DE69304495T2

DE69304495T2 - Borsilikate, Aluminiumsilikate, Phosphosilikate und Reinigung von DNS

Info

Publication number: DE69304495T2
Application number: DE69304495T
Authority: DE
Inventors: James Arthur Down; Adriann Jeanelle Howard; Daniel Lee Woodard
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1992-11-13
Filing date: 1993-11-04
Publication date: 1997-01-02
Anticipated expiration: 2013-11-05
Also published as: AU669398B2; AU5042593A; JP2714529B2; CA2102264A1; JPH06217775A; US5525319A; CA2102264C; EP0600253A1; EP0600253B1; DE69304495D1; US5523392A; US5520899A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Molekularbiologie. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf den Bereich der Reinigung von Deoxyribonukleinsäure.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die andauernden Fortschritte in der Molekularbiologie und in verwandten Disziplinen bedingen einen fortgesetzten Bedarf an Verbesserungen jener Werkzeuge, die mit der vollen Nutzung und Entwicklung der fortgeschrittenen Technologie in Zusammenhang stehen.
An einem weiten Bereich von Technologien ist die Verwendung von Deoxyribonukleinsäuren (DNA) in einer Vielfalt von Formen beteiligt. Zum Beispiel erfordern die Fortschritte auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie ständig die Verwendung von DNA in Form von Sonden, genomischer DNA und Plasmid-DNA.
Die Fortschritte im Bereich der Diagnostik verwenden weiterhin DNA in einer Vielzahl von Anwendungsgebieten. Zum Beispiel werden DNA-Sonden routinemäßig bei der Feststellung und Diagnose humaner Pathogene eingesetzt. In ähnlicher Weise wird DNA bei der Feststellung genetischer Störungen verwendet. DNA wird auch zur Feststellung von Verunreinigungen in Lebensmitteln eingesetzt. Und schließlich werden DNA-Sonden routinemäßig bei der Lokalisierung, Identifizierung und Isolierung von Ziel-DNA verwendet, die aus einer Vielzahl von Gründen, die von genetischer Kartierung bis zu Klonierung und rekombinanter Expression reichen, von Interesse sind.
In vielen Fällen ist DNA in äußerst geringen Mengen zur Verfügung und die Isolierungs- und Reinigungsverfahren können arbeitsintensiv und zeitaufwendig sein. Diese oft zeitaufwendigen und mühsamen Verfahren können zu einem Verlust an DNA führen. Bei der Reinigung von DNA aus Proben, die aus Serum, Urin und Bakterienkulturen erhalten wurden, besteht zusätzlich das Risiko der Kontaminierung und von falsch-positiven Ergebnissen.
Typische Anweisungen zur Reinigung von DNA bedingen die Verwendung von ätzenden und giftigen Zusammensetzungen. Bei der typischen Anweisung zur DNA-Reinigung werden hohe Konzentrationen chaotroper Salze, wie Natriumjodid und Natriumperchlorat, eingesetzt.
Es gibt eine Vielzahl von Anweisungen zur Reinigung von DNA. Wie durch die neuere Aktivität auf dem Gebiet der DNA-Reinigung bewiesen wird, besteht ein fortdauerndes Bestreben nach optimalen Anweisungen zur DNA-Reinigung. Die US-PS 4,923.978 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von DNA, bei welchem eine Lösung von Protein und DNA über einen hydroxylierten Träger geschickt und das Protein gebunden und die DNA eluiert wird. Die US-PS 4,935.342 offenbart die Reinigung von DNA durch selektive Bindung von DNA an Anionentauscher mit anschließender Eluierung. Die US-PS 4,946.952 offenbart die Isolierung von DNA durch Ausfällung mit wasserlöslichen Ketonen. Ein DNA-Reinigungsverfahren unter Verwendung von Chaotropen und dialysierter DNA ist in der US-PS 4,900.677 geoffenbart.
