispielen beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren sind auf dem Gebiet des Nachweises und der Identifization eines breiten Spektrums verschiedener Lebensformen in verschiedenen Probenarten von großer Bedeutung. Diese Verfahren ermöglichen es, viele Lebensformen mit einer bisher unerreichten Schnelligkeit und Empfindlichkeit nachzuweisen und zu identifizieren. Die folgenden Beispiele veranschaulichen dies.

Beispiel 1

Verfahren zur Verwendung von Natriumdodecylsulfat zum Steigern der DNA:RNA-Hybridisierungsgeschwindigkeit

Dieses Beispiel zeigt, daß bei 28,5% (Gew./Vol.) SDS eine stark beschleunigte Hybridisierungsgeschwindigkeit auftritt, wenn die Probe gegenüber gereinigter RNA im Überschuß vorliegt.

A. Oberschüssige Probe plus homologe RNA

1. Sorgfältig mischen:
1 ul Lösung, die 01,6·10&supmin;&sup4; Mikrogramm ribosomale Legionella-RNA (rRNA) enthält.
1 ul 5 M Natriumphosphatpuffer (pH=6,8) (PB).
3 ul Probenlösung, die 10&supmin;&sup4; Mikrogramm I¹²&sup5; - cDNA enthält, die zu etwa 1/5 der Legionella-rRNA-Sequenz komplementär ist.
95 ul 30% (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat in Wasser.
2. Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie vorher beschrieben.
Dieses Verfahren führte zu einer Geschwindigkeitssteigerung um das 100- bis 200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 2

B. Hybridisierung der Überschußprobe

Dieses Beispiel zeigt, daß bei 31,4% (Gew./Vol.) SDS eine stark beschleunigte Hybridisierungsgeschwindigkeit auftritt, wenn die Probe gegenüber gereinigter RNA im Überschuß vorliegt.
1. Sorgfältig mischen:
1 ul einer Lösung, die 1,6·10&supmin;&sup4; Mikrogramm ribosomale Legionella-RNA enthält.
6 ul H&sub2;O
1 ul 5 M Natriumphosphatpuffer (pH=6,8) (PB)
2 ul Probenlösung, die 10&supmin;&sup4; Mikrogramm I¹²&sup5; - cDNA enthält, die zu etwa 1/5 der ribosomalen Legionella- RNA-Sequenz komplementär ist.
90 ul 34,9% (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat in Wasser.
2. Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung um das 150-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 3

=C. Überschuß-RNA-Hybridisierung

Dieses Beispiel zeigt, daß bei 31,4% (Gew./Vol.) SDS eine stark beschleunigte Hybridisierungsgeschwindigkeit auftritt, wenn gereinigte RNA im Überschuß vorhanden ist.
1. Sorgfältig mischen:
2 ul Lösung, die 3,2·10&supmin;&sup4; Mikrogramm ribosomale Legionella-RNA enthält.
1 ul H&sub2;O
1 ul 5,0 M Natriumphosphatpuffer (pH=6,8) (PB) 2 ul Probenlösung, die 2,5·10&supmin;&sup5; Mikrogramm I¹²&sup5;
- cDNA enthält, die zu der ribosomalen Legionella-RNA komplementär ist.
95 ul 34,9% (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat in Wasser.
2. Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung um das 150-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 4

D. Nachweis der Gegenwart von Legionella-Bakterien in einer Flüssigkeitsprobe

Dieses Beispiel zeigt, daß bei 31,4% (Gew./Vol.) SDS eine stark beschleunigte Hybridisierungsgeschwindigkeit auftritt, wenn Bakterien aus einer flüssigen Probe isoliert und der Lyse unterworfen werden. Beschleunigte Hybridisierung findet sogar in Gegenwart von bakteriellen Nicht- Nucleinsäure-Zellkomponenten statt.
1. (a) Zentrifugieren einer Probe, von der bekannt ist, daß sie Legionella-Organismen enthält, bei 14 000·g 10 Min. lang und dann Entfernen des Überstands.
(b) Resuspendieren des Niederschlags in einem lysierenden Puffer und Lysieren der Bakterien, wobei die Nucleinsäure freigesetzt wird.
(c) Sorgfältig mischen:
1 ul lysierte Bakterienlösung in 5% Natriumdodecylsulfat, 0,05 m Trispuffer pH=8,2.
1ul H&sub2;O.
1 ul 5,0 M Natriumphosphatpuffer (PB)
2 ul Probenlösung, die 5·10&supmin;&sup5; Mikrogramm I¹²&sup5; - cDNA enthält, die zu der ribosomalen Legionella-RNA komplementär ist.
2. Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung des 100-200fachen gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 5

