JPH06217775A - 珪酸ホウ素、珪酸アルミニウム、珪酸燐およびｄｎａの精製法 - Google Patents

珪酸ホウ素、珪酸アルミニウム、珪酸燐およびｄｎａの精製法

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JPH06217775A
JPH06217775A JP5285090A JP28509093A JPH06217775A JP H06217775 A JPH06217775 A JP H06217775A JP 5285090 A JP5285090 A JP 5285090A JP 28509093 A JP28509093 A JP 28509093A JP H06217775 A JPH06217775 A JP H06217775A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は珪酸ホウ素、珪酸アルミニウム、珪
酸燐、これらの合成法およびこれらを用いたＤＮＡの精
製方法を開示する。 【構成】 本発明の新規組成物は、次のモノマーユニッ
ト組成物： 【化１】 （式中、Ｘは珪素、ほう素、アルミニウムや燐であり、
Ｒは各々別々にＯＨあるいはモノマーユニットであり、
ｎはＸがＳｉの時は３、Ｘがほう素、アルミニウムや燐
の時は２である）、および式： 【化２】 で表される該組成物の繰り返しユニット、および上記モ
ノマーおよび、この繰り返しユニットからなる組成物を
提供する。上記ユニットの繰り返しは２から無限大を含
み得る。その範囲は２から１００，０００，０００およ
び２から１００，０００を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は分子生物学の分野に関す
る。特に、本発明はデオキシリボ核酸の精製の領域に関
する。
【０００２】
【従来の技術】分子生物学および関連分野の絶ゆまない
進歩は、最大限に発展し増大する進んだ技術を伴った、
道具の絶ゆまない改良の必要性を提供する。
【０００３】広範囲の技術が、様々な形状のデオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）の使用を含む。例えば、組換えＤＮＡ
技術の分野の進歩は、絶えずＤＮＡをプローブ、ゲノム
ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡの形状で必要とする。
【０００４】医療診断の分野の進歩においても絶えず様
々の形式のＤＮＡが使用される。例えば、ＤＮＡプロー
ブは人の病原体の検出や診断に日常的に使用される。同
様に、ＤＮＡは遺伝疾患の検出に使用される。ＤＮＡは
食物の汚染菌の検出にも使用される。またＤＮＡプロー
ブは、遺伝子座の決定からクローニング、組換え体の発
現まで様々の理由で目的のＤＮＡの位置決定、同定およ
び分離に日常的に使用される。
【０００５】多くの場合、ＤＮＡはごく少量でしか得ら
れず、分離精製の操作は面倒で時間のかかるものであ
る。いつも時間がかかり、面倒な操作はＤＮＡの損失に
つながり得る。血清、尿や細菌培養物から得た試料から
のＤＮＡの精製には、汚染や間違った陽性の結果の危険
も存在する。
【０００６】典型的なＤＮＡの精製操作は、腐食性で毒
性のある組成物の使用を含む。典型的なＤＮＡ精製操作
は高濃度のヨウ化ナトリウムや過塩素酸ナトリウムなど
のカオトロピック塩を使用する。
【０００７】ＤＮＡ精製には沢山の操作法がある。ＤＮ
Ａ精製の分野での最近の活動で明らかなように、最適な
ＤＮＡ精製法が絶えず追求されている。米国特許第４，
９２３，９７８号はタンパク質とＤＮＡの溶液をヒドロ
キシル化した支持体上に通過させ、タンパク質を結合さ
せてＤＮＡを溶出させるＤＮＡ精製法を開示する。米国
特許第４，９３５，３４２号はＤＮＡの陰イオン交換体
への選択的結合とそれに続く溶出によるＤＮＡ精製法を