Die EP 0 512 767 beschreibt Verfahren, bei denen Silikatpolymere zur Bindung und Reinigung von DNA eingesetzt werden. Die Methoden verwenden wasserlösliche organische Lösungsmittel, wie etwa Alkohole, zur verbesserten Gewinnung der DNA mit dem Vorteil, die Notwendigkeit toxischerer Reagenzien, wie etwa von chaotropen, zu vermeiden.
Die EP 0 555 798 beschreibt hydroxylierte Silika-Verbindungen, von denen einige zur Bindung und Elution von DNA unter nativen Bedingungen verwendbar sind, das heißt ohne Einsatz von Chaotropen.
Obwohl die derzeitigen Anweisungen zur Reinigung von DNA die Erreichung ihres Ziel möglich machen, ist es doch wünschenswert, DNA ohne Verwendung solcher ätzender und giftiger Verbindungen, wie es die am häufigsten verwendeten Chaotrope sind, bei zusätzlicher Gewinnung erhöhter DNA-Mengen zu reinigen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Verfügung, die durch Reaktion von SiCl&sub4; mit BCl&sub3;, PCl&sub3; oder AlCl&sub3; erhältlich ist, wie in den angeschlossenen Ansprüchen definiert ist. Die Erfindung kann zur Reinigung von DNA aus einer Vielzahl von Quellen und in einer Vielzahl von Formen verwendet werden. Das Verfahren verwendet die erfindungsgemäße Zusammensetzung und macht den Einsatz von Bindungspuffern, wie etwa Chaotropen, zum wahlweisen Merkmal. Die DNA kann in wässeriger Lösung, wie etwa TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) bei Reaumtemperatur gebunden werden. Zusätzlich dazu kann die DNA aus den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen durch Erhitzen in Wasser hinein eluiert werden oder es können allgemein verwendete Elutionspuffer, wie etwa TE oder 1 X TAE eingesetzt werden. Quellen der zur Reinigung bestimmten DNA umfassen Bakterien, Bakteriophagen, Proben, Pflanzen, Tiere und dergleichen. DNA kann in einer Vielzahl von Formen vorliegen und umfaßt einzelstrangige, doppelstrangige, zirkuläre und lineare Formen. Die Erfindung kann mit DNA aus beliebiger Quelle und in beliebiger Form in die Praxis umgesetzt werden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Die Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Verfügung, die erhältlich ist durch Reaktion von SiCl&sub4; mit BCl&sub3;, PCl&sub3; oder AlCl&sub3;, wie in den angeschlossenen Ansprüchen definiert ist.
Die Zusammensetzung sorgt für die Bindung der DNA, wobei auch eine einfache Rückgewinnung der DNA von der Oberfläche ermöglicht wird.
Ebenso zur Verfügung gestellt wird ein Verfahren zur Reinigung von DNA, umfassend das In-Kontakt-bringen von DNA mit einer Zusammensetzung, die hergestellt wird durch Umsetzung von SiCl&sub4; mit BCl&sub3;, PCl&sub3; oder AlCl&sub3;, Kühlung der Reaktionsmischung und Zusatz von Wasser, wie in den Ansprüchen definiert ist.
Die Reaktionsprodukte einer Mischung von SiCl&sub4; und BCl&sub3; oder PCl&sub3; oder AlCl&sub3; mit anschließendem Wasserzusatz werden ebenso zur Verfügung gestellt.
Im allgemeinen führen die Reaktionsprodukte von Wasser und einer Mischung von SiCl&sub4; und PCl&sub3; oder BCl&sub3; oder AlCl&sub3; zu Produkten mit perlförmiger Struktur, die sich wiederholende Einheiten der oben angegebenen Monomereinheit umfassen.