E. Nachweis von Legionella-Bakterien in einer Sputumprobe, von der bekannt ist, daß sie solche Bakterien enthält

Dieses Beispiel zeigt, daß bei 23,4% (Gew./Vol.) SDS eine stark beschleunigte Hybridisierungsgeschwindigkeit auftritt, wenn die Bakterien aus einer klinischen Probe isoliert und ohne Reinigung der RNA lysiert und hybridisiert wurden.
1. (a) Löslich machen von 1 ml Sputum durch Zugeben von 0,1 ml 0,1 M DTT und 10-minütiges Zentrifugieren bei 14 000·g, um die Bakterien absetzen zu lassen. Verwerfen des Überstands.
(b) Resuspendieren des Niederschlags in einem lysierenden Puffer und Lysieren der Legionella-Bakterien, um Nucleinsäuren freizusetzen.
(c) Sorgfältig mischen:
30 ul lysierende Lösung (die etwa 8 000 lysierte Legionella-Bakterien enthält) , zusammengesetzt aus 11% Natriumdodecylsulfat (Gew./Vol.) 3·10&supmin;³ M EDTA; 0,003 M ungepuffertes Tris.
1 ul 5 M Natriumphosphatpuffer (pH=6,8) (PB).
2 ul Probenlösung, die 10&supmin;&sup4; Mikrogramm I¹²&sup5;-cDNA enthält, die zu der Legionella-rRNA komplementär ist.
67 ul 34,9% (Gew./Vol.) SDS.
2. Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung des 100-200fachen gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt, daß bei 23,4% (Gew./Vol.) SDS eine stark beschleunigte Hybridisierungsgeschwindigkeit auftritt, wenn die klinische Probe direkt untersucht wird und die Hybridisierung in Gegenwart der Sputumkomponenten durchgeführt wird.
1. (a) Mischen einer Sputumprobe, von der bekannt ist, daß sie Legionella-Bakterien enthält, mit einem gleichen Volumen einer lysierenden Lösung (33% SDS, 0,01 m ungepuffertes Tris, 0,01 m EDTA, 0,01 m EGTA). 15 Min. Inkubieren bei 72ºC.
(b) Sorgfältig mischen:
30 ul einer Lösung aus 1(a).
1 ul 5 M Natriumphosphatpuffer (pH=6,8) (PB). 2 ul einer Probenlösung, die 10&supmin;&sup4; Mikrogramm I¹²&sup5; - cDNA enthält, die zu der Legionella-rRNA komplementär ist.
67 ul 34,9% (Gew./Vol.) SDS in H&sub2;O.
2. Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung des 100-200fachen gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 7

Verfahren zur Verwendung von Natriumtetradecylsulfat (STDS) zum Steigern der Nucleinsäure-Hybridisierungsgeschwindigkeit

Dieses Beispiel zeigt, daß bei 24,3% (Gew./Vol.) STDS eine stark beschleunigte Geschwindigkeit auftritt, wenn gereinigte RNA verwendet wird.
A. RNA:DNA-Hybridisierung in STDS.
1. Sorgfältig mischen:
1 ul einer Lösung, die 1,7·10&supmin;&sup4; Mikrogramm Legionella-rRNA enthält.
7 ul H&sub2;O.
2 ul Probenlösung, die 10&supmin;&sup4; Mikrogramm I¹²&sup5; - cDNA enthält, die zu Legionella-rRNA komplementär ist.
90 ul 27% (Gew./Gew.) STDS, 0,03 M PB, End-pH=7.
2. Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung des mindestens 500-1000fachen gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 8