開示する。米国特許第４，９４６，９５２号は水溶性ケ
トンで沈澱させてＤＮＡを分離する方法を開示する。カ
オトロピックイオンと透析を用いるＤＮＡ精製は米国特
許第４，９００，６７７号に開示されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】現在のＤＮＡ精製法は
目的を達成できるが、もっともよく使用されるカオトロ
ピックイオンなどの腐食性で毒性のある化合物を使用し
なく、その上ＤＮＡの回収量がより多い方法が望まれ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、次のモノマー
ユニット組成物：
【化７】 （式中、Ｘは珪素、ほう素、アルミニウムや燐であり、
Ｒは各々別々にＯＨあるいはモノマーユニットであり、
ｎはＸがＳｉの時は３、Ｘがほう素、アルミニウムや燐
の時は２である）、および式：
【化８】 で表される該組成物の繰り返しユニット、および上記モ
ノマーおよび、この繰り返しユニットからなる組成物を
提供する。上記ユニットの繰り返しは２から無限大を含
み得る。その範囲は２から１００，０００，０００およ
び２から１００，０００を含む。
【００１０】本発明はＤＮＡを様々な原料や様々な形状
から精製するのに用いられ得る。本方法は本発明の組成
物を使用し、カオトロピックイオンなどの結合バッファ
ーの使用を任意選択のものとした。ＤＮＡはＴＥバッフ
ァー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）などの
溶液中で室温で結合できる。さらに、ＤＮＡは本発明の
組成物から加熱処理で水に溶出する事ができ、この時あ
るいは一般的に使用されるＴＥバッファーや１×ＴＡＥ
などの溶出液を使用する事もできる。精製するＤＮＡの
原料は、細菌、バクテリオファージ、標本、植物、動物
などを含む。ＤＮＡは一本鎖、二本鎖、環状および直鎖
上を含む様々な形状で見いだされる。本発明はどの様な
原料のどの様な形状のＤＮＡに対しても実施できる。
【００１１】本発明は、次のモノマーユニット組成物：
【化９】 （式中、Ｘは珪素、ほう素、アルミニウムや燐であり、
Ｒは各々別々にＯＨあるいはモノマーユニットであり、
ｎはＸがＳｉの時は３、Ｘがほう素、アルミニウムや燐
の時は２である）、および式：
【化１０】 で表される該組成物の繰り返しユニット、および上記モ
ノマーおよび、この繰り返しユニットからなる組成物を
提供する。上記ユニットの繰り返しは２から無限大を含
み得る。その範囲は２から１００，０００，０００およ
び２から１００，０００を含む。
【００１２】この表面はＤＮＡの結合を提供し、同時に
表面からのＤＮＡの回収は容易である。
【００１３】本発明は、次のモノマーユニット組成物：
【化１１】 （式中、Ｘは珪素、ほう素、アルミニウムや燐であり、
Ｒは各々別々にＯＨあるいはモノマーユニットであり、
ｎはＸがＳｉの時は３、Ｘがほう素、アルミニウムや燐
の時は２である）、および式：
【化１２】 で表される該組成物の繰り返しユニット、および上記モ
ノマーおよび、この繰り返しユニットからなる組成物と
ＤＮＡの接触を含むＤＮＡの精製法も提供する。上記ユ
ニットの繰り返しは２から無限大を含み得る。その範囲
は２から１００，０００，０００および２から１００，
０００を含む。
【００１４】ＢＣｌ3またはＰＣｌ3またはＡｌＣｌ3と
ＳｉＣｌ4の混合とそれに続く水の添加による反応生成
物も提供される。
【００１５】本発明は、次のモノマーユニット組成物：
【化１３】 （式中、Ｘは珪素、ほう素、アルミニウムや燐であり、
Ｒは各々別々にＯＨあるいはモノマーユニットであり、
ｎはＸがＳｉの時は３、Ｘがほう素、アルミニウムや燐
の時は２である）、および式：
【化１４】 で表される該組成物の繰り返しユニット、および上記モ
ノマーおよび、この繰り返しユニットからなる組成物の
調製法も提供する。上記ユニットの繰り返しは２から無
限大を含み得る。その範囲は２から１００，０００，０