Es ist möglich, daß die elektronische Natur dieses Polymeren so ist, daß Oberflächenmodifikationen vorgenommen werden können, die von eher konventioneller Natur, durch die Anwesenheit dieses Polymers im Zentrum der Perle jedoch elektronisch verändert sind (wodurch die Oberfläche für die in dieser Offenbarung beschriebenen Zwecke wirksamer wird). Zum Beispiel könnte die Oberfläche mit SiCl&sub4; und anschließende Hydrierung modifiziert werden, was zu einer Silanol-Beschichtung auf der Oberfläche führen würde. Die Exponierung der sich wiederholenden Einheit bedingt die Wechselwirkung mit der DNA und somit sind Oberflächen, die die sich wiederholende Einheit aufweisen, ebenso zur Umsetzung der Erfindung in die Praxis geeignet. Oberflächen, die dazu ausgerichtet sind, erfindungsgemäße Zusammensetzungen aufzuweisen, umfassen zum Beispiel Tauchstab-Konfigurationen, Röhrchen, Fläschchen und Filtrationsgeräte.
Das Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfaßt im allgemeinen das Mischen von SiCl&sub4; mit verschiedenen Mengen von PCl&sub3; oder BCl&sub3; oder AlCl&sub3; mit anschließender Kühlung. Dann wird Wasser zugesetzt, bis sich kein Chlorwasserstoffgas HCl(g) mehr entwickelt, worauf überschüssiges Wasser zugesetzt wird, um vollständige Reaktion von SiCl&sub4; und BCl&sub3; oder AlCl&sub3; oder PCl&sub3; zu gewährleisten. Die Mengen der Reaktanten sind im allgemeinen 15:1 bis 1:15.
Dieses entstehende Produkt wird etwa dreißig (30) Minuten gerührt. Das entstehende Produkt wird abfiltriert und dann gewaschen und getrocknet. Geeignete Waschmedien sind Aceton und dergleichen. Das Produkt ist nun fertig zur Verwendung bei der Reinigung von DNA.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Reinigung von DNA zur Verfügung, welches das In-Kontakt-bringen von DNA mit erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfaßt.
Der Beginn jeder DNA-Reinigung oder jedes Isolierungsverfahrens erfordert die Gewinnung der gewünschten DNA aus ihrer Quelle. Typische Anweisungen zur Gewinnung von DNA aus Proben, wie etwa von Serum, Urin und Bakterienkulturen, sind allgemein bekannt und werden routinemäßig ausgeführt. Ebenso ist es Routine, DNA aus Genom-Bibliotheken und dergleichen erhalten zu können. Der Schlüssel zu der Erfindung ist die Möglichkeit, DNA, sobald sie aus ihrer Quelle erhalten wurde, zu reinigen. Typische Verfahren zur Gewinnung von DNA führen zu einer Suspension der DNA in Lösung. Literaturstellen umfassen solche zur Isolierung von DNA aus biologischen Proben, Harding, J.D., Gebeyehu, G., Bebee, R., Simms, D., Ktevan, L., Nucleic Acids Research, 17:6947 (1989) und Marko, M.A., Chipperfield, R. und Birnboim, H.C., Analytical Biochemistrv, 121:382 (1982). Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA finden sich in Lutze, L.H., Winegar, R.A., Nucleic Acids Research 20:6150 (1990). Angaben über die Extraktion von doppelstrangiger DNA aus biologischen Proben können in Yamada, O., Matsumoto, T., Nakashima, M., Hagri, S., Kamahora, T., Ueyama, H., Kishi, Y., Uemura H., Kurimura, T., Journal of Virological Methods 27:203 (1990) gefunden werden. Die meisten DNA-Lösungen enthalten die DNA in einem geeigneten Puffer, wie etwa TE (Tris-EDTA (10 mM:l mM)), TEA (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA)-Puffer oder als Lysat.
Sobald die DNA in einer geeigneten Lösung erhalten wurde, wird in der Regel zu der Lösung eine Bindematrix zugesetzt. Allgemein verwendete Bindematrices sind Siliziumdioxid in Form von Glas oder Diatomeenerde. Verfahren unter Verwendung von Siliziumdioxid erfordern jedoch hohe Konzentrationen von Chaotropen oder Alkoholen, um die DNA an die Oberflächen zu binden. Häufig verwendete Chaotrope sind Natriumjodid (NaI), Harnstoff, Guanidin-Hydrochlond, Natriumperchlorat (NaClO&sub4;) und Kaliumbromid (KBr). Chaotrope und Alkohole können toxisch, ätzend, entzündlich und/oder teuer sein. Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert keine Anwesenheit von Chaotropen oder Alkoholen zur Bindung an erfindungsgemäße Oberflächen. Die erfindungsgemäßen Verfahren binden DNA in einer wässerigen Lösung bei Raumtemperatur und eluieren die DNA in Wasser bei 37ºC. Gewünschtenfalls können jedoch Chaotrope, Alkohole und dergleichen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Typische Verfahren zum Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen den Zusatz der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zu einer Lösung der DNA, woraufim allgemeinen der Zusatz eines Bindepuffers erfolgt. Zu diesem Zeitpunkt ist es vorteilhaft, daß das erfindungsgemäße Verfahren keinen Bindepuffer erforderlich macht. Die Lösung kann während eines kurzen Zeitraums bei Raumtemperatur inkubiert werden. Nach dem Zentrifugieren kann der Überstand verworfen und das Pellet gewaschen werden. Die DNA kann dann eluiert werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird in der Regel in Gewichtsbereichen von etwa 1:10 bis 1:1 von Gewicht der Zusammensetzung:Wasser eingesetzt werden. Vorzugsweise werden übermäßige Wassermengen vermieden und Puffer, wie etwa TE, können anstelle von Wasser eingesetzt werden.
Als nächstes wird, wenn er verwendet wird, ein Bindepuffer zugesetzt. Nach einer kurzen Inkubationszeit bei Raumtemperatur, obwohl ein Bereich von etwa 20ºC bis etwa 40ºC ebenso möglich ist, von etwa 1 bis etwa 20 Minuten, vorzugsweise etwa 10 Minuten, kann der Behälter zentrifugiert werden, um ein Pellet und Überstandsfraktionen zu erhalten. Der Überstand wird abgetrennt und das Pellet mit einem Reagenz, wie etwa Ethanol, das mit 50 mM Tris verdünnt ist, gewaschen. Eine bevorzugte Waschmittelkonzentration ist 80 % Ethanol. Von den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann die DNA unter Verwendung von Elutionspuffern, wie etwa TE-Puffer, 1 X TEA Puffer und 1 X TBE Puffer, eluiert werden. Wichtiger ist es, daß die Verwendung von Elutionspuffern insgesamt vermieden werden kann und daß DNA durch Erhitzen in Wasser eluiert wird. Zur Maximierung der Ausbeuten kann der Elutionsschritt wiederholt werden.
Die erfindungsgemäßen chemischen Zusammensetzungen können geeigneterweise zu einem Kit vereinigt werden. Ein Kit, der die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfaßt, kann die Zusammensetzung in einem Behälter, wie etwa einem Röhrchen, mit einem geeigneten Puffer, wie etwa TE-Puffer und TAE-Puffer, enthalten und umfaßt gegebenenfalls einen Behälter eines Bindepuffers&sub1; wie etwa Chaotrope, einen Behälter mit Waschpuffer, wie etwa einer mit 50 mM Tris oder 1 X TAE verdünnten Ethanollösung, und einen Behälter mit Elutionspuffer, wie etwa TE-Puffer, 1 X TAE-Puffer und 1 X TBE-Puffer. Ein solcher Kit würde in günstiger Weise die Reinigung von DNA erlauben.
Die folgenden Beispiele erläutern die speziellen Ausführungsformen der Erfindung, die in diesen Unterlagen beschrieben sind. Wie für Fachleute ersichtlich&sub1; sind verschiedene Veränderungen und Modifikationen möglich und werden innerhalb des Rahmens der Erfindung, wie sie beansprucht ist, in Betracht gezogen.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Der Zweck dieses Versuchs ist es, 10 Borsilikat-Polymere zu synthetisieren. Die Polymeren enthalten verschiedene Mengen Bor, da der Einbau von Bor, einem weniger elektropositiven Atom als Silizium, in das Polymer die elektronische Natur der Qberfläche verändern wird und deren Fähigkeit zur Reinigung von DNA aus einer wässerigen Probe durch Festphasenextraktion beeinflussen kann.