B. RNA:DNA-Hybridisierung in STDS + Harnstoff. Die Zugabe von Harnstoff steigert den Umfang der Hybridisierung.

Dieses Beispiel zeigt, daß bei 24,3% (Gew./Gew.) STDS eine stark beschleunigte Geschwindigkeit auftritt, wenn Harnstoff in dem Reaktionsgemisch vorliegt.
1. Sorgfältig mischen:
1 ul Lösung, die 1,7·10&supmin;&sup4; Mikrogramm Legionella-rRNA enthält.
2 ul H&sub2;O.
5 ul 10 M Harnstoff.
2 ul Probenlösung, die 10&supmin;&sup4; Mikrogramm I¹²&sup5;-cDNA enthält, die zu der Legionella-rRNA komplementär ist.
90 ul 27% (Gew./Gew.) STDS, 0,03 M PB, End-pH=7.
2. Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung des mindestens 500-1000fachen qegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.
Zusätzlich ist bei Gegenwart von Harnstoff ein größeres Ausmaß an Hybridisierung zu sehen.

Beispiel 9

A. Durch Natriumdiisobutylsulfosuccinat (SDIBSS) geförderte Steigerung der Hybridisierungsgeschwindigkeit

Dieses Beispiel zeigt, daß bei 41,4% (Gew./Gew.) SDIBSS eine stark beschleunigte Geschwindigkeit auftritt, wenn Phosphatpuffer (PB) verwendet wird, um den pH des SDIBSS auf etwa 7 einzustellen.
(a) RNA:DNA-Hybridisierung
1. Gut mischen:
1 ul einer Lösung, die 1,7·10&supmin;&sup4; Mikrogramm Legionella-rRNA enthält.
2 ul 5 M PB.
2 ul I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu Legionella-rRNA.
4 ul H&sub2;O.
92 ul 45% (Gew./Gew.) SDIBSS.
2. Inkubieren bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jeden Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung des 100-200fachen gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 10

B. RNA:DNA-Hybridisierung in SDIBSS

Dieses Beispiel zeigt, daß bei 33,8% (Gew./Gew.) SDIBSS eine stark beschleunigte Geschwindigkeit auftritt, wenn Phosphatpuffer verwendet wird, um den pH des SDIBSS auf etwa 7 einzustellen.
1. Gut mischen:
1 ul Lösung, die 1,7·10&supmin;&sup4; Mikrogramm Legionella-rRNA enthält.
2 ul 5 M PB.
2 ul I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu Legionella-rRNA.
20 ul H&sub2;O.
75 ul SDIBSS 45% (Gew./Gew.).
2. Inkubieren bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Steigerung der Hybridisierungsgeschwindigkeit um das 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 11

C. RNA:DNA-Hybridisierung in SDIBSS

Dieses Beispiel zeigt, daß bei 38,2% (Gew./Gew.) SDIBSS eine stark beschleunigte Geschwindigkeit auftritt, wenn Phosphatpuffer verwendet wird, um den pH des SDIBSS auf etwa 7 einzustellen.
1. Gut mischen:
1 ul einer Lösung, die 1,7·10&supmin;&sup4; Mikrogramm Legionella-rRNA enthält.
2 ul 5 M PB.
2 ul I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu Legionella-rRNA.
10 ul H&sub2;O.
85 ul 45% (Gew./Gew.) SDIBSS.
2. Inkubieren bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jeden Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Steigerung der Hybridisierungsgeschwindigkeit um das 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 12

D. RNA:DNA-Hybridisierung in SDIBSS

Eine stark beschleunigte Geschwindigkeit tritt auf, wenn ungepuffertes Tris verwendet wird, um den pH des SDIBSS auf etwa 9 einzustellen.
1. Gut mischen:
1 ul einer Lösung, 1,7·10&supmin;&sup4; Mikrogramm Legionella-rRNA enthält.
7 ul 1 M Tris, ungepuffert.
2 ul I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu Legionella-rRNA.
90 ul 45% (Gew./Gew.) SDIBSS.
2. Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung um das 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 13

E. RNA:DNA-Hybridisierung in einem Gemisch aus Natriumdodecylsulfat (SDS) und SDIBSS

Eine stark beschleunigte Geschwindigkeit tritt in einem Gemisch aus SDS und SDIBSS auf.
1. Gut mischen:
1 ul einer Lösung, die 1,7·10&supmin;&sup4; Mikrogramm Legionella-rRNA enthält.
7 ul 1 M Tris, ungepuffert.
2 ul I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu Legionella-rRNA.
45 ul 34,9% (Gew./Vol.) SDS.
45 ul 45% (Gew./Vol.) SDIBSS.
2. Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung um das 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 14