００および２から１００，０００を含む。
【００１６】一般的に、水と、ＳｉＣｌ4とＰＣｌ3また
はＢＣｌ3またはＡｌＣｌ3の混合物の反応は上記に言及
したモノマーユニットの繰り返しユニットからなるビー
ズ様構造を生成させる。
【００１７】このポリマーの電気的な性質は、ポリマー
がビーズの中心に存在するために、通常の性質であるが
電気的な性質だけを変えるような表面の修飾が可能であ
るようなものでありうる（これにより、本明細書に開示
された目的にかなったより効率の良い表面を形成させ
る）。例えば、表面をＳｉＣｌ4で修飾して水和する事
で表面をシランでコートし得る。外に曝された繰り返し
ユニットはＤＮＡと相互作用するものであり、したがっ
てこの繰り返しユニットからなる表面は本発明を実施す
るのにも適する。本発明の組成物を成すためにデザイン
された表面は計量棒状物、管、瓶、ろ過装置などその他
を含む。
【００１８】本発明の組成物を得るための操作は通常、
ＳｉＣｌ4と様々な量のＰＣｌ3またはＢＣｌ3またはＡ
ｌＣｌ3を混合して冷却する事からなる。次に水を塩化
水素ガスＨＣｌ（ｇ）が出なくなるまで加えていき、そ
れから過剰の水を加えてＳｉＣｌ4とＢＣｌ3またはＡｌ
Ｃｌ3またはＰＣｌ3の反応を完結させる。反応物の量比
は通常１５：１から１：１５である。
【００１９】この生成物を約３０分間撹はんする。この
生成物をろ過して洗浄し、それから乾燥させる。望まし
い洗浄試薬はアセトンなどを含む。この生成物は、今、
ＤＮＡ精製のために使用できる。
【００２０】本発明は本発明の組成物とＤＮＡの接触か
らなる操作法も提供する。
【００２１】どの様なＤＮＡの精製あるいは分離の操作
法も、目的のＤＮＡを材料から得る事から始まる。血
清、尿や細菌培養物の試料からＤＮＡを得るための典型
的な操作法はよく知られており日常的に行われる。同様
に、ゲノムライブラリーなどからＤＮＡを得る事も日常
的に行われる。本発明の鍵は、一度ＤＮＡを材料から得
てしまえば精製が可能である事である。ＤＮＡを得るた
めの典型的な操作法はＤＮＡ溶液の懸濁で完結する。生
物学的試料からのＤＮＡの分離の文献はＨａｒｄｉｎ
ｇ， Ｊ．Ｄ．，Ｇｅｂｅｙｅｈｕ， Ｇ．，Ｂｅｂｅ
ｅ， Ｒ．，Ｓｉｍｍｓ， Ｄ．，Ｋｔｅｖａｎ，
Ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，１７：６９４７（１９８９），およびＭａｒｋｏ，
Ｍ．Ａ．，Ｃｈｉｐｐｅｒｆｉｅｌｄ， Ｒ．， ａ
ｎｄ Ｂｉｒｎｂｏｉｍ， Ｈ．Ｃ．，Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２１：３８２
（１９８２）を含む。プラスミドＤＮＡの分離操作法は
Ｌｕｔｚｅ， Ｌ．Ｈ．，Ｗｉｎｅｇｅｒ， Ｒ．
Ａ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，２０：６１５０（１９９０）に見いだされる。２本
鎖ＤＮＡの生物学的試料からの抽出はＹａｍａｄａ，
Ｏ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ， Ｔ．，Ｎａｋａｓｈｉｍ
ａ，Ｍ．，Ｈａｇｒｉ， Ｓ．，Ｋａｍａｈｏｒａ，
Ｔ．，Ｕｅｙａｍａ， Ｈ．，Ｋｉｓｈｉ， Ｙ．，Ｕ
ｅｍｕｒａ， Ｈ．，Ｋｕｒｉｍｕｒａ， Ｔ．，Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ，２７：２０３（１９９０）に見いだされる。ほ
とんどのＤＮＡ溶液はＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ （１
０ｍＭ：１ｍＭ））、ＴＡＥ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａ
ｃｅｔａｔｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）などの望ましいバッ