Materialien

BCl&sub3; in CH&sub2;Cl&sub2;(1M) (Aldrich, Milwaukee, WI)
SiCl&sub4; (Petrarch Systems, Bristol, PA)
Verfahren: 10 Versuche wurden in gleicher Weise durchgeführt, mit Ausnahme der Tatsache, daß der Prozentsatz von BCl&sub3; wie unten gezeigt verändert wird.
SiCl&sub4; und BCl&sub3; werden miteinander gemischt und 20 Minuten lang auf etwa 5ºC abgekühlt. Unter Rühren wird langsam H&sub2;0 zugesetzt, bis sich kein HCl(g) mehr bildet. Es werden 5 ml überschüssiges Wasser zugesetzt, um eine Beendigung der Reaktion zu gewährleisten. Es wird 1 Stunde gerührt.
Es wird filtriert, 3 X mit 10 ml H&sub2;0 und dann 3 X mit 10 ml Aceton gewaschen, 25 Minuten in Luft getrocknet und 1 Stunde trocken erhitzt.

BEISPIEL 2

Phosphor hat etwa die gleiche Elektronegativität wie Bor. Borsilikate erwiesen sich als sehr gut geeignet für die Reinigung von DNA. Wenn die Polarisation der Oberfläche für die Haftung/Elution von DNA von Bedeutung ist, dann sollten auch Phosphosilikate ebenso wie Borsilikate für die DNA-Reinigung geeignet sein.

Materialien:

SiCl&sub4; (Petrarch Systems)
PCl&sub3; - 2M in CH&sub2;Cl&sub2; (Aldrich)
Es wurden 10 Versuche genau in der gleichen Weise durchgeführt, mit Ausnahme der Tatsache, daß die Menge des PCl&sub3; bei jedem Versuch unterschiedlich war. Die folgende Tabelle beschreibt jeden der 10 Versuche.
Bei einem typischen Versuch wird das SiCl&sub4; in einen 25 ml Erlenmeyer-Kolben eingebracht und in einem Eisbad etwa 10 Minuten auf 0ºC abgekühlt. Dann wird PCl&sub3; zugesetzt und 5 Minuten gekühlt. Sehr langsam wird Wasser zugesetzt, etwa. 2 Tropfen pro Minute, bis kein weißes Gas mehr aufsteigt. Man rühre 5 Minuten und setze in Portionen von 1 ml 3 ml zu. Man rühre bei Raumtemperatur 15 Minuten. Man filtriere, wasche den Feststoff mit 3 X 10 ml H&sub2;0 und dann mit 3 X 10 ml Aceton. Man trockne 15 Minuten mit Luft und trockne eine (1) Stunde unter Erhitzen. Aufbewahrung in einem Exsikkator.

BEISPIEL 3

Der Zweck des folgenden Versuchs war die Synthetisierung von Aluminiumsilikat-Polymeren, die verschiedene Mengen Aluminium enthalten. Aluminium ist elektropositiver als Silizium und daher sollte mit steigender Aluminiummenge in dem Polymer die an diesem Polymer haftende DNA-Menge ebenso ansteigen.

Ausgangsmaterial ien

AlCl&sub3;, 1M in Nitrobenzol (Aldrich)
SiCl&sub4; (Petrarch System)

Verfahren

Es wurden 8 Versuche in der gleichen Weise durchgeführt, mit Ausnahme der Tatsache, daß die AlCl&sub3;-Menge von einem Versuch zum nächsten verändert wurde.
In einem typischen Versuch wurden das AlCl&sub3; und das SiCl&sub4; miteinander vermischt und 15 Minuten in einem Eisbad gekühlt. Wasser wird tropfenweise unter heftigem Rühren zugesetzt. Sehr langsam (5 Tropfen alle 2 Minuten) wird Wasser zugesetzt, bis sich kein HCl(g) aus dem Reaktionsgefäß mehr entwickelt.
Zusatz von etwa 3 ml H&sub2;0, um das Ende der Reaktion zu garantieren. 15 Minuten rühren bei Raumtemperatur.
Filtrieren, waschen mit 3 X 10 ml Aceton, 3 X 20 ml H&sub2;O, 3 X 10 ml Aceton. 20 Minuten trocknen in Luft, eine (1) Stunde trocknen unter Erhitzen. Aufbewahrung in einem Exsikkator.

BEISPIEL 4

Dieser Versuch beschreibt, wie die DNA-Bindungskapazität von SUPER FINE SUPER FLOSS CELITE (Industriestandard, Manville) bestimmt wurde und wie hoch dessen Kapazität ist. Es wurde festgestellt, daß SUPER FINE SUPER FLOSS CELITE DNA stark bindet und daß die DNA bei 2,5 M mit NaCl0&sub4; als Bindepuffer eluiert.

Materialien:

Super Fine Super Floss (SFSF) Probe von Manville, Denver, CO (1:5 Gew./Gew. in H&sub2;O))
DNA (BRL Cat. 56125A)
50 mM Tris pH 7,0 (Verdünnung aus 1 M Stammlösung) BRL Cat. 5505UA
(PREP-A-GENE KIT (Bio-Rad, Richmond, CA) Bindepuffer (verdünnt aus 6 M Stammlösung) NaCl0&sub4; Fisher Cat. 5490-500
Waschpuffer 80 % Ethanol in 50 mM Tris, pH 7, Elutionspuffer
Milli Q H&sub2;0
Ethidiumbromid (10 mg/ml) Sigma Cat. E-8751
1 % Agarose BRL Cat. 5510UA
1 X TAE (aus 50 X Stammlösung) Tris Base-Sigma CAT T-1503
Essigsäure - Fisher A38-500
EDTA - Sigma CAT ED2550
Type II Beladungsfarbstoff (25 % Ficoll 400, 0,25 % Bromphenolblau, 0,25 % Xylolcyanol Ficoll 400 - Sigma CAT F4375, Bromphenolblau - BIO-RAD CAT 161-0404
Xylolcyanol - Sigma CAT X-4126
POLAROID Film Typ 57 und 55