F. RNA:DNA-Hybridisierung in SDIBSS in Gegenwart heterologer RNA

Eine stark beschleunigte Geschwindigkeit tritt in Gegenwart einer hohen Konzentration (56 Mikrogramm/ml) heterologer RNA auf.
1. Gut mischen:
1 ul einer Lösung, die 1,7·10&supmin;&sup4; Mikrogramm Legionella-rRNA enthält.
3 ul einer Lösung, die 5,6 Mikrogramm einer heterologen bakteriellen RNA enthalt.
4 ul 1 M Tris, ungepuffert.
2 ul I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu Legionella-rRNA.
90 ul 45% (Gew./Gew.) SDIBSS.
2. Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung des mindestens 100-200fachen gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 15

G. Nachweis von Legionella-Bakterien in Sputum durch RNA:DNA-Hybridisierung in SDIBSS

Eine stark beschleunigte Geschwindigkeit tritt auf, wenn Bakterien aus Sputum isoliert werden, lysiert und in SDIBSS hybridisiert werden. Hybridisierung fand in SDIBSS sogar in Gegenwart von Nicht-Nucleinsäure-Zellkomponenten statt.
1. (a) Löslichmachen von 1 ml Sputum durch Zusatz von 0,1 ml 0,25 DTT und 10-minütigem Zentrifugieren des Gemisches bei 14 000·g, um die Bakterien abzutrennen. Verwerfen des Überstands.
(b) Resuspendieren des Niederschlags in einer solchen Menge Lysepuffer, die 1/3 seines Volumens entspricht (33% SDS, 0,01 M EDTA, 0,01 M Tris, ungepuffert) und 15 Min. Inkubieren bei 72ºC, um die Bakterien zu lysieren.
(c) Gut mischen:
2 ul 5 M PB.
4 ul I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu Legionella-rRNA.
30 ul 45% (Gew. /Gew.) DBISS.
(d) Zugeben des Gemisches (c) zu dem Gemisch (b) und sorgfältig mischen.
2. Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung um das 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 16

H. Nachweis von Legionella-Bakterien in einer flüssigen Probe durch RNA:DNA-Hybridisierung in SDIBSS.

Eine stark beschleunigte Geschwindigkeit tritt auf, wenn die Bakterien aus einer nichtklinischen Probe isoliert und in SDIBSS hybridisiert werden. Eine separate Lyse- Inkubations-Stufe wurde nicht durchgeführt.
1. (a) Vorfiltern der flüssigen Probe, von der bekannt ist, daß -sie Legionella enthält, um große Partikel zu entfernen.
(b) Gut mischen:
30 ul Lösung der Lösung, die Legionella-Bakterien enthält.
15 ul 33% SDS, 0,01 M Tris, ungepuffert, 0,01 M EDTA.
1,8 ul 5 M PB.
5 ul I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu Legionella-rRNA.
190 ul 45% (Gew./Gew.) SDIBSS.
2. Inkubieren bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jeden Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Steigerung der Hybridisierungsgeschwindigkeit um das 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 17

I. RNA:DNA-Hybridisierung in Gegenwart von SDIBSS und Harnstoff

Eine stark beschleunigte Geschwindigkeit tritt in einem Gemisch aus SDIBSS und Harnstoff auf.
1. Gut mischen:
1 ul einer Lösung, die 1,7·10&supmin;&sup4; Mikrogramm Legionella-rRNA enthält.
2 ul H&sub2;O.
5 ul 10 M Harnstoff.
90 ul SDIBSS 45% (Gew./Gew.).
2. Inkubieren bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Steigerung der Hybridisierungsgeschwindigkeit um das mindestens 200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 18

J. RNA:DNA-Hybridisierung in SDIBSS und Harnstoff

Eine stark beschleunigte Geschwindigkeit tritt in einer Mischung aus SDIBSS und Harnstoff auf.
1. Gut mischen:
2 ul Lösung, die 3,4·10&supmin;&sup4; Mikrogramm Legionella-rRNA enthält.
1 ul 5 M PB.
2 ul I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu Legionella-rRNA.
25 ul 27% (Gew./Gew.) SDIBSS, 8 M Harnstoff.
70 ul 45% (Gew./Gew.) SDIBSS.
2. Inkubieren bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Steigerung der Hybridisierungsgeschwindigkeit um das 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 19