ファーあるいは細胞溶解物中のＤＮＡからなる。
【００２２】ＤＮＡを望ましい溶液中に得た後、典型的
には結合マトリクスを溶液に加える。通常用いられるマ
トリクスはガラスあるいは珪草（ｄｉａｔｏｍｓ）の形
状のシリカである。しかしながら、シリカを使用する操
作法はＤＮＡを表面に結合させるのに高濃度のカオトロ
ピックイオンやアルコールを必要とする。現在使用され
ているカオトロピックイオンはヨウ化ナトリウム（Ｎａ
Ｉ）、尿素、塩酸グアニジン、過塩素酸ナトリウムと臭
化カリウムを含む。カオトロピックイオンとアルコール
は毒性で、腐食性で、引火性でそして／または高価であ
り得る。本発明の操作法は本発明の表面への結合にカオ
トロピックイオンやアルコールの存在を必要としない。
本発明の方法ではＤＮＡを水溶液中で室温で結合させ、
３７℃の水に溶出する。しかしながら、カオトロピック
イオンやアルコールなどは望まれる場合には本発明の操
作において使用できる。本発明の操作法を使用する典型
的な手順は本発明の組成物をＤＮＡ溶液に加える事を含
み、一般的にはその後結合バッファーが加えられる。こ
の時本発明の操作法では結合バッファーを必要としない
事が利点である。この溶液は室温で短い時間インキュベ
ートされ得る。遠心分離により上清を捨てて、ペレット
を洗うことができる。それからＤＮＡを溶出し得る。
【００２３】本発明の組成物は典型的に組成物重量：水
の比が約１：１０から１０：１の範囲で使用される。好
ましくは水の過剰は避けられ、水の代わりにＴＥなどの
バッファーが用いられ得る。
【００２４】次に、使用する場合、ここで結合バッファ
ーを加える。室温（ただし２０℃から４０℃の範囲が可
能）で短い時間（１分から２０分、好ましくは１０分）
のインキュベーションの後、容器を遠心分離して上清と
ペレットに分離し得る。上清を分離してペレットを５０
ｍＭ Ｔｒｉｓで希釈したエタノールなどの試薬で洗浄
する。洗浄試薬の好ましい濃度は８０％エタノールであ
る。ＤＮＡは次に、本発明の組成物からＴＥバッファ
ー、１×ＴＡＥバッファーや１×ＴＢＥバッファーなど
の溶出バッファーを用いて溶出する事が出きる。重要な
事は溶出バッファーの使用をやめ、加熱する事でＤＮＡ
を水に溶出できることである。最大の回収率の為には溶
出のステップは繰り返され得る。本発明の化学組成物は
使い易いキットに組み立てられ得る。本発明の組成物か
らなるキットは組成物と共にＴＥバッファーやＴＡＥバ
ッファーなど適したバッファー入った瓶などの容器を含
み得、オプションとしてカオトロピックイオンなどの結
合バッファーの容器、５０ｍＭ Ｔｒｉｓあるいは１×
ＴＡＥで希釈したエタノール溶液などの洗浄バッファー
の容器とＴＥバッファー、１×ＴＡＥや１×ＴＢＥバッ
ファーなどの溶出バッファーの容器を含み得る。このよ
うなキットは便利なＤＮＡの精製を可能にする。
【００２５】以下の実施例は本明細書に説明した本発明
の特定の態様を説明する。当業者には明らかなように、
本発明の主旨及び範囲を離れることなく他の様々な修正
法が可能である。
【００２６】
【実施例】
実施例１ 本実験の目的は１０種の珪酸ホウ素ポリマーを合成する
事である。珪素より陽性な原子であるホウ素のポリマー
への取り込みは、その表面の電気的性質を変え、溶液試
料からの固相抽出によるＤＮＡの精製の能力に影響し得
るため、これらのポリマーは様々な量のホウ素を含む。
【００２７】材料 ＣＨ2Ｃｌ2（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗ
Ｉ）中の１Ｍ ＢＣｌ3 ＳｉＣｌ4（Ｐｅｔｒａｒｃｈ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒ
ｉｓｔｏｌ，ＰＡ）操作手順 ： ＢＣｌ3の含量のみ下記に示すとおり変え
て１０の実験を同様に行った。