METHODEN

1. Es wurden zwei Gruppen von Reaktionen festgesetzt, eine für jeden Oberflächentyp. Jede Oberfläche hat 8 Röhrchen, die 50 µl der DNA-Lösung enthalten. Diese Lösung ist 0,5 µl DNA in 50 µl 50 mM Tris, pH 7,0, für 31 µg DNA pro Reaktion. Die Titrationsbereiche liegen von OM NaCl0&sub4; bis 6M NaCl0&sub4;.
2. Zusatz von 20 µl jeder Oberfläche zu den Reaktionsmischungen.
3. Zusatz von 400 µl Bindepuffer je nach Titration. Für das Prep-A-Gen waren dies 0,0M, 2,0M, 2,SM, 3,0M, 3,SM, 4,0M, 4,5M und 6,0M NaCl0&sub4;. Für SFSF war die Titration 0M, 1,0M, 1,5M, 2,0M, 2,SM, 3,0M, 3,5M und 4,DM NaCl0&sub4;.
4. Inkubation 10 Minuten unter Schwenken bei Raumtemperatur.
5. Zentrifugieren und Verwerfen des Überstands.
6. Waschen des Pellets zweimal mit 80 % Ethanol/50 mM Tris, pH 7,0.
7. Eluieren der DNA in 20 µl H&sub2;0, 37ºC, 10 Minuten.
8. Zentrifugieren und Abtrennen des Überstands in ein eigenes Röhrchen. Wiederholung der Elutionsstufe und Vereinigen der Überstände auf ~40 µl gesamt.
9. Zusatz von 2 µl Beladungsfarbstoff Typ II zu jedem Röhrchen.
10. Aufbringen auf 1 % Agarose, 1 X TAE Gel. ~25 Minuten Laufzeit bei 100-130 Volt in 1 X TAE-Puffer.
11. Färben mit Ethidiumbromid in H&sub2;0 (~1:1000) während ~15 Minuten. Entfärbung während ~20 bis 30 Minuten.
12. Fotografieren mit UV-Licht mit Polaroid Film Typ 57. Wenn möglich Herstellung der Negative mit Film Typ 55.

Ergebnisse und Schlußfolgerungen

Das Prep-A-Gen zeigt keine Elution von DNA bis zu 3,0M NaClO&sub4;, während SFSF DNA in ihrem nativen Zustand bindet und stark bei 2,5M NaClO&sub4; eluiert. Eindeutig verhält sich SFSF besser als Prep-A-Gen.

BEISPIEL 5

Dieser Versuch beschreibt die DNA-Bindunsgskapazität von Borsilikaten, Phosphosilikaten und Aluminiumsilikaten.
Die Elektrophorese zeigt, daß viele dieser Oberflächen eine gute Gewinnung von DNA bis herab zu iM NaClD&sub4; als Bindepuffer ergeben. Das übersteigt die Ergebnisse von Super Fine Super Floss Celite, der eine gute Gewinnung nur bis herab zu 2,5M NaCl0&sub4; ergibt. Aus der Analyse der Gel-Elektrophorese würde es auch scheinen, daß manche dieser Oberflächen gleiche oder bessere Gewinnung von DNA bis herab zu diesen niedrigeren Gehalten von NaCl0&sub4; als Bindepuffer und unter nativen Bedindungen liefern.

Materialien

Material der Zusammensetzung, wie es für Borsilikate im wesentlichen in Übereinstimmung mit den Beispielen 1, 2 und 3 beschrieben wurde.
Phosphosilikate oder Aluminiumsilikate.
SUPER FINE SUPER FLOSS (Manville) 1:5 Gewicht:Wasser.