K. RNA:DNA-Hybridisierung in Gegenwart von SDIBSS und NaSCN.

Eine stark beschleunigte Geschwindigkeit tritt in einem Gemisch aus SDIBSS und Natriumthiocyanat auf.
1. Gut mischen:
2 ul Lösung, die 3,4·10&supmin;&sup4; Mikrogramm Legionella-rRNA enthält.
1 ul 5 M PB.
2 ul I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu Legionella-rRNA.
5 ul 10,5 M NaSCN.
90 ul 45% (Gew. /Gew.) SDIBSS.
2. Inkubieren bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Steigerung der Hybridisierungsgeschwindigkeit um das 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 20

L. RNA:DNA-Hybridisierung in Gemischen aus SDIBSS, Harnstoff und NaSCN.

Eine stark beschleunigte Geschwindigkeit tritt in Gegenwart von SDIBSS, Natriumthiocyanat und Harnstoff auf.
1. Gut mischen:
2ul einer Lösung, die 3,4·10&supmin;&sup4; Mikrogramm Legionella-rRNA enthält.
1 ul 5 M PB.
2 ul I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu Legionella-rRNA.
5 ul 4 M Harnstoff, 4 M NaSCN, 0,05 M DTT, 0,03 M HCl.
90 ul 45% (Gew./Gew.) SDIBSS.
2. Inkubieren bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen der Aliquote und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Steigerung der Hybridisierungsgeschwindigkeit um das mindestens 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.
Die folgenden Beispiele betreffen den schnellen und empfindlichen Nachweis von drei medizinisch wichtigen Bakterien, von denen jedes beim Menschen Krankheiten verursacht.
A. Bakterien der Gruppe Mycobakterien verursachen beim Menschen eine Vielzahl von Krankheiten. Von diesen sind Tuberkulose und Lepra bedeutend. Gegenwärtige Diagnose-Verfahren verwenden Kulturen zum Nachweis und zur Identifization der Bakterien. Eine Wachstumstufe ist notwendig, um die Bakterien zu vermehren, so daß sie nachgewiesen werden können und unterschiedliche Wachstumsverfahren werden verwendet, um diese Bakterien zu identifizieren. Dieses Diagnose-Verfahren ist arbeitsintensiv und sehr langsam. Da es wichtig ist, so schnell wie möglich zu wissen, ob der Patient mit Mycobakterien infiziert ist, um eine geeignete antimikrobielle Therapie einzuleiten, ist dieses Diagnose-Verfahren arbeitsintensiv und sehr langsam.
Mit den gegenwärtigen Verfahren dauert es 1-8 Wochen, um eine definitive Diagnose über Mycobakterien zu erhalten. Die Durchführung der in Beispiel 25 beschriebenen Untersuchung dauert etwa 2-3 Std. und erfordert keine Wachstumsstufe. Daher gestattet das erfindungsgemäße Verfahren die Ausführung eines Tests für Mycobakterien, der über 100mal schneller ist als die gegenwärtigen Verfahren, keine Wachstumsstufe erfordert, viel weniger arbeitsintensiv und viel kostengünstiger ist. Darüber hinaus ermöglicht die Schnelligkeit des Tests eine schnelle Behandlung der Krankheit mit unschätzbarem Nutzen für die Patienten.
B. Das Bakterium Mycoplasma pneumoniae verursacht ebenfalls Krankheit beim Menschen. Gegenwärtig werden Kulturverfahren zur Diagnose verwendet und eine definitive Diagnose dauert im allgemeinen 1-2 Wochen.
Die Durchführung der in Beispiel 23 beschriebenen Untersuchung dauert weniger als 2 Std. und erfordert keine Wachstumsstufe. Daher ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Ausführung eines Tests für Mycoplasma pneumoniae, der etwa 100mal schneller ist als die gegenwärtigen Verfahren und andere Vorteile und Nutzen ähnlich denen zuvor in A. beschriebenen aufweist.
C. Legionella-Bakterien verursachen ebenfalls Krankheiten beim Menschen. Die gegenwärtig empfohlenen Diagnose- Verfahren umfassen Kulturverfahren. Diese Verfahren führen im allgemeinen in etwa 3 Tagen zu einer definitiven Antwort, können jedoch auch 1 Woche oder länger dauern.
Die Durchführung der im Beispiel 25 beschriebenen Untersuchung dauert weniger als 2 Std., erfordert keine Wachstumsstufe, ist etwa 20mal schneller als die gegenwärtigen Verfahren und hat andere Vorteile und Nutzen ähnlich denen, die zuvor in A. beschrieben wurden.