【００２８】 ＢＣｌ3 ＳｉＣｌ4 表面 μＬ ｍＭｏｌ ｇ ｍＭｏｌ １ １．０ １．０ １．７０ １０．０ ２ ２．０ ２．０ １．７０ １０．０ ３ ５．０ ５．０ １．７０ １０．０ ４ ７．０ ７．０ １．７０ １０．０ ５ １０．０ １０．０ １．７０ １０．０ μＬ ｍＭｏｌ ６ ５．０ ５．０ １２３．０ １．０ ７ ５．０ ５．０ ２４７．０ ２．０ ８ ５．０ ５．０ ３７０．０ ３．０ ９ ５．０ ５．０ ４９３．０ ４．０ １０ ５．０ ５．０ ０．０ ０．０ ＳｉＣｌ4とＢＣｌ3を混合し、５℃で２０分冷却した。
撹はんしながらＨＣｌ（ｇ）が溶出しなくなるまでＨ2
Ｏを徐々に加えた。反応を完結するために５ｍｌの過剰
Ｈ2Ｏを加えた。１時間撹はんした。
【００２９】ろ過して１０ｍｌのＨ2Ｏで３回、次に１
０ｍｌのアセトンで３回洗浄し、２５分空気中で乾燥し
て１時間加熱して乾燥した。
【００３０】実施例２ 燐はホウ素とおおよそ同じ電気的陰性を持つ。珪酸ホウ
素はＤＮＡの精製において非常に有用である事が示され
ている。したがってＤＮＡの吸着／溶出において表面の
極性化が重要であるならば、珪酸燐も珪酸ホウ素と同じ
くらいＤＮＡ精製において有用なはずである。
【００３１】材料 ＳｉＣｌ4（Ｐｅｔｒａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ） ＣＨ2Ｃｌ2（Ａｌｄｒｉｃｈ）中の２Ｍ ＰＣｌ3 各実験においてＰＣｌ3の量のみを変え、１０の実験を
全く同様に行った。この１０の実験を下記の表に示す。
【００３２】 ＳｉＣｌ4 ＰＣｌ3 実験 ｍＬ ｍＭｏｌ ｃｇ ｍＬ ｍＭｏｌ １ １．３４０ １０．０ ０．１ ０．５ １．０ ２ １．３４０ １０．０ ０．３ １．５ ３．０ ３ １．３４０ １０．０ ０．５ ２．５ ５．０ ４ １．３４０ １０．０ ０．７ ３．５ ７．０ ５ １．３４０ １０．０ １．０ ５．０ １０．０ ６ ０．６５ ５．０ １．５ ３．７５ ７．５ ７ ０．６５ ５．０ ２．０ ５．０ １０．０ ８ ０．６５ ５．０ ３．０ ７．５ １５．０ ９ ０．６５ ５．０ ４．０ １０．０ ２０．０ １０ ０．６５ ５．０ ５．０ １２．５ ２５．０ 典型的な実験では、ＳｉＣｌ4を２５ｍｌのエレンマイ
ヤーフラスコに加え、氷浴中０℃で約１０分冷却した。
ＰＣｌ3をこれに加え５分冷却した。Ｈ2Ｏを白色気体が
溶出しなくなるまで非常にゆっくり、約１分あたり２滴
の速度で加えた。５分撹はんして１ｍｌ増加分量に対し
て３ｍｌを加えた。室温で１５分撹はんした。ろ過して
から１０ｍｌのＨ2Ｏで３回、次に１０ｍｌのアセトン
で３回洗浄し、２５分間空気中で乾燥して１時間加熱し
て乾燥した。デシケーター中で保存した。
【００３３】実施例３ 次の実験は様々な量のアルミニウムを含む珪酸アルミニ
ウムを合成する事が目的である。アルミニウムは珪素よ
り電気的に陽性であり、したがってポリマー中のアルミ
ニウムの量が増加するに従いこのポリマーに吸着するＤ
ＮＡの量が増加するはずである。
【００３４】開始材料 ニトロベンゼン中の１Ｍ ＡｌＣｌ3 ＳｉＣｌ4（Ｐｅｔｒａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ）操作手順 ＡｌＣｌ3の量をのみ変えて８の実験を同様に行った。
【００３５】 ＳｉＣｌ4 ＡｌＣｌ3 実験 ｍＬ ｍＭｏｌ ｍＬ ｍＭｏｌ １ １．３４ １０．０ １．０ １．０ ２ １．３４ １０．０ ３．０ ３．０ ３ １．３４ １０．０ ５．０ ５．０ ４ １．３４ １０．０ ７．０ ７．０ ５ １．３４ １０．０ １０．０ １０．０ ６ ０．６７ ５．０ ７．５ ７．５ ７ ０．６７ ５．０ １０．０ １０．０ ８ ０．６７ ５．０ １５．０ １５．０ 典型的な実験では、ＡｌＣｌ3とＳｉＣｌ4を混合して氷
浴中で１５分冷却した。水を激しく撹はんしながら滴下
した。反応容器からＨＣｌ（ｇ）が溶出しなくなるまで