Methoden

Es wurden acht Reaktionsgruppen für jede unten gezeigte Oberfläche getestet. Die Konzentrationen der Bindepuffer sind 1,0M, 1,5M, 2,0M, 2,5M, 3,0M, 3,5M, 4,0M mit SFSF bei 3,0M NaCl0&sub4; als verwendeter Standard. Hinsichtlich des Verfahrens vergleiche Beispiel 4. Ergebnisse Tabelle 1 - Ergebnisse der DNA-Bindungsstudien:
- Wenn DNA-Bindung auftrat, eluierte die DNA nicht.
+ Spurenmengen von DNA eluieren über alle Werte hinweg.
++ Nahezu vollständige Eluierung bis herab zur angegebenen Molarität des Bindepuffers.
+++ Starke Elution der DNA über alle Werte.
+, ++ und +++ wurden optisch durch Färbung des Gels mit Ethidiumbromid bestimmt.
1-9 Borsilikate
10-19 Phosphosilikate
20-27 Aluminiumsilikate

Schlußfolgerung

Mehrere Oberflächen übertreffen SFSF-Celit sowohl in der aus der Lösung gewonnenen DNA-Menge als auch in der Konzentration des zur Erbringung dieser Menge erforderlichen Bindepuffers. Gemäß der Agarosegel-Elektrophorese-Analyse wurde nahezu 100%ige Rückgewinnung der DNA aus der Lösung, selbst bei 1,0M NaCl0&sub4; als Bindepuffer, mit mehreren der Oberflächen erreicht.

Claims

1. Ein Verfahren zur Reinigung von DNA, welches Bindung der DNA an eine DNA-Bindungssubstanz umfaßt, die durch ein Verfahren erhältlich ist, welches folgende Schritte umfaßt:

a) Herstellung einer Reaktionsmischung, die im wesentlichen aus SiCl&sub4; und einer zweiten Komponente besteht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

- einem molaren Prozentsatz von BCl&sub3; von etwa 33,5 %,

- einem molaren Prozentsatz von BCl&sub3; von etwa 55,6 %,

- einem molaren Prozentsatz von BCl&sub3; von etwa 83,3 %,

- einem molaren Prozentsatz von PCl&sub3; von etwa 50,0 bis 83,3 % und

- einem molaren Prozentsatz von AlCl&sub3; von etwa 9,1 %;

b) Kühlung der Reaktionsmischung; und

c) Zusatz von Wasser zu der Reaktionsmischung bis die Gasentwicklung beendet ist.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, in welchem DNA in Gegenwart einer wässerigen Lösung an die DNA-Bindungssubstanzen gebunden wird.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem DNA-Eluierung von den DNA-Bindungssubstanzen umfaßt.

4. Das Verfahren nach Anspruch 3, in welchem die Eluierung durch Hitze und Wasser erreicht wird.

5. Ein Kit zur Reinigung von DNA, der eine DNA-Bindungssubstanz enthält, die durch ein Verfahren erhältlich ist, das folgende Schritte umfaßt:

- einem molaren Prozentsatz von BCl&sub3; von etwa 33,5 %,

- einem molaren Prozentsatz von BCl&sub3; von etwa 55,6 %,

- einem molaren Prozentsatz von BCl&sub3; von etwa 83,3 ,

- einem molaren Prozentsatz von PCl&sub3; von etwa 50,0 bis 83,3 %, und

- einem molaren Prozentsatz von AlCl&sub3; von etwa 9,1 %;

b) Kühlung der Reaktionsmischung; und

6. Der Kit nach Anspruch 5, der zusätzlich einen Bindungspuffer und einen Waschpuffer enthält.

7. Der Kit nach Anspruch 6, der zusätzlich einen Elutionspuffer enthält.

8. Eine DNA-Bindungssubstanz, die durch ein Verfahren erhältlich ist, das folgende Schritte umfaßt:

- einem molaren Prozentsatz von BCl&sub3; von etwa 33,5 %,

- einem molaren Prozentsatz von BCl&sub3; von etwa 55,6 %,

- einem molaren Prozentsatz von BCl&sub3; von etwa 83,3 %,

- einem molaren Prozentsatz von PCl&sub3; von etwa 50,0 bis 83,3 %, und

- einem molaren Prozentsatz von AlCl&sub3; von etwa 9,1 %;

b) Kühlung der Reaktionsmischung; und