Beispiel 21

M. Nachweis von Legionella-Bakterien in einer Sputumprobe durch RNA:DNA-Hybridisierung in SDIBSS, Harnstoff und SDS

Eine stark beschleunigte Geschwindigkeit tritt auf, wenn Sputum direkt in einem Gemisch aus SDIBSS, SDS und Harnstoff untersucht wird.
1. (a) Gut mischen:
3 ul Sputum.
6 ul 17% SDS, 0,01 M Tris (ungepuffert), 0,01 M EDTA. 15 Min. lang inkubieren bei 72ºC.
(b) Gut mischen:
3 ul 1(a) Lösung.
2 ul H&sub2;O.
3 ul 10 M Harnstoff.
2 ul I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu Legionella-rRNA.
90 ul 45% (Gew./Gew.) SDIBSS.
2. Inkubieren bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Steigerung der Hybridisierungsgeschwindigkeit um das 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 22

N. Nachweis von Legionella-Bakterien in einer Sputumprobe durch RNA:DNA-Hybridisierung in SDIBSS-, Harnstoff-, SDS-Gemischen.

Ein Beispiel des schnellen Nachweises von Legionella-Bakterien in einer Sputumprobe durch Verwenden eines Gemisches aus SDIBSS, SDS und Harnstoff, um die Hybridisierungsgeschwindigkeit stark zu beschleunigen.
1. (a) Gut mischen:
20 ul Sputum.
80 ul 5 M Harnstoff, 4 M NaSCN, 0,05 M Tris (ungepuffert) und 10 Min. lang Zentrifugieren bei 14 000·g. Verwerfen des Überstands.
(b) Zufügen von 25 ul 11% SDS, 3,3 M Harnstoff, 0,007 M EDTA, 0,05 M Tris (ungepuffert) zu dem Niederschlag und Resuspendieren. 15 Min. lang Inkubieren bei 72ºC.
(c) Gut mischen:
5 ul Lösung 1(b)
2 ul I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu Legionella-rRNA.
3 ul 10 M Harnstoff.
90 ul 45% (Gew./Gew.) SDIBSS.
2. 1 Std. lang Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und Untersuchen auf Hybridisierung wie beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung um das 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 23

O. Nachweis von Mycoplasma pneumoniae Bakterien in einer Rachenabstrichprobe durch RNA:DNA-Hybridisierung in SDIBSS.

Ein Beispiel der Verwendung des SDIBSS-Systems zum schnellen Nachweis von Mycoplasma pneumoniae in einer klinischen Probe.
1. (a) Resuspendieren des Rachenabstrichmaterials in einer geeigneten Lösung, die mit den beteiligten Bakterien kompatibel ist.
(b) 10 Min. lang Zentrifugieren der Lösung der bei 13 000·g. Verwerfen des Überstands.
(c) Resuspendieren des Niederschlags in 300 ul 45% (Gew./Gew.) SDIBSS, das 3% SDS enthält, 0,03 M PB, (pH=6,8), 10&supmin;³ M EDTA, 10&supmin;³ M EDTA, 10&supmin;³ M EGTA und I¹²&sup5; - cDNA, komplementär zu M. pneumoniae-rRNA.
2. 1 Std. lang Inkubieren der Mischung bei 72ºc und Untersuchen auf Hybridisierung wie beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung um das 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 24