水を非常にゆっくり（２分間毎に５滴）と加えた。
【００３６】反応を完結するために３ｍｌのＨ2Ｏを加
えた。室温で１５分撹はんした。
【００３７】ろ過して１０ｍｌのアセトンで３回、２０
ｍｌのＨ2Ｏで３回、１０ｍｌのアセトンで３回洗浄し
た。２０分空気中で乾燥して１時間加熱して乾燥した。
デシケーター中で保存した。
【００３８】実施例４ この実験はＳＵＰＥＲ ＦＩＮＥ ＳＵＰＥＲ ＦＬＯ
ＳＳ ＣＥＬＩＴＥ（超微粒子フロスシーライト）（工
業標準（ｔｈｅ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｓｔａｎｄａｒ
ｄ）、Ｍａｎｖｉｌｌｅ）のＤＮＡ結合能力がどの様に
決定されたか、及びこの能力は何であるかを記載する。
ＳＵＰＥＲ ＦＩＮＥ ＳＵＰＥＲ ＦＬＯＳＳ ＣＥ
ＬＩＴＥはＤＮＡを強く結合し、２．５ＭのＮａＣｌＯ
4の結合バッファー中で溶出する事が明らかにされた。
【００３９】材料： Ｓｕｐｅｒ Ｆｉｎｅ Ｓｕｐｅｒ Ｆｌｏｓｓ （Ｓ
ＦＳＦ）（Ｍａｎｖｉｌｌｅのサンプル，Ｄｅｎｖｅ
ｒ，ＣＯ（１：５ ｗ／ｗ水溶液）） λＤＮＡ（ＢＲＬカタログ番号５６１２５Ａ） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０ （１Ｍ保存液を希
釈）ＢＲＬカタログ番号５５０５ＵＡ（ＰＲＥＰ−Ａ−
ＧＥＮＥ ＫＩＴ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎ
ｄ，ＣＡ）） 結合バッファー（６Ｍ保存液から希釈）ＮａＣｌＯ4
Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号５４９０−５００ 洗浄バッファー ８０％エタノールの５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ，ｐＨ７．０ 溶出バッファー Ｍｉｌｌｉ Ｑ Ｈ2Ｏ エチジウムブロマイド （１０ｍｇ／ｍｌ）Ｓｉｇｍａ
カタログ番号Ｅ−８７５１ １％アガロース ＢＲＬカタログ番号５５１０ＵＡ １×ＴＡＥ （５０×保存液から）Ｔｒｉｓベース−Ｓ
ｉｇｍａカタログ番号Ｔ−１５０３ 酢酸−Ｆｉｓｈｅｒ Ａ３８−５００ ＥＤＴＡ−Ｓｉｇｍａカタログ番号ＥＤ２５５０ タイプＩＩローディングダイ（２５％ Ｆｉｃｏｌｌ４
００，０．２５％ ブロモフェノールブルー，０．２５
％ キシレンシアノール−Ｆｉｃｏｌｌ４００−Ｓｉｇ
ｍａカタログ番号Ｆ４３７５ ブロモフェノールブルー−Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ番号
１６１−０４０４ キシレンシアノール−Ｓｉｇｍａカタログ番号 Ｘ−４
１２６ ポラロイドフィルム タイプ５７およびタイプ５５方法 １．表面の各タイプにつき１つの、合計２グループの反
応を組み立てる。各表面につき５０μｌのＤＮＡ溶液の
入ったチューブを８本用意する。この溶液は０．５μｌ
のλＤＮＡ（３１μｇ）を含む５０μｌの５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ，ｐＨ７．０である。ＮａＣｌＯ4の希釈範囲は
０Ｍから６Ｍである。
【００４０】２．反応液に２０μｌの各表面を加える。
【００４１】３．４００μｌの各希釈結合溶液を加え
る。Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅの場合これらは０．０Ｍ、
２．０Ｍ、２．５Ｍ、３．０Ｍ、３．５Ｍ、４．０Ｍ、
４．５Ｍおよび６．０ＭのＮａＣｌＯ4である。ＳＦＳ
Ｆの場合希釈は０Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍ、２．０Ｍ、
２．５Ｍ、３．０Ｍ、３．５Ｍおよび４．０ＭのＮａＣ
ｌＯ4である。
【００４２】４．室温で揺り動かしながら１０分インキ
ュベートする。
【００４３】５．遠心分離して上清を捨てる。
【００４４】６．８０％エタノール／５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ，ｐＨ７．０でペレットを２回洗浄する。
【００４５】７．ＤＮＡを２０μｌのＨ2Ｏに３７℃で
１０分溶出する。
【００４６】８．遠心して上清を除く。溶出ステップを
繰り返して上清を合計約４０μｌまで合わせる。
【００４７】９．各チューブに２μｌのタイプＩＩロー
ディングダイを加える。
【００４８】１０．１％アガロース１×ＴＡＥゲルにロ
ードする。１×ＴＡＥバッファー中で１００−１３０Ｖ
で約２５分泳動する。
【００４９】１１．エチジウムブロマイド水溶液（〜
１：１０００）で〜１５分染色する。〜２０−３０分脱
色する。
【００５０】１２．ＵＶライトの上からポラロイドタイ
プ５７フィルムで写真をとる。可能ならばタイプ５５フ
ィルムを用いてネガを撮る。
【００５１】結果及び結論 Ｐｒｅｐ−Ａ−ＧｅｎｅのＤＮＡの溶出は３．０ＭのＮ
ａＣｌＯ4まで見られなかったが、ＳＦＳＦはそのまま
の状態でＤＮＡを結合し，２．５ＭのＮａＣｌＯ4で強
く溶出した。ＳＦＳＦは明らかにＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎ
ｅより良好な能力を示した。
【００５２】実施例５ この実験は珪酸ホウ素、珪酸燐、珪酸アルミニウムのＤ
ＮＡ結合能力を記載する。
【００５３】電気泳動は多くのこれらの表面が最低１Ｍ
のＮａＣｌＯ4結合バッファーでよい回収率を与える事
を示した。これは最低２．５ＭのＮａＣｌＯ4までしか
良い回収率を与えなかったＳｕｐｅｒ Ｆｉｎｅ Ｓｕ
ｐｅｒ Ｆｌｏｓｓを上回った。いくつかの表面はこれ
らの低いレベルのＮａＣｌＯ4の結合バッファーにおい
て、またそのままの状態において等しいかまたはより高
いＤＮＡ回収率を与える事も、アガロースゲル電気泳動
の解析で示された。
【００５４】材料 珪酸ホウ素について説明した実施例１、２および３によ
る組成の材料。
【００５５】珪酸燐及び珪酸アルミニウム。
【００５６】ＳＵＰＥＲ ＦＩＮＥ ＳＵＰＥＲ ＦＬ
ＯＳＳ （Ｍａｎｖｉｌｌｅ）１：５ 重量：水方法 下記に示した各表面につき８の反応グループをテストし
た。結合バッファーの濃度は１．０Ｍ、１．５Ｍ、２．
０Ｍ、２．５Ｍ、３．０Ｍ、３．５Ｍ、４．０ＭのＳＦ
ＳＦであり、標準として３．０ＭのＮａＣｌＯ4とす
る。操作手順については実施例４を見よ。
【００５７】結果
【表１】 表１ − ＤＮＡ結合解析の結果： ポリマーのホウ素、 アルミニウム、燐 ＤＮＡの結合 水中での表面 のパーセント １Ｍ−４Ｍ［ＮａＣｌＯ4］ 結合 １ ９．１ ＋＋ １．５Ｍ ２ １６．６ − ３ ３３．５ ＋＋＋ ある ４ ４２．２ ＋＋ １．５Ｍ ５ ５０．０ − ６ ５５．６ ＋＋＋ ある ７ ６２．５ ＋＋ １．５Ｍ ８ ７１．４ ＋＋ ２．０Ｍ ９ ８３．３ ＋＋＋ ある １０ ９．１ − １１ １６．６ ＋＋ １．５Ｍ １２ ３３．３ ＋＋ １．５Ｍ １３ ４２．２ ＋ １４ ５０．０ ＋＋＋ ある １５ ６２．５ ＋＋＋ ある １６ ６６．６ ＋＋ １７ ７５．０ ＋＋＋ ある １８ ８０．０ ＋＋＋ ある １９ ８３．３ ＋＋＋ ある ２０ ９．１ ＋＋＋ ある ２１ ２３．１ ＋ ２２ ３３．３ ＋ ２３ ４１．２ − ２４ ５０．０ − ２５ ６０．８ − ２６ ６６．６ − ２７ ７５．０ − − ＤＮＡ結合が起こった場合、ＤＮＡが溶出され
なかった。
【００５８】＋ いろいろな希釈にわたって微量の
ＤＮＡが溶出。
【００５９】＋＋ 示された最少濃度までは完全に近
い溶出。
【００６０】＋＋＋ いろいろな希釈にわたってＤＮＡ
が強く溶出。
【００６１】＋、＋＋、＋＋＋はエチジウムブロマイド
染色したゲルの観察によって決定した。
【００６２】１−９ 珪酸ホウ素 １０−１９ 珪酸燐 ２０−２７ 珪酸アルミニウム結論 いくつかの表面は、溶液からのＤＮＡの回収量とこれに