A. Untersuchung der Gegenwart von Mycoplasma in einer Gewebekultur mittels RNA:DNA-Hybridisierung in SDIBSS.

Es wird ein Beispiel der Anwendung des Natriumphosphatsystems zum schnellen Nachweis einer Mycoplasma-Infektion von Gewebekultur beschrieben.
1. (a) 5 Min. lang Zentrifugieren von 50 ul Gewebekulturmedien einer Zellkultur aus Babyhamsternierenzellen bei 12.000·g. Verwerfen des Überstands.
(b) Resuspendieren des Niederschlags in 100 ul 0,15 M NaCl.
(c) Gut mischen:
45 ul Lösung (b).
5 ul 5% Sarkosyl, 10&supmin;² M EDTA, 10&supmin;² M EGTA, 0,96 M PB, 0,01 Mikrogramm/ml 3H-cDNA, komplementär zu Mycoplasma hominis-rRNA.
65 ul 4,8 M PB.
und ausreichend SDIBSS, um die Hybridisierungsgeschwindigkeit stark zu beschleunigen.
2. 1 Std. lang Inkubieren bei 72ºC und Untersuchen auf Hybridisierung wie beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Steigerung der Hybridisierungsgeschwindigkeit um das 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 25

B. Nachweis von Mycobakterien in einer Sputumprobe durch RNA:DNA-Hybridisierung in SDIBSS.

Dies ist ein Beispiel für die Verwendung des SDIBSS-Systems zum schnellen Nachweis von Mycobakterien in einer klinischen Probe.
1. (a) Verflüssigen des Sputums und Zentrifugieren der Lösung, um Mycobakterien abzutrennen. Verwerfen des Überstands.
(b) Suspendieren des Niederschlags in 40 ul 3,3% SDS und Zufügen von 50 ul Glasbeads (0,2-0,3mm) (Dyno-Mill- Sorte), 10 Min. lang beschallen in einem Mettler M4 Ultraschallreinigungsgerät.
(c) Gut mischen:
Lösung aus b).
100 ul 45% (Gew./Gew.) SDIBSS.
176 ul 43,5% (Gew./Gew.) SDIBSS, 0,07 M PB, I¹²&sup5; - cDNA (10&supmin;²) Mikrogramm/ml), komplementär zu Mycobakterien-rRNA.
2. 1 Std. lang Inkubieren des Gemisches bei 72ºC und Untersuchen auf Hybridisierung wie beschrieben.
Dieses Verfahren führt zu einer Geschwindigkeitssteigerung um das 100-200fache gegenüber der Geschwindigkeit unter Referenzbedingungen.

Beispiel 26

Nachweis von Legionella-Bakterien in einer flüssigen Probe durch RNA:DNA-Hybridisierung in SDIBSS und Amphyl (Verkauf durch National Laboratories). Aktive Bestandteile in Amphyl, 10,5% o-Phenylphenol, 5% o-Benzo-p-Chlorphenol, 84,5% inerte Bestandteile.

Eine stark beschleunigte Geschwindigkeit tritt in einem Gemisch aus Natriumphosphat und Amphyl, einem bakteriziden Mittel, auf.
1. Gut mischen:
2 ul Lösung, die 1,2·10&sup4; intakte Legionella-Bakterien enthält.
12 ul Lösung, die 4% Amphyl und radioaktive cDNA enthält, die komplementär zu Legionella-rRNA ist.
18 ul 4,8 M PB
und ausreichend SDIBSS, um die Hybridisierungsgeschwindigkeit stark zu beschleunigen.
2. Inkubieren bei 72ºC und zu bestimmten Zeiten Entfernen von Aliquoten. Verdünnen jedes Aliquots und Untersuchen auf Hybridisierung wie zuvor beschrieben.
Dieses Beispiel zeigt, daß die rRNA der Legionella-Bakterien durch Zusetzen von Amphyl zu dem Reaktionsgemisch zur Hybridisierung verfügbar gemacht wurde. Es ist kein vorheriges Aufbrechen der Bakterien notwendig.

Claims

1. Verfahren zur Bildung doppelsträngiger Nucleinsäuremoleküle aus separaten einzelsträngigen Nucleinsäuremolekülen, bei dem die Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber der Reaktionsgeschwindigkeit unter Standardbedingungen beträchtlich erhöht ist, das zum Nachweis der Gegenwart oder der Menge von Bakterien in einer Probe, die im Verdacht steht, Bakterien zu enthalten, verwendet wird, umfassend:

das Herstellen einer wäßrigen Reaktionslösung, die eine Menge einer Testprobe enthält, die im Verdacht steht, Bakterien zu enthalten, wobei die Testprobe mit einer Menge von denaturierendem Agens behandelt worden ist, die ausreicht, um die doppelsträngigen Nucleinsauremoleküle, die in den Bakterien vorhanden sind, in einzelsträngige Nucleinsäuremoleküle zu dissoziieren, einer Menge eines zweiten einzelsträngigen Nucleinsäuremoleküls, das zu einem Segment der Basensequenz der Nucleinsäuremoleküle des nachzuweisenden Organismus komplementär ist, und einer bekannten Konzentration von mindestens einem Nucleinsäure ausfällenden Detergens, wobei die bekannte Konzentration ausreicht, um die Reaktionsgeschwindigkeit auf das 100- oder mehrfache der Geschwindigkeit der Reaktion unter Standardbedingungen zu beschleunigen;

das Inkubieren der wäßrigen Reaktionslösung bei einer Temperatur, bei der Reassoziation stattfinden kann; und

das Testen der inkubierten wäßrigen Reaktionslösung auf die Gegenwart oder die Menge doppelsträngiger Nucleinsäuremoleküle der nachzuweisenden Bakterien.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS), Natrium-diisobutyl-sulfosuccinat (SDIBSS) und/oder Natrium-tetradecylsulfat (STDS) umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Reaktionslösung ein denaturierendes Agens in einer Konzentration enthält, die die Beschleunigungsrate der Reassoziation nicht signifikant inhibiert.

4. Verfahren nach Ansprüchen 1, 2 oder 3, bei dem die Reaktionslösung Harnstoff, NaSCN, Guanidin HCl enthält.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Reaktionslösung weniger als etwa 2 M Harnstoff oder weniger als etwa 2 M NaSCN enthält.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Bakterien ein Mitglied der Gattung Legionella sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, worin die Bakterien ein Mitglied der Gruppe Mycobakterium sind.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, worin die Bakterien Mycoplasma pneumoniae sind.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Probe eine klinische Probe ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die klinische Probe Sputum oder einen Rachenabstrich enthält.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Reaktionslösung ein bakterizides Agens enthält.

12. Verfahren zum Testen der Gegenwart oder der Menge von Legionella-Bakterien in einer klinischen Probe, die im Verdacht steht, Legionella-Bakterien zu enthalten, umfassend:

das Herstellen einer wäßrigen Reaktionslösung, die eine Menge der Testprobe enthält, die ggfs. behandelt wurde, um ihre doppelsträngigen Nucleinsäuremoleküle zur Einzelstrangform zu denaturieren,

cDNA, die komplementär zu einem Segment von LegionellarRNA ist,

SDIBSS in ausreichender Konzentration, um die Hybridisierungsgeschwindigkeit auf das 100- oder mehrfache der Geschwindigkeit (falls vorhanden) der Reaktion unter Standardbedingungen zu beschleunigen, und

ein bakterizides Agens;

Inkubieren der wäßrigen Reaktionslösung bei etwa 72ºC für eine Zeit, die für die cDNA ausreichend ist, um im wesentlichen mit in der klinischen Probe vorhandener komplementärer Bakteriennucleinsäure zu hybridisieren; und

Testen der wäßrigen Reaktionslösung auf das Vorliegen von oder die Menge an Hybridisierung.

13. Verfahren zum Testen der Gegenwart oder der Menge von Mycoplasma pneumoniae in einer klinischen Probe, die im Verdacht steht, M. pneumoniae zu enthalten, umfassend:

das Herstellen einer wäßrigen Reaktionslösung, die eine Quantität der Testprobe enthält, die ggfs. behandelt wurde, um ihre doppelsträngigen Nucleinsäuremoleküle in die Einzelstrangform zu denaturieren,

cDNA, die komplementär zu einem Segment von Mycoplasma pneumoniae-rRNA ist;

SDIBSS in ausreichender Konzentration, um die Hybridisierungsgeschwindigkeit auf das 100- oder mehrfache der Geschwindigkeit (falls vorhanden) der Reaktion bei Standardbedingungen zu beschleunigen;

Testen der wäßrigen Reaktionslösung auf die Gegenwart von oder die Menge der Hybridisierung.