必要な結合バッファーの濃度の両方においてＳＦＳＦシ
ーライトを上回る性能を示した。アガロースゲル電気泳
動による解析からいくつかの表面では、１．０ＭのＮａ
ＣｌＯ4の結合バッファーまでさえ１００％の溶液中Ｄ
ＮＡの回収率が達成された。
【００６３】本発明は詳細に説明した態様に限定される
ものではなく、本発明の主旨及び範囲を離れる事なく様
々な修正法および均等物が当業者には明かであり、これ
らの均等物は本発明に含まれる事が明らかであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エイドリアン・ジーネル・ハワード アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27704，ダーラム，ニュー・キャッスル・ ロード 1321，アパートメント エイ−４ (72)発明者 ジェームズ・アーサー・ダウン アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27511，キャリー，チャーター・オーク ス・サークル 101

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式： 【化１】 （式中、Ｘは珪素、ホウ素、アルミニウムあるいは燐で
    あり、Ｒは各々別々にＯＨあるいはモノマーユニットで
    あり、ｎはＸが珪素の場合３でＸがホウ素、アルミニウ
    ムあるいは燐の場合２である）の組成物、および式： 【化２】 からなる組成物の繰り返しユニット、および上記モノマ
    ーおよび上記モノマーの上記繰り返しユニットからなる
    組成物にＤＮＡを接触させることからなるＤＮＡの精製
    方法。
  2. 【請求項２】 カオトロピックイオンを使用する事から
    なる請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 ＤＮＡが溶液中で結合する請求項１記載
    の方法。
  4. 【請求項４】 珪酸ホウ素、珪酸燐あるいは珪酸アルミ
    ニウムからのＤＮＡの溶出をさらに含む事からなる請求
    項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 溶出が加熱および水によって得られる請
    求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 式： 【化３】 （式中、Ｘは珪素、ホウ素、アルミニウムあるいは燐で
    あり、Ｒは各々別々にＯＨあるいはモノマーユニットで
    あり、ｎはＸが珪素の場合３でＸがホウ素、アルミニウ
    ムあるいは燐の場合２である）の組成物、および式： 【化４】 からなる組成物の繰り返しユニット、および上記モノマ
    ーおよび上記モノマーの上記繰り返しユニットからなる
    組成物からなるＤＮＡの精製のためのキット。
  7. 【請求項７】 結合バッファーおよび洗浄バッファーを
    さらに含む請求項６記載のキット。
  8. 【請求項８】 溶出バッファーをさらに含む請求項７記
    載のキット。
  9. 【請求項９】 式： 【化５】 （式中、Ｘは珪素、ホウ素、アルミニウムあるいは燐で
    あり、Ｒは各々別々にＯＨあるいはモノマーユニットで
    あり、ｎはＸが珪素の場合３でＸがホウ素、アルミニウ
    ムあるいは燐の場合２である）、および式： 【化６】 からなる組成物の繰り返しユニット、および上記モノマ
    ーおよび上記モノマーの上記繰り返しユニットからなる
    組成物の化合物。
  10. 【請求項１０】 ＢＣｌ3またはＰＣｌ3またはＡｌＣｌ
    3とＳｉＣｌ4の混合物と水の反応生成物。
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